专利名称：质谱分析用板及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及质谱分析用板(plate for mass spectrometry)及其制备方法和用途，所述板能够大量、快速、高灵敏度地进行蛋白质组(proteome)分析。
背景技术：
由于药物创新基础研究的进步，包括分子生物学和基因组学(基因组科学)的基础研究的进步，在这几年内，药物创新的情况已经发生显著变化，并且也正在开发基因组药物创新代表的药物创新新方法。
然而，仍不能从基因组明确的核苷序列中预测蛋白质功能(生理作用)；为建立连接遗传信息和新药的技术，需要存在后基因组(post-genome)。因此，蛋白组学(蛋白质分析学)正受到关注，其目的在于分离和鉴别上述核苷序列中翻译的全部蛋白质(报告多于100000种)，并指定它们的功能。
尽管，蛋白质组狭义上是指构成单个生物体的全部蛋白质，但是广义上有时是指组织学或解剖学指定的生物体部位，如，特定细胞的细胞液中的全部蛋白质、血清中含有的全部蛋白质、特定组织中含有的全部蛋白质等。在本说明书中，该术语以广义使用，但是显而易见的是，广义上的蛋白质组的完全集合体是狭义上的蛋白质组。
在蛋白质组分析中，普遍使用结合二维电泳和质谱分析的常规方法，但是下述问题仍没有解决。也就是说，在常规方法中，在迁移后对试样进行质谱分析之前，迁移凝胶(migration gel)必须分裂成碎片，必须用特定溶液从各个碎片中提取蛋白质。由于花费的时间长和多步骤复杂操作的要求，测量时间缩短、装置尺寸减小、大量分析物的筛选和整个装置的自动化已经变得极其困难。
此外，存在另一个问题，即称为“低丰度蛋白质”的问题。例如，在酵母中只有100个基因产生酵母的总蛋白质重量的50％。这意味着剩余的50％蛋白质是数千个基因的产物。大量低丰度蛋白质含有大量对生物体来说是最重要的蛋白质，例如调节蛋白和信号传输蛋白，包括受体。但是，常规方法产生的情况是不能回收电泳法分离的大量和痕量蛋白质试样。
在为了克服电泳和质谱的组合技术中的这些缺陷的尝试中，以及为了阐明蛋白质-蛋白质的相互作用，正在进行各种努力。例如，同位素编码亲和标签方法(ICATisotope-coded affinity tag；Nat.Biotech.，17994-999(1999))、酵母中的双杂交系统、BIA-MS-MS、蛋白质阵列法(protein arraymethod)(溶液，芯片；Trends Biotechnol.，19s34-39(2001))和利用LC-MS-MS的peptidomics等是可以使用的。特别地，作为蛋白质阵列方法的实例，可提及固相蛋白质阵列法(芯片方法；Curr.Opin.Biotechnol.，1265-69(2001))、信息结合在纳米颗粒中的液相阵列法(荧光解码珠粒；Clin.Chem.，431749-1756(1997)；Nat.Biotech.，19631-635(2001)；条形码状纳米颗粒(barcoded nanoparticles)；Trends Biotechnol.(2001)，同上)等。
同时，本发明的发明人已经提出一种蛋白质组分析的方法，其使得能够同时分析膜蛋白质和通过编组(grouping)膜蛋白质能够与其发生相互作用的化合物(WO02/56026)。
除了这种在测量方法(体系)的改进之外，还报道了在蛋白质质谱领域中的改进的努力，但是它们的目的并非为了蛋白质组分析，或者它们技术上难以应用于蛋白质组分析。已经报道过下述方法，所述方法包括将由电泳法分离出来的蛋白质印迹(blotting)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，并使用双面涂布的带(Electrophoresis，17954-961(1996))、框架(Anal.Chem.，692888-2892(1997))或油脂(Anal.Chem.，714800-4807(1997)；Anal.Chem.，714981-4988(1999)；WO00/45168)对固定至用于MALDI型质谱的不锈钢板上的膜进行测量。这些方法不完美，原因在于不仅这些方法由于在测量过程中将PVDF膜固定至质谱分析用板而费力，而且背景高，相对峰强度极其低，因此它们不适合蛋白质组分析，而蛋白质组分析要求高的检测灵敏度。
