本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种水稻专用叶面微生物菌肥及其制备方法。
背景技术：
微生物菌肥是针对作物栽培面积扩大，连作重茬增多，农作物病虫害日趋严重等问题，利用高新生物技术研制而成的新型生物抗病菌肥。微生物菌肥属于活菌制剂，具有活性强、代谢产物多、生防效果好、对人、畜、农作物和自然环境安全，以及不易产生抗药性等优点，广泛应用于经济作物种植领域。
水稻是人类的主要粮食作物，也是直接经济作物，水稻的产量与品质受作物病害及空瘪率的影响巨大。稻瘟病是水稻的重要病害之一，能够引起水稻大幅度减产，严重时能减产40%-50%，更甚至颗粒无收。稻瘟病在世界各地的稻区均有发生，主要以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度的减产现象，尤其是穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。随着化学农药的大量使用，水稻品质急剧下降，同时土壤环境也受到了很大程度的破坏，恶性循环使得水稻产量越来越低。
通过对芽孢杆菌的研究发现，芽孢杆菌能够有效抑制稻瘟病菌的生长，利用微生物菌肥对稻瘟病进行防治，可在有效防治的基础上，减少化学农药的使用，降低化学农药对土壤的污染；同时有效降低因化学农药作用而导致的病原菌抗药性的增强，保护土壤微生态系统平衡，改善水稻生存环境并提高其抗病能力，对水稻增产和品质提高有着重要意义。
技术实现要素：
根据现有技术中存在的技术缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种水稻专用叶面微生物菌肥及其制备方法，解决因农药使用量的不断增加，致使稻瘟病菌抗病性不断增加，水稻产量及品质下降的问题，降低水稻空瘪率及稻瘟病的发病率，提高水稻产量及品质。
为了实现本发明的技术目的，本发明一种水稻专用叶面微生物菌肥及其制备方法的技术方案是：
一种水稻专用叶面微生物菌肥，所述微生物菌肥的组成成分及其质量份数为：黄腐酸钾4-6份，芽孢杆菌菌剂2-4份，磷酸二氢钾0.1-0.25份，硫酸钾0.2-0.8份，硫酸镁0.03-0.08份，磷酸氢二铵0.1-0.25份，其余为水。
作为本发明的进一步改进，所述芽孢杆菌菌剂的微生物菌包括枯草芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）,简称jq-001菌株已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为cgmccno.11632；所述甲基营养型芽孢杆菌（bacillusmethylotrophicus），简称jq-018菌株已于2015年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为cgmccno.11838。
作为本发明的进一步改进，所述微生物菌肥的制备方法包括如下步骤：
（1）菌种活化：将低温保存的所述枯草芽孢杆菌与所述甲基营养型芽孢杆菌菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，36-38℃恒温条件下培养24-36h；
（2）一级种子液的制备：配制牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，利用500ml三角瓶分装，装液量200ml，高压灭菌后接入活化后的所述枯草芽孢杆菌与所述甲基营养型芽孢杆菌，温度36-38℃，转速200-260rpm/min条件下培养22-26h；
（3）二级种子液的制备：配制种子罐培养基，将步骤（2）得到的所述一级种子液，按3-5%的接种量分别接入500l种子罐，温度36-38℃，转速180-260rpm/min，通气量0.6-1.2v／v·min条件下培养20-26h；
（4）大规模工业发酵培养：配制发酵罐培养基，将步骤（3）得到的所述二级种子液，按大规模工业发酵罐所用培养基体积比的5-10％接种量分别接入大规模工业发酵罐，温度36-38℃，转速180-260rpm/min，通气量0.6-1.2v／v·min条件下培养24-30h至产生芽胞，完成发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵液与甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
（5）芽孢杆菌菌剂的制备：所述芽孢杆菌菌剂的制备包括枯草芽孢杆菌菌剂的制备与甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备，将步骤（4）得到的所述枯草芽孢杆菌发酵液与所述甲基营养型芽孢杆菌发酵液，按发酵罐干物质重量比为1:1添加硅藻土进行吸附，然后进行压滤、浓缩、干燥；
（6）所述枯草芽孢杆菌菌剂与所述甲基营养型芽孢杆菌菌剂含菌量的检测：采用稀释平板法检测干燥后滤饼的含菌量；
