一种微生物土壤修复剂、其制备方法及应用与流程

本发明属于土壤污染修复领域，特别是涉及一种微生物土壤修复剂、其制备方法及应用。

背景技术

土壤是指地球陆地表面上能够生长植物的疏松表层，它是一切生物赖以生存的重要基础，同时也是不可缺少，不可再生的重要自然资源。然而，目前全国土壤环境状况不容乐观，土壤的环境污染问题日趋严重，尤其是土壤重金属污染问题。相比大气污染和水体污染而言，土壤重金属污染具有隐蔽性、不可逆性、长期性等特点，不仅直接与农业生产相关，还可能会威胁到人类的生命健康。

重金属是指比重大于5（密度大于4.5克每立方厘米）的金属或其化合物造成的环境污染，其主要包括，如镉（cd）、铅（pb）、汞（hg）等生物毒性显著的元素和有一定毒性的铜（cu）、镍（ni）等元素，这对于环境安全和人类健康都有着重大危害。

2018年全国土壤污染状况调查结果显示，南方土壤污染比北方地区严重，特别是珠江三角洲，长江三角洲地区更为明显，在西南，中南等地区重金属超标现象明显，从污染物超标情况看，镉、汞、铜、铅、铬、锌、镍7种无机污染物点位超标率分别为7.0%、1.6%、2.7%、2.1%、1.5%、1.1%、4.8%。其中主要的耕地重金属污染物是镍，铜，汞，铅；工矿业废弃土壤（主要涉及的企业由有色金属、皮革企业、造纸企业、石油企业、化工企业、生物制药企业、矿物制品、电力企业等）主要的污染物是锌，汞，铅，点超标率为40%左右。随着社会发展，重金属不仅扩大了影响范围，还一步步迁移到食物链各个部分之中，并在人类体内积累。例如镉通常通过废水排入环境中，再通过灌溉进入食物，水稻是典型的“受害作物”。人长期食用含镉的食物会引起痛痛病（即骨癌病）。病症表现为腰、手、脚等关节疼痛，到了患病后期，患者骨骼软化、萎缩，四肢弯曲，脊柱变形，骨质松脆，就连咳嗽都能引起骨折并且不能进食，疼痛无比。镉大米主要产自湖南、湖北，2013年5月中国广东发现大量产自湖南的含镉毒大米，一度引起轰动。更需要注意的是，儿童不仅重金属耐受程度低其成长过程中体内积累过量重金属，会影响其智力与体格发育。例如我国远超工业发达的国家的儿童铅中毒状况，由于儿童铅吸收率及在体内滞留时间是成人5~8倍，相较于成年人来说更容易中毒，其表现为引起机体的神经系统、血液系统、消化系统的一系列异常表现，影响人体的正常机能，严重可导致死亡，而人体吸收到铅元素的主要来源之一就是被铅污染的土壤。

土壤重金属污染的治理刻不容缓，目前，国内外用于解决土壤重金属污染的方法基本上可以分为物理修复技术、化学修复技术、生物修复技术3大类。物理及化学方法实施方便灵活，周期较短，但是实施起来的工程量较大，成本较高，可能还会带来环境污染，应用范围有限。生物法主要是利用植物和微生物对重金属的吸附和钝化作用，其中微生物治理重金属污染，具有成本低、高效率、对环境破坏小、无二次污染、适合于大面积修复等优点，应用潜力巨大。

将微生物制备成微生物菌剂并用作土壤修复剂，在土壤重金属污染治理已初见成效。然而微生物的生存和繁殖对环境有一定的要求，在实际应用过程中死亡率高，这极大限制了微生物在土壤污染治理中的应用，因此急需开发一种提高菌剂存活率的土壤修复配方。

海藻糖是一种天然的非还原性二糖，它是两个葡萄糖通过ɑ藻糖是一种天然的糖苷键连结而成。相当数量的研究表明，海藻糖在生理功能方面尤其是物理化学压力下对细胞保护发挥着重要的作用，如高温、低温、脱水、干旱、辐射、重金属环境等，微生物在这些环境下的生存能力与它们胞内海藻糖含量有关。已有研究表明，通过外源添加海藻糖，微生物对重金属的耐受程度也有所提高。因为这一生理功能，海藻糖作为微生物菌剂的保护剂已经有了一定范围的应用。

