本发明属于固氮菌肥制备领域，具体涉及一种巨菌草固氮菌肥及其制备方法。
背景技术：
巨菌草（pennisetumsp.）隶属于狼尾草属，多年生，直立，丛生，根系发达，抗逆性强，产量高。巨菌草是2005-2007年间由福建农林大学菌草研究所与莱索托农业部合作南非引进的品种经改良培育而成，为典型的四碳植物，宜在热带、亚热带、温带生长。巨菌草营养丰富，蛋白质、糖分含量高，用途广泛，既可作为食（药）用菌的生产栽培原料，以草代木栽培食(药)用菌，又可作为成牛羊鹿等动物饲料，还具有较强的防风固沙的生态治理功能，并可用于发电等，是一种具有广阔应用潜力的生态草、能源草。目前，巨菌草已在我国的西藏、内蒙古、青海、宁夏、甘肃等土地贫瘠的沙漠、流动沙丘等地种植生长，其种植后沙地有机质、酶活性及微生物数量有明显增加，固沙效果明显。经测定，种植后菌草的总氮含量超过了其从土壤和肥料中的摄取的总氮量，其原因很大可能是巨菌草内生固氮菌起了作用。内生固氮菌可以在根际或植物体内进行联合固氮，为植物生长提供氮素或促生长物质，可为植物（如甘蔗）生长提供高达60％的氮素，同时内生固氮菌还可通过分泌植物生长激素等多种生理活性物质，与病原菌竞争营养和空间，从多方面促进植物生长，在农业生产实践中具有广阔的应用前景。因此，从巨菌草中分离内生固氮菌并开发出具有应用潜力的固氮菌肥施用于巨菌草、玉米等禾本科植物具有技术的可行性和较强的应用前景。
在公知技术中，目前我国施用于禾本科植物的固氮菌肥料多采用联合固氮菌，如园褐固氮菌、棕色固氮菌、阴沟肠杆菌等，但实际应用时固氮量低、应用效果不稳定。这些菌株或从土壤中分离、或从禾本科植物的根部分离，配制菌肥时多直接应用发酵液或使用简单载体吸附后储存使用。这类菌液有效期短，固体菌剂含有效活菌数低，且因纯培养的固氮菌在施入土壤时会因环境条件骤变而大量死亡，应用效果受到严重影响。有关研究表明，联合固氮菌在自然条件下固氮效率低、田间效果不稳定主要是受到能量供应、铵盐抑制和固氮酶有氧失活影响。联合固氮菌生物固氮作用耗能大，根表固氮菌的碳源供应十分有限，造成了固氮菌的固氮效率受到了影响。能量供应限制成为了固氮菌固氮效率低下的主要限制因素。有研究采用了基因工程菌，克隆了能控制四碳二烯酸运输的dna片段及其所编码的多肽用于制备固氮菌肥，取得了一定的应用效果。但由于基因工程菌的应用限制及其稳定性问题，此类基因工程改造的固氮菌肥实际应用还有一段的距离。
有鉴于此，本发明提供了一种新的固氮菌菌肥配制工艺，固氮菌直接分离自巨菌草根部，液体扩培后加入一定量的红糖，混匀与载体结合后发酵制备而成。载体采用巨菌草本身，结合部分全菌草（药）用菌菌糟，并添加了一定比例的红糖水、镁盐、钙盐等营养成分，保证了固氮菌生长及固氮所需的能量。发酵方式采用带呼吸阀的移动袋装发酵，工艺操作简便，适合工业化生产，且菌株生长营养充足、固氮酶活性保留时间长，能充分利用菌糟等废弃物料，拓宽了食（药）用菌生产产业链，应用前景广阔。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种巨菌草固氮菌肥及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种巨菌草固氮菌肥，所述巨菌草固氮菌肥的原料组成为：巨菌草650～750kg、菌草食（药）用菌菌糟250～350g、菌液150～200ml和营养液100～150ml；所述菌液是以肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）为生产菌株，在lb液体培养基中培养得到，具体过程为：肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）菌株固体活化扩培后，接种至lb液体培养基中，在28～30℃、150～180r/min的条件下恒温振荡培养18～24h，od600值达1.5以上；所述食（药）用菌菌糟为灵芝、香菇、木耳和杏鲍菇菌糟中的任一种；所述营养液由以下组分配制而成：红糖3～5g、过磷酸钙1～2g和硫酸镁0.05～0.15g，100ml水溶解。
所述肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）菌株分离来自巨菌草的根部、茎部或叶部，通过ashby无氮培养基培养而成的高固氮酶活型的菌株。其菌落形态圆形、乳白色、水滴状，接种环挑易拉成丝；光学显微镜下，较粗短杆状、大小0.5～0.8×1～2um、单独、成双或短链状排列；无芽孢，无鞭毛、有较厚荚膜，有菌毛，革兰式染色阴性，有荚膜，无鞭毛。经16srrna提取鉴定为肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）。
