本发明涉及一种微量元素液体水溶肥的生产方法。
背景技术：
海藻肥料以天然海藻为原料，经过特殊生化工艺处理，提取并保留海藻天然活性成分，精炼浓缩而形成的一种新型有机肥料。海藻肥料具有提高作物产量和品质，抵抗病虫害及不良环境以及改良土壤保持水土的功效，其应用于农业生产有巨大的市场需求和良好的发展前景。但是，要保障海藻肥料的质量，就必须把握好海藻原料和提取工艺两个关键环节。
首先，海藻肥料质量的优劣取决于所用的原料。目前，海藻肥生产企业所用的原料主要以褐藻为主，包括泡叶藻、昆布、海带、马尾藻等。其他藻类如墨角藻、浒苔、石莼、卡帕藻等也有少数企业在用。国外海藻肥企业绝大多数使用褐藻为原料，其中尤以泡叶藻应用最为广泛如Seasol、Maxicrop等知名品牌，实际作用效果也表明泡叶藻是优质的海藻原料。但是，我国沿海没有泡叶藻分布，国内企业采用的原料种类繁杂，品质参差不一，造成海藻肥产品质量良莠不齐，甚至有些厂家打着“海藻肥”的幌子，直接勾兑褐藻酸，黄腐酸、氮磷钾等冒充海藻肥，影响了海藻肥质量，扰乱了海藻肥市场。
其次，决定海藻肥质量的第二个因素是提取工艺。不同的提取工艺对海藻肥活性成分的种类和含量影响巨大。目前，海藻活性成分的提取方法主要有化学法、物理法以及生物法。化学法主要是利用酸、碱及有机溶剂处理海藻细胞，使细胞消解或内源物质增溶，该方法操作简单，容易实现，也是国内外绝大多数海藻肥生产企业采用的方法。但是，化学试剂对海藻细胞内的活性物质成分的破坏是相当大的，并且残留的有机试剂对环境也是潜在的危害。物理法的原理是控制压力，温度等物理环境条件，利用机械力使海藻细胞破碎，内容物释放。该方法虽然工艺清洁、环境友好，但是对于仪器设备的要求严苛，反应条件变化剧烈，成本较高，难以实现大规模生产。生物法包括酶法降解和微生物发酵两种方法，其主要原理是破坏海藻细胞壁结构并降解大分子物质为植物容易吸收利用的小分子物质，该方法反应温和，产物多元化，整个生产过程安全环保无污染，是理想的海藻肥生产方法。
利用微生物发酵法生产海藻肥料的研究相对较少，仅有的几例研究是选用多种微生物对海藻原料进行类似堆肥发酵或好氧发酵处理，存在发酵过程可控性差，发酵周期长，目标产物不明确等问题，难以满足工业化生产要求的统一，稳定，可控的标准，产品的质量难以保障。
针对农业用微生物的评价指标主要包括菌剂的纯度和单位质量中的菌剂数量。因此，作为现有技术的菌剂制备方法一般是：在微生物适宜生存的温度和pH条件下进行一次发酵工艺，相当于温室培养。
由于目前土壤板结酸化严重，外界气温变化无常，温室培养的微生物菌剂直接投放到土壤中，因不能适应恶劣的土壤环境造成大量死亡，即使有少量存活因无法形成种群效应，也无法发挥微生物菌剂的效果。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种海藻复合分级发酵制备微量元素液体水溶肥的方法，第一、采用性能优良的产纤维素酶的巨大芽孢杆菌和降解海藻酸的嗜糖芽孢杆菌降解海藻，并模拟土壤自然生态环境，使发酵后的菌种在投入土壤后，能很快适应环境，确保存活率；第二、利用所述巨大芽孢杆菌和嗜糖芽孢杆菌发酵海藻液制备微量元素液体水溶肥，制备方法中发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
海藻复合分级发酵制备微量元素液体水溶肥的方法，其特征在于按照以下步骤进行：
1)、制备海藻粉末：将烘干后的海藻磨成粉末；
2)、制备产品A和种子液：海藻粉末与水按照质量比1～10∶100装入发酵罐中，在100～150℃条件下灭菌15～35min，得到产品A；
将巨大芽孢杆菌活化与扩培，制备巨大芽孢杆菌种子液X；将嗜糖芽孢杆菌活化与扩培，制备嗜糖芽孢杆菌种子液Y；
3)、制备产品B：将种子液X接种到产品A中，种子液X用量为产品A质量的1％～10％，发酵温度为30～37℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5～8，发酵时间为8～24h，得到产品B；
4)、制备产品C：调整产品B的pH至4.0～5.5，发酵罐内温度至0℃～5℃，保存2～5天，然后将温度调整至20℃～35℃，得到产品C；
5)、制备产品D：将种子液Y接种到产品C中，种子液Y用量为产品C质量的1％～10％，发酵温度为30～34℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5～8，发酵时间为8～24h，得到产品D；
6)、制备产品E：调整产品D的pH至4.0～5.5，发酵罐内温度至0℃～5℃，保存2～7天，然后将温度调整至25℃～35℃，得到产品E；
7)、制备海藻提取液：将产品E压滤得到海藻渣及滤液，其中滤液为海藻提取液；
8)、制备微量元素液体水溶肥：将步骤7)得到的海藻提取液与微量元素混合，搅拌至溶解完全，得到微量元素液体水溶肥；其中海藻提取液与微量元素的质量比为60～80∶20～40。
步骤1)中的海藻为铜藻、海带、鼠尾藻和马尾藻中的一种或者任意比例的两种以上。
步骤2)中巨大芽孢杆菌的活化与扩培：液体培养基按照以下质量比配成：羧甲基纤维素钠10份、胰蛋白胨10份、磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钠3份、氯化铁3份、氯化钠0.5份和蒸馏水1000份；巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5∶100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为20h；
