一种利用菌糠废弃物生产生物肥料增效剂的方法及应用与流程

本发明属于废弃物资源化利用领域，具体涉及一种利用菌糠废弃物生产生物肥料增效剂的方法及应用。

背景技术：

微生物肥料是指一类含有活体微生物的特定制品，通过微生物的生命活动及其代谢产物带来肥效。随着我国化肥和农药使用量的增加，带来了一系列的生态和经济问题，如土壤板结、酸化、土传病害加重，水体富营养化，同时化肥使用量虽在增加，但利用效率却越来越低，作物增产甚微，生产成本提高，农民的经济收入降低，严重打击了生产积极性，从而限制了农业的发展。我国明确提出“减肥减药”和化肥零增长的目标，这为微生物肥料的发展带来了机遇。研究表明，微生物肥料可以增加化肥的利用率，提高作物的品质，改善土壤结构，增加作物的抗逆和抗病性，提高作物产量，是一类绿色、环保、无毒的新型肥料。康萍之等研究表明施入微生物菌剂能够明显改善设施瓜菜根围土壤微生态环境，降低有害病原菌，减轻土传病害发生，促进作物健康生长，其增产率最高可达16.06％；saravananetal.(2003)通过实验筛选出8种对香蕉镰刀菌枯萎病菌具有拮抗作用的菌株，其中pseudomonasfluorescens菌株对该病原菌的抑制活性最高，且将拮抗菌与假楝树的压滤渣混合后施用可以取得最好的拮抗效果。但微生物肥料在应用和实践中也存在许多问题，其中最突出的是功能微生物的适应性，由于土壤中存在着土著微生物，它们对区域环境具有极强的适应性，使得外来微生物很难繁殖壮大，这就给生物肥料菌种在作物根际的定殖和发挥功效提供了障碍；管文芳等研究发现，与对照组相比，在温室栽培条件下经微生物肥料“宁盾”粉剂处理叶菜类植物鲜重增加了187％，干重增加了166％，而田间小区条件下经微生物肥料“宁盾”粉剂处理叶菜类植物鲜重只增加了33.2％，干重只增加了61.2％；周晨昊等研究表明盆栽试验中小白菜全株鲜重增加了45.6％，而大棚种植试验中，小白菜鲜重只增加了18.2％。所以，微生物肥料在田间效果还不够稳定。

厌氧发酵是指在缺氧或无氧条件下，由兼性厌氧菌和专性厌氧菌联合降解有机物，最终会生成二氧化碳和甲烷等气体。依据“三阶段理论”，厌氧发酵分为水解、产酸、产甲烷三个阶段。水解阶段，是在水解和发酵细菌的作用下，将碳水化合物、蛋白质、脂肪的大分子物质水解为单糖、氨基酸、脂肪酸、甘油等小分子物质；产酸阶段，是在产氢产乙酸菌作用下，将水解阶段的产物进一步分解为氢、二氧化碳和乙酸；产甲烷阶段，是通过两种产甲烷菌的作用，一组是把氢和二氧化碳转化为甲烷，一组是对乙酸脱羧产生甲烷。三者之间即相互作用又相互影响。目前有关厌氧发酵产酸研究较多的是城市污泥及餐厨垃圾等含有机质较为丰富的物质，且大部分针对产酸工艺优化的研究，蔡伟娜等指出较高的温度不仅有利于污泥水解发酵过程中有机物的溶解，而且会极大的促进中间产物有机酸的生成，但甲烷菌的生长会受到抑制。陈兴春等研究发现和碱性环境相比，在ph＝6.5时产酸更稳定，产酸量较高，但碱性条件更适合产乙酸；白杰等通过建模研究了c/n比条件对关键酶和产酸类型的影响；张玉静等研究发现当ph值为6.0时,餐厨垃圾水解酸化效果最好,比其他ph值条件下产生更多的有机酸。ph值为6.0时,vfa浓度与单位vs产酸量在第68h达到最大值,分别为40.89g/l和0.328gvfa/gvs,是不控制ph值时的8倍，由此可以看出ph值对发酵产物组成影响显著。需要指出的是，在产酸阶段，会产生短链有机酸和一些小分子的醇类和酮类物质，研究表明，有机酸类物质如苹果酸(rudrappaetal，2007)会促进根际促生菌(pgpr)的募集，大豆根系分泌物中的黄酮类物质也会吸引有益微生物，增加定殖(morrisetal，1998)。所以，探究产酸阶段产生的小分子物质对微生物肥料菌株趋化定殖影响具有重要的意义，而有关这方面的研究甚少。

