一种移频无标记远场超分辨光学宽场显微成像方法

1.本发明属于显微成像领域，涉及一种移频无标记超分辨显微成像方法，具体涉及一种移频无标记远场超分辨光学宽场显微成像方法。


背景技术：

2.传统光学系统受到阿贝衍射极限的限制。如何提高空间分辨率至100nm以下甚至分子尺度、实现高对比度的超分辨显微成像成为了光学显微成像技术的主要研究方向之一。超分辨显微成像技术分为荧光标记和非荧光标记法。超分辨荧光显微技术能将空间分辨力提升至纳米量级，但超分辨荧光显微技术过分依赖于荧光染色剂，与此同时荧光染色剂在标记样本的时候存在时间消耗过长、灭活、染色不均、光照漂白等多个问题，限制了超分辨荧光显微技术应用发展。更令人担忧的是每当样本为无法染色的微纳米结构材料或集成电路芯片等非生物样品时，超分辨荧光显微技术不再适用。
3.无标记显微成像技术中，移频技术可以突破传统成像与探测器件的带宽限制，在视场大、速度快上具有显著优势。移频无标记超分辨显微方法利用倏逝波照明将样品的高频空间信息平移到显微镜能接收到的低频通带范围内，通过频谱拼接算法将高低频频谱拼接，恢复出超分辨光学显微图像。移频无标记超分辨显微方法无需荧光标记，可以实现对非生物样品的超分辨成像，具有广泛的应用前景。
4.目前已有的移频无标记超分辨显微技术有纳米光纤照明超分辨技术、纳米线环状照明超分辨显微技术、波导光栅照明超分辨显微技术，现有的以上方法都属于局域照明方式，照明场面积有限，其产生的倏逝波激发效率有限，空间频谱不够纯净，受限于基底介质材料的折射率，其横向分辨率提高能力有限。此外，这些方法在实用化方面还存在着一定的难度，例如纳米线环状照明方法不利于进行大规模集成化生产。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种移频无标记远场超分辨光学宽场显微成像方法，该方法基于金属/介质多层膜结构材料激发的大面积均匀高频体等离激元(bpps)模式场对样品进行移频照明，通过调节照明波矢获得多幅包含样品低频和高频信息图像，对一系列频谱有所重叠的图片强度分布在频域空间进行迭代拼接，得到覆盖了在最大可探测波矢范围内的物空间频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的无变形样品显微图像。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.一种移频无标记远场超分辨光学宽场显微成像的照明器件，从下到上依次包括透明基底层、激发光栅、金属/介质多层膜结构层，其中：
8.透明基底层上加工有激发光栅，激发光栅上设置有金属/介质多层膜结构层，金属/介质多层膜结构层由金属膜层和介质膜层交替堆叠而成；
9.照明光源从透明基底背面照射至激发光栅表面，光栅结构激发的高频衍射子波仅
kx
max
,-kx
min
]与[kx
min
,kx
max
]、照明光源波长带宽的设计规则如下：
[0026]
1)设计激发光栅周期使得kg位于工作波长λ下bpps窗口的[kx
min
,kx
max
]中；
[0027]
2)入射角度θ范围的选取：在工作波长λ下，选择nsinθk0+kg位于对应波长bpps窗口[kx
min
,kx
max
]中，同时满足对于不为1的任何正负整数m，nsinθk0+mkg位于两个bpps窗口外；
[0028]
3)针对照明光源波长带宽内的任何角度和波长组合的设计规则均满足规则2)；
[0029]
本步骤中，也可设计激发光栅结构配合金属/介质多层膜层结构中bpps的空间滤波窗口，使得+2级次滤出实现高频bpps场的激发；
[0030]
本步骤中，上述规则适用于一维激发光栅的情况，当采用二维激发光栅时，仍遵照上述设计方式，二维激发光栅在各个方向上都满足该方向高频bpps的激发，但是需要重新设计光栅结构例如光栅圈组，然后配合光栅方向选择合适的方向角照明，仍旧只滤出1个级次；
