丝胶蛋白包裹的铜纳米簇的制备及荧光探针的制作方法

本发明涉及纳米技术领域，尤其涉及一种丝胶蛋白包裹的铜纳米簇的制备及荧光探针。

背景技术：

荧光金属纳米簇由几至几百个原子组成，尺寸接近于电子的费米波长，由于量子尺寸效应而具有类似分子的光学性能且呈现出离散的能级，例如强烈的荧光性质和尺寸可调的电子过渡态。由于超小粒径、低毒性、生物相容性好、斯托克斯位移大、光稳定性优异等优点，荧光金属纳米簇已经在分析检测、ph传感、细胞成像等各方面展现出应用优势。但是，在过去的十几年中，荧光金属纳米簇的研究主要集中在荧光金纳米簇和荧光银纳米簇上，结合多种合成配体，也就是模板，如多肽、蛋白质、dna、聚合物和生物硫醇小分子的合成工艺日趋成熟，也有大量研究关注应用在生物成像、传感分析检测、光电器件等方面的金、银纳米簇。但是，作为贵金属，金和银在价格和含量上的合成代价比较大，因此，铜作为廉价易得、含量相对丰富的金属在荧光金属纳米簇上的研究潜力不容小觑。

近年来，荧光铜纳米簇作为一种理想的荧光探针吸引了很多研究者的关注，在环境监测和食品安全等领域，荧光分析法分析灵敏、操作简单、选择性好、准确度高且便捷高效。与传统的荧光探针如有机染料、量子点和荧光蛋白等相比，荧光金属纳米团簇具有可调光性、超细亚纳米尺寸、光稳定性好、高选择性和高生物相容性等优点，并且合成与修饰过程简单、对环境的危害也较小。目前，荧光铜纳米簇在催化、传感分析检测、细胞标记和细胞成像等方面的研究已经得到了初步研究和应用。

相比于荧光金纳米簇和银纳米作为新型发光材料的广泛研究和应用，铜纳米簇的合成仍处于初步阶段，其荧光性能也还较少得到实际应用。其限制原因主要在于超小尺寸的铜纳米簇的合成具有一定的难度，且铜离子在空气中容易氧化、聚集。此外，便捷可控、批量生产的方法也一直在探索中。而且，实现铜纳米簇荧光发射颜色及强度可调控性也需要继续深入探究。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种丝胶蛋白包裹的铜纳米簇的制备及荧光探针，本发明采用一步法制备了具有优异荧光反应的铜纳米簇，对砷离子(as³⁺)具有良好的选择性和灵敏度。

本发明的第一个目的是提供一种丝胶蛋白包裹的铜纳米簇，包括多个纳米粒子，所述纳米粒子包括丝胶蛋白壳以及包裹在所述丝胶蛋白壳中的铜纳米粒子，所述丝胶蛋白包裹的铜纳米簇的粒径为2-5nm。其中，丝胶蛋白的分子量为100kda-150kda。

进一步地，丝胶蛋白包裹的铜纳米簇在365nm紫外光的照射下呈现蓝紫色荧光，其最大激发波长和最大发射波长分别为350nm和425nm。

进一步地，丝胶蛋白包裹的铜纳米簇中，铜元素和丝胶蛋白的质量比为1:(31-62)。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测as³⁺的荧光探针，包括上述丝胶蛋白包裹的铜纳米簇。

进一步地，用于检测as³⁺的荧光探针可检测到的as³⁺的浓度为0.01-10ppm。

进一步地，可将上述丝胶蛋白包裹的铜纳米簇的水溶液用于检测as³⁺，丝胶蛋白包裹的铜纳米簇的水溶液的浓度为1mg/ml-4mg/ml。优选地，丝胶蛋白包裹的铜纳米簇的水溶液的浓度为1mg/ml-2mg/ml。

本发明的第三个目的是提供一种上述丝胶蛋白包裹的铜纳米簇的制备方法，包括以下步骤：

将铜盐的水溶液和丝胶蛋白水溶液混匀，然后向其中滴加碱的水溶液调节溶液的ph值至11-13，并在37℃-70℃下避光反应，反应完全后得到所述丝胶蛋白包裹的铜纳米簇的溶液。

在蚕丝加工过程中，脱去的丝胶蛋白往往当作废液处理，对于丝胶蛋白的回收利用很少。丝胶蛋白占蚕丝量的20％～30％，丝胶蛋白由外到内由多种蛋白质组成，且丝胶蛋白链上有许多侧链较长的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸等，其中大多数氨基酸具有强极性的侧基，如羟基、羧基和氨基等。

进一步地，铜盐为硫酸铜(cuso4)、氯化铜(cucl2)等，所述铜盐的水溶液的浓度为8-12mm。

进一步地，丝胶蛋白水溶液的浓度为40-60mg/ml。

进一步地，铜盐和丝胶蛋白的质量比为1:(31-62)。

进一步地，碱为氢氧化钠(naoh)、氨水(nh3·h2o)等。

进一步地，反应时间为14-16h。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明回收利用了通常蚕丝加工工程中作为废液处理的丝胶蛋白，将其应用到铜纳米簇的制备中，成功实现了资源的回收利用，并且延续绿色合成路线，一步法合成以丝胶蛋白为模版的铜纳米簇，其具有优异的荧光反应，且初步实现了铜纳米簇荧光发射颜色的稳定及强度可调控性。

