基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统及成像方法

本发明涉及光学显微成像的技术领域，尤其涉及一种基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统及成像方法。

背景技术：

衍射是光的一个基本特性，它几乎可被用来解释所有经典的波动现象。由于衍射的存在，光束在传播过程中光斑逐渐变大，能量逐渐发散，是在生物组织成像时造成成像深度有限和分辨率低的重要原因之一。因此在激光器问世之后，人们就开始考虑如何消除或抵消衍射现象以增加对生物组织进行成像时的成像深度及成像分辨率。

在非线性介质中，科研人员通过采用介质的自聚焦非线性实现对光束衍射的抑制，这种方法早已经在实验上得到验证。但是人们更希望能够在自由空间实现无衍射光束，这种需求也使得无衍射光束成为历年来研究领域的一个重要课题。基于无衍射光束的光学成像技术能够实现对生物组织成像，然而，现有的光学成像技术通常是基于高斯光束这种成像技术在对生物组织进行成像时存在穿透深度及穿透宽度较小的问题，导致图像分辨率受到影响，最终得到的图像清晰度较差，且无法获取生物组织的深层结构。

技术实现要素：

本发明实施例提供了一种基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统及成像方法，旨在解决现有技术方法中所存在的对生物组织进行成像时图像清晰度较差且无法获取深层结构的问题。

第一方面，本发明实施例提供了一种基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，其中，所述系统包括信号采集装置及成像处理终端，所述信号采集装置包括：飞秒激光器、单模保偏光纤、半波片、空间光调制器、扫描阵镜、物镜、双色镜、三维移动平台及光电倍增管；所述单模保偏光纤的一端连接所述飞秒激光器，所述单模保偏光纤与所述空间光调制器之间的第一光路中设有所述半波片，所述空间光调制器与所述双色镜之间的第二光路中设有所述扫描阵镜，所述物镜设置于所述双色镜前端，所述三维移动平台设置于所述物镜前端，样品放置于所述三维移动平台的上端面，所述双色镜一侧设有光电倍增管；所述飞秒激光器用于产生飞秒脉冲型激发光；所述单模保偏光纤用于对所述飞秒脉冲型激发光进行整形以得到标准高斯光后经所述第一光路传输至所述半波片；所述半波片用于对经所述第一光路传输的标准高斯光的偏振方向进行调整，并将调整后得到的线偏振高斯光传输至所述空间光调制器；所述空间光调制器用于对所述线偏振高斯光进行调制，并将调制得到的艾里光经所述第二光路传输至所述扫描阵镜进行同步扫描后传输至所述双色镜；所述双色镜用于对同步扫描后得到的激发光进行透射传输至所述物镜，并对来自物镜的荧光信号进行反射；所述物镜用于对所述激发光进行聚焦照射所述样品同时收集所述样品所反射的荧光信号；所述三维移动平台用于驱动所述样品进行三维移动；所述光电倍增管用于对所述双色镜反射的荧光信号进行放大处理得到荧光放大信号；所述光电倍增管与所述成像处理终端进行电连接以输出荧光放大信号至所述成像处理终端，所述成像处理终端用于对所述荧光放大信号进行处理得到荧光图像。

所述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，其中，所述空间光调制器上安装有第一掩膜板、第二掩膜板或第三掩膜板；所述空间光调制器上安装不同掩膜板以调制得到不同级的艾里光。

所述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，其中，所述双色镜与所述光电倍增管之间的第三光路中还设有滤镜；所述滤镜用于对所述双色镜反射的荧光信号进行滤波。

所述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，其中，所述第一光路还中依次设置有第一透镜、第二透镜及第三透镜，所述半波片设置于所述第三透镜的下游。

所述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，其中，所述第二光路中还依次设置有第四透镜、第五透镜、第一反射镜、第六透镜、第七透镜及第二反射镜，所述扫描阵镜设置于所述第一反射镜与所述第六透镜之间。

所述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，其中，所述第三光路中还依次设置有第三反射镜及第八透镜，所述滤镜设置于所述第八透镜的下游。

另一方面，本发明实施例还提供了一种基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像方法，其中，所述基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像方法应用于上述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，所述方法包括：