[0031]
步骤二、将显微成像的样品置于金属/介质多层膜结构层之上；
[0032]
步骤三、采用多种波长激光(不同激光波长范围《400nm)或者宽波带小发散角的可见光光源(光源波长带宽《400nm)作为照明光源，从透明基底层底部中心沿步骤一中设计的入射角度θ倾斜照明激发光栅，最大角度调节范围0
°
～90
°
，光栅结构激发的高频衍射子波在金属/介质多层膜结构的空间频谱滤波之后，激发大面积、均匀的高频bpps模式场，基于金属/介质多层膜结构材料激发的大面积均匀高频bpps模式场对样品进行移频照明，通过调节照明波矢获得多幅包含样品低频和高频信息图像，对一系列频谱有所重叠的图片强度分布在频域空间进行迭代拼接，得到覆盖在最大可探测波矢范围内的物空间频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的无变形样品显微图像，其中：
[0033]
照明波矢量将根据该照明器件在不同波长下的工作性能实现调节；
[0034]
照明光源入射角度及波长变化会带来bpps的波矢改变，通过改变不同入射角度及波长，可以获得多幅不同bpps独立照明下的图像；bpps波矢的调节范围需要包含低频和高频，此时可探测空间频谱范围也会随着bpps波矢而发生平移，根据不同bpps对应的探测频谱做频谱复原。
[0035]
本发明中，照明光源可以为非相干、自然偏振光、激光，波段范围紫外至可见光。
[0036]
本发明中，单色光源可以为引入滤波片的汞灯﹑纳黄灯、单色led灯或氩灯。
[0037]
本发明中，照明光源为红外波段光源时，可采用相应工作波段下的双曲色散材料替代金属/介质多层膜结构材料实现空间滤波特性。
[0038]
本发明中，通过配合多波长、多照明角度提供不同波矢大小的照明bpps，照明样品时远场分别采集相应的低频、高频空间信息，对一系列频谱有所重叠的图片强度分布在频域空间进行迭代拼接，得到覆盖了在最大可探测波矢范围内的物空间频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的无变形样品显微图像。
[0039]
本发明中，金属/介质多层膜结构中的金属可以为良导体材料:au、ag或al，厚度为10nm以上；介质可以为低损耗的光学膜层材料，包括但不限于sio2，可包含更高折射率材料如sic等，厚度为10nm以上。
[0040]
本发明中，激发光栅所用材料可以为n》2的高折射率介质，或采用金属，包括不限于ag、si、cr或cu。
[0041]
本发明中，激发光栅用于对照明光进行空间频谱的调制，其结构包括但不限于一
维金属结构、二维金属结构、一维高折射率介质光栅结构、二维高折射率介质光栅结构，还可以为不透光材料(金属材料等)组成的分布均匀的纳米结构，可以是一维纳米结构或二维纳米结构，其尺寸和间距不大于照明光波长，形状可以为规则的几何体如环形光栅结构或不规则的任意面型。
[0042]
本发明中，改变激发光栅中纳米结构的尺寸和间距可以调节激发衍射子波的空间频率和透射效率。
[0043]
本发明中，改变金属/介质多层膜结构中的金属材料和介质材料或者改变金属膜层与介质膜层的厚度或者改变金属/介质多层膜结构的膜对数，可以调整空间带通滤波的窗口位置及截止频率。
[0044]
本发明中，金属/介质多层膜结构最上部的金属膜层外可单独施加一层透明介质层作为保护层，其厚度为10nm～40nm。
[0045]
本发明中，激发光栅采用磁控溅射、ebl、fib、光刻或纳米压印制备，填平采用翻转工艺或填平工艺，金属/介质多层膜结构采用磁控溅射、热蒸发等镀膜技术进行制备。
[0046]
本发明的原理如下：
[0047]