步骤2)中嗜糖芽孢杆菌的活化与扩培：液体培养基按照以下质量比配成：海藻酸钠5份、硫酸铵5份、硫酸镁1份、磷酸氢二钾2份、硫酸亚铁0.01份和蒸馏水1000份；嗜糖芽孢杆菌接种至液体培养基中，嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5∶100，，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为20h。
步骤2)中所述海藻粉末和水的质量比为4∶100，灭菌温度115℃，灭菌时间25min；
步骤4)中，调整产品B的pH至5.0，发酵罐内温度至5℃，保存3天，然后将温度调整至20℃。
步骤6)中，调整产品D的pH至5.0，发酵罐内温度至5℃，保存3天，然后将温度调整至25℃。
所述的酸碱调节剂为柠檬酸，草酸，醋酸，磷酸氢二钾，碳酸钠，醋酸钠中的一种或任意比例的两种以上。
所述微量元素是乙二胺四乙酸二钠锌、乙二胺四乙酸二钠亚铁、乙二胺四乙酸二钠铜、乙二胺四乙酸二钠锰、七水硫酸锌、七水硫酸亚铁、五水硫酸铜、一水硫酸锰、钼酸铵、钼酸钠、硼酸和硼砂中的一种或任意比例的两种以上。
所述巨大芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌YIC～BM1，保藏号为CGMCC No.12156。
所述嗜糖芽孢杆菌是嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，保藏号为CGMCC No.12155。
发明具有以下有益技术效果：
本发明采用的巨大芽孢菌株具有产纤维素酶的能力，能够破坏海藻细胞壁结构促使海藻体内更多营养物质得以释放。本发明采用的嗜糖芽孢杆菌具有降解褐藻酸的能力，一方面能够降解褐藻酸生成小分子量的褐藻寡糖等易于植物吸收利用的营养成分，另一方面破坏海藻细胞壁结构促使海藻体内更多营养物质得以释放。利用该菌株发酵处理铜藻、鼠尾藻、马尾藻属等海藻原料，发酵一定天数后，以此发酵液作为海藻肥母液，直接或者复配N、P、K，微量元素，氨基酸，有机质等有效成分用于农作物生长。肥效实验表明，利用该方法获得发酵液能够明显促进植物根系生长，改良土壤微环境，提高作物产量。
本发明还具有以下特点：
1、本发明采用巨大芽孢杆菌YIC～BM1以及嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3对海藻发酵，能够破坏海藻细胞壁结构促使海藻体内更多营养物质得以释放，发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。
2、本发明采用复合菌种发酵，各类菌株发挥协同作用，效果肥效均明显优于单一的菌种发酵，而且纯生物发酵，保证了海藻活性成分不受破坏。
3、本发明采用的复合菌种发酵不同于简单的将不同的菌种种子液混合发酵，而是根据微生物的作用不同，按照先后次序依次分级发酵，避免了微生物菌群间的相互竞争拮抗，减少内耗，将各自菌群的作用发挥到最大化，保证了最好的效果。
4、本发明将微量元素与海藻中有效成分结合，可明显提高作物抗逆、抗病性。易于植物吸收利用，同时海藻活性成分作为一种重要的信号分子，能够参与植物的生长调节和诱导抗病过程促进植物的生长，提高植物对不良环境及病虫害的抵抗力。
5、本发明通过调节发酵条件使发酵出的菌株具备适应恶劣的土壤环境的能力，有利于菌功能的发挥。
6、本发明通过缓慢的温度调节，使菌株适应温度的变化，避免温度变化过快，菌株不能适应而大量死亡。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实施例1
将洗净烘干后的新鲜鼠尾藻磨成50～60目粉末。
海藻粉末与水按照质量比4∶100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A。
并制备种子液：
种子液X的制备实例：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5∶100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为20h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液X；
种子液Y的制备实例：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基，嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5∶100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为20h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液Y；
将种子液X加入到产品A中，其中种子液X与产品A的质量比为5∶100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品B；调整产品B的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品的温度至20℃，得到产品C；然后补充种子液Y，补充的种子液Y与产品C的质量比为5∶100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品D；调整产品D的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至25℃，得到产品E；将产品E压滤后得到海藻提取液；将海藻提取液、乙二胺四乙酸二钠锌、乙二胺四乙酸二钠亚铁、乙二胺四乙酸二钠铜和硼砂按照质量比65∶15∶10∶9∶1混合，搅拌溶解全完后，即为本发明产品。
