一种以戊二胺发酵尾液发酵的生物基水溶肥及其制备方法与应用与流程

本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种以戊二胺发酵尾液发酵的生物基水溶肥及其制备方法与应用。

背景技术：

中国是农业大国，在生产过程中主要施用的肥料为化学肥料，化肥年用量居高不下。而农民缺乏科学施肥量，一味追求多施多产，造成了土壤肥力过剩、土壤板结、土壤有机质降低等一系列问题。水溶肥料慢慢进入人们视野，水肥一体化，合理科学施肥，成为了可替代化学肥料的新型首选肥料。

戊二胺工业产业链中会产生大量的工业发酵尾液，戊二胺工业发酵尾液有着一定的恶臭味，溶液一般呈无色或黑色黏稠状。通常情况下，这些工业下游的发酵尾液经过处理后，交给污水处理厂，在这就产生了一定的处理费用，从而增加了生产成本。对戊二胺工业发酵尾液成分分析过后，可发现其中含有n、p、k等作物和微生物生长所必须的元素，因此考虑对其进行高值化利用。因此，需要开发一种新的工艺对戊二胺工业发酵尾液进行再次利用，以减少成本，可达到减少污染的效果，同时延长戊二胺生产工业的产业链。

此外，土壤中富含有大量的矿物元素和微生物，其中微生物发挥着无可替代的作用，它们通过自身的生命活动，将一些无法被植物直接吸收的营养元素转化成可吸收的状态，改善作物的营养条件。因此，需要开发一种利用土壤自身的特性同时进一步利用戊二胺发酵尾液的工艺方法。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种以戊二胺发酵尾液发酵的生物基水溶肥。

本发明还提供了上述生物基水溶肥的制备方法。

本发明进一步提供了上述生物基水溶肥的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种以戊二胺发酵尾液发酵的生物基水溶肥的制备方法，其包括如下步骤：

(1)用ph调节剂调节戊二胺发酵尾液的ph值为6.5～7.5；

(2)将微生物培养基(p2培养基)与步骤(1)调节ph后的戊二胺发酵尾液混合，高温高压蒸汽灭菌，得到混合培养基；

(3)将微生物接种到步骤(2)得到的混合培养基中，培养，即得。

步骤(1)中，所述的ph调节剂为谷氨酸溶液和磷酸溶液中的任意一种或两种组合；其中，优选先用谷氨酸溶将其ph调节到9.07，然后再向其中加入磷酸溶液，调节其ph值到7.0，这是因为直接用磷酸调节ph，可能导致部分金属离子，如钙离子形成沉淀；当ph为中性偏酸的时候，再用磷酸调节，溶液的状态比较稳定，不易形成沉淀。

其中，所述的谷氨酸溶液，其制备方法为取1.85g谷氨酸溶解于250ml纯水中，得到谷氨酸饱和溶液，ph值为3.29。

步骤(1)中，调节戊二胺发酵尾液中戊二胺的浓度至45～60mg/ml，优选50～55mg/ml；所述的戊二胺发酵尾液为指生物法制备戊二胺过程中所产生的液体，具体地，指的是在分离纯化工艺过程中所产生含有戊二胺的提余液或洗涤液。

所述生物法制备戊二胺工艺过程指的是以赖氨酸或赖氨酸盐粉末，或其发酵液为原料，通过酶催化脱羧转化为戊二胺，而后通过过滤、提取、蒸馏、结晶等分离纯化过程获得戊二胺或戊二胺盐的产品。

发酵尾液指的是在此过程中所产生的含有戊二胺的提余液或洗涤液，组成主要为戊二胺、无机盐、色素、水；无机盐主要为钙、镁、钠、钾的磷酸盐、硫酸盐、二羧酸盐，无机盐占比1％～10％，戊二胺占比0.5％～20％，含氮量占比3～8％(质量分数)。

步骤(2)中，p2培养基的各组分为：酵母粉3g/l，葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，乙酸铵2g/l，氯化钠3g/l，七水合硫酸镁3g/l，磷酸氢二钾1g/l，磷酸二氢钾1g/l，七水合硫酸亚铁0.1g/l，溶剂为水。

步骤(2)中，p2培养基与调节ph后的戊二胺发酵尾液的体积比为1:0.5～5，优选1:2。

步骤(3)中，所述的微生物为施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)中的任意一种或两种组合；

其中，施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)，菌株名为nrcb010，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏编号为cgmccno.19067，保藏日期为2019年12月02日，保藏地址为中国北京，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

其中，解淀粉芽孢杆菌菌株号为nrcb005，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.17214，保藏日期为2019年1月18日。该菌株为现有的，是已公开。

