一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥的制作方法

本发明涉及农用微生物技术领域，特别涉及一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥。

背景技术：

我国黄瓜栽培面积约1900万亩，设施栽培面积约占42％。随着栽培年限的增加，黄瓜连作(重茬)所带来的危害已成为影响我国黄瓜设施栽培生产的关键问题，据不完全统计：设施黄瓜连作栽培2年后，黄瓜产量减少20％；连作栽培4年后，黄瓜产量减少50％；连作栽培8年以上者，黄瓜接近绝收。引起上述重茬危害的原因包括：土传病虫害、自毒作用、有机质与微量元素匮乏等。其中由土传病虫害(主要是黄瓜枯萎病、根结线虫病)造成的危害，被认为是引起黄瓜重茬危害的主要原因。

目前生产上使用威百亩、石灰氮等化学药剂防治黄瓜枯萎病和黄瓜根结线虫病，其中威百亩对黄瓜枯萎病的防治效果可达87.03％(植物保护学报2017，44(1)：159-167土壤环境条件对威百亩熏蒸防治黄瓜枯萎病的影响，王惟萍等)，但威百亩对人体健康和环境有害，法国已宣布禁用；石灰氮对土壤中根结线虫的防效可达80.8％(浙江农业科学2013年第12期施用石灰氮防控大棚黄瓜连作障碍的讨论，周海燕等)。其它报道还有：约55-60kg/亩的石灰氮对黄瓜根结线虫有显著的杀灭效果，杀灭率达到93.26％(浙江大学硕士专业学位论文，不同土壤消毒方式克服黄瓜枯萎病及根结线虫病害的研究，梁红娟2012年3月)。由于威百亩、石灰氮等化学药剂属于非选择性农药，也会杀死或抑制土壤中的有益生物。

也可以使用生物菌剂防治黄瓜枯萎病和黄瓜根结线虫病。中国专利文献cn105601449a公开了一种黄瓜专用抗重茬复合剂，该复合剂由枯草芽孢杆菌固体菌剂、解淀粉芽孢杆菌固体菌剂、细黄链霉菌固体菌剂、微生物菌肥磷钾复合肥及微量元素添加剂按照质量比18～25∶8～12∶8～12∶50～65∶0.8～1.2的比例混配制成的。

中国专利文献cn104973994b公开了一种黄瓜用抗重茬病害有机肥，其配方是：以重量计，玉米秸秆100～200份、动物粪便200～300份、大豆秸秆50～80份、柳叶50～100份、臭椿叶50～100份、烟叶20～50份、冬青叶20～50份、发酵剂5～10份、水适量。其中发酵剂包括芽孢杆菌、酵母菌和嗜热性侧孢霉菌。

上述两篇文献公开的黄瓜抗重茬菌剂的组分配方中，缺少对黄瓜枯萎病病原菌和黄瓜根结线虫具有拮抗作用的木霉类的真菌，或缺乏补充钾元素的技术手段等，其组分配方没有完全根据引起黄瓜重茬危害的主要原因来组配。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供了一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥。

本发明由如下技术方案实现的：一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥主要由以下重量份比例的组分所制成：

10～16重量份枯草芽孢杆菌j-5菌粉、6～12重量份胶冻样类芽孢杆菌菌粉、18～24重量份哈茨木霉菌菌粉、18～26重量份棘孢木霉菌菌粉、20～28重量份淡紫拟青霉菌菌粉、0.1～1重量份壳聚糖、20～30重量份腐殖酸钾、20～30重量份磷酸二氢钾、40～50重量份硅藻土。其中，所述枯草芽孢杆菌j-5，保藏号为cgmccno.11750。所述枯草芽孢杆菌j-5菌粉是按照下述步骤制备得到的：将保藏号为cgmccno.11750的枯草芽孢杆菌菌株斜面用接种针挑取一环，接种至1只装有50ml牛肉膏液体培养基(1000ml该培养基的配方为：3g牛肉膏、10g蛋白胨、5gnacl和1000ml蒸馏水，ph7.0～7.2.)的250ml的摇瓶中，重复上述接种过程8次，即把枯草芽孢杆菌菌株接种到8只同样的装有50ml牛肉膏液体培养基的250ml的摇瓶中；于35℃、200r/min条件下摇床振荡培养36小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液；将上述培养的400ml培养液转入装有15lpb液体培养基(1000ml该培养基的配方为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl5g和1000ml自来水，调整ph值至7.2～7.4)的50l发酵罐中，于35℃、180r/min的恒温条件下培养48小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液，用离心机5000r/min离心5分钟，获得枯草芽孢杆菌的芽孢及菌体，与硅藻土按1∶1的比例混匀，低温干燥后粉碎，形成有效活菌数为100×10⁸cfu/g～120×10⁸cfu/g的枯草芽孢杆菌j-5粉剂。

