一种磷酸钙/氧化锆梯度多孔支架及制备方法和应用与流程

本发明涉及一种磷酸钙/氧化锆可控梯度多孔支架及制备方法和应用，属于生物医学材料
技术领域：
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背景技术：
：在骨修复工程中，多孔支架通常具有支撑骨缺损部位、诱导新骨生成的作用。因此，理想的多孔支架需要具备良好的生物相容性且具有一定强度以便恢复骨形态和性能，同时，支架要在人体环境中有一定的溶解度，能够逐步诱导骨细胞长入支架内部，实现自我修复。磷酸钙类陶瓷与人体骨骼成分相似度较高，是一类具有良好的生物活性陶瓷。从骨修复角度看，磷酸钙类陶瓷具有良好的骨传导性，成骨细胞附着于该类支架表面，能够实现增殖、分化、成熟，合成骨基质胶原，进一步矿化，形成骨组织。另外，大部分磷酸钙类陶瓷在人体环境中能发生降解，游离的钙离子、磷酸盐等降解产物能够促进细胞生长分化，有利于骨组织形成。虽然磷酸钙类陶瓷具有优越的生物性能，但其在机械性能方面存在一定缺陷，例如弹性模量与人体骨组织相比过大，断裂韧性与人骨相比过小等问题，种种性质都限制了磷酸钙类陶瓷作为承重骨修复材料的应用。氧化锆是一种优良的生物惰性陶瓷，力学性能优良，具有耐磨性和化学稳定性。然而，氧化锆本身并没有良好的细胞和组织亲和力。如今，陶瓷多孔支架能够通过多种技术制造，例如添加造孔剂、泡沫浸渍、直接发泡、冷冻干燥等等。上述方法都存在一些问题，如烧结后存在杂质残留，孔隙形状、分布难以控制，需要模具，造价成本较高等。而且目前临床应用的多孔骨支架多为均匀单一孔径，且孔隙结构较难控制。而天然骨的各处密度有所变化，单一孔径的支架植入后难以与周围骨组织的密度变化相一致，容易引发骨质流失等问题。从力学角度来看，植入的支架需要有一定的力学性能来支撑缺损部位，满足正常活动。对于多孔支架而言孔隙率越低，强度越高，但细胞长入支架需要较高的孔隙率保证正常生长代谢。因此，高力学性能、高孔隙率这对矛盾要求限制了陶瓷多孔支架的广泛应用。而缓解这一矛盾的方法就是制备梯度多孔支架，这种结构有望能在达到力学强度要求和促进细胞生长之间获得一个平衡。另外，细胞生长、代谢所需的孔径也各有不同，大孔径结构能够在细胞生长过程中起到营养供给，气体交换和清除代谢废物等作用，但会影响细胞附着和细胞内信号传导，而小孔径结构可以提供上述相反的性质。具体孔径要求还与细胞种类相关。一般而言，孔径尺寸为15～40μm，允许显微组织长入；孔径为40～100μm，允许非矿物类骨组织长入；孔径大于100μm，允许血管组织长入(duj，zuoy，linl，etal.jmechbehavbiomedmater，2018，88：150-159.)。seheangoh等在研究中发现，孔径为380～405μm的支架段对软骨细胞和成骨细胞生长较好，孔径为186～200μm的支架段对成纤维细胞生长较好，孔径290～310μm的支架段新生骨形成速度明显快于其他孔径的支架段(seheangoh，ilkyupark，etal.biomaterials，2007，28：1664-1671.)。而且对于细胞的初期粘附，小孔径支架能够提供较高的粘附表面积，而大孔径的支架在后期细胞往支架内部迁移提供了更充足的空间。基于以上考虑，梯度多孔支架更加符合植入修复要求，能更好的满足细胞进行较长周期的生长活动。传统制造方法要制造出梯度孔径结构较为困难。光固化成形陶瓷打印技术，具有3d打印技术实现个性化定制的优势，能够在较高程度地还原患者骨骼原始形貌的同时，实现一些例如特殊形状、梯度孔径等特定结构的打印。通过计算机绘制三维模型实现对材料内部的孔隙形状、大小，孔道结构，孔隙率等指标的精确控制，从而较好地平衡材料强度和孔隙率、连通率之间的关系，为多孔材料的制备提供了更大的灵活性和速度。