（7）所述微生物菌肥的制备：按质量份数，将步骤（5）得到的所述芽孢杆菌菌剂按比例加入硅藻土稀释至芽孢浓度浓度≥50亿个/g，然后与所述黄腐酸钾4-6份，所述磷酸二氢钾0.1-0.25份，所述硫酸钾0.2-0.8份，所述硫酸镁0.03-0.08份，所述磷酸氢二铵0.1-0.25份及所述余量水混合均匀，得到所述微生物菌肥。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（3）中的所述种子罐培养基的配方如下：牛肉膏0.3-0.5%，蛋白胨1.1-1.5%，氯化钠0.4-0.8%，葡萄糖0.4-0.8%。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（4）中的所述发酵罐培养基的配方如下：甜菜糖蜜4-8%，甘油0.2-0.4%，大豆提取物3-5%，磷酸二氢钾0.01-0.03%，硫酸锰0.005-0.015%，氯化镁0.4-0.6%。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（5）中压滤采用板框压滤机。
作为本发明的进一步改进，所述步骤（5）中干燥采用沸腾干燥床，所述干燥温度为65-80℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的水稻专用叶面微生物菌肥具有生产周期短、活性高、成本低的优点，有利于工业化生产，应用的两株菌种具有适应性强、稳定性好、增殖速度快及对病原菌拮抗性强等特点，且协同效果显著，应用于水稻稻瘟病的防治过程，菌株能够稳定定植在作物的各个部位，占领病原菌的生态位，从而抑制病原菌的生长，同时促进作物生长，增加作物产量，提高产品品质。该微生物菌肥通过页面喷洒，应用于稻瘟病的防治，可在有效防治稻瘟病的基础上，减少化学农药的使用，降低化学农药对土壤的污染；同时有效降低因化学农药作用而导致的病原菌抗药性的增强，保护土壤微生态系统平衡，改善水稻生存环境并提高其抗病能力，对水稻增产和品质提高有着重要意义。
具体实施方式
本发明提供的枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）,简称jq-001菌株已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为cgmccno.11632；甲基营养型芽孢杆菌（bacillusmethylotrophicus），简称jq-018菌株已于2015年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为cgmccno.11838。
为对本发明有益效果作进一步阐述，进行了以下具体实施例，特别说明的是，以下具体实施例旨在更好的理解本发明，绝不仅限于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用实验材料，如无特殊说明，均为商店购买的常规生化制剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
实施例1、微生物菌肥的制备
1、一种水稻专用叶面微生物菌肥，所述微生物菌肥的组成成分及其质量份数为：黄腐酸钾4-6份，芽孢杆菌菌剂2-4份，磷酸二氢钾0.1-0.25份，硫酸钾0.2-0.8份，硫酸镁0.03-0.08份，磷酸氢二铵0.1-0.25份，其余为水。
2、芽孢杆菌菌剂的微生物菌包括枯草芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）,简称jq-001菌株已于2015年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为cgmccno.11632；甲基营养型芽孢杆菌（bacillusmethylotrophicus），简称jq-018菌株已于2015年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为cgmccno.11838。
枯草芽孢杆菌jq-001菌株与甲基营养型芽孢杆菌jq-018菌株的鉴定相关内容如下：
枯草芽孢杆菌jq-001菌株的鉴定（cgmccno.11632）
（1）微生物学特性：菌株在na培养基，37℃环境下，培养12-18h后，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，扁平干燥无光泽，边缘不整齐，不产生色素。菌株杆状、具周生鞭毛，革兰氏染色呈阳性，好氧。
（2）分子生物学特性：将jq-001菌株的16srdna扩增序列在ncbi数据库中比对，与bacillussubtilis同源性为99.38％，结合jq-001菌株的形态特征、生理生化特征，确定jq-001菌株属于枯草芽孢杆菌bacillussubtilis。
甲基营养型芽孢杆菌jq-018菌株的鉴定（cgmccno.11838）：
（1）微生物学特性：jq-018菌体呈短杆状，周生鞭毛，可产孢，革兰氏染色阳性。菌株在pda培养基上34℃培养12h后，菌落圆形，半透明呈白色，表面光滑，中间凸起，不产生色素，有粘性。在na培养基上菌落较小或者不生长。液体培养形成菌膜，24h后产孢，棕黄色，浑浊，有沉淀。菌株表现好氧生长。
（2）生理生化实验：
甲基营养型芽孢杆菌jq-018的生理生化特征
注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应
（3）分子生物学鉴定：