技术实现要素：

为弥补现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种微生物土壤修复剂、其制备方法和在治理土壤重金属污染中的应用，该土壤修复剂使用海藻糖作为保护剂保护微生物抵御重金属的胁迫，提升菌剂的存活率，同时结合细菌、真菌和有机堆肥共同作用于被重金属物质污染的土壤，使土壤中的重金属或络合或吸附或被氧化还原，从而达到治理被重金属污染的土壤的效果。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种微生物土壤修复剂，由以下质量分数的各物质复配而成：10%-15%枯草芽孢杆菌发酵液、5%-20%酿酒酵母发酵液、5%-10%绿色木霉发酵液、10%-20%海藻糖、20%-30%麸皮和20%-30%禽畜粪便。

优选的，所述的禽畜粪便为鸡粪和牛粪等量混合而成。

所述枯草芽孢杆菌发酵液细胞数至少2.0×10⁹/ml，所述酿酒酵母发酵液细胞数至少2.0×10⁹/ml，绿色木霉发酵液细胞数至少2.0×10⁹/ml。

所述微生物土壤修复剂剂型为颗粒剂。

本发明的第二目的在于提供上述微生物土壤修复剂的制备方法，包括如下步骤：

1）将枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、绿色木霉活化后分别接种至lb、ypd、pdb液体培养基，制备种子液；

2）枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、绿色木霉种子液分别以5%-15%接种量接种至lb、ypd、pda二级发酵培养基中，发酵1-3d，获取发酵液；

3）将枯草芽孢杆菌发酵液、酿酒酵母发酵液、绿色木霉发酵液和海藻糖、麸皮、禽畜粪便按比例复配组成微生物土壤修复剂。

优选的，本发明的微生物土壤修复剂采用颗粒剂，将步骤3）获取的微生物土壤修复剂投入造粒装置，控制造粒速度20-40r/min，将混合料造粒成球，自然风干后得到颗粒状土壤修复剂。

其中，所述lb液体培养基及lb二级发酵培养基组成质量分数为：酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，ph自然，121℃条件下灭菌20min；

ypd液体培养基及ypd二级发酵培养基组成质量分数为：酵母膏1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，ph自然，108℃条件下灭菌20min；

pdb液体培养基及pdb二级发酵培养基组成质量分数为：马铃薯20%，葡萄糖2%，ph自然，121℃条件下灭菌20min。

本发明的第三目的在于提供上述微生物土壤修复剂在重金属污染土壤修复中的应用。

优选的，在土地翻耕时拌细黄土均匀撒施所述微生物土壤修复剂；用量为20-80kg/m²。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1）该修复剂中采用真菌加细菌复配的配方，可有效互补又不产生拮抗作用，适用范围更广；

2）该修复剂中的海藻糖既可以作为碳源，为菌种生存提供营养物质，还可以在菌体表面形成一层保护膜，保护菌体不被重金属破坏；

3）该修复剂中的麸皮及禽畜粪便既具有吸附重金属的功效，也能作为菌种的营养物质，同时还能作为有机肥，有增强修复土壤肥力，增加作物产量的作用；

4）本发明的土壤修复剂制备方法简单易行，使用方法简单，可操作性强，并且安全环保，不会造成二次污染。

附图说明

图1是原样土壤使用用量40%实施例1的土壤修复剂处理前后的重金属含量；

图2是使用不同用量实施例1的土壤修复剂处理后的土壤重金属含量；

图3是原样土壤使用用量40%实施例2的土壤修复剂处理前后的重金属含量；

图4是原样土壤使用用量40%实施例3的土壤修复剂处理前后的重金属含量。

具体实施方式

以下通过结合实施例对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。由于菌株准备工作步骤相同，故只对不同比例土壤修复剂做具体实施陈述。