菌糠又称蘑菇渣、菇渣和菌渣等，是指在生产上具有较少或已不具有提供养分能力的食用菌培养基。菌糠一般的成分主要包括秸秆、木屑、干草、玉米芯等高木质纤维性物料，米糠、麦麸、畜禽粪便、尿素等养分调理性物料，以及石灰粉、石膏粉等ph调理性物料等。菌糠具有较高的营养价值，即含有农作物生长所必需的氮、磷、钾等大量营养元素,钙、镁、硫等中量营养元素,铜、锌、铁、硼、钼、锰等微量元素，又含有有肌酸、黄酮类、多肽、少量生物碱、微量酚性物、以及皂甙植物甾醇及三萜皂甙等代谢物质。目前国内外对食用菌菌糠的利用途径较为广泛，主要包括：1、作为饲料，徐廷生等报道在奶牛日粮中添加5％和10％的菌糠替代等量的精料补充料，可分别提高产奶量4.85％和1.24％，乳脂率和乳比重没有显著差异，饲料成本下降4.11％和8.21％，经济效益明显提高；李超等用金针菇菌糠饲喂昌图仔鹅，结果表明，仔鹅对菌糠的采食速度可提高10％以上，采食量增加6.46％，试验组比对照组日增重提高4.48％，经济效益增加19.3％；马寿福等指出菌糠的营养相当于常规麦麸类饲料,可作为新型饲料资源应用于养殖业中,以降低饲料成本；zhang等研究发现用肋状拟内孢霉253发酵后的平菇菌糠粗蛋白的含量从24.1％增加到32.3％,发酵后的香菇菌糠粗蛋白的含量从28.4％增加到36.7％。2、作为肥料，菌糠作为肥料，在大豆田施用后，土壤中的有机质含量增加，速效磷增加，可使大豆的产量提高16.3％～25％。朱小平等人用菌糠加微生物或通过施用适宜的菌制剂，在菠菜等多种蔬菜作物上试验发现施用微生物加菌糠效果最好，提供植物营养活性库，降低农业生产成本，能够显著提高作物的产量；刘雯雯等证明了未经堆肥腐熟处理的菌糠作为微生物肥料的载体是可行的。3、作为土壤改良剂和修复剂，chiu等研究发现用3％的肺形侧耳菌糠可以有效的去除土壤中的31％～33％的溢油和51％～54％可塑剂；ribas等指出用10％的双孢蘑菇菌糠通过土壤生物降解可以使生菜增产1.3倍。而目前关于将菌糠废弃物缺氧发酵生产生物肥料增效剂的研究甚少，还有待进一步研究。

技术实现要素：

本发明针对目前菌糠废弃物资源丰富但实际利用效率低，微生物肥料田间效果不稳定的情况，开发研制了一种合理高效利用菌糠废弃物，且能够增强根际促生菌根际定殖数量，从而提高促生效果的缺氧发酵液态复合物。

本发明的另一目的是提供该液态复合物的生产方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种液态生物肥料增效剂，是由菌糠经缺氧发酵而成。

所述的菌糠由市场上购买所得，晾干后粉碎过筛。

所述的缺氧发酵是利用菌糠缺氧发酵装置，以菌糠废弃物为发酵底物接种驯化后的河底污泥进行缺氧发酵，缺氧发酵的生产条件为初始ph为7～8，驯化后的河底污泥接种量为发酵底物的10％～15％(物料的质量比，下同)，最终含水量为85％～90％，在35℃～40℃条件下发酵160h～170h。

本发明所用的驯化后的河底污泥，其驯化方法为：将新鲜的河底污泥按质量比为20％的接种量接种到菌糠废弃物中，最终含水量为85％，发酵温度为37℃，初始ph为6.0，发酵4天，将此发酵产物作为接种物，以菌糠废弃物为发酵底物再进行第二次发酵，第二次发酵所得的发酵产物为驯化后的河底污泥。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种菌糠缺氧发酵制得液态生物肥料增效剂的生产方法，生产工艺简单，设备要求低，制得的液态复合物对微生物肥料菌株的定殖促进效果好，可作为微生物肥料的增效剂使用或配施液体菌剂使用，且能够高效的资源化利用菌糠资源，对保护生态环境和人体健康具有重要意义。

