再扫描光学系统、显微镜及方法与流程

本发明涉及再扫描光学系统和方法。

背景技术：

1、从de luca gm，breedijk rm、brandt ra等人的“re-scan confocal microscopy:scanning twice for better resolution(再扫描共焦显微镜：扫描两次以获得更好的分辨率)”，biomed opt express.(《生物医学光学快报》)2013年；4(11):2644–2656，出版于2013年10月25日，doi:10.364/boe.4.002644，认识了一种再扫描共聚焦显微镜，以下简称“de luca”。这种显微镜有两个单元：1)具有一组扫描反射镜的标准的共焦显微镜，该组扫描反射镜具有双重功能：扫描激发光和反扫描样品光，以及2)将穿过针孔的光“写入”相机的再扫描单。通过控制各个扫描反射镜和再扫描反射镜的角振幅的比率，能够控制显微镜的特性。

2、在这样的再扫描系统中，重要的是扫描和再扫描反射镜执行同步动作。优选地，扫描反射镜的每次扫描在再扫描反射镜的相应扫描开始、各自结束时恰好开始、各自结束。如果扫描和再扫描反射镜异步移动，则获得的图像会有较低的质量。如将理解的，在更高的扫描速度下，反射镜移动得更快，并且用于同步的可接受的绝对误差容限变得更小。由于deluca的系统中反射镜的同步程度是有限的，因此扫描速度也受到限制。

3、类似的系统也在b.straub benedikt等人的“versatile high-speed confocalmicroscopy using a single laser beam(使用单个激光束的通用高速共焦显微镜)”，rev.sci.lnstrum.(《科学仪器评论》)，91,033706(2020)；doi 10.1063/1.5122311，每个方向使用两个扫描元件(fx,fy)；g.steinbach等人的“fluorescence-detected lineardichroism imaging in a re-scan confocal microscope equipped with differentialpolarization attachment(在配备差分偏振附件的再扫描共焦显微镜中进行荧光检测线性二色性成像)”，european biophysics journal(《欧洲生物物理学杂志》)(2019)48:457-463；doi 10.1007/s00249-0l 9-0l365-4，其使用上述de luca(2013)的系统；g.m.r.deluca等人的“configurations of the re-scan confocal microscope(rcm)forbiomedical applications(用于生物医学应用的再扫描共焦显微镜(rcm)的配置)”，j.microscopy(《显微镜学期刊》)266(2)2017.pp,166-177doi:10.1111/jmi.12526；以及wo2018/127566a1中进行了描述。

4、为了克服这种同步问题，单个扫描反射镜既可以用于扫描激发光，激发光更通常地称为照明光，也可以用于再扫描荧光，荧光更通常地称为样品光。例如，roth等人的“optical photon reassignment microscopy(opra)(光学光子再分配显微镜(opra))”，optical nanoscopy(《纳米光学显微镜》)2013 2:5，以下简称“roth”，公开了一种光学光子再分配显微镜。在这种显微镜中，激光器发出488nm的激发光，该激发光被引导到二色性分束器，该分束器将激发光反射到扫描单元上。扫描单元将激发光扫描到物镜上，物镜将激发光聚焦到样品上。返回的荧光然后被引导回到扫描单元并且被反扫描。随后，荧光使用二色性分束器与激发光分离。在这种分离之后，荧光束穿过能够被用于实现共焦切片的可调节检测针孔。针孔位于展开荧光束的两个透镜之间。在展开之后，荧光束使用相同的扫描系统进行再扫描，并且经由透镜被投影到相机。

5、后一种显微镜设置的缺点是，因为扫描和再扫描都使用相同的扫描系统，所以光学设置相当大：反扫描的荧光光束被引导到扫描系统周围，然后被引导到将荧光光束再扫描到相机上的扫描系统上。

