专利名称：：中国林蛙皮cDNA文库的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学领域及生物制药领域，具体涉及一种中国林蛙皮cDNA文库及其构建方法，并涉及从所构建的cDNA文库中筛选具有抗临床多重耐药菌活性的抗菌肽基因。
背景技术：
：人类与环境微生物的抗争一直持续在人类进化过程之中，1941年开始的青霉素的临床使用加剧了人与环境微生物的拮抗。近半个多世纪以来，微生物耐药性突变株的产生与新型抗菌剂的发现一直吸引着人们的注意，这关乎着人类的健康与环境的和谐。自从二十世纪八十年代瑞典科学家BomanHG等人从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到杀菌肽(bactericidalproteins),命名为cecropin后，每年都有多种抗菌肽被分离、纯化。抗菌肽具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广以及材料来源丰富等特点。抗菌肽的来源复杂多样，从植物到动物甚至人体组织，都分离、纯化得到过抗菌肽。其中两栖类动物生存环境复杂多样，它们的皮肤在维持生存、开拓和适应广阔栖息地中起着重要作用。为了适应生存环境，两栖类的皮肤中分布了种类繁多、功能复杂的活性物质，是一个巨大的活性生物分子资源库和药物资源库，使得两栖类的皮肤成为人们分离抗菌肽的一大研究热点。继1987年Zasloff.M课题组从非洲爪蟾Xenopuslaevis皮肤中分离出magainins后，每年都有大量的抗菌肽从两栖纲无尾目类动物(青蛙和蟾蜍)的皮肤中获得。抗菌肽在最低抑菌浓度(MIC)下对细菌质膜的破坏作用被认为是抗菌肽主要的抗菌机理，但是在实际研究中人们发现部分抗菌肽种类可以跨菌膜存在，并且进一步抑制生物大分子的合成，影响部分酶的活性，甚至影响细胞的分化或剌激细胞自动裂解。一般说来，在抗菌肽的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度(MBC)非常接近(小于2倍)的情况下，认为抗菌肽是起到杀菌的作用而非抑菌；相反，如果MIC和MBC浓度比超过两倍则可以认为抗菌肽是起到抑菌作用，多数抗菌肽属于杀菌作用机理。抗菌肽不能够被已知的耐药菌的抗抗生素机制所抑制，这一点已经被部分研究所证实。而且研究表明抗菌肽在微克分子浓度时对肿瘤细胞和病毒都有杀伤作用，但对没有病变的动物细胞没有作用。这是目前使用的各种肿瘤化疗药物所不具备的特性。在目前许多病原菌对现有抗生素逐步产生耐药性，而新的抗生素的发现又极其困难的情况下，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。但是，天然抗菌肽在动植物体内含量极微，仅靠提取得到抗菌肽不仅产量低、费时长、工艺复杂，而且花费昂贵，很难实现大规模生产。因此，开展抗菌肽基因工程研究具有重要意义。
发明内容本发明的目的在于构建中国林蛙皮的cDNA文库，用以筛选高抗菌活性的抗菌肽。并从中筛选得到具有抗临床多重耐药菌活性的林蛙抗菌肽。为了实现上述目的，采取以下步骤构建cDNA文库1、蛙皮中总RNA提取及mRNA纯化用v-gene纯化试剂盒(v-gene)纯化mRNA，用分光光度法估测总RNA含量和纯度.2、cDNA合成和重组载体的构建按universalriboclonecDNAsynthesissystem操作指南(promega)，以randomhexamericprimers为引物，经反转录合成第1链cDNA;再以DNAPolymeraseI合成第2链.用T4DNA连接酶在cDNA的5'端连接EcoRI衔接头，用NotI酶切cDNA，使cDNA的3'末端形成NotI突出末端，以便于将cDNA定向克隆到载体中，酚:氯仿抽提cDNA。按试剂盒操作说明，以T4DNA连接酶将cDNA定向连接至U不同比例的Xphage载体(packagenelambdaDNApackagingsystempromega)上，以选择最佳连接比例。噬菌体包装、宿主菌(LE392)的感染和文库的扩增等按常规操作。3、cDNA文库的滴度和重组率的测定从cDNA文库中取出5nL，按1:1000、1:10000的比例稀释，转染宿主菌大肠杆菌(LE392)，铺于含IPTG和X-gal的平板上，培养过夜后，计算噬菌斑的个数，按下面公式推算文库的滴度。a&wa噬菌斑数x稀释倍数文库滴度(pfUZmL)--转染的体积分别记数蓝斑和白斑的个数，计算重组率。图1:cDNA1%琼脂糖凝胶电泳。具体实施方式实施例1:林蛙皮cDNA文库构建方法cDNA文库构建所需中国林蛙及fliiate附/wiwtoc/teitsZ/fe附&,Z)flv/V/为长白山区人工放养，蛙皮为秋季林蛙排卵之前采集。