本发明菌糠缺氧发酵制得的液态生物肥料增效剂含挥发性脂肪酸总量超过3.0mg/ml，稀释液用于解淀粉芽孢杆菌sqr9的趋化实验表明sqr9对稀释液趋化运动效果明显，通过盆栽实验发现稀释液能够显著增强sqr9在玉米根际的定殖数量，具有明显的促生效果。

附图说明

图1初始ph对菌糠缺氧发酵产挥发性脂肪酸总量的影响。

图2接种量对菌糠缺氧发酵产挥发性脂肪酸总量的影响。

图3含水量对菌糠缺氧发酵产挥发性脂肪酸总量的影响。

图4发酵温度对菌糠缺氧发酵产挥发性脂肪酸总量的影响。

图5发酵时间对菌糠缺氧发酵产挥发性脂肪酸总量的影响。

图6sqr9对不同倍数稀释液的趋化效果图。

图7菌糠缺氧发酵液稀释液对sqr9在根际定殖数量的影响和促生效果。生物材料保藏信息

sqr9，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年2月27日，保藏号为cgmccno.5808。

具体实施方式

本发明使用的菌糠厌氧发酵装置是根据菌糠缺氧发酵要求，由市场上购买所得(生产厂家：四川蜀牛玻璃仪器有限公司和南通百思泰实验器材有限公司；商品名称：棕色玻璃瓶和厌氧密封盖；型号：1l和内径4cm)。也可以采用其他满足缺氧发酵条件的装置。

实施例1

1、菌糠的获得

由市场上购买所得。

2、缺氧发酵产酸条件的研究

1)、初始ph：设定不同梯度的初始ph(5.0、6.0、7.0和8.0)，接种量为10％(质量比，下同)，含水量为85％，在35℃条件下发酵4天，通过抽滤进行固液分离，测定液体中挥发性脂肪酸总量。

结果：由图1可知，挥发性脂肪酸总量在初始ph5.0～8.0之间逐渐升高，初始ph在8.0时挥发性脂肪酸总量最高，达到3.11mg/ml。确定8.0为最优的发酵初始ph。

2)、接种量：设定不同接种量(5％、10％、15％和20％)，初始ph为6.0，含水量为85％，在35℃条件下发酵4天，通过抽滤进行固液分离，测定液体中的挥发性脂肪酸总量。

结果：由图2可知，接种量为15％(质量比)时，挥发性脂肪酸总量最高，达到了2.53mg/ml，因此确定接种量为15％为最优接种量。

3)、含水量：设定不同含水量(80％、85％、90％和95％)，初始ph为6.0，接种量为10％(质量比)，在35℃条件下发酵4天，通过抽滤进行固液分离，测定液体中挥发性脂肪酸总量。

结果：由图3可知，含水量为80％时，挥发性脂肪酸总量最高，85％与80％差异不显著，考虑到发酵的稳定性以及经济成本，确定85％为最优含水量。

4)、发酵温度：设定不同发酵温度(30℃、35℃、40℃和45℃)，初始ph为6.0，接种量为10％(质量比，下同)，含水量为85％，发酵4天，通过抽滤进行固液分离，测定液体中挥发性脂肪酸总量。

结果：由图4可知，当温度为35℃时，挥发性脂肪酸总量最高，达到2.32mg/ml，因此确定35℃为最优发酵温度。

5)、发酵时间：设定不同发酵时间(每12h取样一次，为期7天)，初始ph为6.0，接种量为10％(质量比，下同)，含水量为85％，发酵温度为35℃，每12h取样一次，通过抽滤进行固液分离，测定液体中挥发性脂肪酸总量。

结果：由图5可知，当发酵156h时，挥发性脂肪酸总量最高，达到3.56mg/ml，因此确定156h位最优发酵时间。

综上所述，最优缺氧发酵条件为：初始ph8.0，接种量15％，含水量85％，发酵温度35℃，发酵时间156h。挥发性脂肪酸总量达到3.55mg/ml。

3、sqr9对发酵液稀释液的趋化研究

通过平板趋化实验研究sqr9对各处理液的趋化效果，共设7个处理：

1)趋化缓冲液(阴性对照)；2)50μm柠檬酸(阳性对照)；3)菌糠缺氧发酵原液；4)菌糠缺氧发酵原液稀释10倍；5)菌糠缺氧发酵原液稀释100倍；6)菌糠缺氧发酵原液稀释1000倍；7)菌糠缺氧发酵原液稀释10000倍。每个处理3个重复，向培养皿的中间位置滴加10μl各处理液，然后，培养皿于室温下静置30min，观察培养皿中趋化圈的形成情况，结果如图6所示，与对照相比，sqr9对菌糠缺氧发酵液10倍、100倍、1000倍稀释液均表现出不同程度的趋化响应，其中稀释100倍、1000倍的趋化圈较大，即sqr9对菌糠缺氧发酵液稀释100倍、1000倍具有较明显的趋化效果。