单色横磁平面波从基底背面照射至激发光栅表面，光栅结构激发的高频衍射子波在金属/介质多层膜结构的空间频谱滤波之后，激发大面积、均匀的高频bpps模式场。bpps模式源于由金属/介质多层膜结构中相邻金属/介质层界面处存在的表面等离激元模式(sps)场相互耦合产生。异于sps模式局域在金属膜层表面的特性，bpps模式贯穿于整个三维人工电磁超材料空间中，在金属/介质多层膜结构内部呈现空间上的超衍射传输特性，在离开金属/介质多层膜结构时呈现指数衰减，此时表现出倏逝波特性，通过对金属/介质多层膜结构的设计，该bpps的波矢将远高于全反射产生的倏逝波的波矢。基于等效介质理论(emt)，金属/介质多层膜结构近似为双曲色散特性的各向异性介质，对空间频率k
x
具有高通滤波特性，低频bpps模式以及局域在金属层表面的sps模式无法在人工电磁超材料中传输，仅有高于截止频率的高频bpps模式才能透过金属/介质多层膜结构，作为照明场可用于照明样本。当采用光栅等纳米结构时，照明后产生的高频衍射子波可耦合至金属/介质多层膜结构中的bpps模式。通过设计大面积光栅等纳米激发结构配合金属/介质多层膜结构，可激发出大面积、均匀的高频bpps模式场，用于无标记样品的宽场显微成像照明源。通过配合多波长、多照明角度提供不同波矢大小的照明bpps，照明样品时远场分别采集相应的低频、高频空间信息，对一系列频谱有所重叠的图片强度分布在频域空间进行迭代拼接，得到覆盖了在最大可探测波矢范围内的物空间频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的无变形样品显微图像。
[0048]
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
[0049]
1、本发明直接在整块的透明基底材料上采用大面积紫外干涉光刻技术等方法制备激发光栅结构，其特点是通过设计大面积光栅等纳米激发结构配合金属/介质多层膜结构，可激发出大面积、均匀的高频bpps模式场，用于无标记样品的宽场显微成像照明源，其横向波矢远高于波导等介质材料所支持的倏逝波波矢，分辨力大幅提升，理论估算其分辨力提升至λ/7.82，约为普通显微镜的4倍；
[0050]
2、本发明通过光栅结构位于整块基底材料以上，可实现宽场照明；
[0051]
3、照明结构与样品能够有效分离，可以在不破坏照明结构的情况下清洗成像区
域，有利于照明结构的重复利用；
[0052]
4、该方法有利于集成化大规模生产，降低成本；
[0053]
5、本发明具有原理新颖、结构简单、易于操作、工作带宽宽、效率高、成本低等优点，为实现更高质量的无标记光学显微成像开拓了新思路。
附图说明
[0054]
图1为本发明照明器件的结构示意图，图中：1-透明基底层，2-激发光栅，3-介质膜层，4-金属膜层，5-样本。
[0055]
图2为本发明照明器件的无标记显微成像示意图。
[0056]
图3为本发明实施例l bpps激发结构示意图，(a)bpps激发结构示意图；(b)tm与te偏振下ag/sio2金属/介质多层膜结构otf；(c)-1、0与+1级次的otf；(d)不同衍射级次的otf比值。
[0057]
图4为本发明实施例1中心距100nm双缝结构在bpps照明下的远场成像仿真过程与结果，(a)采用fdtd方法截面处监视器记录的bpps结构表面倏逝波被散射到远场的x-z截面光强分布；(b)中心距100nm双缝结构的远场成像光强分布；(c)双缝结构的频谱；(d)远场探测到的双缝结构散射光频谱。
[0058]
图5为本发明实施例1中双缝中心距变化下远场成像对比度，(a)80～120nm中心距变化下，远场对比度变化曲线；(b)中心距90-110nm的双缝结构远场成像归一化强度。
[0059]
图6为本发明实施例1中ag/sio2金属/介质多层膜结构380～780nm波长范围内的otf。
[0060]
