试样观察装置及试样观察方法与流程

本公开涉及一种试样观察装置及试样观察方法。

背景技术：

1、作为目前的试样观察装置，例如列举荧光观察显微镜。在荧光观察显微镜中，将选择性地化学结合的色素注入试样内的靶(target)，观察由激发光的照射引起的来自靶的荧光。但是，在荧光观察显微镜中，在试样为生物体的情况下，需要考虑侵袭性。例如需要充分顾虑：对生物体的色素的安全性、具有比较高的能量的可见域的激发光的处理。

2、近年来，代替目前的荧光观察，着眼于基于多光子激发或高次谐波产生这种现象的非线性光学显微镜。在非线性光学显微镜中，例如使用波长700nm～1700nm程度的近红外光。近红外光与可见光相比能量低，因此，非线性光学显微镜的侵袭性比较低。另外，多光子激发、高次谐波产生，有时在没有染色的情况下产生。在不需要试样的染色的观点下，也可以说非线性显微镜的侵袭性低。具有以下功能的显微镜被称为多模态(multi-modal)显微镜，即，能够通过辨别基于多光子激发、高次谐波产生这种多观测方式(modality)的光响应，来识别多个不同的靶。

3、作为关于非线性光学显微镜的技术，例如存在记载于非专利文献1、2的方法。在非专利文献1中，一边改变照射于试样的光的波长，一边进行摄像，从试样的图像提取仅单一的靶发光的部分，进行将该提取部分的激发光谱作为基准的分离处理。在非专利文献2中，按每个脉冲调制照射于试样的光的偏振光，观察老鼠的尾巴的胶原蛋白的取向方向。

4、现有技术文献

5、非专利文献

6、非专利文献1：andrew j.radosevich et al.,“hyperspectral in-vivo two-photon microscopy of intrinsic fluorophores”biomedical optics 2008,osatechnical digest(cd)paper bwg7.pdf

7、非专利文献2：ximeng y.dow et al.,“imaging the nonlinear susceptibilitytensor of collagen by nonlinear optical stokes ellipsometry”biophysicaljournal 111,1361－1374,october 4,2016

技术实现思路

1、发明所要解决的技术问题

2、在上述的多模态观察中，为了使多个光子同时被靶吸收，不使用通常的激光，而使用超短脉冲光是大前提。近年来，正进行产生超短脉冲光的光源的开发。另一方面，在实现多模态观察时，不使用靶的染色提高了装置构筑的困难性。

3、具体地，在目前的多模态观察中，由于使用与多个不同的观察方式对应的宽波长的脉冲光，因此，需要将与观察方式的数量对应的多个光源组装到装置。另外，为了辨别来自试样的不同的波长的光的各个，因此，需要将分色镜等波长分离元件或光检测器与观察方式的数量对应地组装到装置。考虑到装置的用户不一定是光的专家，典型的多模态观察的装置由于光学系统变得复杂而成为对于用户来说难以处理的装置。

4、另外，也另外存在：为以简单的结构实现多模态观察的问题。例如，在用单一的超短脉冲激光进行多模态观察的情况下，为了实施根据多个方式的观察，需要进行波长的切换。在该波长的切换时，由于产生有限的时滞(time lag)，因此，基于波长的切换的试样的实时观察是困难的。因此，考虑：例如通过将波长设定在用于多个观察方式的理想的波长的平均附近，同时实施基于全部的方式的观察。但是，在该方法中，由于关于各观察方式使用偏离最适波长的激发光，因此，为了进行s/n比良好的观察，不得不提高脉冲光的能量，作为结果，提高了试样的侵袭性。

5、本公开是为了解决上述问题而完成，其目的在于，提供一种能够以简易的光学系统实施试样的多模态观察的试样观察方法及试样观察装置。

6、用于解决问题的技术方案

7、本公开的一个方面的试样观察装置具备：光源部，其将中心波长不同的多个脉冲光以规定的时间间隔排列的脉冲列作为激发光输出；测定部，其一边对试样扫描激发光，一边对与包含于脉冲列的各脉冲光的照射对应的、来自试样的光响应进行时间分辨测定，取得对各脉冲光的测定数据；以及处理部，其基于包含于试样的每个靶的激发光谱，将线性分离处理实施于对各脉冲光的测定数据。

8、在该试样观察装置中，形成中心波长不同的多个脉冲光以规定的时间间隔排列的脉冲列。通过将多个脉冲光的中心波长的各个应用于各观察方式，不需要与观察方式的数量对应的多个光源的配置。另外，在该试样观察装置中，对与各脉冲光的照射对应的、来自试样的光响应进行时间分辨测定，基于包含于试样的每个靶的激发光谱，将线性分离处理实施于对各脉冲光的测定数据。由此，不一定要配置与观察方式的数量对应的波长分离元件和光检测器。另外，通过使用线性分离处理，能够原理上回避得到的关于各靶的观察像间的串扰。因此，在该试样观察装置中，能够用简易的光学系统实施试样的多模态观察。