4、菌糠缺氧发酵液稀释液对sqr9在根际定殖数量的影响和促生效果

sqr9菌悬液制备方法为：取-80℃甘油管保存的sqr9菌种在lb固体培养基平板上划线活化，置于37℃培养箱培养12小时。挑取单菌落于3ml液体lb试管，将在37℃，170r/min震荡培养10小时的菌液作为种子液。以1％(v/v)的接种量将种子液转接至盛有100ml液体lb培养基的250ml锥形瓶，在37℃，170r/min条件下培养至对数中期(od600＝1.0)，25℃离心收集菌体，弃上清液，菌体用灭菌蒸馏水洗涤3次后等体积重悬备用。

培养基质为土壤(黄棕壤)和石英砂的混合物，其中土壤：石英砂＝7:3。培养作物为玉米(珍糯2号)。采用real-timepcr技术研究菌糠缺氧发酵液稀释液对sqr9在根际定殖数量的影响，通过测定玉米的株高、地上部鲜重、地上部干重3个指标来分析相应的促生效果，试验共设7个处理：1)blank：不加sqr9和菌糠发酵液；2)j1000：不加sqr9，只施加菌糠发酵液1000倍稀释液；3)j1000+sqr9(i)：添加失活的sqr9，施加菌糠发酵液1000倍稀释液；4)water+sqr9：加sqr9，施加等体积的清水；5)j1000+sqr9：加sqr9，施加菌糠发酵液1000倍稀释液；6)j2000+sqr9：加sqr9，施加菌糠发酵液2000倍稀释液；7)j5000+sqr9：加sqr9，施加菌糠发酵液5000倍稀释液。每个处理设置20个重复，在无菌环境下用育苗基质将玉米培养至2叶期，选取长势一致的玉米苗移栽至培养钵中，每钵装培养基质1.5kg，每钵一棵苗。在移苗之前，先按照处理对每钵的培养基质进行喷菌，使每钵中sqr9终浓度为1×10⁷cfus·g^-1培养基质，每钵培养基质再均匀的喷洒50ml的菌糠发酵液各稀释液或50ml清水。整个盆栽试验历时28天，期间共取样3次，分别为移苗后7天、移苗后14天、移苗后28天。用dneasypowersoilkit提取玉米根际土dna，sqr9特异性引物为2f:5’-atagcaagagcgaggcagaagt-3’；2r:5’-cagaggaatcatcaacaccaacagt-3’，real-timepcr仪器型号为steponeplus，反应体系为：sybrpremixextaq^tmⅱ10μl、pcrforwardprimer(10μm)0.4μl、pcrreverseprimer(10μm)0.4μl、roxreferencedye0.4μl、dna模板2μl、ddh2o6.8μl，总体系为20μl。采用两步法pcr扩增程序：stage1：95℃30秒；stage2：reps40、95℃5秒、60℃34秒。dissociationstage：95℃15秒、60℃1分钟、95℃15秒。real-timepcr结果如图7所示，与对照组water+sqr9相比，无论是移苗后7天、移苗后14天，还是移苗后28天，j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9处理的sqr9dna拷贝数值均有所提高，其中j2000+sqr9、j5000+sqr9处理组达到显著水平，说明施用菌糠发酵液1000倍稀释液、2000倍稀释液、5000倍稀释液均能够提高解淀粉芽孢杆菌sqr9在玉米根际的定殖，其中菌糠发酵液2000倍稀释液、5000倍稀释液作用显著；就稀释倍数而言，sqr9dna拷贝数值由高到低依次为j5000+sqr9、j2000+sqr9、j1000+sqr9，说明施用菌糠发酵液5000倍稀释液对sqr9在玉米根际定殖的促进效果最佳。分别对每次取样的玉米株高、地上部鲜重、地上部干重进行统计测定，结果如表1所示。移苗后7天：与blank相比，j1000、j1000+sqr9(i)、water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9处理的株高分别增加了3.3％、12.8％、13.2％、18.0％、19.2％、21.7％，说明菌糠发酵液具有一定的养分作用，sqr9菌体自身有机质也贡献了部分促生作用，另外，j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9差异显著，其中j5000+sqr9处理效果最佳；地上部鲜重分别增加了0.7％、52.9％、61.7％、94.0％、94.3％、102.5％，说明菌糠发酵液具有一定的养分作用，sqr9菌体自身有机质也贡献了部分促生作用，另外，j1000+sqr9(i)、water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9差异显著，其中j5000+sqr9效果最佳；地上部干重分别增加了16.7％、66.7％、68.5％、97.8％、101.9％、109.3％，说明菌糠发酵液具有一定的养分作用，sqr9菌体自身有机质也贡献了部分促生作用，另外，j1000+sqr9(i)、water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9差异显著，其中j5000+sqr9效果最佳。