针刺活蛙枕骨大孔后，扒取蛙皮，迅速置液氮冻存。1.蛙皮中总RNA提取及mRNA纯化取冻存的蛙皮约100mg，加入匀浆缓冲液，冰上匀浆。匀浆液置37。C温浴lh后，加入等体积的酚:氯仿抽提液，剧烈震荡lmin，5,000xg离心10min;上层水相按同法再抽提1次;第2次抽提的上层水相中加入0.1倍体积的3M醋酸钠(pH5,2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，冰浴2h;4。C，5，000xg离心15min，弃上清，用冰冷的75%乙醇洗沉淀；4°C，5,000xg离心15min，弃上清；真空干燥15min，沉淀用DEPC处理的水溶解;加等体积的8M尿素-3MLiCl溶液(DEPC处理)于-20。C过夜沉淀后，4°C，10,000xg离心30min，小心弃上清，加75%乙醇洗沉淀；4°C，10，000xg离心10min，真空干燥，沉淀用DEPC处理的水溶解，取500ng的总RNA，立即用v-gene纯化试剂盒(v-gene)纯化mRNA，用分光光度法估测总RNA含量和纯度.2.cDNA合成和重组载体的构建按universalriboclonecDNAsynthesissystem操作指南(promega)，以randomhexamericprimers为引物，经反转录合成第1链cDNA;再以DNAPolymeraseI合成第2链.用T4DNA连接酶在cDNA的5'端连接EcoRI衔接头，用NotI酶切cDNA，使cDNA的3'末端形成NotI突出末端，以便于将cDNA定向克隆到载体中，酚:氯仿抽提cDNA。按试剂盒操作说明，以T4DNA连接酶将cDNA定向连接到不同比例的Xphage载体(packagenelambdaDNApackagingsystempromega)上，以选择最佳连接比例(表l)。噬菌体包装、宿主菌(LE392)的感染和文库的扩增等按常规操作。电泳结果见图l，其中带1:Marker;带2:cDNA。3.cDNA文库的滴度和重组率的测定表l预连接反应<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(lOng/pl;O.Olpmol/pl)T4DNALigase10XBuffer1111Nuclease-FreeWater634T4DNALigase1111从cDNA文库中取出5pL,按1:1000、1:10000的比例稀释，转染宿主菌大肠杆菌(LE392),铺于含IPTG和X-gal的平板上，培养过夜后，计算噬菌斑的个数，按下面公式推算文库的滴度。一出化由^,、噬菌斑数x稀释倍数文库滴度(pfUZmL)--转染的体积分别记数蓝斑和白斑的个数，计算得到文库滴度2.4X105pfii/mL，重组率达到99.4%。实施例2:对得到的抗临床多重耐药菌的抗菌肽的活性测定将处于对数生长期的菌液预冷后，4,000r.p.m.离心5min收集菌体。用0.2M磷酸缓冲液(pH6.4)清洗菌体除去残余的培养基后，将菌体悬浮于相同磷酸缓冲液中，使ODs95值为0.30.4。按2ml/管加入菌液，并加入适量的待测样品溶液，参照管中加入相应体积的溶剂。混匀后，37'C摇床培养45min后，取出，冰浴10min。以磷酸缓冲液为空白测OD595。根据公式U2=(A0-A)/A(U:活力单位Aq:参照管00595值A:样品管od595值)，计算抗菌活力大小。权利要求1、一种中国林蛙(Ranatemporariachensinensis，David)皮cDNA文库。2、如权利要求1所述的中国林蛙cDNA文库，其特征在于林蛙为长白山区人工放养，蛙皮为秋季林蛙排卵前采集。3、如权利要求1所述的cDNA文库，其特征在于通过将载体和cDNA多核苷酸产物共同转化寄主细胞使在细胞内同源重组，从而使cDNA多核苷酸产物插入载体。全文摘要本发明涉及分子生物学领域及生物制药领域，具体涉及一种中国林蛙皮cDNA文库及其构建方法，并涉及从所构建的cDNA文库中筛选具有抗临床多重耐药菌活性的抗菌肽基因。构建文库所需中国林蛙(Ranatemporariachensinensis，David)为长白山区人工放养，蛙皮为秋季林蛙排卵之前采集。得到的文库特征为，cDNA片段大约分布在0.3～6kb，文库滴度2.4×10<sup>5</sup>pfu/mL，重组率达到99.4％。可从文库中筛选广谱、高效的抗菌肽基因，一方面可以为开发研究新的抗菌肽提供依据；另一方面可以使定向改变抗菌肽的抗菌谱、溶解度、稳定性范围等成为可能。文档编号C40B40/02GK101671851SQ20091006756公开日2010年3月17日申请日期2009年9月22日优先权日2009年9月22日发明者丁天兵,杰周,孟庆繁,滕利荣,程瑛琨申请人:吉林大学