此外，还报道过以下的方法，包括将电泳之后的凝胶直接印迹至基质涂布的质谱分析用板并进行质谱分析的方法，以及包括将蛋白质电印迹至用于印迹的PVDF膜上，然后将该蛋白质扩散印迹至基质涂布的质谱分析用板(US5595636)。然而，在这些方法中，当使用电印迹时，存在的问题是在印迹期间基质溶解在印迹缓冲液中，并且测量它们变得几乎不可能。另一方面，当使用扩散印迹时，印迹效率低，以致于检测灵敏度不够，特别是对将低丰度蛋白质印迹至质谱分析用板上的检测灵敏度不够。
而且，还报道了基于上述方法改进的方法，该方法包括将硝化纤维素(用于印迹用途的膜组分)和基质的混合物施用(apply)于质谱分析用板(GB2312782A)。然而，在电印迹或扩散印迹的情况下，即使该方法，也不能说完全解决了这些问题。
至于质谱分析用板，常用的铝板或不锈钢板，以及它们的改进类型，例如涂布有氧化硅的质谱分析用板或者添加有憎水基的质谱分析用板，可商业购买(Ciphergen制造的，WO94/28418)。然而，即使这些技术和产品也不能总是满足大量、快速和高灵敏度地进行蛋白质组分析的研究和开发需要。
本发明的目的是介绍比基于电泳和质谱分析组合的蛋白质组常规分析方法更新的新方法。具体地，本发明的目的是提供能够快速和高灵敏度地进行大量蛋白质组分析的技术。
发明内容
本发明基于以下的发现与PVDF固定在膜状的基板上的板相比，通过用PVDF涂布基板而在基板上形成PVDF薄层所制备的质谱分析用板提供了显著改进的质谱分析检测灵敏度和准确性。此外，因为这种质谱分析用板在印迹时不含有基质，所以额外的优点是即使在电印迹中，基质也不溶解。
因此，本发明涉及1)质谱分析用板，其包括支撑体和其上的含PVDF的涂层；2)制备质谱分析用板的方法，其包括用PVDF涂布支撑体；以及3)鉴别分析物的方法，其包括对含分析物的试样进行凝胶电泳，以分离分析物，将分离出的分析物印迹至上述1)中的色谱分析用的板或上述2)的方法中制备的色谱分析用的板，并对印迹的分析物进行质谱分析。
通过以下本发明的详细描述，本发明的其它目的和特点，以及本发明的效果将显而易见。
图1显示从迁移凝胶电印迹至质谱分析用板的程度。A表示迁移凝胶(印迹之前)，B表示迁移凝胶(印迹之后)，以及C表示本发明的质谱分析用板(印迹之后)。左侧的数字符号显示相应带的蛋白质的分子量。这表明在一些蛋白质中，由于电印迹，凝胶中几乎全部部分的蛋白质迁移至色谱分析用的板。
图2显示迁移凝胶和色谱分析用板之间的位置关系(图2A)和板上迁移的蛋白质所接受的激光量(图2B)。在这两图中，1、2和3分别表示色谱分析用板、迁移凝胶和蛋白质。此外，A、B和C分别表示最大光通量(lightquantity)、最小光通量和零光通量。
图3显示使用本发明质谱分析用板(图3A)、铝板(图3B)和蛋白质芯片阵列(H4，图3C)所获得的质谱峰的相对强度。
图4显示使用本发明的质谱分析用板或铝板所获得的SCUPA和HSA的质谱光谱(峰图像)。横轴表示分子量，纵轴表示相对强度。图4A和B显示SCUPA的结果，图4C和D显示HSA的结果。此外，图4A和C显示了使用本发明质谱分析用板的情况，图4B和D显示了使用铝板的情况。
图5显示了通过质谱分析，使用本发明的质谱分析用板进行电印迹的蛋白质(SCUPA)和对其发生特定反应的抗体(抗SCUPA抗体)之间的蛋白质-蛋白质相互作用的分析结果。横轴表示分子量，纵轴表示相对强度。图中的数值符号表示峰的分子量。图5A显示分离并印迹的SCUPA与抗SCUPA抗体之间的相互作用。此外，图5B显示单独使用抗SCUPA抗体所获得的结果。
图6显示当将电泳-分离的蛋白质印迹至PVDF膜时所获得的质谱光谱。横轴表示分子量，纵轴表示相对强度。图中的数值符号表示峰的分子量。图6A表示SCUPA的结果，图6B表示HSA的结果。
具体实施例方式
质谱分析用板本发明的质谱分析用板在支撑体(support)(基本结构)上具有涂层(薄层)，所述涂层含有聚偏二氟乙烯(PVDF)。对支撑体的材料没有限制，只要其为用于质谱分析用板的常用之一。例如，可提及绝缘体(玻璃、陶瓷、塑料/树脂等)、金属(铝、不锈钢等)、导电聚合物，以及它们的组合等。优选使用铝板。
本发明质谱分析用板的形状设计为特别适合所使用的质谱仪的试样入口。例如，可提及集合型(cluster type)质谱分析用板等，所述集合型质谱分析用板预先开槽过，以使得容易分离单独的片断，从而在蛋白质印迹至适合电泳后凝胶尺寸的集合型(assembly type)质谱分析用板后，各板适合质量分析的试样入口，然而，本发明不应解释为局限于此。
在本发明中，“含PVDF的涂层”是指通过将分散体PVDF分子沉积在支撑体上而形成的薄层，而不是通过在支撑体上重叠预先模塑过的结构体(如使用常规公知的PVDF膜)而制备的层。尽管对PVDF沉积的方式没有限制，优选使用下述制备质谱分析用板的方法的实例中所述的方法。