并且该方法消除了模具限制，一定程度上降低了投资成本。技术实现要素：针对上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供一种磷酸钙/氧化锆可控梯度多孔支架及制备方法和应用。该复合多孔支架以磷酸钙类陶瓷和氧化锆为多孔支架基体，通过计算机绘制梯度孔支架三维模型，利用光固化技术实现坯体成形和高温脱脂烧结法制得支架成品。所述支架能在无模具条件下实现梯度孔径定制化设计，具有一定的强度和良好的生物活性，能够应用于骨组织工程领域，作为骨填充物、置换物或作为体外培养细胞支架。本发明采用的技术方案如下：一种磷酸钙/氧化锆可控梯度多孔支架的制备方法，其具体步骤如下：步骤1、建模：用建模软件设计梯度多孔支架三维图，保存为stl格式文件；步骤2、球磨混料：将磷酸钙类陶瓷粉体、氧化锆粉体混合，置入行星球磨机中球磨；步骤3、浆料制备：将步骤2得到的混合陶瓷粉料加入光敏树脂和分散剂混合均匀；步骤4、坯体成形：将步骤1得到的模型文件导入光固化机，将步骤3得到的浆料用光固化成形的方法打印出多孔支架坯体；步骤5、超声清洗：将多孔支架坯体加入无水乙醇中，置超声清洗机中清洗，去除表面未固化浆料；步骤6、干燥：将步骤5得到的支架坯体放到干燥箱中干燥；步骤7、脱脂烧结：将步骤6得到的支架坯体脱脂烧结，随炉冷却到室温后取出得到磷酸钙/氧化锆梯度多孔支架。所述步骤2中，磷酸钙类陶瓷包括羟基磷灰石、磷酸三钙和双相磷酸钙、氟磷灰石、碳酸磷灰石中的至少一种。所述步骤2中，所选磷酸钙类陶瓷、氧化锆粉体的粒径为50nm～100μm，质量比为5～95∶95～5。所述步骤3中，选用的光敏树脂包括预聚体、活性稀释剂和光引发剂，其中预聚体为环氧树脂、酚醛树脂和丙烯酸树脂中至少一种，活性稀释剂为丙烯酸酯单体，光引发剂为自由基光引发剂和阳离子光引发剂中至少一种，分散剂为聚丙烯酸钠、聚丙烯酸铵、聚乙二醇中至少一种。所述步骤3中，以浆料总重量为100％，各组分含量分别为：混合陶瓷粉料50％～80％，光敏树脂17％～50％(预聚体7％～21％，活性稀释剂8％～24％，光引发剂2％～5％)，分散剂0％～3％。所述步骤5中，超声清洗工作参数为频率20～30khz，清洗时间10～30分钟，频率过高或时间过长会溶解支架表面部分材料。所述步骤6中，干燥工艺参数为干燥温度20℃～80℃，干燥时间为0.5～2小时。所述步骤7中，脱脂烧结工艺参数为升温至400℃～700℃之间保温1～4小时，继续升温至900℃～1600℃之间保温2～5小时，升温速度控制在0.5～5℃/min。本发明提供一种磷酸钙/氧化锆可控梯度多孔支架，所述支架采用上述方法制备而成，具有有序渐变的梯度孔结构，孔径大小为10～1000μm，孔隙率为30％～90％。本发明还提供一种上述磷酸钙/氧化锆可控梯度多孔支架在骨组织工程中作为骨填充物、置换物或作为体外培养细胞支架的应用。本发明的有益效果是：(1)本发明使用了光固化成形技术，制得的多孔支架孔径成梯度分布，形状、孔隙等参数可控，能够满足个性化定制需求。(2)本发明的支架具有不同孔径多孔结构，有利于营养物质的输送及较长时间段成骨细胞在支架表面粘附、增殖和分化。(3)本发明使用的磷酸钙类陶瓷和氧化锆都属于生物陶瓷，具有良好的生物相容性。附图说明图1是本发明所述的磷酸钙/氧化锆可控梯度多孔支架的制备流程图。图2是光固化打印的梯度多孔支架图。图3是mc3t3-e1前成骨细胞与单一孔径支架共同培养状态图。图4是不同孔径支架同mc3t3-e1前成骨细胞共同培养1d、4d、7d后的吸光度值。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式，对本发明作进一步说明。