本发明利用丝胶蛋白为合成荧光铜纳米簇的还原剂和保护剂，合成的荧光铜纳米簇具有少见的蓝紫光区的发射波长，且粒径均一、荧光效果好、毒性低。

本发明的实验方法简单，操作方便，成本低廉，对环境无污染，解决了作为废液处理的丝胶蛋白的资源浪费的问题；也解决了传统荧光探针粒径不够小，光稳定性不够好，灵敏度不足，工艺复杂的问题。

此外，通过荧光淬灭机理本发明的铜纳米簇可作为检测as³⁺的荧光探针，对as³⁺具有良好的选择性和较高的灵敏度。结合丝胶蛋白优异的生物相容性和荧光纳米铜簇在检测和治疗方面的潜力，本发明的铜纳米簇荧光探针在铜离子的检测，生物成像，治疗领域具有重要的意义和广阔的应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的丝胶@铜纳米簇溶液与纯丝素蛋白溶液的最大发射波长测试结果；

图2是本发明实施例1制备的不同浓度的丝胶@铜纳米簇溶液在日光灯和365nm的紫外灯下照射发光的照片；

图3是本发明实施例1制备的不同浓度的丝胶@铜纳米簇溶液的荧光强度测试结果；

图4是本发明实施例2中丝胶@铜纳米簇应用于重金属离子检测的测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本发明的一种丝胶蛋白包裹的铜纳米簇(以下简称丝胶@铜纳米簇)的合成方法，包括以下步骤：

(1)配制50mg/ml的丝胶蛋白(sericin)水溶液(100kda-150kda)，10mm的硫酸铜(cuso4)水溶液和1m的氢氧化钠(naoh)水溶液。

(2)将所配的丝胶蛋白水溶液、cuso4水溶液和naoh水溶液置于37℃的恒温箱中20分钟。将预热后的cuso4水溶液加入丝胶蛋白水溶液中，以1:4的体积比充分混合均匀后，逐滴向混合溶液中加入naoh水溶液，以调节溶液ph值为12，待三种溶液充分混合均匀后，在37℃的避光恒温箱中充分反应16小时，得到丝胶@铜纳米簇的溶液。

将丝胶@铜纳米簇溶液置于-20℃冰箱冷冻12小时后，移置-80℃的冷冻干燥机中冻干48小时以获得丝胶@铜纳米簇粉末，置于4℃避光环境下保存。

取以上制备的丝胶@铜纳米簇粉末溶于水，分别配置浓度为1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml和4mg/ml的丝胶@铜纳米簇溶液。

应用rf-5301荧光分光光度计测定浓度为4mg/ml的丝胶@铜纳米簇溶液的最大激发波长和最大发射波长，在300nm到800nm区间进行扫描，结果表明其最大激发波长和最大发射波长分别为350nm和425nm(图1)，与纯丝胶蛋白的荧光图谱对比可得所得荧光效果是由所制丝胶@铜纳米簇产生。

取浓度为1mg/ml的丝胶@铜纳米簇的溶液，分别置于日光灯和365nm的紫外灯下照射，结果如图2所示，结果表明本发明的丝胶@铜纳米簇的溶液在日光灯下呈黄绿色(图2a)，在365nm的紫外灯下呈现强烈的蓝紫色荧光(图2b)。

应用rf-5301荧光分光光度计测定溶液浓度与荧光强度的关系，结果如图3所示。结果表明，溶液浓度为1mg/ml-2mg/ml时，荧光强度较强。

实施例2

称量14等份实施例1制得的丝胶@铜纳米簇粉末0.01g，其中13份分别溶解于5ml的含有其中一种重金属阳离子(co²⁺,li⁺,k⁺,sr²⁺,ni²⁺,cd²⁺,na⁺,hg²⁺,zn²⁺,cu²⁺,ba²⁺,as³⁺或pb²⁺)水溶液中，另一份溶于5ml超纯水中作为空白对比样，置于37℃恒温振荡箱中，转速200rpm，恒温振荡30mins，以充分有效反应。取丝胶@铜纳米簇与重金属阳离子的反应溶液和对比样，使用rf-5301荧光分光光度计进行荧光强度的测定，结果如图4所示，结果表明as³⁺对丝胶@铜纳米簇具有显著的荧光淬灭作用，该丝胶@铜纳米簇对as³⁺具有单一的选择性和较高的灵敏度。

实施例3

按照实施例1的方法制备丝胶@铜纳米簇，不同之处在于：

在步骤(1)中，配置40mg/ml的丝胶蛋白水溶液，8mm的氯化铜水溶液和1m的氨水溶液。

在步骤(2)中，在ph值为11、50℃条件下反应14h。

实施例4

按照实施例1的方法制备丝胶@铜纳米簇，不同之处在于：在步骤(1)中，配置60mg/ml的丝胶蛋白水溶液，12mm的硫酸铜水溶液和1m的氨水溶液。

在步骤(2)中，在ph值为13、70℃条件下反应14h。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。