开启所述飞秒激光器产生飞秒脉冲型激发光并经所述单模保偏光纤整形后输出标准高斯光；

所述标准高斯光经所述第一光路传输至所述半波片进行偏振方向调整后得到线偏振高斯光传输至所述空间光调制器；

所述空间光调制器对所述线偏振高斯光进行调制得到艾里光，并经所述第二光路传输至所述扫描阵镜进行同步扫描后传输至所述双色镜；

所述双色镜对同步扫描后得到的激发光进行透射传输至所述物镜，并经所述物镜聚焦照射于所述三维移动平台的所述样品上；

控制所述三维移动平台驱动所述样品进行三维移动以通过透射传输的激发光对所述样品进行扫描照射；

所述物镜收集所述样品反射的荧光信号并经所述双色镜反射至所述光电倍增管进行放大处理，得到荧光放大信号后输出至所述成像处理终端；

所述成像处理终端获取所述荧光放大信号进行处理得到荧光图像。

所述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像方法，其中，所述艾里光为艾里一级光束、艾里二级光束或艾里三级光束。

所述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像方法，其中，所述飞秒激光器产生的飞秒脉冲型激发光的波长为600-1300nm。

所述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像方法，其中，所述荧光放大信号为波长665-715nm的荧光信号。

本发明实施例提供了一种基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统及成像方法，系统包括信号采集装置及成像处理终端，信号采集装置包括：飞秒激光器、单模保偏光纤、半波片、空间光调制器、扫描阵镜、物镜、双色镜、三维移动平台及光电倍增管。上述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，通过飞秒激光器产生飞秒脉冲型激发光经单模保偏光纤进行整形得到标准高斯光，经半波片调整得到线偏振高斯光后经空间光调制器调制得到艾里光，对艾里光进行同步扫描后聚焦照射样品以激发产生荧光信号，收集荧光信号进行放大后处理得到荧光图像；利用艾里光具有较大穿透深度和宽度的特点以显著扩展对生物组织进行轴成像的范围，从而实现单帧捕获体积图像，能够得到清晰的成像图像及深层结构，且极大提高了成像速度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的效果示意图；

图3为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的效果示意图；

图4为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的效果示意图；

图5为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的效果示意图；

图6为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的效果示意图；

图7为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像方法的流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。

还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

在本实施例中，请参阅图1，图1为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的结构示意图。如图所示，本发明实施例提供了一种基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，所述系统包括信号采集装置及成像处理终端20，所述信号采集装置包括：飞秒激光器101、单模保偏光纤102、半波片106、空间光调制器107、扫描阵镜111、物镜120、双色镜115、三维移动平台122及光电倍增管119；所述单模保偏光纤102的一端连接所述飞秒激光器101，所述单模保偏光纤102与所述空间光调制器107之间的第一光路中设有所述半波片106，所述空间光调制器107与所述双色镜115之间的第二光路中设有所述扫描阵镜111，所述物镜120设置于所述双色镜115前端，所述三维移动平台121设置于所述物镜120前端，样品放置于所述三维移动平台121的上端面，所述双色镜115一侧设有光电倍增管119。

所述飞秒激光器101用于产生飞秒脉冲型激发光；所述单模保偏光纤102用于对所述飞秒脉冲型激发光进行整形以得到标准高斯光后经所述第一光路传输至所述半波片106；所述半波片106用于对经所述第一光路传输的标准高斯光的偏振方向进行调整，并将调整后得到的线偏振高斯光传输至所述空间光调制器107；所述空间光调制器107用于对所述线偏振高斯光进行调制，并将调制得到的艾里光经所述第二光路传输至所述扫描阵镜111进行同步扫描后传输至所述双色镜115；所述双色镜115用于对同步扫描后得到的激发光进行透射传输至所述物镜120，并对来自物镜120的荧光信号进行反射；所述物镜120用于对所述激发光进行聚焦照射所述样品同时收集所述样品所反射的荧光信号；所述三维移动平台121用于驱动所述样品进行三维移动；所述光电倍增管119用于对所述双色镜115反射的荧光信号进行放大处理得到荧光放大信号；所述光电倍增管119与所述成像处理终端20进行电连接以输出荧光放大信号至所述成像处理终端20，所述成像处理终端20用于对所述荧光放大信号进行处理得到荧光图像。其中，飞秒激光器101产生的飞秒脉冲型激发光的波长为600-1300nm，可根据实际使用情况对秒脉冲型激发光的波长进行调节；双色镜115的具体作用为反射来自物镜的荧光信号，透射同步扫描后得到的激发光，同时还可以微调激发光的传输方向，确保透射光线的光路与物镜120的光轴重合；物镜的放大倍数可以进行调节，可选用8倍、10倍、20倍、50倍、100倍或200倍物镜进行放大处理。可通过三维移动平台121驱动样品沿水平方向进行二维移动，以调整激发光对样品进行聚焦照射的区域，还可通过三维移动平台121驱动样品沿z轴方向进行竖直移动，以使激发光聚焦的焦点准确照射于样品上。