实施例2
将洗净烘干后的新鲜铜藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比4∶100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A。
并制备种子液：
种子液X的制备实例：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5∶100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液X；
种子液Y的制备实例：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基，嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5∶100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液Y；
将种子液X加入到产品A中，其中种子液X与产品A的质量比为5∶100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品B；调整产品B的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品的温度至20℃，得到产品C；然后补充种子液Y，补充的种子液Y与产品C的质量比为5∶100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品D；调整产品D的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至25℃，得到产品E；将产品E压滤后得到含巨大芽孢杆菌YIC～BM1和嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3海藻滤液；将含菌海藻滤液、乙二胺四乙酸二钠锌、七水硫酸锌、一水硫酸锰、乙二胺四乙酸二钠铜和钼酸铵按照质量比67.5∶10∶2∶10∶10∶0.5混合，搅拌溶解全完后，即为本发明产品。
实施例3
将洗净烘干后的新鲜铜藻和新鲜马尾藻按照质量比1∶1复配，磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比4∶100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A。
并制备种子液：
种子液X的制备实例：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5∶100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液X；
种子液Y的制备实例：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基，嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5∶100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液Y；
将种子液X加入到产品A中，其中种子液X与产品A的质量比为5∶100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品B；调整产品B的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品的温度至20℃，得到产品C；然后补充种子液Y，补充的种子液Y与产品C的质量比为5∶100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品D；调整产品D的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至25℃，得到产品E；将产品E压滤后得到含巨大芽孢杆菌YIC～BM1和嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3海藻滤液；将含菌海藻滤液与七水硫酸锌、硼酸按照质量比60∶30∶10混合，搅拌溶解全完后，即为本发明产品。
实施例4
将洗净烘干后的海带磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比4∶100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A。
并制备种子液：
种子液X的制备实例：将产纤维素酶的巨大芽孢杆菌YIC～BM1接种至液体培养基，巨大芽孢杆菌YIC～BM1和培养基的体积比例为5∶100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液X；
种子液Y的制备实例：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基，嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5∶100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h；活化之后按同样操作步骤扩培，得到种子液Y；