该菌株的生理生化鉴定结果表明：其能利用葡萄糖、乳糖；硝酸盐还原、枸橼酸、vp试验、丙二酸盐、柠檬酸盐试验阳性；氧化酶、吲哚、甲基红试验阴性。此外，经测定，该菌还具有一定的产生铁载体能和产氨能力，所产生的氨能分泌到液体发酵培养基中，测得发酵液中铵态氮含量2.5±0.2mg/l；生长过程中能分泌吲哚乙酸（iaa），且在有色氨酸的情况下产量要远大于无色氨酸，为72.4±5.2ug/ml；在有机、无机磷培养基上均能形成明显的溶磷圈，具有一定的溶磷能力，为113.8±4.8ug/ml；其固氮酶活性在有氮源存在的时候（lb培养基中）要明显高于无氮培养基(改良kfb培养基)中，为524.3±11.3nmolc2h4/(ml·h)。
一种如上所述的巨菌草固氮菌肥的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料预处理：a.巨菌草：采用拔节期的巨菌草，收割其茎、叶部位，采用菌草粉碎机粉碎，低温烘干，过80-100目筛子；b.菌草食（药）用菌菌糟：收集无杂质、无霉变的全部由菌草栽培的食（药）用菌菌糟，低温烘干，粉碎，过80-100目筛；
（2）固氮菌肥的制备：先将步骤（1）处理的巨菌草和菌草食（药）用菌菌糟按比例混合均匀后，直接与菌液和营养液按配方混合均匀，一起装入发酵装置中，密封发酵，待发酵物料中颜色变深明显，发酵结束即制得所述巨菌草固氮菌肥。
步骤（1）烘干的温度为40~50℃。
步骤（2）发酵条件为：温度：25～32℃，时间：5～10d。
步骤（2）发酵装置：用带呼吸阀的发酵袋，带有单向透气孔的pe膜，4-5层厚，透气孔经8～10mm，透氧量2.10～4.35cm3/m2.bar.d，排气压力574～712mmh2o，袋装容量为1kg～20kg。
本发明的有益效果在于：
（1）巨菌草中分离、筛选了高固氮酶活性的内生固氮菌肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola），且其具有较强的溶磷、分泌铵盐的能力，该固氮菌在lb液体培养中的固氮酶活性要强于在改良kps无氮培养基中，采用lb液体培养基扩培养菌液，操作简便、成本低廉、生长速度快、菌量多、不易受杂菌污染；
（2）采用固氮菌株来源的植物巨菌草作为载体，提高了菌体的存活能力；
（3）采用菌草食（药）用菌菌糟作为配比载体，拓宽了菌糟的利用途径，且能较好的满足内生菌株的生长：
（4）添加红糖水作为碳源，并结合了一定各钙盐、镁盐，满足了菌体的营养需求；
（5）克服了传统固氮菌肥制备采用薄膜覆盖发酵，易污染和发酵温度高，易杀灭固氮菌的缺点。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
一种巨菌草固氮菌肥，所述巨菌草固氮菌肥的原料组成为：巨菌草650kg、菌草食（药）用菌菌糟250g、菌液150ml和营养液100ml；所述菌液是以肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）为生产菌株，在lb液体培养基中培养得到，具体过程为：肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）菌株固体活化扩培后，接种至lb液体培养基中，在28℃150r/min的条件下恒温振荡培养18h，od600值达1.5以上；所述食（药）用菌菌糟为灵芝菌糟；所述营养液由以下组分配制而成：红糖3g、过磷酸钙1g和硫酸镁0.05g，水100ml溶解。
一种如上所述的巨菌草固氮菌肥的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料预处理：a.巨菌草：采用拔节期的巨菌草，收割其茎、叶，采用菌草粉碎机粉碎，40℃烘干，过80目筛；b.菌草食（药）用菌菌糟：收集无杂质、无霉变的全部用菌草栽培的食（药）用菌菌糟，低温烘干，粉碎，过80目筛；
