基于光场调控的快速三维光片荧光显微成像装置及方法

本发明属于光学仪器，具体涉及一种基于光场调控的快速三维光片荧光显微成像装置及方法。

背景技术：

1、光学显微是人类最早发明的显微成像技术，具有非侵入、对观测物体损伤低、丰富的成像机制、实时动态观察和较低的经济成本等优点，已被广泛地应用于生物医学、工业、农业、科研等领域。相比于传统的二维光学显微技术，三维光学显微成像技术可对生物结构形态进行三维成像与分析，能更加直观、准确地了解观测目标的三维形貌及结构，为科学研究提供最直接的证据。

2、光片荧光显微使用一层薄光片从侧面照明样品激发荧光，然后通过与光片垂直放置的探测物镜收集荧光，通过轴向移动样品，或同步轴向移动光片/物镜可以拍摄得到样品一系列不同轴向位置的二维荧光图像，从而实现三维显微成像。由于光片荧光显微只对样品成像区域进行选择性照明，不但避免了离焦背景的产生，天然具有三维层析能力，还将光损伤控制在极低水平，合适长时间对活体样品进行三维显微成像。

3、虽然光片荧光显微相对于其它三维光学显微技术具有速度较快的优势，但在观测亚秒至毫秒级快速三维动态过程时，其快速成像能力特别是三维成像速度仍然不足，无法实现实时三维成像。光片荧光显微系统的三维成像速度取决于对单个焦面的二维成像速度和垂直于焦面的轴向移动速度。其中二维成像速度指对单个像面连续成像时的速度，主要由相机的参数决定，高灵敏商用数字相机能达到100帧每秒的全画幅速度，通过降低曝光时间或进行像素合并等方法可以进一步提高成像速度。三维成像速度主要受制于轴向移动速度，即拍摄三维样品沿轴向不同深度处二维图像从而获得数据体帧的速度，光片和样品相对移动速度、相机成像速度、硬件同步、数据传输和后期图像处理等很多因素都会影响三维成像速度，目前主要受光片和样品相对移动速度制约。早期的光片荧光显微系统中成像物镜和光片同时保持静止，由于成像系统景深有限，样品只能在焦面附近清晰成像，因此需要沿着轴向机械移动样品并用相机同步拍摄二维图像序列实现三维成像。成像速度受限于电动位移台移动速度，而且相机曝光时间内，样品需处于静止状态，获取单个视场一个完整的三维数据体帧需要花费数秒到数分钟时间，此外机械移动引起的振动还会影响成像质量。用移动速度较快的压电位移台沿轴向移动成像物镜和光片，而保持样品静止实现三维成像，可将成像速度提高一倍，但还无法实时三维显微成像。

4、传统的光片荧光显微装置成像景深小，在成像过程中需要机械移动样品或成像探测物镜实现三维成像，受限于位移平台的机械移动速度，成像速度限制在几十帧每秒，获取一体帧的数据需要花费数秒到分钟量级的时间，无法实现实时三维显微成像。

5、因此，提出一种基于光场调控的快速三维光片荧光显微成像装置及方法，来解决现有技术存在的困难，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种基于光场调控的快速三维光片荧光显微成像装置及方法，解决了当前显微成像装置受限于电动/压电位移台性能，三维成像速度很难再大幅提升的问题，本发明利用探测光场调控技术调控成像系统的点扩散函数(例如，艾里点扩散函数、球差型点扩散函数等)扩展成像系统景深在很大轴向范围能清晰成像，然后通过轴向扫描光片并用相机同步拍摄样品一系列不同轴向位置处的二维荧光图像实现三维成像，可有效避免成像探测物镜或样品的机械移动，是提高三维成像速度的一种策略。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