适当地选择薄层的厚度，只要其不对蛋白质印迹的效率和质谱分析测量灵敏度等产生不利的影响即可，例如，该厚度为约0.1至约1000微米，优选为约1至约300微米。
制备质谱分析用板的方法本发明的质谱分析用板是通过PVDF涂布支撑体表面而制备的。至于涂布方法的优选实例，可提及涂抹(painting)、喷射(spraying)、气相沉积、浸渍、印刷和溅射等。
在“涂抹”的情况下，可使用适当的工具(例如，刷子)，将溶解在合适溶剂(例如，如二甲基甲酰胺等有机溶剂)中的合适浓度(例如，约1至约100mg/mL)的PVDF(以下简称为“含PVDF的溶液”)涂抹至支撑体(基本结构，基板)上。
在“喷射”的情况下，可将以上述相同方式制备的含PVDF的溶液从喷射器喷射出，从而PVDF均匀地沉积在支撑体上。
在“气相沉积”的情况下，PVDF薄层可形成在支撑体表面上，其是通过使用用于制备有机薄膜的常用真空气相沉积装置在含有支撑体的真空室中加热和蒸发PVDF(固态或溶液的)而形成的。
在“浸渍”的情况下，可将支撑体浸渍在以上述相同方式制备的含PVDF的溶液中。
在“印刷”的情况下，可根据支撑体的材料，适当地选择和利用各种可常用的印刷技术；例如，可优选使用丝网印刷等。
在“溅射”的情况下，可形成薄层，例如，通过在支撑体和PVDF之间施加直流高压，同时将惰性气体(例如，氩气等)导入真空室中，并且使电离的气体碰撞PVDF，使得溅射的PVDF分子沉积在支撑体上。
可在支撑体的各个表面上施用涂层，也可只在进行质谱分析的一个表面上施用涂层。
可根据涂布方式，适当地使用优选形式的PVDF；例如，可以以含PVDF的溶液、含PVDF的蒸汽和PVDF固体分子等形式，将PVDF施用至支撑体上。优选以含PVDF的溶液的形式施用。“施用”是指使PVDF与支撑体接触，以使其在接触后保留和积聚在支撑体上。对施用的量没有限制；至于PVDF的量的实例，可提及约1至100μg/cm2。在施用后，通过自动干燥和真空干燥等除去溶剂。
本发明质谱分析用板中的支撑体(基本结构，基板)可具有表面，该表面在用PVDF涂布之前，由适当的物理或化学技术预先改性(处理)。具体地，可提及板表面抛光、磨蚀(abrasion)、酸处理、碱处理和玻璃处理(四甲氧基硅烷等)作为实例。
本发明质谱分析用板在稳定性上是优异的。也就是说，本发明质谱分析用板的特征在于即使在浸渍在pH值为2-10或含有各种盐、如甲醇或乙腈等溶剂或它们的混合溶剂的水溶液中、电力负荷、湿润和干燥的重复循环和高度真空状态的条件下，粘合表面(adhesive surface)也不剥落。
板的用途A.鉴别(identification)蛋白质等使用本发明的质谱分析用板，可鉴别各种化合物，包括蛋白质在内。也就是说，对含有分析物(例如，蛋白质、核酸、寡核苷酸、糖、寡糖、细胞膜受体激动剂或拮抗剂、毒素、病毒表位(virus epitope)、激素、肽、酶、酶底物或酶抑制剂、辅因子、药物(drug)、凝集素、抗体等)的试样进行电泳(例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳)，以分离出分析物，将分离出的分析物印迹至本发明质谱分析用板上，并利用质谱分析印迹的分析物，如此鉴别分析物(从有关分析物分子量的信息上)。
含分析物的试样含分析物的试样可使用任何公知的技术从(生物)材料中制备。此处，至于(生物)材料的实例，可提及如动物、植物和微生物等任意选择的生物体的细胞或组织，或者细胞外液(例如，血液、血浆、尿、骨髓液、腹水等)、细胞内液、细胞小颗粒中的液体等。此外，也包括细胞培养液和通过基因重组获得的培养液等。
为制备进行电泳分析的含分析物的试样，使用公知的方法。例如，在含蛋白质试样的情况下，通过在蛋白酶抑制剂存在下，在合适的缓冲液中匀化靶细胞之后，或者在使用如Polytron等细胞破碎装置悬浮细胞之后，或者在通过低渗透压休克(shock)破碎细胞之后，或者在超声破碎细胞膜之后，收集离心上清液，可获得可溶性的部分。此外，可在利用表面活性剂或者蛋白质变质剂增溶后，使用所获得的沉淀物(不可溶)部分。
电泳这是试样中的分析物通过电泳分离出(在凝胶上展开)的步骤。所使用的电泳装置可以是公知的装置。可使用商业产品。根据目的，可使用任何一维凝胶电泳和二维凝胶电泳。在二维凝胶电泳中，一维迁移是基于由于分析物等电点的分离，二维迁移是基于由于分析物的分子量的分离。对用于电泳的凝胶尺寸没有限制。尽管10cm×10cm是常用的尺寸，但是必要时也可使用20cm×20cm或者其它尺寸。此外，尽管凝胶的材料主要是聚丙烯酰胺，取决于用途，使用其它介质，例如琼脂糖凝胶和醋酸纤维素膜也是可行的。至于凝胶的浓度，既可使用均匀的浓度，也可使用梯度浓度。