6、wo 2020/263094公开了一种再扫描显微镜，其依赖于包括至少两个不平行反射表面的可旋转元件。

7、鉴于上述情况，本领域需要更紧凑的光学再扫描系统。

技术实现思路

1、鉴于上述情况，在此提供下文所述的再扫描光学系统。

2、在一个方面中，再扫描光学系统包括扫描元件和第一光学元件，第一光学元件定义通向扫描元件的入射照明光束路径，该入射照明光束路径用于将一束照明光引导到扫描元件上以提供来自扫描元件的扫描照明光束；

3、第二光学元件，其定义扫描光束路径，所述扫描光束路径用于将来自扫描元件的扫描照明光束引导向样品并且照明样品从而产生样品光，以及用于将一束捕获的样品光(“扫描样品光束”)引导到扫描元件上以从扫描元件提供反扫描的样品光束；

4、第三光学元件，其定义用于从扫描元件将至少一部分反扫描的样品光束引导返回到扫描元件上以提供来自扫描元件的再扫描样品光束的反扫描光束路径；和

5、第四光学元件，其定义用于将再扫描样品光束引导朝向成像系统的成像平面的再扫描光束路径。

6、在该系统中，第三光学元件定义了反扫描光束路径的从扫描元件延伸的第一光束路径段和反扫描光束路径的延伸到扫描元件的第二光束路径段。

7、此外，第四光学元件定义第三路径段，该第三路径段在第一光束路径段和第二光束路径段之间从扫描元件延伸和/或以与扫描样品光路成80-100度范围内的封闭角度从扫描元件延伸。

8、因此，再扫描光学系统可以被构造得紧凑。反扫描的光束路径可以定义系统的尺寸的至少一部分。此外，该系统可以用相对较少的光学元件来构造，这些光学元件可以是简单构造的(反射镜、透镜、滤波器等)。因此，该系统是通用的。

9、再扫描光学系统可以与定义和/或包括成像平面的成像系统和/或与保持样品的显微镜组合。显微镜可以包括物镜，并且扫描光束路径和扫描样品光束路径可以穿过物镜。所提供的再扫描光学系统简化了以小的占用面积和/或在选择性地使用或不使用再扫描光学系统的布置中提供这种组合。这可以特别适用于定义以与扫描样品光路成80-100度范围内，例如成基本上90度的封闭角度从扫描元件延伸的第三路径段的第四光学元件的情况。

10、可选地，第一路径段和第二路径段各自由反射器定义，并且没有用于反射器和扫描元件之间的样品光的光束引导光学元件。反射器可以是用于选择性地反射光束和/或其一部分的分束器，例如二色反射镜和/或偏振相关反射器。

11、该一个或多个光学元件可以是或包括透镜、反射镜、分束器、滤波器、光导管、光纤、棱镜、孔径、电光调制器和/或声光调制器、偏振器和/或其任何合适的组合中的一个或多个。

12、扫描元件可以是定义反射侧的反射器，特别是反射镜，优选地是介质镜。在这种情况下，反扫描光束路径和优选地扫描样品光路和/或再扫描光束路径可以被布置在反射侧，从而允许系统的小占用面积。反射侧可以是由扫描元件的反射表面，例如反射镜表面定义的半空间。

13、所提供的再扫描光学系统可以包括在反扫描光束路径(dsc)中以提高图像质量的空间滤波器。

14、第三光学元件可以包括在其两侧上的孔径和透镜或透镜系统，每个都定义在反扫描光束路径中的焦点。由此形成的焦点可以重叠形成共同焦点，并且孔径可以被布置在共同焦点中。

15、这有利于样品光的空间滤波和/或可以简化共焦显微镜。

16、优选地，扫描元件和透镜或透镜系统中的至少一个，更优选地，透镜和/或透镜系统中的每个沿着反扫描光束路径以相应透镜或透镜系统的焦距分开。在某种意义上，孔径和扫描元件可以被认为是在透镜或透镜系统的相对侧上。

17、这可以在反扫描光束路径中避免另外的透镜或透镜系统，和/或增加第三光学元件的对准的简单性和/或鲁棒性，并且可能增加整个系统和/或与另外的系统组合的系统的对准的简单性和/或鲁棒性。