优选的，所述黄瓜专用抗重茬生物菌肥的组分中，胶冻样类芽孢杆菌菌粉活菌数≥200×10⁸cfu/g、哈茨木霉菌菌粉活菌数≥100×10⁸cfu/g、棘孢木霉菌菌粉活菌数≥100×10⁸cfu/g、淡紫拟青霉菌菌粉活菌数≥100×10⁸cfu/g。

优选的，本发明所述的黄瓜专用抗重茬生物菌肥主要由以下重量份比例的组分所制成：12～15重量份枯草芽孢杆菌j-5菌粉、8～10重量份胶冻样类芽孢杆菌菌粉、20～23重量份哈茨木霉菌菌粉、19～23重量份棘孢木霉菌菌粉、23～26重量份淡紫拟青霉菌菌粉、0.5～1重量份壳聚糖、22～28重量份腐殖酸钾、24～29重量份磷酸二氢钾与44～47重量份硅藻土。

优选的，所述黄瓜专用抗重茬生物菌肥主要由以下重量份比例的组分所制成：13重量份枯草芽孢杆菌j-5菌粉、9重量份胶冻样类芽孢杆菌菌粉、21重量份哈茨木霉菌菌粉、22重量份棘孢木霉菌菌粉、24重量份淡紫拟青霉菌菌粉、0.9重量份壳聚糖、25重量份腐殖酸钾、25重量份磷酸二氢钾、45重量份硅藻土。

优选的，所述黄瓜专用抗重茬生物菌肥的总有效活菌数≥50×10⁸cfu/g。

保藏号为cgmccno.11750的枯草芽孢杆菌j-5制成的菌剂，采用喷施办法可以有效抑制灰霉菌感染所致的黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病，这在中国专利文献cn105907680b已有公开。经本专利申请人研究发现：枯草芽孢杆菌j-5对黄瓜枯萎病的病原菌也有很强的拮抗作用。另外，枯草芽孢杆菌对危害黄瓜的根结线虫--南方根结线虫的防治效果超过40％(《现代农业科技》2008年第11期根结线虫防治研究进展孙世伟等)，所以枯草芽孢杆菌j-5是一种多功能菌，具有多功能特性即以枯草芽孢杆菌j-5制成的菌剂对黄瓜枯萎病的病原菌、黄瓜灰霉菌的病原菌以及黄瓜根结线虫都具有拮抗作用。

图1为枯草芽孢杆菌j-5对黄瓜枯萎病的病原菌尖孢镰刀菌黄瓜专化型的室内平板对峙效果。其中a是病原菌单接种图片(ck)；b是枯草芽孢杆菌j-5对病原菌的室内平板对峙图。由图1可见，抑制圈半径为5mm以上，枯草芽孢杆菌j-5对黄瓜枯萎病的病原菌生长具有较强的拮抗作用。

胶冻样类芽孢杆菌，具有解磷、解钾、固氮、抑制土壤有害和致病微生物的繁殖从而减少多种土传病害的发生的功效。本发明使用的胶冻样类芽孢杆菌固体菌粉是目前市场上销售的产品，例如由邢台思倍特生物科技有限公司销售的胶冻样类芽孢杆菌固体菌粉，按照“农用微生物菌剂(gb20287-2006)”中规定的办法检测，所述的胶冻样类芽孢杆菌固体菌粉≥200×10⁸cfu/g。