9、也可以是，光源部，通过根据时间调制从单一的光源生成的脉冲光的中心波长，生成脉冲列。由此，能够使光学系统更简易。

10、也可以是，在光源部，使用根据输入强度改变输出波长的孤子自频移，生成脉冲列。在该情况下，例如能够使用光纤激光器简便地实施脉冲光的每个波长的时间调制。因此，实现装置的简化。

11、也可以是，处理部预先保有：在试样对包含于脉冲列的多个脉冲光仅特定的靶发光的区域的激发光谱，基于该激发光谱将线性分离处理实施于对各脉冲光的测定数据。在该情况下，通过预先保有从与实际的试样同等的试样得到的激发光谱，能够充分确保线性分离处理的精度。因此，能够更适当地回避得到的测定数据间的串扰。

12、也可以是，试样观察装置还具有：图像生成部，其基于实施了线性分离处理的测定数据，生成关于特定的靶的观察像。由此，能够在抑制串扰的状态下得到关于各靶的观察像。

13、也可以是，图像生成部生成将关于特定的靶的观察像重叠的重叠图像。在该情况下，由于关于各靶的观察结果汇总为一个图像，因此，能够提高解析观察结果时的便利性。另外，也能够应对如通过多个观察方式能够观察的现象。

14、也可以是，测定部具有：对来自试样的光进行时间分辨测定的多通道的检测部。根据该结构，即使在包含于激发光的脉冲光的波长的数量少于试样的靶的数量的情况下，也能够实施试样的多模态观察。

15、本公开的一个方面的试样观察方法具备：输出步骤，将中心波长不同的多个脉冲光以规定的时间间隔排列的脉冲列作为激发光输出；测定步骤，一边对试样扫描激发光，一边对与包含于脉冲列的各脉冲光的照射对应的、来自试样的光响应进行时间分辨测定，取得对各脉冲光的测定数据；以及处理步骤，基于包含于试样的每个靶的激发光谱，将线性分离处理实施于对各脉冲光的测定数据。

16、在该试样观察方法中，形成中心波长不同的多个脉冲光以规定的时间间隔排列的脉冲列。通过将多个脉冲光的中心波长的各个应用于各观察方式，不需要与观察方式的数量对应的多个光源的配置。另外，在该试样观察装置中，对与各脉冲光的照射对应的、来自试样的光响应进行时间分辨测定，基于包含于试样的每个靶的激发光谱，将线性分离处理实施于对各脉冲光的测定数据。由此，不一定要配置与观察方式的数量对应的波长分离元件和光检测器。另外，通过使用线性分离处理，能够原理上回避得到的关于各靶的观察像间的串扰。因此，在该试样观察装置中，能够用简易的光学系统实施试样的多模态观察。

17、也可以是，在输出步骤中，通过根据时间调制从单一的光源生成的脉冲光的中心波长，生成脉冲列。由此，能够使光学系统更简易。

18、也可以是，在输出步骤中，使用根据输入强度改变输出波长的孤子自频移，生成脉冲列。在该情况下，例如能够使用光纤激光器简便地实施脉冲光的每个波长的时间调制。

19、也可以是，在处理步骤中，预先保有：在试样对包含于脉冲列的多个脉冲光仅特定的靶发光的区域的激发光谱，基于该激发光谱将线性分离处理实施于对各脉冲光的测定数据。在该情况下，通过预先保有从与实际的试样同等的试样得到的激发光谱，能够充分确保线性分离处理的精度。因此，能够更适当地回避得到的测定数据间的串扰。

20、也可以是，试样观察方法还具有：图像生成步骤，基于实施了线性分离处理的测定数据，生成关于特定的靶的观察像。由此，能够在抑制串扰的状态下得到关于各靶的观察像。

21、也可以是，在图像生成步骤中，生成将关于特定的靶的观察像重叠的重叠图像。在该情况下，由于关于各靶的观察结果汇总为一个图像，因此，能够提高解析观察结果时的便利性。另外，也能够应对如通过多个观察方式能够观察的现象。

22、也可以是，在测定步骤中，通过多通道检测，对来自试样的光响应进行时间分辨测定。根据该结构，即使在包含于激发光的脉冲光的波长的数量少于试样的靶的数量的情况下，也能够实施试样的多模态观察。

23、发明的效果

24、根据本公开，能够用简易的光学系统实施试样的多模态观察。