18、在反扫描光束路径中的透镜和/或透镜系统可以具有相同的焦距。这可以简化系统的设计、制造和对准中的一个或多个。同样或可替换地，由于需要提供更少的不同元件，因此可以降低制造成本。

19、在该系统中，第一光学元件可以包括在入射照明光束中的具有(第一)焦距的透镜或透镜系统，和沿照明光路被布置在距离透镜或透镜系统一个(第一)焦距处的扫描元件。

20、同样或可替换地，第二光学元件可以包括在扫描光束路径中的具有(第二)焦距的透镜或透镜系统，和沿扫描光束路径被布置在距离透镜或透镜系统一个(第二)焦距处的扫描元件。

21、同样或可替换地，第四光学元件可以包括在再扫描光束路径中的具有(第四)焦距的透镜或透镜系统，和沿再扫描光束路径被布置在距离透镜或透镜系统一个(第四)焦距处的扫描元件。

22、这些选项中的任何一个，尤其是其组合，都可以提高光学系统的鲁棒性，尤其是在对准方面。同样，并且特别地，这可以帮助提供入射照明光束路径、扫描光束路径和再扫描光束路径中的一个或多个作为远心光束路径，简化再扫描光学系统与其他光学系统的组合。第一焦距、第二焦距和第四焦距中的至少两个，优选地其中的每个焦距可以相等。

23、因此，在一个方面中，还提供了一种再扫描光学系统，其可选地结合本文所讨论的任何其他实施例，包括：扫描元件和第一光学元件，该第一光学元件定义通向扫描元件的用于将一束照明光引导到扫描元件上以提供来自扫描元件的扫描照明光束的入射照明光束路径；第二光学元件，其定义用于将来自扫描元件的扫描照明光束引导向样品并且照明样品从而产生样品光的扫描光束路径，并且定义用于将捕获的样品光束(“扫描样品光束”)引导到扫描元件上以提供来自扫描元件的反扫描样品光束的扫描样品光路；第三光学元件，其定义用于从扫描元件将至少一部分反扫描的样品光束引导返回到扫描元件上以提供来自扫描元件的反扫描样品光束的反扫描光束路径；和第四光学元件，其定义用于将再扫描样品光束引导朝向成像系统的成像平面的再扫描光束路径。这个再扫描光学系统还相对于扫描光束路径和再扫描光束路径中的至少一个是远心的。优选地，该系统相对于扫描光束路径和再扫描光束路径两者是双远心的。这可以简化再扫描光学系统与其他光学系统的组合，特别是考虑到各种系统的光学对准。这种另外的光学系统可以特别地包括在扫描光束路径中或与之连接的显微镜或显微镜物镜和/或在再扫描光束路径中或与之连接的成像系统。

24、该系统可以被配置为提供用于照明样品并且产生样品光的线形强度分布的照明光。因此，可以同时照明样品的一部分。再扫描光学系统可以被配置为使得该线形强度分布具有垂直于照明光在样品处的扫描方向的主延伸方向，用于照明样品并且使样品光沿着该线形。该主延伸方向可以平行于扫描元件的旋转轴线。因此，通过扫描照明光，可以通过行扫描来扫描样品。

25、第一光学元件可以包括用于定义沿入射照明光束路径的线形强度分布的入射光和/或用于沿扫描照明光束提供具有线形强度分布的光的一个或多个光学元件。

26、入射照明光束路径可以包括定义线形强度分布的一个或多个照明点定义元件。具体地，第一光学元件可以包括该一个或多个照明点定义元件。该一个或多个照明点定义元件可以包括透镜和/或光束掩模；那么，透镜可以例如是或包括鲍威尔(powell)透镜和/或柱面透镜。同样或可替换地，该一个或多个激发点定义元件可以包括一个或多个衍射光学元件，如衍射光栅。第一光学元件可以包括在具有(第一)焦距的在入射照明光束中的透镜或透镜系统。然后，光束掩模，如果提供的话，可以沿着照明光路被布置在距离透镜或透镜系统一个(第一)焦距处并且在透镜或透镜系统前面。同样或可替换地，扫描元件可以沿着照明光路被布置在距离透镜或透镜系统一个(第一)焦距处并且在透镜或透镜系统后面。注意，词语如“前面”和“后面”指的是所讨论的光的传播方向和/或与所讨论的光学元件相关联的光的传播方向。