印迹这是将通过凝胶电泳分离出的分析物从凝胶中转印(transfer)至本发明质谱分析用板的步骤。至于印迹装置，可使用公知的装置。可使用商业产品。印迹方法本身是公知的。通过各种方法(例如，扩散、电力和其它方法)，将迁移后在凝胶上展开的分析物转印至质谱分析用板上。该步骤通常称为印迹。可提及扩散印迹、电印迹等。特别优选为电印迹。
至于在电印迹时使用的缓冲液，优选使用pH为7-9和低盐浓度的缓冲液。具体地，可提及三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris buffer)、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液等作为实例。至于三羟甲基氨基甲烷缓冲液，可提及Tris/甘氨酸/甲醇缓冲液、SDS-Tris-Tricine缓冲液等；至于磷酸盐缓冲液，可提及ACN/NaCl/等渗磷酸盐缓冲液、磷酸钠/CAN等；至于硼酸盐缓冲液，可提及硼酸钠/氯化氢缓冲液、Tris-硼酸盐/EDTA缓冲液和硼酸盐/ACN等；至于乙酸盐缓冲液，可提及Tris-乙酸盐/EDTA等。优选地，缓冲液为Tris/甘氨酸/甲醇缓冲液或硼酸钠/氯化氢缓冲液。作为Tris/甘氨酸/甲醇缓冲液的组成实例，可提及约10-15毫摩尔(mM)Tris、70-120毫摩尔甘氨酸和7-13％甲醇。作为硼酸钠-氯化氢缓冲液的组成实例，可提及约5-20毫摩尔硼酸钠。
此外，在印迹后，可添加称为基质的试剂，以吸收激光，并且通过能量转移促进分析物分子的电离，从而进行随后的质谱分析(通过MALDI方法)。至于基质，可使用质谱分析领域中公知的基质。例如，芥子酸(SPA(＝3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(cinammic acid)))、吲哚丙烯酸(IAA)、2，5-二羟基苯甲酸(DHB)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)等，然而基质不应解释为局限于此。优选地，基质为DHB或CHCA。在CHCA的情况下，优选添加至少为21％饱和浓度的基质。具体地，可提及21-100％饱和浓度的基质，优选为40-100％饱和浓度的基质，特别优选为50-100％饱和浓度的基质。
质谱分析这是通过质谱分析，分析印迹至本发明质谱分析用板上的分析物而鉴别分析物(从有关分子量的信息)的步骤。质谱仪是通过电离气态试样，因而物质的分子或分子碎片进入电磁场，基于物质的转印状态(transfer status)，通过质量数/电荷数分离物质，并测定物质的光谱，而测量和检测物质的分子量的装置。可使用基于以下方法原理的质谱仪，所述方法为MALDI-TOFMS方法，其是基质辅助激光解吸电离(matrix-aided laserdeionization，MALDI)与飞行时间质谱(time-of-flight mass spectrometry，TOFMS)的组合，所述MALDI包括混合和干燥试样与吸收激光基质以产生结晶，通过来自基质的能量转移，使晶体电离，并通过激光照射瞬时加热，以及将电离的分析物引入真空中，所述TOFMS包括通过由于初始加速，试样分子离子飞行时间的差异来分析质量数；包括将单独的试样置于一个液滴中，从液体中直接电离分析物的方法；纳米级电喷射质谱(nano-ESMS)方法，其包括将试样溶液电喷射至大气中，以将单独的分析物气化成未折叠状态的多价离子；等等。
对放置在本发明质谱分析用板上的分析物进行质谱分析的方法本身是公知的。
此外，为根据本发明充分自动化蛋白组分析，通过朝着一维方向或二维方向移动激光出口，或者相反移动其上有质谱分析用板的台座，以及进行连续的全表面扫描(在间断的扫描方法中，存在未用激光照射的剩余的分析物，也就是说，未分析的剩余的分析物)，可分析通过电泳一维展开或二维展开的全部分析物。结合该方法和间断的扫描方法，使得可以将分配至96孔板的96种试样作为一个整体包埋(mount)至质谱分析用板上(96种试样在长方形芯片上以恒定的间隔排列)，并且对该试样进行质谱分析。