步骤(3)中，所述的培养为于28℃下150～220rpm培养至指数生长末期。

上述方法制备得到的以戊二胺发酵尾液发酵的生物基水溶肥也在本发明的保护范围之内。

上述生物基水溶肥在促进农作物生长中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的农作物为生菜、小青菜、白菜、菠菜、番茄等。

其中，所述应用的具体方法为将上述生物基水溶肥料对生菜根部进行灌根施肥，促进了生菜地上部分(即可食用部分)生长，亦促进生菜的根系的生长，增加生菜产量。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的优势：

(1)本发明提供生物基肥实现了对戊二胺工业发酵尾液的再次利用，解决了现阶段工艺中，戊二胺产业链中发酵尾液气味刺鼻，处理需高额成本的问题，同时利用微生物发酵将戊二胺产业链延长，应用于农业，变废为宝，经济环保。

(2)本发明提供生物基肥的制备方法，其原材料易得，过程简便易操作。

(3)本发明提供的生物基肥能够促进生菜的生长，增加生菜产量。

附图说明

图1为实施例3中生菜叶干重的变化。

图2为实施例3中生菜叶鲜重的变化。

图3为实施例3中生菜根鲜重的变化。

图4为实施例3中生菜根干重的变化。

图5为实施例3中生菜根长的变化。

图6为实施例3中生菜根直径的变化。

图7为实施例3中生菜根尖数的变化。

图8为实施例3中生菜株高的变化。

图9为实施例3中生菜叶绿素含量的变化。

图10为实施例3中生菜叶叶片数的变化。

图11为实施例3中生菜叶叶面积的变化。

图12为实施例2中biolog板中awcd值随时间的变化。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：一种以戊二胺发酵尾液发酵的生物基水溶肥料配制方法，具体包括以下步骤：

(1)配制ph调节剂：取1.85g谷氨酸溶解于250ml纯水中，得到谷氨酸溶液，ph值为3.29。

(2)取5ml的戊二胺发酵尾液溶于95ml纯水中，振荡混匀，向其中加入80-120ml谷氨酸溶液，调节其ph值到9.0，然后再向其中加入大约10滴磷酸，调节其ph值到6.95-7.05。

(3)配制p2液体培养基：使用千分之一的电子天平称取酵母粉3g，葡萄糖10g，蛋白胨5g，乙酸铵2g，氯化钠3g，七水合硫酸镁3g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，七水合硫酸亚铁0.1g，用蒸馏水溶解混合，定容至1l。

(4)将步骤三里p2液体培养基与步骤二中稀释之后的戊二胺发酵尾液以优选的2:1的比例混合，配置成混合培养基。

(5)取四个250ml锥形瓶，编号为ck组(空白组)、nrcb010组、nrcb005组和nrcb005+nrcb010组。在ck组中加入120ml纯水，在三组菌剂处理组中加入120ml混合培养基。混菌组选取了ncrb010(施氏假单胞菌)和nrcb005(解淀粉芽孢杆菌)这两种菌，在超净工作台中按1％的量接种两株菌放入恒温振荡培养箱中28℃、200r/min进行培养，而nrcb005组在混合培养基中只接种nrcb005一株菌，nrcb010组在混合培养基中只接种nrcb010一株菌，同样置于恒温振荡培养箱中28℃、200r/min进行培养培养5d后，在各组锥形瓶中取出溶液100ml，用200ml纯水稀释，制备为生物基水溶肥料。

实施例2：解淀粉芽孢杆菌nrcb005和施氏假单胞菌nrcb010的促生特性

吲哚乙酸(iaa)、溶磷量、速效钾等为微生物对植物起促生作用的重要指标。我们测定了解淀粉芽孢杆菌nrcb005和施氏假单胞菌nrcb010的各项指标，方法参考对比文件cn201910191639.5中实施例6、7、8。具体数据见下表1，从表1数据中可知，两种菌均有以往文献中报导的促生特性。

表1nrcb005和nrcb010的促生特性

实施例3：应用于恒温可控光温室生菜

供试作物生菜，品种为意大利生菜。供试土壤为采自南京市六合区的露地蔬菜土。本试验设立了清水常规对照(ck组)和三组经微生物发酵的戊二胺发酵尾液试验组(nrcb005组、nrcb010组和nrcb010+nrcb005组)(实施例1制备)，每个处理组设置5个重复(每盆计一个重复)，每盆播种10颗种子，按生长状况剔除过大过小生菜，每盆留有5株生菜，待生菜长到两对叶时，以灌根的施肥方式对生菜根部进行浇灌，用量为10ml/株，每隔一周灌根一次，共两次。出苗至收获共35天，采收期对生菜的株高、叶面积、叶绿素含量、叶片数、根长度、根平均直径、根尖数、叶与根的鲜重和干重进行测定。