jq-018菌株测序后得到1414bp长的碱基序列，将该序列在ncbi数据库中比对，与bacillusmethylotrophicus同源性达到99.38％，结合jq-018菌株的形态特征、生理生化特性，确定所检测的jq-018菌株属于甲基营养型芽孢杆菌。
3、微生物菌肥的制备方法包括如下步骤：
（1）菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌与甲基营养型芽孢杆菌菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，36-38℃恒温条件下培养24-36h；
（2）一级种子液的制备：配制牛肉膏蛋白胨摇瓶培养基，利用500ml三角瓶分装，装液量200ml，高压灭菌后接入活化后的枯草芽孢杆菌与甲基营养型芽孢杆菌，温度36-38℃，转速200-260rpm/min条件下培养22-26h；
（3）二级种子液的制备：配制种子罐培养基，将步骤（2）得到的一级种子液，按3-5%的接种量分别接入500l种子罐，温度36-38℃，转速180-260rpm/min，通气量0.6-1.2v／v·min条件下培养20-26h；
（4）大规模工业发酵培养：配制发酵罐培养基，将步骤（3）得到的二级种子液，按大规模工业发酵罐所用培养基体积比的5-10％接种量分别接入大规模工业发酵罐，温度36-38℃，转速180-260rpm/min，通气量0.6-1.2v／v·min条件下培养24-30h至产生芽胞，完成发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵液与甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
（5）芽孢杆菌菌剂的制备：芽孢杆菌菌剂的制备包括枯草芽孢杆菌菌剂的制备与甲基营养型芽孢杆菌菌剂的制备，将步骤（4）得到的枯草芽孢杆菌发酵液与甲基营养型芽孢杆菌发酵液，按发酵罐干物质重量比为1:1添加硅藻土进行吸附，然后进行压滤、浓缩、干燥；
（6）枯草芽孢杆菌菌剂与甲基营养型芽孢杆菌菌剂含菌量的检测：采用稀释平板法检测干燥后滤饼的含菌量；
（7）微生物菌肥的制备：按质量份数，将步骤（5）得到的芽孢杆菌菌剂按比例加入硅藻土稀释至芽孢浓度浓度≥50亿个/g，然后与黄腐酸钾4-6份，磷酸二氢钾0.1-0.25份，硫酸钾0.2-0.8份，硫酸镁0.03-0.08份，磷酸氢二铵0.1-0.25份及余量水混合均匀，得到微生物菌肥。
4、步骤（3）中的种子罐培养基的配方如下：牛肉膏0.3-0.5%，蛋白胨1.1-1.5%，氯化钠0.4-0.8%，葡萄糖0.4-0.8%。
5、步骤（4）中的发酵罐培养基的配方如下：甜菜糖蜜4-8%，甘油0.2-0.4%，大豆提取物3-5%，磷酸二氢钾0.01-0.03%，硫酸锰0.005-0.015%，氯化镁0.4-0.6%。
6、步骤（5）中压滤采用板框压滤机。
7、步骤（5）中干燥采用沸腾干燥床，干燥温度为65-80℃。
实施例2、微生物菌肥对水稻空瘪率的影响
1、供试药剂
本发明制备的水稻专用叶面微生物菌肥。
2、供试作物与防治对象
供试作物：水稻；
防治对象：水稻空瘪率。
3、试验地点
试验地点：哈尔滨阿城区料甸镇联合七队。
4、大田试验
①试验设计及安排
小区设置：以宽2m，长20m为一个试验区。
本试验设计了喷施稀释1000倍的水稻专用叶面微生物菌肥的3个试验区域，分别为a1、a2、a3及空白对照ck共4个处理，重复4次，共12个小区，每小区面积约40m2，各小区随机排列；施肥方式为作物叶面喷施。
②试验调查及计算方法
于水稻收获期，每个试验区随机采集30株水稻籽粒样品，将其自然风干后分别测其千粒重与空瘪率。
每组分别统计水稻千粒重及空瘪率。
③试验结果
本发明制备的水稻专用叶面微生物菌肥对水稻空瘪率的影响结果如表1。
表1微生物菌肥喷施对水稻空瘪率的影响
从表1可以看出，本发明水稻专用叶面微生物菌肥对水稻空瘪率有较好的防治效果，其中，平均增产11.49%，空瘪率降低46.02%。
实施例3、微生物菌肥对水稻稻瘟病发病率的影响
1、供试药剂
本发明制备的水稻专用叶面微生物菌肥。
2、供试作物与防治对象
供试作物：水稻；
防治对象：水稻稻瘟病。
3、试验地点
试验地点：哈尔滨阿城区料甸镇联合七队。
4、大田试验
①试验设计及安排
小区设置：以宽2m，长20m为一个试验区。
本试验设计了喷施稀释1000倍的水稻专用叶面微生物菌肥的3个试验区域，分别为b1、b2、b3及空白对照ck共4个处理，重复4次，共12个小区，每小区面积约40m2，各小区随机排列；施肥方式为作物叶面喷施。
②试验调查及计算方法
于水稻收获期，每个试验区随机选取15个取样点测定稻瘟病株数量，统计稻瘟病发病率与产量。
每组分别统计水稻稻瘟病发病率与产量。
③试验结果
本发明制备的水稻专用叶面微生物菌肥对水稻稻瘟病发病率与产量的影响结果如表2。
表2微生物菌肥喷施对水稻稻瘟病发病率与产量的影响
从表2可以看出，本发明水稻专用叶面微生物菌肥对水稻稻瘟病发病率与产量有较好的防治效果，其中，平均增产38.82%，稻瘟病发病率降低降低59.67%。
以上所述，仅是本发明的较好实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实例所作的任何简单修改、变换材料等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。