2、一种基于光场调控的快速三维光片荧光显微装置，包括沿着光路先后顺序依次设置的以下模块：

3、激光光源模块、照明光场调控模块、振镜扫描光片生成模块、照明和探测正交双物镜模块、样品池模块、探测光场调控模块、宽场成像模块；

4、还包括控制和数据采集模块，数据控制和数据采集模块与照明光场调控模块、振镜扫描光片生成模块和探测光场调控模块单向连接，与宽场成像模块双向连接。

5、上述的装置，可选的，激光光源模块，包括单色或多色激光光源、扩束准直透镜和线性偏振片，用于产生照明样品的激光并保证光束模式和偏振态；

6、照明光场调控模块，包括液晶空间光调制器和第一反射棱镜，用于调控激光束的空间相位分布，生成新型无衍射部分贝塞尔光束；

7、振镜扫描光片生成模块，用于快速一维扫描新型无衍射部分贝塞尔光束生成光片和轴向扫描移动光片；

8、照明和探测正交双物镜模块，由长工作距离照明物镜成像探测物镜组成；

9、样品池模块，用于安放微管或标准显微切片样品，且成像探测物镜位于样品池内，照明物镜位于样品池外；

10、探测光场调控模块，用于调控系统点扩散函数从而扩展成像景深，避免机械移动延迟而实现快速三维成像；

11、宽场探测模块，由成像镜头和scmos相机组成，用于对荧光图像进行成像；

12、控制和数据采集模块，包括一台计算机和数字控制板卡，用于产生新型光束的计算相位全息图并通过液晶空间光调制器加载，以及控制scmos相机同步采集荧光显微图像。

13、上述的装置，可选的，振镜扫描光片生成模块包括沿着光路依次设置的第一透镜、第一反射镜和第二反射镜、第二透镜、二维扫描振镜、第三透镜和第四透镜组成激光扩束器和道威棱镜，用于快速一维扫描光束生成光片并轴向扫描移动光片。

14、上述的装置，可选的，探测光场调控模块包括依次设置的荧光滤光片、第三反射镜、第五透镜和第六透镜组成荧光缩束器、第四反射镜、第二反射棱镜、变形镜、反射镜，第七透镜和第八透镜组成荧光扩束器。

15、一种基于光场调控的快速三维光片荧光显微装置的成像方法，应用于上述任一项所述的一种基于光场调控的快速三维光片荧光显微装置，包括以下步骤：

16、s1、生成部分贝塞尔光束；

17、s2、形成光片照明光场；

18、s3、探测光场调控模块调控探测点扩散函数扩展成像景深；

19、s4、拍摄样品的二维荧光图像序列；

20、s5、图像去卷积及三维可视化重构。

21、上述的方法，可选的，s1具体包括以下步骤：

22、s101激光光源扩束准直照射到照明光场调控模块；

23、s102通过加载计算相位全息图到照明光场调控模块，调控激光束的空间相位分布，从而生成部分贝塞尔光束。

24、上述的方法，可选的，s2具体包括以下步骤：

25、s201启动二维扫描振镜扫描程序；

26、s202振镜沿着y轴快速扫描部分贝塞尔光束生成光片照明光场，并经过长工作距离照明物镜从侧面照明放置在样品池中的样品。

27、上述的方法，可选的，s3具体包括以下步骤：

28、s301在探测光场调控模块中的变形镜上加载产生三次曲面面形；

29、s302将成像探测系统的点扩散函数从传统高斯型调控成艾里点扩散函数，从而扩展成像探测系统的成像景深。

30、上述的方法，可选的，s4具体包括以下步骤：

31、s401保持二维扫描振镜沿着y轴快速扫描生成光片场，与此同时二维扫描振镜沿着z轴移动光片扫描显微样品；

32、s402用scmos相机同步拍摄显微样品不同轴向位置处的二维荧光图像序列。

33、上述的方法，可选的，s5具体包括以下步骤：

34、s501对二维荧光图像序列进行去卷积操作；

35、s502然后利用软件对二维荧光图像序列进行三维可视化重构，从而实现基于光场调控的无机械移动的快速三维显微成像。

36、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种基于光场调控的快速三维光片荧光显微装置及方法，具有以下有益效果：

37、1、本发明通过扩展成像景深，无需机械移动物镜或样品，仅需快速轴向移动光片并用相机同步拍摄实现三维成像，可将成像速度从数秒到数分钟一体帧提高到每秒数十体帧，满足实时三维显微成像需求。

38、2、本发明在三维成像过程中，样品池中的成像探测物镜和显微样品都无需机械移动，从而避免了机械移动导致样品池中水的流动对显微成像的不利影响。照明物镜位于样品池外，照明光片通过样品池中玻璃窗口进入，样品池中仅有成像探测物镜，充足的空间可以兼用微管样品和标准显微切片样品成像，可以降低样本制备难度，扩展显微成像应用场景和范围。

39、3、本发明中探测光场调控模块中的连续面形变形镜调控成像探测点扩散函数扩展成像景深，具有偏振不敏感、无色散和荧光利用率高的优点。照明光场调控模块中的核心器件为液晶空间光调制器，具有调控像素多的优点，可以灵活动态生成新型复杂无衍射光场。