生菜主要的生长指标为叶片鲜干重。由测定的试验结果表明，与ck组清水灌根相比，nrcb005组、nrcb010组和nrcb010+nrcb005组对生菜灌根处理后，均对生菜起到促生作用，增幅效果为nrcb010+nrcb005组>nrcb005组>nrcb010组。各处理组均能提高生菜叶片的鲜干重以及根的鲜干重，在叶鲜重方面，nrcb010+nrcb005组提高了35％，nrcb005组提高了21％，nrcb010组提高了19％；在叶干重上，nrcb010+nrcb005组提高了43％，nrcb005组提高了28％，nrcb010组提高了26％；在根鲜重上，nrcb010+nrcb005组提高了32％，nrcb005组提高了25％，nrcb010组提高了22％；在根干重上，nrcb010+nrcb005组提高了32％，nrcb005组提高了16％，nrcb010组提高了20％，具体数据如表2，图1～图4所示。总体上讲，以叶干重数据为准，nrcb010+nrcb005发酵的试验组效果最好，其效果优于施加单一微生物的效果，利于生菜干物质的累积，营养元素不断贮存，该微生物菌剂有着较好市场价值和农业应用前景。

表2菌剂对生菜鲜干重的影响

对于生菜生长发育的其他指标来说，比如地上部分的株高、叶绿素、叶片数、叶面积，地下根系的根尖数、根长、根直径、根面积等(图5～图11)，我们制备的生物基水溶肥料对生菜灌根施肥后，与清水对照相比均能有效改善生菜生理指标，具体数据如表3、4所示。

表3菌剂对生菜的表型影响

表4菌剂对生菜的地下根系的影响

对比例1：参照对比文件cn201910191639.5中实施例11中实验方法，将供试作物换成意大利生菜，供试土壤为露地蔬菜土，采用土壤盆摘实验，在未酸化的土壤中，对生菜幼苗进行灌根处理，32天后进行生菜采收。本试验设立了三组试验组，第一组为采用p2液体培养基发酵nrcb005的处理组、第二组为实施例1中nrcb005组、第三组为实施例1中nrcb010+nrcb005组。由实验结果可知，与微生物菌剂nrcb005未经发酵的处理组(第一组)相比，nrcb005组(第二组、以戊二胺发酵尾液为原料，经nrcb005发酵的处理组)处理的生菜叶鲜重增加12％，叶干重增加12％，根鲜重增加10％，根干重增加14％。而nrcb010+nrcb005(第三组、以戊二胺发酵尾液为主原料，经nrcb010+nrcb005发酵的处理组)处理的生菜叶鲜重、叶干重、根鲜重、根干重分别能提升21％、26％、18％、27％。对比得出，本发明中以戊二胺尾液为原料生物基水溶肥料其促生效果明显提升。此外，在相同的处理条件下，由nrcb010+nrcb005混合菌剂的促生效果明显优于nrcb005单一菌剂。在经济核算方面，充分利用了发酵尾液，减少了污水处理成本和微生物菌剂的发酵培养基成本。

实施例4：基于biolog-eco技术分析微生物菌剂灌根下种植生菜地土壤微生物功能性。

以意大利生菜为研究对象，应用biolog-eco技术分析了盆栽条件下不同菌剂灌根处理生菜幼苗与未处理的生菜幼苗根际土壤微生物碳源利用水平的变化。

本发明的biolog-eco技术所采用的是biologecoplate^tm微平板(biologinc.，usa)这种生态板是有三个重复的96孔反应微平板，除三个对照孔a1只装有四氮叠茂氧化还原染色剂和一些营养物质外，其余的孔均装有不同的单一碳底物。此biologeco技术通过分布于96孔中的碳源底物来分析评价土壤微生物生理代谢特征。

供试土壤样品为实施例2中露地蔬菜土。

样品制备：在超净工作台中称取1g烘干的根际鲜土，放入9ml提前高温灭菌的0.86％的生理盐水中，超声处理1min，置于恒温振荡培养箱中28℃、170rpm振荡培养30min，最终稀释比例为1：1000。采用以上方法获得对照组以及不同菌剂灌根处理的根际新鲜土样，制成土壤稀释悬液。

biologeco实验：用八孔移液枪向eco板各孔中加入150μl上述用生理盐水稀释1000倍后的土壤稀释悬液，每个土样一块eco板相当于三个重复，并将接种好的eco板用无菌封口膜密封培养于28℃培养箱中，然后分别在培养24h、48h、72h时，在全自动微生物鉴定仪中测定每个板的吸光度值。