图7为本发明实施例2中横向波矢3.86k0的bpps照明下超分辨无标记成显微像，(a)tm偏振入射双曲色散材料的otf；(b)-1、0与+1级次的otf；(c)中心距68nm双缝结构的远场成像光强分布。
具体实施方式
[0061]
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0062]
实施例1
[0063]
本实施例以能够产生一个2.66k0的纯净bpps照明场，并用于中心距为100nm双缝微纳结构照明实现远场无标记显微成像的器件为例。
[0064]
照明光为波长为532nm的tm平面波，器件由下到上依次为sio2基底、周期性亚波长ag光栅、ag/sio2金属/介质多层膜结构。bpps激发结构设计如图3(a)所示，其中金属/介质多层膜结构由10层20nm厚的ag膜和9层50nm厚的sio2膜交替堆叠而成，周期性亚波长ag光栅的周期为170nm，厚度为40nm，占空比为1:1。在532nm波长下，ag和sio2的介电常数分别为-10.18+0.83i、2.13。
[0065]
在显微成像的过程中，照明物体激发出散射光，其中携带有样本的高频空间结构信息。远场收集到的参与成像的散射光和物体空间结构信息之间的关系可利用埃德瓦尔反射球模型近似解释，其表达为物体散射势在照明波矢下的傅里叶空间频谱与一个低通函数
的乘积，其中低通函数为1的取值范围为|ks|《nak0，ks为散射光的横向波矢，k0＝2π/λ为物空间光波矢，na为物镜的数值孔径。传统照明光通过倾斜照明，横向波矢k
x
最大为nak0，如图2(a)，由图中虚线标示，灰色阴影区域范围为远场可探测到散射光ks的取值范围，远场可探测最大范围可到2nak0，但因为高阶傅里叶分量的丢失，导致其远场成像分辨力受限于衍射极限。当采用倏逝波照明时，由于其横向波矢k
eva
大于k0，远场散射场所携带频谱中心搬移至细实线处，如图2(b)斜线阴影区域所示，使得远场可探测最大空间频率扩展至粗实线圆，为k
eva
+nak0。此时倏逝波照明物体时成像系统截止频率以外更多的高频信息被平移至成像系统的通带内参与成像，使整个光学系统最大可探测空间频率拓展，从而克服衍射极限，显著提升显微远场成像分辨力。一般倏逝波激发方法中，k
eva
受限于波导或介质材料折射率，因此bpps提供了一种具有更高横向空间波矢的照明源。图2(d)为bpps照明样本成像示意图，其中bpps照明源由ag/sio2组成双曲色散材料结合亚波长光栅构成。特定角度下入射tm偏振波，照射亚波长光栅激发包含高频衍射波的多个衍射级次子波，通过双曲色散材料实现空间频谱滤波，滤除杂散级次，从而在出射面激发出大面积单一波矢的纯净bpps场，其照明物体可以将高频空间信息平移至远场探测成像系统的通带中，从而提高成像分辨率。
[0066]
利用严格耦合波分析方法详细分析高频bpps激发结构的滤波特性，当一个tm偏振光照射金属/介质多层膜结构时，如图3(b)粗实线，此时otf呈现一个窗口为[-3.12k0，-1.46k0]、[1.46k0，3.12k0]的空间频谱带通滤波通带，意味着满足该范围的高频波矢能够在双曲色散材料中传播，而te偏振光入射时，如图3(b)细实线所示，此时整体透过率近似为0。当加载亚波长纳米激发光栅后，在tm波照射下将激发多个级次衍射子波，其横向波矢可由光栅公式决定，表达为：
[0067]kx,m
＝k
inc
+mkg；
[0068]
其中，m为衍射子波级次，且
[0069]kinc
＝nsinθk0；
[0070][0071]
正入射时，-1、0、+1级次横向波矢分别为-3.12k0、0k0、3.12k0，位于通带外，无法传播至出射界面；当增大入射角度时提供一个更大的横向波矢量k
inc
，使得-1级次移入通带内，同时0级次和+1级次仍在通带外，从而滤出纯净的-1级次。图3(c)展示了在不同角度入射下-1、0、+1级次的otf，可以看出在0
°
至90
°