实施实例1梯度多孔支架的制备如图1所示，一种磷酸钙/氧化锆可控梯度多孔支架的制备方法，是通过以下步骤实现的：步骤1、建模：用建模软件设计梯度多孔支架三维图，保存为stl文件；步骤2、球磨混料：将粒径为10μm的羟基磷灰石粉体和300nm的氧化锆粉体以90∶10的质量比混合，置入行星球磨机中以100r/min球磨2小时；步骤3、浆料制备：将步骤2得到的混合陶瓷粉料加入光敏树脂和分散剂混合均匀。浆料的各项成分的质量组成为：混合陶瓷粉末为55％，光敏树脂为43％，分散剂为2％；步骤4、坯体成形：将步骤1得到的模型文件导入光固化机，将步骤3得到的浆料用光固化成形的方法打印出多孔支架坯体，如图2所示；步骤5、超声清洗：将多孔支架坯体加入无水乙醇中，置超声清洗机中进行清洗10分钟；步骤6、干燥：将步骤5得到的支架坯体放到50℃的干燥箱中干燥1小时；步骤7、脱脂烧结：将步骤6得到的支架坯体从室温以1℃/min升温至500℃保温2小时，继续升温至1150℃保温3小时，随炉冷却到室温后取出得到磷酸钙/氧化锆可控梯度多孔支架。实施实例2不同的孔径支架细胞增值实验本实施实例和实施实例1的区别在于：步骤1用建模软件设计单一孔径支架三维图，其余地方与实施实例1基本相同，此处不再一一赘述。最终得到平均孔径为200～300μm、300～400μm、400～500μm的多孔支架。cck-8细胞增殖实验：将不同孔径的支架经高温高压灭菌后，放入24孔板内。每孔接种1ml浓度为5×10^4个/ml的mc3t3-e1细胞悬液，放入37℃，5％co2的细胞培养箱中培养，如图3所示。24h后，将支架取出，置于新的24孔板内，加入培养液继续培养，每2d换一次液。分别于1d、4d、7d后终止培养，每孔加入cck-8溶液100μl，37℃避光孵育2h后分别吸出100μl液体加入到新的96孔板内，于酶标仪450nm检测各孔吸光度值。结果如图4所示。结果：图3中，与支架共同培养的细胞生长状态良好，并且支架周围、以及孔内细胞分布均匀，没有明显的空白处，表明该支架具有良好的生物相容性。图4表明在三种孔径支架存在的情况下，细胞都能保持良好的增殖。具体而言，培养1d后，平均孔径为200～300μm的支架组的细胞活力高于其他两组，平均孔径为400～500μm的支架组细胞活力最低，这种情况在4d后依然明显。可能是细胞培养初期，小孔径支架表面积更大，有利于细胞在其表面粘附生长。培养7d后，各组细胞都保持良好的增殖状况，平均孔径为300～400μm的支架组细胞活力略高于平均孔径为200～300μm的支架组。究其原因，可能是细胞不断增殖迁移，需要较大的孔隙空间保证正常生长代谢。因此，小孔径有利于细胞前期粘附于支架表面，大孔径有利于为后期细胞增殖迁移提供足够空间。梯度多孔结构的支架有条件为不同阶段的细胞生长迁移活动提供场所。实施实例3复合多孔材料力学性能测试本实施实例和实施实例1的区别在于：步骤1用建模软件设计单一孔径支架三维图，步骤2羟基磷灰石和氧化锆的质量比为100/0，90/10，80/20，70/30，0/100。其余地方与实施实例1基本相同，此处不再一一赘述。对制得的复合多孔支架进行抗压强度测试，测试结果如下表所示。结果表明，随着羟基磷灰石基体内氧化锆掺入量的增加，抗压强度逐步提高。不同配比的多孔复合支架可以应用于不同部位骨缺损处的填充或置换。羟基磷灰石/氧化锆质量比抗压强度/mpa100/015.2590/1021.3480/2027.2770/3031.410/10061.23以上结合附图对本发明的具体实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。当前第1页12