（2）固氮菌肥的制备：先将步骤（1）处理的巨菌草和菌草食（药）用菌菌糟按比例混合均匀后，直接与菌液和营养液按配方混合均匀，一起装入发酵装置中，密封发酵（温度25℃，时间5d），待发酵物料中颜色变深明显，发酵结束即制得所述巨菌草固氮菌肥；发酵装置：用带呼吸阀的发酵袋，带有单向透气孔的pe膜，4层厚，透气孔经8mm，透氧量2.10cm3/m2.bar.d，排气压力574mmh2o，袋装容量为2kg。
固氮菌肥产品性能的鉴定：按照农业行业标准ny411-2000固氮菌肥料对所制备的固氮菌肥各项指标进行测定，结果表明，所测的固氮菌肥其外观为黑褐色粉状、湿润、较为松散，无异臭味；含水量：32%（v/m）；ph7.0；细度，以过孔径0.18mm标准筛余物计算，11.3%（m/m）；有效活菌数5.1×108个/g；杂菌率13.1%（个//个）；有效期9个月。各项指标均符合农业行业标准ny411-2000固氮菌肥料标准。
实施例2
一种巨菌草固氮菌肥，所述巨菌草固氮菌肥的原料组成为：巨菌草750kg、菌草食（药）用菌菌糟350g、菌液200ml和营养液150ml；所述菌液是以肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）为生产菌株，在lb液体培养基中培养得到，具体过程为：肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）菌株固体活化扩培后，接种至lb液体培养基中，在30℃、180r/min的条件下恒温振荡培养24h，od600值达1.5以上；所述食（药）用菌菌糟为木耳菌糟；所述营养液由以下组分配制而成：红糖5g、过磷酸钙2g和硫酸镁0.15g，100ml水溶解。
一种如上所述的巨菌草固氮菌肥的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料预处理：a.巨菌草：采用拔节期的巨菌草，收割其茎、叶，采用菌草粉碎机粉碎，45℃烘干，过100目筛；b.菌草食（药）用菌菌糟：收集无杂质、无霉变的全部由菌草栽培的食（药）用菌菌糟，低温烘干，粉碎，过100目筛；
（2）固氮菌肥的制备：先将步骤（1）处理的巨菌草和菌草食（药）用菌菌糟按比例混合均匀后，直接与菌液和营养液按配方混合均匀，一起装入发酵装置中，密封发酵（温度32℃，时间10d），待发酵物料中颜色变深明显，发酵结束即制得所述巨菌草固氮菌肥；发酵装置：用带呼吸阀的发酵袋，带有单向透气孔的pe膜，5层厚，透气孔经9mm，透氧量4.35cm3/m2.bar.d，排气压力712mmh2o，袋装容量为20kg。
固氮菌肥产品性能的鉴定：按照农业行业标准ny411-2000固氮菌肥料对所制备的固氮菌肥各项指标进行测定，结果表明，所测的固氮菌肥其外观为黑褐色粉状、湿润、较为松散，无异臭味；含水量：30%（v/m）；ph7.2；细度，以过孔径0.18mm标准筛余物计算，12.5%（m/m）；有效活菌数5.7×108个/g；杂菌率12.5%（个//个）；有效期10个月。各项指标均符合农业行业标准ny411-2000固氮菌肥料标准。
实施例3
一种巨菌草固氮菌肥，所述巨菌草固氮菌肥的原料组成为：巨菌草700kg、菌草食（药）用菌菌糟300g、菌液175ml和营养液125ml；所述菌液是以肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）为生产菌株，在lb液体培养基中培养得到，具体过程为：肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）菌株固体活化扩培后，接种至lb液体培养基中，在29℃、165r/min的条件下恒温振荡培养21h，od600值达1.5以上；所述食（药）用菌菌糟为香菇菌糟；所述营养液由以下组分配制而成：红糖4g、过磷酸钙1.5g和硫酸镁0.08g，100ml水溶解。
一种如上所述的巨菌草固氮菌肥的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料预处理：a.巨菌草：采用拔节期的巨菌草，收割其茎、叶，采用菌草粉碎机粉碎，50℃烘干，过90目筛子；b.菌草食（药）用菌菌糟：收集无杂质、无霉变的全部用菌草栽培的食（药）用菌菌糟，低温烘干，粉碎，过90目筛；
（2）固氮菌肥的制备：先将步骤（1）处理的巨菌草和菌草食（药）用菌菌糟按比例混合均匀后，直接与菌液和营养液按配方混合均匀，一起装入发酵装置中，密封发酵（温度28℃，时间8d），待发酵物料中颜色变深明显，发酵结束即制得所述巨菌草固氮菌肥；发酵装置：用带有单向透气孔的pe膜，5层厚，透气孔经9mm，透氧量3.5cm3/m2.bar.d，排气压力650mmh2o，袋装容量为10kg。