B.鉴别分析物组根据本发明，可同时分析多种分析物的集合(分析物组)。也就是说，从上述各种生物材料制备的含分析物的试样通常含有多种和各种分析物。通过用一维或二维凝胶电泳分离这种分析物组，以及将分离出和展开在凝胶上的分析物组印迹在，如尺寸与迁移凝胶(优选为集合型质谱分析用板，其具有预先形成的穿孔线，以使能够容易分离每个片，以使其在印迹后符合质谱仪的试样入口)相符合的本发明质谱分析用板上，通常可将含分析物试样中含有的所有分析物(如果分析物是蛋白质，则为蛋白质组)，分离至相应的位置，并将它们印迹至质谱分析用板上。通过使用上述连续扫描型质谱仪，测量这些分析物组，可同时鉴别印迹的分析物组。
C.鉴别分析物复合物根据本发明，可同时分析分析物和对该分析物具有亲合力(与其发生相互作用)的分析物之间的键接。也就是说，通过利用电泳分离分析物，将分离出的分析物印迹至本发明质谱分析用板上，然后添加含有对该分析物具有亲合力(与其发生相互作用)的化合物的试样(例如，肽、蛋白质、核酸、非肽化合物、合成化合物、发酵产品、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物、细胞膜级分(fraction)、细胞器膜级分等)，以在板上形成复合物，并对形成的复合物进行质谱分析，可鉴别印迹的分析物、对该分析物具有亲合力(与其发生相互作用)的化合物，和/或它们的复合物(从有关分子量的信息)。
为更详细地描述本发明，以下给出实施例；然而，这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1制备质谱分析用板将铝基本结构(铝板)浸入1％四甲氧基硅烷/1％乙酸溶液，并在空气中干燥，然后煅烧(130℃，3小时)，所述铝基本结构制备成符合蛋白质芯片系统(ProteinChip System)(由Ciphergen制造的)的质谱分析用板的入口。将溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中的聚偏二氟乙烯(PVDF)，以10mg/mL的量施用在该板上。制备的质谱分析用板是扁平的，其尺寸为78毫米×8毫米×2毫米，其具有白色表面。
在随后步骤中，质谱分析用板绝对不发生化学变化、电变化、机械变化或物理变化，例如破裂、剥落、损伤和褪色，所述的随后步骤，例如浸渍在有机溶剂中以预处理、与电泳凝胶接触、在各种缓冲液中电印迹，以及在随后的基质应用期间高真空和干燥以及质谱分析。
使用该质谱分析用板，进行下述研究。
实施例2将蛋白质电印迹至质谱分析用板对预先染色的分子量标记(Bio-Rad制造)进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，在90mA电流下，于12.5mM Tris/96 mM甘氨酸/10％甲醇缓冲液中将凝胶上的蛋白质电印迹至实施例1中制备的质谱分析用板上。因此，尽管少量分子量为90000-110000的预先染色的蛋白质印迹之后残留在聚丙烯酰胺凝胶中(图1B)，但是所有蛋白质被有效地印迹至本发明质谱分析用板上(图1C)。
实施例3质谱分析印迹至质谱分析用板的蛋白质在对试样(蛋白质混合物)进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，将凝胶直接与实施例1的质谱分析用板接触，将通过电泳分离出来的蛋白质电印迹至实施例1中制备的质谱分析用板上，并且立即将该质谱分析用板放置在质谱仪中并测量。使用2，5-二羟基苯甲酸(DHB；75mg/mL乙醇溶液)作为基质，并使用蛋白质芯片系统(上述的)作为测量装置，进行测量的条件如下检测器电压1800V，检测器灵敏度8，以及激光器强度280。为了质量校正，利用肌红蛋白(获自马肌肉)、GAPDH(获自兔)和白蛋白(获自牛血清)，进行外部校正。在该试验中，两种蛋白质，即单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(SCUPA)和人血清白蛋白(HSA)，用作蛋白质混合物，在还原条件下，对4μg蛋白质混合物串联电泳两次，至12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。也就是说，添加初始试样，在30mA电流下进行电泳40分钟，然后断开电流，将相同的试样再次添加至相同的泳道中，进一步在30mA电流下电泳23分钟。迁移后，切割各迁移通道的凝胶，进一步在离凝胶上表面上的添加位置39mm处切割，然后将两片凝胶以它们的上表面各自接触而放置，其后与质谱分析用板相互接触(图2A)。此时，以SCUPA、HSA、SCUPA、HSA、HSA、SCUPA、HSA和SCUPA的顺序布置迁移试样，将各蛋白质的4个带，总共8个带印迹至质谱分析用板上。