范围内，-1级次能够被选用耦合进双曲色散材料，而其他级次相对受到抑制。49
°
时其他级次也被耦合进双曲色散材料中，如图3(d)，这是源于0级次波矢约为1.1k0，在双曲色散材料的otf中该波矢位置存在一个局域的sps模式，因此为保证-1级次波矢滤出纯净，选择可用入射角度为3
°
到90
°
。
[0072]
本实施例以双缝物体为例，借助时域有限差分方法，图4显示了一个cr膜上的双缝结构在bpps照明下远场成像的建模过程与结果。双缝结构中心距为100nm，单缝宽为50nm，物镜na＝0.85，照明波长为532nm，根据衍射极限可知在传统照明下物体无法被分辨。当采用如图3(a)的横向波矢为2.66k0的bpps照明时，图4(a)展示了采用fdtd方法建立模型的截面场强分布，bpps模式在双缝结构处受到调制，向远场散射。导出fdtd方法模型中的远场散射光的场分布，采用角谱衍射理论逆向计算远场成像如图4(b)，可知此时在bpps照明下该双缝能够被分辨。本实施例还对远场散射光场的频谱分布进行分析。如图4(c)和4(d)所示，
对于双缝结构的频谱，传统照明下远场可探测的散射光频谱范围在以原点为中心，na/λ为半径的区域，图4(c)中虚线圈所示。bpps照明下远场散射光场分布频谱如图4(d)，与双缝结构在中心为(k
bpps
/2π，0)、半径为na/λ范围内的频谱分布一致。该结果证实了频谱向bpps波矢方向平移了一个k
bpps
的距离，产生了移频效应。另外，对于同一波矢2.66k0，还对该bpps照明下不同中心距的双缝成像效果进行了模拟测试。图5展示了在横向波矢量2.66k0下不仅仅对双狭缝中心距100nm具有分辨能力，根据瑞利准则，在95至110nm范围内bpps都能分辨双缝结构。同时这也是它局限性所在，每个横向波矢量对应了一个能最佳分辨的(此处为双狭缝中心距)较小分辨区间。
[0073]
本实施例在宽带波长范围内的工作性能在可见光范围(380～780nm)范围内也有良好表现。图6显示了在可见光范围(380～780nm)内金属/介质多层膜结构的光学传递函数。从中可以看出，otf窗口下限几乎不随入射波长而变化，其上限将随着入射波长的增加而缓慢减小。同时发现在可见光波段内均可激发高频空间波矢bpps模式。另外，通过优化照明结构材料及参数还可将工作波长拓展至紫外光波段，或在部分波段拓展成低频透过。对于红外波段，可采用双曲超材料替代金属/介质多层膜结构材料实现相应的滤波特性。
[0074]
实施例2：
[0075]
本实施例中，更高波矢的高频bpps可通过进一步改变金属/介质多层膜结构及激发光栅结构参数，采用工作方式b优化改进了亚波长光栅以及金属/介质多层膜结构的厚度与层数，波长为532nm。该器件由下到上依次为sio2基底、周期性亚波长ag光栅以及ag/sio2金属/介质多层膜结构。8对ag/sio2金属/介质多层膜结构厚度为27nm/15nm，外加一层27nmag膜。其otf如图7(a)所示，532nmtm波入射下滤波通带为[-4.65k0，-2.15k0]和[2.15k0，4.65k0]。当加载周期为187nm的激发光栅时，-1、0、+1级次otf如图7(b)所示，可知在该光栅周期下改变照明角度滤出+1级次波矢。选取44
°
为入射角度时，+1级次波矢为3.86k0。当照明中心距为68nm双缝结构时，成像场强如图7(c)，证明该更高横向波矢的bpps照明能够显著提高远场成像分辨力。
[0076]
本发明可通过在实施例1、实施例2的基础上，通过配合多波长、多照明角度提供不同波矢大小的照明bpps，照明样品时远场分别采集相应的低频、高频空间信息，对一系列频谱有所重叠的图片强度分布在频域空间进行迭代拼接，得到覆盖了在最大可探测波矢范围内的物空间频谱，最后进行反傅里叶变换重构出超分辨的无变形样品显微图像。经过理论估算，分辨力最高可提高至约为普通显微镜的4倍。