传统成像方法均是基于高斯光束对样品进行成像，关闭空间光调制器107不对线偏振高斯光进行调制即可直接将线偏振高斯光传输至扫描阵镜111，由于高斯光束的穿透深度较小，需要沿z轴方向匀速移动载有实验样品的三维移动平台121，每移动一次，光电倍增管119捕获一层图像，以使同步扫描后得到的激发光对样品各深度层进行照射得到多层图像，叠加捕获到的多层图像得到三维堆叠图像作为最终成像图像，此成像过程中需要获取多帧图像进行叠加，增加了成像所需时间。而本方案中采用空间光调制器107对线偏振高斯光进行调制得到艾里光束，通过艾里光束对样品进行照射产生荧光信号，获取荧光信号进行放大后成像得到荧光图像，由于艾里光束穿透深度大于高斯光束，通过单帧2d扫描即可获取得到清晰荧光图像，缩短了成像时间，提高了成像效率。

在更具体的实施例中，所述空间光调制器107上安装有第一掩膜板、第二掩膜板或第三掩膜板；所述空间光调制器107上安装不同掩膜板以调制得到不同级的艾里光。具体的，可调整安装于空间光调制器上的掩膜板以得到对应级别的艾里光，例如，当空间光调制器上安装有第一掩膜板时，对应调制得到第一震荡级的艾里光，简称艾里一级光束；当安装有第二掩膜板时，对应调制得到第二震荡级的艾里光，简称艾里二级光束；当安装有第三掩膜板时，对应调制得到第三震荡级的艾里光，简称艾里三级光束。

图2为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的效果示意图，具体的，在飞秒脉冲型激发光的波长分别为635nm和780nm时，分别测量在自由空间下光斑的形状，将电荷耦合器122固定设置于所述三维移动平台121的下端面，并沿z轴方向匀速移动三维移动平台121，每移动一次，电荷耦合器122捕获一层图像，叠加捕获到的多层图像得到三维堆叠图像并在x方向投影作为最终光斑图像，光斑图像中即包含当前激发光的光斑形状，获取得到空间光调制器调制的多个级别的艾里光斑图像与未经空间光调制器调制的高斯光斑图像进行了比较，比较结果如图2所示。如图2所示，以图像中光强度大于最大光强的1/e作为阈值获取光斑，波长分别为635nm和780nm，高斯光的光斑在z轴方向的长度约为60μm，波长780nm时高斯光的光斑长度略大于635nm时高斯光的光斑长度；艾里一级光束的光斑长度约是同波长下高斯光的10倍，艾里二级光束约是艾里一级光束的2倍，艾里三级光束约是艾里一级光束的3倍，波长780nm时艾里光的光斑长度略大于635nm时同级别的艾里光且光斑在z轴方向变细，由此可知艾里光的光斑长度在z轴方向远大于高斯光的光斑长度。

在更具体的实施例中，所述双色镜115与所述光电倍增管119之间的第三光路中还设有滤镜118；所述滤镜118用于对所述双色镜115反射的荧光信号进行滤波。可通过滤镜118对荧光信号进行滤波处理，得到一定波长范围内的荧光信号并输出至光电倍增管119并滤除其他杂散光，以提高荧光信号的信噪比，从而进一步增强最终所得到的成像图像的清晰度。

在更具体的实施例中，所述第一光路还中依次设置有第一透镜103、第二透镜104及第三透镜105，所述半波片106设置于所述第三透镜105的下游。第一光路中所设置的第一透镜103、第二透镜104及第三透镜105分别用于对入射激光进行聚焦或发散，通过三个透镜的组合使用可以扩大光斑直径，也可简称为扩束，半波片106设置于第三透镜105下游，则半波片106用于对扩大光斑直径的标准高斯光的偏振方向进行调整。