因为所使用的质谱仪不是连续地，而是在24个等间距的点照射激光至单个质谱分析用板上，所以发生了对激光不曝光、部分曝光和全曝光的情况，这取决于质谱分析用板上印迹的蛋白质的位置(图2B)。为了增加对激光最大曝光的概率，并因此增加在该分析装置内，在该限制下的最高峰强度，设计了以下的模式，即通过上述技术，将各模型蛋白印迹至质谱分析用板上四个不同的位置。因此，即使印迹理论上质量相同的蛋白质，获自质谱分析的峰高是可变的(图3)。因此，在该实验中，假设所获得多个峰中最大相对强度的峰的值与对激光完全曝光的实际值最接近，进行了讨论。
预先将质谱分析用板浸入甲醇中，并用印迹缓冲液(10mM硼酸钠缓冲液，pH8.0)平衡，然后在90mA电流下对其进行电印迹2小时。随后，进行质谱分析，并测量相对峰强度。为参考对照，以相同的方式进行其它实验，不同之处在于使用常规非PVDF涂布的铝板和引入有十六烷基的铝板(ProteinChip array，Ciphergen制备，H4)。结果示于图3和图4中。
在SCUPA的情况下，本发明质谱分析用板的相对峰强度(图3A)为12.31，是常规铝板强度值(图3B)(0.87)的14倍。对HSA进行类似的比较，该质谱分析用板的相对峰强度，是铝板强度值的49倍(6.260.129)。此外，质谱分析用板产生的相对峰强度是H4产生的2倍至4倍(图3C)。而且，本发明质谱分析用板(图4A和C)比铝板(图4B和D)产生了更多明显的光谱。从这些结果中，发现通过使用本发明质谱分析用板，可同时快速和高灵敏度地通过质谱分析，分析电泳分离之后的多种蛋白质。
实施例4分析电泳分离之后电印迹的蛋白质和结合蛋白之间的相互作用作为本发明质谱分析用板的应用实例，进行了以下的研究印迹至质谱分析用板的蛋白质和能够与其发生相互作用的蛋白质之间的结合；随后通过质谱分析鉴别它们的蛋白质复合物。至于材料，使用SCUPA及其抗体(抗SCUPA抗体)。
在将SCUPA(4μg)添加至12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶之后，进行电泳1小时。在迁移之后，切割凝胶，并以实施例3中相同的方式，将凝胶上的SCUPA电印迹至实施例1中制备的质谱分析用板上。在阻断SCUPA印迹的质谱分析用板之后，添加抗血清(用硫酸铵粗精制的，且含有抗SCUPA抗体)，并反应过夜。在完成反应后，用PBS缓冲液洗涤该板，添加基质，进行质谱分析。结果示于图5中。
在电泳之后印迹至质谱分析用板的SCUPA在48，616处产生峰，并观察到与固定在同一板上的SCUPA发生相互作用的抗SCUPA抗体在145,300(73，115指定给相同抗体的二价离子)处的峰(图5A)。此外，在作为对比的没有SCUPA的凝胶中，在此质谱分析用板中没有观察到峰，尽管进行了相同过程，例如电印迹、阻断、添加抗SCUPA抗体以及用PBS洗涤(图5B)。
上述结果显示了，在电泳分离之后，印迹至质谱分析用板上的SCUPA保留结合能够与其发生相互作用的蛋白质(抗SCUPA抗体)的活性，并且实际上同时测量印迹的蛋白质和与其发生相互作用的蛋白质的分子量，从而可鉴别两种分子物种；上述结果表明了可以检测该质谱分析用板上的蛋白质-蛋白质复合物，以及可以鉴别在该质谱分析用板上形成的复合物。
比较例1印迹至PVDF膜和质谱分析在还原条件下，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，对两种蛋白质，即SCUPA和HSA各4μg的混合物串联电泳两次。添加初始试样，在30mA电流进行电泳40分钟，然后断开电流，将相同的试样再次添加至相同的泳道中，进一步在30mA电流下进行电泳23分钟。迁移后，切割各迁移通道的凝胶，进一步在离凝胶上表面上的添加位置39mm处切割；如图2A所示，将两片凝胶以它们的上表面各自接触而放置，并将78mm×8mm切割的PVDF膜放置在凝胶上，并在10mM硼酸钠缓冲液(pH8.0)中在90mA电流下进行电印迹2小时。在完成印迹之后，用PBS洗涤PVDF膜，用蒸馏水冲洗，干燥，并使用透明的双面涂布的带(Sumitomo 3M Ltd.制造的)施加至铝板。向其添加基质(DHB)，使用ProteinChip System(如上所述的)进行质谱分析。