总体来看，菌糠发酵液自身的养分可以起到一定的促生作用，sqr9菌体自身的有机质也发挥了部分促生作用，但由sqr9在玉米根际定殖而引起的促生作用显然更重要，促生作用由高到低分别为j5000+sqr9、j2000+sqr9、j1000+sqr9，这与sqr9在玉米根际定殖结果一致。移苗后14天：与blank相比，j1000、j1000+sqr9(i)、water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9处理的株高分别增加了14.1％、18.7％、24.1％、27.8％、27.9％、29.3％，说明菌糠发酵液具有一定的养分作用，sqr9菌体自身有机质也贡献了部分促生作用，另外，j1000+sqr9(i)、water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9差异显著，其中j5000+sqr9处理效果最佳；地上部鲜重分别增加了38.1％、55.7％、72.2％、81.2％、91.5％、96.3％，说明菌糠发酵液具有一定的养分作用，sqr9菌体自身有机质也贡献了部分促生作用，另外，j1000+sqr9(i)、water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9差异显著，其中j5000+sqr9效果最佳；地上部干重分别增加了27.5％、33.9％、43.5％、47.8％、65.2％、65.9％，说明菌糠发酵液具有一定的养分作用，sqr9菌体自身有机质也贡献了部分促生作用，另外，water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9差异显著，其中j5000+sqr9效果最佳。总体来看，菌糠发酵液自身的养分可以起到一定的促生作用，sqr9菌体自身的有机质也发挥了部分促生作用，但由sqr9在玉米根际定殖而引起的促生作用显然更重要，促生作用由高到低分别为j5000+sqr9、j2000+sqr9、j1000+sqr9，这与sqr9在玉米根际定殖结果一致。移苗后28天：与blank相比，j1000、j1000+sqr9(i)、water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9处理的株高分别增加了13.2.％、17.3％、17.4％、16.2％、16.6％、22.6％，说明菌糠发酵液具有一定的养分作用，sqr9菌体自身有机质也贡献了部分促生作用，另外，j1000、j1000+sqr9(i)、water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9差异显著，其中j5000+sqr9处理效果最佳；地上部鲜重分别增加了61.9％、71.2％、77.5％、79.6％、86.9％、104.4％，说明菌糠发酵液具有一定的养分作用，sqr9菌体自身有机质也贡献了部分促生作用，另外，j1000、j1000+sqr9(i)、water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9差异显著，其中j5000+sqr9效果最佳；地上部干重分别增加了65.3％、75.1％、75.6％、78.7％、85.3％、1.22％，说明菌糠发酵液具有一定的养分作用，sqr9菌体自身有机质也贡献了部分促生作用，另外，j1000、j1000+sqr9(i)、water+sqr9、j1000+sqr9、j2000+sqr9、j5000+sqr9差异显著，其中j5000+sqr9效果最佳。总体来看，菌糠发酵液自身的养分可以起到一定的促生作用，sqr9菌体自身的有机质也发挥了部分促生作用，但由sqr9在玉米根际定殖而引起的促生作用显然更重要，促生作用由高到低分别为j5000+sqr9、j2000+sqr9、j1000+sqr9，这与sqr9在玉米根际定殖结果一致。综上所述，促生结果和定殖结果完全一致，菌糠发酵液最佳稀释倍数为5000倍。

表1不同处理对玉米生长的影响