将种子液X加入到产品A中，其中种子液X与产品A的质量比为5：100，发酵温度为32℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品B；调整产品B的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品的温度至20℃，得到产品C；然后补充种子液Y，补充的种子液Y与产品C的质量比为5∶100，发酵温度为30℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20％，转速为200r/min，通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为24h，得到产品D；调整产品D的pH至5.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存3天，以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至25℃，得到产品E；将产品E压滤后得到含巨大芽孢杆菌YIC～BM1和嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3海藻滤液；将含菌海藻滤液与乙二胺四乙酸二钠锌、乙二胺四乙酸二钠亚铁、乙二胺四乙酸二钠锰、乙二胺四乙酸二钠铜、硼酸和钼酸铵按照质量比70∶8∶8∶7.5∶5∶1∶0.5混合，搅拌溶解全完后，即为本发明产品。
上述实施例中酸调节剂是柠檬酸，碱调节剂是碳酸钠。
下面结合实验数据进一步说明本发明有益效果：
1材料与方法：
1.1试验地点：五洲丰农业科技有限公司试验基地，中性棕壤，中高肥力。
1.2试验供试材料：普通微量元素液体水溶肥样品(除不加海藻提取液外，其它制备条件与本发明产品相同)与本发明产品；同样管理的小油菜。
1.3试验设计：
处理1(T1)：实施例1所述海藻微量元素液体水溶肥；
处理2(T2)：实施例2所述海藻微量元素液体水溶肥；
处理3(T3)：实施例3所述海藻微量元素液体水溶肥；
处理4(T4)：实施例4所述海藻微量元素液体水溶肥；
对照处理(CK1-4)：处理T1-T4对应的对照普通微量元素液体水溶肥(除不加海藻提取液外，其它制备条件与本发明产品相同)。
各处理除了实验肥料不同外，其他农艺管理措施均一致。每个处理3次重复，随机区组排列，根据作物生长情况分3次叶面喷施，分别将0.1kg实验肥料溶解于200kg水中，进行叶面喷施，小区面积100m2，四周设保护行，南北向，行距22cm，株距16cm，每小区2840株。
2结果与分析
2.1不同处理对小油菜产量的影响
表1不同处理对产量的影响
结果表明：在施肥量相当的情况下，喷施本发明产品的小油菜较对照，能明显看出叶片浓绿肥厚，明显提升作物品质，大大降低了作用病虫害，有效增强作物的抗性。
本发明所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的保藏号为CGMCC No.12156；保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillus megaterium。
所述巨大芽孢杆菌YIC～BM1的生物特性如下：
YIC～BM1菌株在纤维素培养基平板上生长48h后，菌落圆形，白色，表面平整。显微镜观察菌株为革兰氏阳性，杆状，能运动，产芽孢。生长温度范围20～40℃，PH范围6-10，NaCl浓度范围0～20％，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH 7.5。触酶，氧化酶，半乳糖苷酶阳性，吲哚，VP实验阴性，不还原硝酸；能够利用葡萄糖，甘露糖，乳糖，棉子糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇，山梨醇。根据其生理生化特征，基因序列及系统发育树信息，将该菌株鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。
本发明所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No.12155；保藏单位名称是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年3月2日；拉丁文分类命名为：Bacillus halosaccharovorans。
所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的生物特性如下：
YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生长48h后，菌落不规则，淡黄色，中间不透明，边缘半透明，表面褶皱。显微镜观察菌株为杆状，在末端或近末端可产生芽孢，革兰氏阳性，能运动，生长后期菌体易聚集成团。生长温度范围20～45℃，PH范围6～9，NaCl浓度范围0～15％，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH 7.5。触酶，氧化酶，VP试验阳性，能够利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，淀粉；不能利用山梨醇，纤维素。根据其生理生化特征，基因序列及系统发育树信息，将该菌株鉴定为嗜糖芽孢杆菌Bacillus halosaccharovorans。
注：+表示可以利用，～表示不能利用。