结果是，印迹至PVDF膜上的SCUPA在50,096.9处产生峰，HSA在67,394.5处产生峰；然而，难以鉴定这两个峰，这是因为相对峰强度极其低，以及信噪比(S/N比)低(图6)。此外，发现在质谱分析用板的情况下(同样适用于本发明的质谱分析用板)，花费2-3分钟到达真空状态，然后立即测量是可行的；然而，在PVDF膜的情况下，长达45分钟到达真空状态，从而导致所使用的质谱仪过量负载，并且质谱仪不经受频繁使用。
实施例5使用本发明质谱分析用板进行各种蛋白质组分析使用各种细胞或组织提取试样，在相对低的分子量范围内(分子量1,000-20,000)确定本发明质谱分析用板的性能。在下述试验中，将试样施加至16％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(在Tris-Tricine缓冲液中)，并电泳90分钟，然后在10mM硼酸钠缓冲液(用盐酸将pH值调节值8.0)中将分析物从凝胶中电印迹至本发明色谱分析用板上1-2小时。在印迹完成之后，冲洗该板，沾污(spot)基质，并进行质谱分析。
(1)在4℃下使用1N醋酸匀化猪小脑，并在4℃下，以3,000rpm的转速离心30分钟，回收上清液。添加乙腈，获得最终10％的浓度，将上清液施用至反相色谱的柱上。用含有10％乙腈的0.1％三氟乙酸(TFA)洗涤该柱，并用含60％乙腈的0.1％TFA洗脱。冷冻干燥洗脱物，并将其用作猪小脑提取物。在通过SDS-PAGE分离出提取物后，将其电印迹至本发明质谱分析用板上。使用含有饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)作为基质的0.5％TFA/50％ACN，进行质谱分析。结果是，在3,000-20,000的分子量范围内，峰是可检测的。
将其与使用DHB(150mg/mL乙醇)或饱和SPA(在0.5％TFA/50％ACN)代替饱和CHCA作为基质的情况作比较。在DHB的情况下，在3,000-20,000的分子量范围内，没有观察到明显的峰。在饱和SPA的情况下，在相同的分子量范围内，只有观察到几个峰。相反，在饱和CHCA的情况下，在2,000-10,000和5,000-20,000的分子量范围内，观察到大量的峰。从这些结果中，显示CHCA更优选用于鉴别相对低分子量范围内的蛋白质。
(2)以与上述(1)中相同的方式，进行猪小脑提取物的质谱分析，不同之处在于使用50％饱和CHCA作为基质。结果是，在1,000或更大的分子量范围内，峰是可检测的。特别地，在检测3,000-20,000分子量范围内的峰时，表现出了优越的性能。
在1,000-10,000分子量范围内的质谱分析中峰出现的程度方面，将其与使用10％或20％饱和CHCA代替50％饱和CHCA的情况作比较。在10％饱和CHCA的情况下，观察到几个峰。在20％饱和CHCA的情况下，峰的数目略微多于使用10％饱和CHCA的情况。相反，在50％饱和CHCA的情况下，观察到很多峰。
(3)在100ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸盐(PMA)的存在下，在含10％FCS的RPMI1640介质中培养U937细胞(1×105至2×106个细胞/ml)48小时。进行相同的实验，但是没有PMA，以作为对照。培养结束后，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并制备细胞团(cell pellet)。此外，添加蛋白质提取试剂(Novagen Inc.)和蛋白酶抑制剂，在离心细胞团之后，在4℃下静置细胞团15分钟，并回收上清液，用作细胞溶胞产物。在通过SDS-PAGE分离之后，将其电印迹至本发明质谱分析用板上。随后，进行质谱分析；3,000-20,000分子量范围内的所检测到的峰的强度方面，比较PMA刺激U937细胞的结果和对照U937细胞的结果。结果是，在蛋白质的PMA刺激表达中观察到下述变化(表1)。
表1
(4)进行剖面小鼠组织。使用Beads Shocker(Yasui Kikai Corporation，Osaka)，在2,500rpm转速下处理10-30秒，破裂小鼠组织(脑、肺、肝、肌肉)，添加TricinePAGE试样缓冲液(Wako Pure Chemical Industries)，在12,000rpm下离心5分钟，回收上清液。在用SDS-PAGE分离之后，将上清液电印迹至本发明质谱分析用板上，进行质谱分析。结果是，在各组织中检测到组织特异的肽(分子量3,000-20,000)。