27、在该系统中，扫描样品光束路径，特别是扫描照明光束路径和/或扫描样品光束路径，以及第三光束路径段可以定义80-100度范围内，优选地85-95度范围内，更优选地约90度的封闭角。这可以简化在显微镜设置中该系统的内含物。例如，该系统可以容易地插入检测物镜和成像系统之间的直角光束线中。此外，这可以简化电缆和/或其他外围部件和部分的布置。

28、注意，这里，两个路径段之间的“封闭角”涉及相应路径段之间相对于路径段的顶点的最小角度。

29、在该系统中，入射照明光束路径和扫描光束路径可以定义小于130度，例如在100-125度范围内，优选地在105-120度范围内，更优选地在110-115度范围内的封闭角。

30、样品光束路径和第一光束路径段可以定义小于130度，例如在100-125度范围内，优选地在105-120度范围内，更优选地在110-115度范围内的封闭角。

31、第一光束路径段和第二光束路径段可以定义小于110度，例如锐角和/或在80-100度范围内，优选地在85-95度范围内，更优选地约90度的封闭角。

32、第二光束路径段和第三光束路径段可以定义90度或锐角的封闭角；该封闭角优选地在90-50度范围内，优选地在80-60度范围内，更优选地在75-65度范围内。

33、扫描元件可以包括定义法线的反射器，优选地反射镜，更优选地介质镜，其中入射照明光束路径、扫描光束路径、扫描样品光束、反扫描光束路径和再扫描光束路径中的每个以与法线成各个角度入射在反射器上和/或以与法线成各个角度被反射器反射，其中相对于法线的该各个角度小于65度，优选地小于60度，更优选地55度或更小，并且其中相对于法线的该各角度大于25度，优选地大于30度，诸如35度或更大。

34、对于反射器，特别是反射镜，诸如介质镜，相对于其他入射角，与反射表面或反射层的法线角接近或与法线成接近45度的入射角可能是优选的。因此，优选的是，入射到扫描元件(和/或系统中的任何其他反射器)上并且由扫描元件反射的各种光束路径以这样的角度或接近这样的角度布置。

35、因此，光学元件的布置和各种光束的对准可以被布置为使得入射到扫描元件上并且由扫描元件反射的任何先前讨论的光束与由扫描元件定义的法线之间的封闭角小于65度，优选地小于60度，更优选地55度或更小，并且还可能大于25度，优选地大于30度，诸如35度；因此，光束被布置在与法线成45度角的20度角展度内，优选地在15度角展度内，更优选地在10度角展度内。

36、需要注意的是，反射镜上的入射与法线的夹角越小，反射镜上的光束表面积就越小，因此较小的反射镜可能足以反射大部分或全部光束；减小反射镜的尺寸可以允许减小其惯性，这可以实现更高的扫描速度。

37、光学系统可以与显微镜组合和/或其本身可以包括用于将照明光束的至少一部分聚焦到样品上和/或聚焦到样品中的物镜。物镜可以是用于将照明光束的该至少一部分浸没聚焦到样品上和/或样品中的浸没物镜。光学系统还可以包括用于保持样品的样品保持器，优选地用于将样品保持在物镜的焦点处或焦点附近。将物镜集成在系统中可以允许对准、鲁棒性、可控性和图像质量中的一个或多个的改进。

38、光学系统可以与定义图像平面的成像系统组合，和/或其本身可以包括成像系统，该成像系统可以定义图像平面并且可以包括相机。在任何情况下，光学系统可以被配置为将再扫描样品光的至少一部分聚焦到各图像平面上。