枯草芽孢杆菌购自广东省微生物菌种保藏管理中心gdmcc，编号gim1.977，酿酒酵母购自广东省微生物菌种保藏管理中心gdmcc，编号gim2.213，绿色木霉购自广东省微生物菌种保藏管理中心gdmcc，编号gim3.140，海藻糖购自青岛博智汇力生物科技有限公司。

lb液体培养基及lb二级发酵培养基组成（质量分数）为：酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，ph自然，121℃条件下灭菌20min；

ypd液体培养基及ypd二级发酵培养基组成（质量分数）为：酵母膏1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，ph自然，108℃条件下灭菌20min；

pdb液体培养基及pdb二级发酵培养基组成（质量分数）为：马铃薯20%，葡萄糖2%，ph自然，121℃条件下灭菌20min。

实施例1

处理土壤重金属污染的微生物土壤修复剂的制备方法，步骤如下：

（1）枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、绿色木霉活化后分别接种在lb、ypd、pdb液体培养基上制备种子液；

（2）枯草芽孢杆菌种子液按5%接种量接种至lb二级发酵培养基中，37℃200r/min摇瓶培养22-26h，直至微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×10⁹个/ml时终止发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵液；

酿酒酵母种子液按5%接种量接种至ypd二级发酵培养基中，28℃200r/min摇瓶培养22-26h，直至微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×10⁹个/ml时终止发酵，得到酵母菌发酵液；

绿色木霉种子液按10%接种量接种至pdb二级发酵培养基中，200r/min摇瓶培养3d，直至微镜检测计数发酵液中细胞数达2.0×10⁹个/ml时终止发酵，得到绿色木霉发酵液。

（3）配制重金属污染土壤修复剂，其由以下重量百分数的各原料组成：枯草芽孢杆菌发酵液15%，酿酒酵母5%，绿色木霉10%，海藻糖10%，麸皮30%，禽畜粪便30%。混合均匀后投入造粒装置，控制造粒速度20-40r/min，将混合料造粒成球，自然风干72h，得到颗粒状土壤修复剂。

将过3mm筛的风干土壤制备成2mg/kg的镉、100mg/kg的铅、100mg/kg的铅污染土壤，充分混匀后，装入直径10cm、高10cm的塑料花盆中，每盆装土500g，加入去离子水使含水量为田间持水量的60％，将颗粒状微生物土壤修复剂均匀播撒于土壤中，用量依次为20kg/m²、40kg/m²、60kg/m²、80kg/m²。置植物箱内培养，设定条件为：白天温度为25℃，全光照；晚上温度为18℃，黑暗；全天湿度为75％。30天后收集样品，测定其中的重金属含量。原样土壤与40kg/m²用量的微生物土壤修复剂处理后土壤中重金属含量如图1所示，不同用量的微生物土壤修复剂处理后的重金属去除率如图2所示。

实施例2

菌株发酵液制备方法同实施例1（1）（2）；

（3）配制重金属污染土壤修复剂，其由以下重量百分数的各原料组成：枯草芽孢杆菌发酵液10%，酿酒酵母20%，绿色木霉10%，海藻糖20%，麸皮20%，禽畜粪便20%。混合均匀后投入造粒装置，控制造粒速度20-40r/min，将混合料造粒成球，自然风干72h，得到颗粒状土壤修复剂。该修复剂按40kg/m²的剂量施洒在从小白菜田采集的土壤样品上，测定其土壤中重金属含量。原样土壤与微生物土壤修复剂处理后土壤中重金属含量如图3所示。

实施例3

菌株发酵液制备方法同实施例1（1）（2）；

配制重金属污染土壤修复剂，其由以下重量百分数的各原料组成：枯草芽孢杆菌发酵液15%，酿酒酵母15%，绿色木霉5%，海藻糖15%，麸皮25%，禽畜粪便25%。混合均匀后投入造粒装置，控制造粒速度20-40r/min，将混合料造粒成球，自然风干72h，得到颗粒状土壤修复剂。该修复剂按40kg/m²的剂量施洒在从铅锌开采矿区污染的区域采集的土壤样品上，测定其土壤中重金属含量。原样土壤与微生物土壤修复剂处理后土壤中重金属含量如图4所示。