实施例6研究电印迹时缓冲液的影响作为电印迹时的缓冲液，使用Tris缓冲液(25mM Tirs/192mM甘氨酸/20％甲醇，pH8.3)、磷酸盐缓冲液(5％ ACN/125mM NaCl/PBS，pH7.2)、乙酸盐缓冲液(40mM Tris-乙酸盐/1mM EDTA，pH8.0)和硼酸盐缓冲液(10mM硼酸钠-盐酸，pH8.0)。至于质谱分析用的蛋白质，使用HSA和SCUPA。除了这些条件之外，依照实施例5的方法，进行实验。结果是，在检测的缓冲液中，硼酸盐缓冲液产生最大的质谱峰强度。例如，对SCUPA而言，硼酸盐缓冲液的峰强度的最大值约是磷酸盐缓冲液的21倍，对HSA而言，约4倍。
工业实用性由于使用PVDF作为配体吸附剂，本发明质谱分析用板能够均匀地吸附各种蛋白质，在印迹效率上优异，并能够正常保留蛋白质的三维结构和功能。本发明质谱分析用板的特征也在于没有非特定吸附，印迹后进行质谱分析的能力等。
利用本发明质谱分析用板的特征，可大量、快速和高灵敏度地分析和鉴别蛋白质。蛋白质可为一种蛋白质，或者多种蛋白质的集合体(蛋白质组)，甚至同样可分析和鉴别对该蛋白质具有亲合力(与其相互作用)的化合物的复合物(也就是说，大量，快速而又高灵敏度地)。
此外，能够显著减少操作时间、步骤简化、装置尺寸减小、成本降低、自动化和筛选大量分析物，并使大规模蛋白质分析容易。而且，能够蛋白质组分析生理重要的低丰度蛋白质，从而有助于发现诊断用途的生物标记和发现新药物研发的种子化合物(seed compound)。
因此，本发明使得可以向传统蛋白质组分析中引入一种新技术，其是电泳和质谱分析的结合。
本申请是基于向美国申请的US10/264,505和向日本申请的日本专利申请No.2002-344710，在本说明书中整体引入这两申请的教导。
在该说明书中引入所有引用，包括在此提及的出版物和专利，通过在此以如同它们单独表现出被引入的程度，作为参考，它们中全部在此限定。
尽管重点以优选的实施方式，描述了本发明，但是对本领域技术人员明显的是，这些优选的实施方式可以更改。本发明可通过除此处详细描述的方法之外的方法来实现。因此，本发明包括囊括在权利要求的精神和范围内的各种更改。
权利要求
1.质谱分析用板，其包括支撑体和与其粘附的涂层，其中所述涂层含有聚偏二氟乙烯。
2.权利要求1的板，其中支撑体是由铝或不锈钢制成的。
3.制备质谱分析用板的方法，其包括用聚偏二氟乙烯涂布支撑体。
4.权利要求3的方法，其中涂布的方式是涂抹、喷射、气相沉积、浸渍、印刷或溅射。
5.权利要求3或4的方法，其包括将含有聚偏二氟乙烯的溶液施用至支撑体。
6.权利要求5的方法，其包括施用后，除去所述溶剂。
7.质谱分析用板，其是通过权利要求3-6中任一项的方法制备的。
8.鉴别分析物的方法，其包括下述步骤(a)-(d)(a)提供权利要求1或7的质谱分析用板，(b)对含有分析物的试样进行凝胶电泳，(c)将迁移后的凝胶印迹至所述板上，以将所述分析物转印至所述板上，以及(d)对所述板进行质谱分析，以分析转印的分析物。
9.权利要求8的方法，其中印迹是电印迹。
10.权利要求8或9的方法，其中质谱分析是MALDI-MS。
11.权利要求8-10中任一项的方法，其中含分析物的试样含有多种分析物。
12.权利要求8-11中任一项的方法，其中分析物选自蛋白质、核酸、寡核苷酸、糖、寡糖、细胞膜受体激动剂或拮抗剂、毒素、病毒表位、激素、肽、酶、酶底物或酶抑制剂、辅因子、药物、凝集素和抗体。
13.权利要求8-12中任一项的方法，进一步包括在步骤(c)和(d)之间的步骤(c2)，其中使含有对转印的分析物具有亲合力的物质的试样与所述板接触，以在板上形成所述分析物和所述物质的复合物，由此在步骤(d)中同时分析所述分析物和所述物质。
14.权利要求8-13中任一项的方法，进一步包括在步骤(c)或(c2)和步骤(d)之间，将质谱分析用基质添加至所述板。
15.权利要求14的方法，其中基质是2，5-二羟基苯甲酸。
全文摘要
本发明提供质谱分析用板，其包括支撑体和其上的含PVDF的涂层(即，PVDF沉积的薄层)；制备质谱分析用板的方法，其包括用PVDF涂布支撑体表面。本发明还提供鉴别分析物的方法，其包括对含分析物的试样进行凝胶电泳，以分离分析物，将分离出的分析物从凝胶中印迹至上述色谱分析用板，并将该板进行质谱分析，由此分析转印的分析物。
文档编号H01J49/26GK1720450SQ20038010519
公开日2006年1月11日 申请日期2003年10月3日 优先权日2002年10月4日
发明者田中宪次, 李良子, 栋近公司, 有国尚, 落合文吾 申请人:普罗托赛拉株式会社