平均吸光度(awcd)及多样性指数的计算

本发明采用平均吸光度(awcd)来描述微生物代谢强度，其计算公式如下：

awcd＝[∑(ci-r)]/31，ci是除对照孔外各孔的吸光度值，r是对照孔的吸光度值。

应用spss25.0软件对上述全自动微生物鉴定仪测得的吸光度值进行统计分析，分别计算得到对照组(ck组)、施加施氏假单胞菌nrcb010和解淀粉芽孢杆菌nrcb005的混菌处理组(nrcb010+nrcb005组)、只施加解淀粉芽孢杆菌nrcb005处理组和只施加施氏假单胞菌nrcb010处理组，在采收时期的平均吸光度awcd值，如图12展示。由图12可看出，不管处理方式如何，awcd值随着培养时间的延长而增加，微生物所利用的碳源量也呈现着逐渐增加的趋势，各处理组间碳源利用总量无明显差异。基于所获得的awcd值再分别计算shannon多样性指数(h′)、simpson指数(d)以及mcintosh多样性指数(u)，它们的计算公式分别如下：

h′＝-∑pilnpi

d＝1-∑pi²

u＝(∑ni²)^1/2

其中pi为第i孔吸光度所占总吸光度的比例；ni为第i孔吸光度值。

从表5可以看出：nrcb010+nrcb005混菌处理组、nrcb005处理组和nrcb010处理组的shannon指数和simpson指均具有较高的数值，而mcintosh指数略低于ck对照组，并且不同处理同一时间内的数值没有明显差异。可见，不管灌根施加混合菌剂nrcb010+nrcb005、还是施加单一菌剂nrcb005和nrcb010对生菜根际土壤生物群落功能多样性的影响无显著性差异。

表5基于awcd计算的多样性指数

实施例5：戊二胺盐、戊二胺尾液和此种生物基水溶肥料应用于盆栽生菜的效果

经物理、化学等分离操作，我们将戊二胺发酵尾液中的活性物质进行提炼，发现其含有多种有效盐成分，如磷酸盐、乙酸盐和谷酸盐等。将三种单一活性物质戊二胺盐和戊二胺发酵尾液，以及由实施例1方法制备的三种生物基水溶肥设立对比试验。加上清水，共七个处理组，每个处理组设置5个盆栽花盆，每盆播种10颗种子，按生长状况剔除过大过小生菜，每盆留有5株生菜，待生菜长到两对叶时，以叶喷的施肥方式对生菜叶片进行施肥，喷施浓度为1μm，每隔一周喷施一次，共两次。供试品种为意大利生菜，供试土壤为采自南京六合的露地蔬菜土，生菜出苗至收获共39天，采收期对生菜的叶与根的鲜重和干重进行测定。实验结果表明，以清水对照为对比，7组试验组灌根处理后均能促进生菜生长，鲜干重明显增加，其中增加幅度nrcb010+nrcn005>nrcb005>nrcb010>戊二胺磷酸盐>戊二胺乙酸盐>戊二胺谷酸盐>戊二胺尾液；经微生物发酵后的戊二胺尾液，即nrcb010+nrcb005组，经叶片喷施后叶鲜重能提高37％，根鲜重提高41％，叶干重提高34％，根干重提高42％，具体数据见表6。由此可见，戊二胺尾液确实对生菜生长发育有着一定的促生效果，尾液中单一盐组分效果优于不加分离的尾液组，但经我们用施氏假单胞菌和解淀粉芽孢杆菌联合发酵后的戊二胺尾液混合物，即此生物基水溶肥，对生菜的促生效果更好，且从添加nrcb005和nrcb010基本菌剂的促生特性数据可以看出两者具有互补性。

表6不同组分对生菜生长的影响

本发明提供了一种生物基水溶肥料的配制方法，创造性地发现了一种戊二胺发酵尾液处理的新型方式，将原本需要高成本处理的戊二胺发酵尾液，利用微生物发酵成能被植物所吸收的营养活性物质，延伸了戊二胺的产业链，与农业结合。同时，本发明还阐述了此种肥料在生菜中的应用，能促进灌根施肥后生菜叶片养分积累，促进了生菜地上部分(即可食用部分)生长，亦促进生菜的根系的生长，在农业上有着不错的应用前景。

此外，本发明提供了一种以戊二胺发酵尾液发酵的生物基水溶肥及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一种以戊二胺发酵尾液发酵的生物基水溶肥及其制备方法与应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1406

<212>dna

<213>施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)

<400>1

gtccccccgaaggttagactagctacttctggagcaacccactcccatggtgtgacgggc60

ggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgtgacattctgattcacgattactagcga120

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