在更具体的实施例中，所述第二光路中还依次设置有第四透镜108、第五透镜109、第一反射镜110、第六透镜112、第七透镜113及第二反射镜114，所述扫描阵镜111设置于所述第一反射镜110与所述第六透镜112之间。具体的，第四透镜108及第五透镜109组合使用以缩小光斑直径，缩小光斑直径的艾里光经第一反射镜110反射至扫描阵镜111进行同步扫描，通过扫描阵镜111进行同步扫描后的艾里光实现对样品的点阵扫描，同步扫描后的艾里光经过第六透镜112及第七透镜113以扩大光斑直径，第二反射镜114对扩大光斑直径的艾里光进行反射以输出至双色镜115。

在更具体的实施例中，所述第三光路中还依次设置有第三反射镜116及第八透镜117，所述滤镜118设置于所述第八透镜117的下游。经双色镜115反射的荧光信号被第三反射镜116反射输出至第八透镜117，荧光信号的传输光路如图1中深色实线所示，第八透镜117可对荧光信号进行聚焦，滤镜118对聚焦后的荧光信号进行滤波并最终输出至光电倍增管119。

图3为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的效果示意图，图4为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的效果示意图，具体的，对高斯光束和艾里一级光束在浑浊介质的穿透能力进行比较所得到的比较结果如图3所示，飞秒脉冲型激发光的波长设定为635nm，分别将150μm和300μm厚充满水/牛奶混合物(6％的全脂牛奶)的玻璃腔作为样品，在样品的远端设置一个千分尺(r1l3s1pthorlabs)，通过反射的光的相对强度来评估对浑浊介质的穿透能力。其中，图3-a为对样品的扫描方式，图3-b为样品的反射光成像，图3-c为艾里一级光束对150μm厚的水/牛奶混合物的玻璃腔进行反射成像所得到的散射图像，图3-e为高斯光束对150μm厚的水/牛奶混合物的玻璃腔进行照射所得到的成像图像，通过比较发现，艾里一级光束所得到的散射图像的信号强度与高斯光束的成像图像较为接近，但艾里一级光束的散射图像的图像分辨率高于高斯光束，如图3-c中白色方框内凹边清晰可见，但图3-e中白色方框内的凹边较为模糊。图3-d为艾里一级光束对3000μm厚的水/牛奶混合物的玻璃腔进行反射成像所得到的散射图像，图3-f高斯光束对3000μm厚的水/牛奶混合物的玻璃腔进行照射所得到的成像图像，显然此时艾里一级光束所得到的散射图像的信号强度强于高斯光束的成像图像，高斯光束的成像图像的信号强度基本消失，而艾里一级光束的散射图像的信号强度相比图3-c未明显下降，仍然能够对样品进行清晰成像。采用高斯光束及艾里一级光束对不同深度的样品进行散射成像时的峰值信号进行分析得到的分析结果如图4所示，其中，纵坐标所示的信号强度比值即是对峰值信号已进行归一化处理所得数值，信号强度比值即为当前信号强度与最大信号强度的比值，取1/e作为信号强度比值阈值，信号强度比值大于1/e则判断当前光束能够穿透样品并进行清晰成像，否则判断当前光束无法穿透样品并进行清晰成像，经分析可知，高斯光束的穿透深度约为135μm，艾里一级光束的穿透深度约为286μm，则艾里一级光束的穿透深度约为高斯光束的2倍，且艾里一级光束的衰减速率(由曲线倾斜角度反映)比高斯光束的衰减速率低，衰减速率低则抗散射能力更强，总体分析可知，对于浑浊介质(非透明介质)艾里一级光束比高斯光束具有更大的穿透深度及更好的抗散射能力。

图5为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的效果示意图。具体的，采用高斯光束、艾里一级光束及艾里二级光束对hela细胞(海拉细胞)进行单光子成像得到的成像图像如图5所示，其中，图5-a是采用高斯光束(激发光波长635nm，100倍物镜)以0.5μm轴向步长(每一帧图像均沿z轴轴向进深0.5μm)、扫描了15μm厚的薄层所得到的成像图像，具体过程为使用高斯光束的单帧图像记录每一细胞薄层，获取在15μm厚度范围内的30帧单帧图像进行堆叠得到三维堆叠图像(分辨率为512*512)作为最终的成像图像，获取成像图像的整个过程耗时约1分钟，由于成像时间较长，这种成像方法无法进行快速成像以对动态事件进行观察；图5-b及图5-c分别是采用艾里一级光束(激发光波长635nm，100倍物镜)和艾里二级光束(激发光波长635nm，100倍物镜)对样品进行荧光成像所得到的单帧荧光图像，由于艾里光束具有焦深拉长的特点，艾里一级光束模式下通过一个单帧2d扫描可以对同体积内的大多数细胞进行成像，细胞的细微结构也清晰可见，艾里二级光束模式下进行单帧2d扫描成像则能够获取细胞的更多细节结构，艾里光束成像与高斯光束成像所得到的成像图像的横向分辨率几乎相同，然而通过艾里光束进行单帧2d扫描成像，整个成像过程只需要1秒，从而可以大幅提高成像速度。