固氮菌肥产品性能的鉴定：按照农业行业标准ny411-2000固氮菌肥料对所制备的固氮菌肥各项指标进行测定，结果表明，所测的固氮菌肥其外观为黑褐色粉状、湿润、较为松散，无异臭味；含水量：31%（v/m）；ph6.8；细度，以过孔径0.18mm标准筛余物计算，10.1%（m/m）；有效活菌数4.2×108个/g；杂菌率12.5%（个//个）；有效期9个月。各项指标均符合农业行业标准ny411-2000固氮菌肥料标准。
实施例4
一种巨菌草固氮菌肥，所述巨菌草固氮菌肥的原料组成为：巨菌草700kg、菌草食（药）用菌菌糟300g、菌液200ml和营养液150ml；所述菌液是以肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）为生产菌株，在lb液体培养基中培养得到，具体过程为：肺炎克雷伯菌（klebasiellavarlicola）菌株固体活化扩培后，接种至lb液体培养基中，在30℃、150r/min的条件下恒温振荡培养20h，od600值达2.0；所述食（药）用菌菌糟为杏鲍菇菌糟；所述营养液由以下组分配制而成：红糖4g、过磷酸钙1.5g和硫酸镁0.10g，100ml水溶解。
一种如上所述的巨菌草固氮菌肥的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料预处理：a.巨菌草：采用拔节期的巨菌草，收集其茎、叶部位，采用菌草粉碎机粉碎，45℃烘干，过100目筛；b.菌草食（药）用菌菌糟：收集无杂质、无霉变的全部由菌草栽培的食（药）用菌菌糟，低温烘干，粉碎，过100目筛；
（2）固氮菌肥的制备：先将步骤（1）处理的巨菌草和菌草食（药）用菌菌糟按比例混合均匀后，无需灭菌，直接与菌液和营养液按配方混合均匀，一起装入发酵装置中，密封发酵（温度30℃，时间7d），待发酵物料中颜色变深明显，发酵结束即制得所述巨菌草固氮菌肥；所述发酵装置：用带呼吸阀的发酵袋，带有单向透气孔的pe膜，5层厚，透气孔经10mm，透氧量4.10cm3/m2.bar.d，排气压力700mmh2o，袋装容量为1kg。
固氮菌肥产品性能的鉴定：按照农业行业标准ny411-2000固氮菌肥料对所制备的固氮菌肥各项指标进行测定，结果表明，所测的固氮菌肥其外观为黑褐色粉状、湿润、较为松散，无异臭味；含水量：33%（v/m）；ph7.0；细度，以过孔径0.18mm标准筛余物计算，10.2%（m/m）；有效活菌数4.8×108个/g；杂菌率12.9%（个//个）；有效期12个月。各项指标均符合农业行业标准ny411-2000固氮菌肥料标准。
菌肥的肥效试验
（1）发芽率试验：将菌肥用无菌水稀释10倍，200r/min30℃恒温摇床浸提4h，4000r/min离心取上清液，将上清液分别稀释成原浸提液的10～100%（v/v）。将玉米种子置于培养皿中，底部加一张滤纸保湿，每个培养皿加100粒玉米种子，添加10～20ml不同浓度的稀释液浸泡，每个稀释液重复三次试验，并以无菌水作为对照。将培养皿置于25℃培养箱内发芽，培养5～7d,计数其发芽种子数和发芽率。
试验结果表明：在稀释液70～100%的范围内，浓度越高，玉米种子发芽率越低，且发芽率低于无菌水浸泡的对照，说明菌肥浸提液对玉米种子有一定的毒副作用；当浓度60%时，稀释液组的玉米种子发芽率与无菌水相当，发芽率达到最高，可达90～95%；当浓度10%~50%时，浓度越高，玉米种子发芽率越高，且稀释液组的玉米种子发芽率高于无菌水对照组，说明低浓度菌肥浸提液对玉米种子发芽有一定的促进生长作用。
（2）盆栽试验：
分为三个处理组，分别为普通泥土的对照组、普通泥土加上5%未接固氮菌和营养液的菌草和全菌草菌糟按比例混合原料、普通泥土加5%菌肥。挑选生长基本一致、刚发芽的玉米种子，测定其根长、芽长，播种于一次性的塑料杯中，每个杯子播种1粒种子，置于三种处理组的杯中进行培养，每组处理组10个重复。培养14d，统计其出苗天数、根长、苗长，对比不同处理组的试验效果。
试验结果表明，施种菌肥能显著的促进根的生长、出苗及苗的生长，具有明显的促生效果。其中，出苗天数提前了3d，提前了50%；根长增加4.1cm，提高164%；苗长增长7cm，提高100%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。