图6为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统的效果示意图。采用高斯光束、艾里一级光束及艾里二级光束对转基因斑马鱼血管进行双光子体成像得到的成像图像如图6所示，其中，图6-a是采用高斯光束(激发光波长780nm，10倍物镜)以1μm轴向步长(每一帧图像均沿z轴轴向进深1μm)、扫描了28μm厚的鱼体所得到的成像图像，与单光子成像相比，双光子体的成像深度更深，双光子体的成像深度约是单光子体的2倍，具体过程为使用高斯光束的单帧图像记录每一鱼体薄层，获取在28μm厚度范围内的28帧单帧图像进行堆叠得到三维堆叠图像(分辨率为512*512)作为最终的成像图像；图5-b及图5-c分别是采用艾里一级光束(激发光波长780nm，10倍物镜)和艾里二级光束(激发光波长780nm，10倍物镜)对样品进行荧光成像所得到的单帧荧光图像，对图像分析可知，艾里一级光束成像及艾里二级光束成像不仅能够覆盖高斯光束成像模式下28帧堆叠成像图像中所包含的图像信息，而且细节更加显著，鱼体血管的脉络分布也更加清晰，也即是能够获取到更清晰的成像图像及更深层的结构。

请参阅图7，图7为本发明实施例提供的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像方法的方法流程示意图。本发明实施例还提供了一种基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像方法，其中，所述基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像方法应用于上述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，如图7所示，所述方法包括步骤s110-s170。

s110、开启所述飞秒激光器产生飞秒脉冲型激发光并经所述单模保偏光纤整形后输出标准高斯光。其中，所述飞秒激光器产生的飞秒脉冲型激发光的波长为600-1300nm。

s120、所述标准高斯光经所述第一光路传输至所述半波片进行偏振方向调整后得到线偏振高斯光传输至所述空间光调制器。

s130、所述空间光调制器对所述线偏振高斯光进行调制得到艾里光，并经所述第二光路传输至所述扫描阵镜进行同步扫描后传输至所述双色镜。其中，所述艾里光为艾里一级光束、艾里二级光束或艾里三级光束。

s140、所述双色镜对同步扫描后得到的激发光进行透射传输至所述物镜，并经所述物镜聚焦照射于所述三维移动平台的所述样品上。

s150、控制所述三维移动平台驱动所述样品进行三维移动以通过透射传输的激发光对所述样品进行扫描照射。

s160、所述物镜收集所述样品反射的荧光信号并经所述双色镜反射至所述光电倍增管进行放大处理，得到荧光放大信号后输出至所述成像处理终端。其中，所述荧光放大信号为波长665-715nm的荧光信号。

s170、所述成像处理终端获取所述荧光放大信号进行处理得到荧光图像。

在本发明实施例所提供了一种基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统及成像方法，系统包括信号采集装置及成像处理终端，信号采集装置包括：飞秒激光器、单模保偏光纤、半波片、空间光调制器、扫描阵镜、物镜、双色镜、三维移动平台及光电倍增管。上述的基于超长无衍射光的大深度荧光显微成像系统，通过飞秒激光器产生飞秒脉冲型激发光经单模保偏光纤进行整形得到标准高斯光，经半波片调整得到线偏振高斯光后经空间光调制器调制得到艾里光，对艾里光进行同步扫描后聚焦照射样品以激发产生荧光信号，收集荧光信号进行放大后处理得到荧光图像；利用艾里光具有较大穿透深度和宽度的特点以显著扩展对生物组织进行轴成像的范围，从而实现单帧捕获体积图像，能够得到清晰的成像图像及深层结构，且极大提高了成像速度。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。