哈茨木霉菌是一种多功能菌，具有多功能特性即对黄瓜枯萎病、黄瓜根结线虫病都具有防治效果。本发明使用的哈茨木霉菌固体菌粉是目前市场上销售的产品，例如由山东长泰生物科技有限公司、山东绿陇生物科技有限公司生产的哈茨木霉菌菌粉，有效活菌数≥100×10⁸cfu/g。

棘孢木霉菌用来防治土传病害(根腐病、不明原因死棵)效果显著，可利用棘孢木霉菌防治黄瓜枯萎病。本发明使用的棘孢木霉菌固体菌粉是目前市场上销售的产品，例如山东鑫卓源化工有限公司、广西中向启明生态科技有限公司生产的棘孢木霉菌菌粉，有效活菌数≥100×10⁸cfu/g。

淡紫拟青霉菌属于内寄生性真菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能够明显减轻多种作物根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等植物线虫病的危害。本发明使用的淡紫拟青霉菌菌粉是目前市场上销售的产品，例如，潍坊瑞辰生物科技有限公司、山东诺杰生物科技有限公司、湖北启明生物工程有限公司等生产的淡紫拟青霉菌菌粉，有效活菌数100×10⁸cfu/g以上。

当然，也可以根据现有技术文献，使用常规的培养基采用常规培养方法进行逐级培养制备得到所述的胶冻样类芽孢杆菌固体菌粉、哈茨木霉菌固体菌粉、棘孢木霉菌固体菌粉、淡紫拟青霉菌菌粉等。

腐殖酸钾可提高土壤速效钾含量，还具有促进分解天然的毒性物质的作用，对黄瓜生长具有多重有益的作用。

磷酸二氢钾：磷酸二氢钾能调节土壤的酸碱度，补充钾元素，有利于农作物的生长，能增强作物的拮抗能力，对黄瓜生长也具有多重有益的作用。

壳聚糖，用其作为土壤改良剂原料，有利于提高作物的广谱抗病性、抗旱性和保水性，刺激土壤有益微生物的生长产生能杀死线虫和虫卵的酶，间接消灭线虫，对黄瓜根结线虫具有一定的防效。

硅藻土对自毒物质具有一定的吸附作用，能降低黄瓜自毒物质对黄瓜生长的抑制作用。

本发明中，腐殖酸钾、壳聚糖、磷酸二氢钾、硅藻土，均是目前市场上销售的产品。

根据“农用微生物菌剂(gb20287-2006)”标准检测枯草芽孢杆菌j-5菌粉、胶冻样类芽孢杆菌菌粉、哈茨木霉菌菌粉、棘孢木霉菌菌粉、淡紫拟青霉菌菌粉活菌数。本发明一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥的总有效活菌数≥50×10⁸cfu/g。

本发明一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥可以采用拌土的施用方法进行穴施、环施或沟施。本技术领域的技术人员可以根据实际生产情况确定本发明黄瓜专用抗重茬生物菌肥的施用量及其施用方法，这对于本技术领域的技术人员而言不存在任何技术问题，是容易实现的。

本发明的有益效果是：

本发明黄瓜专用抗重茬生物菌肥，充分发挥了该生物菌肥中所含有的各种拮抗微生物具有的多功能特性以及有益物质的多重作用，充分利用了有益菌之间的相互协同作用，有针对性地解决由黄瓜枯萎病、根结线虫病以及土壤缺钾等引起的重茬问题，对黄瓜连作障碍具有较好的防治效果，实现了黄瓜种植增产增收。另外本发明的黄瓜专用抗重茬生物菌肥防治黄瓜枯萎病的效果与威百亩接近，防治黄瓜根结线虫的效果略低于石灰氮，可以使用本发明替代对人体和环境有害的威百亩、石灰氮。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌j-5对黄瓜枯萎病的病原菌尖孢镰刀菌黄瓜专化型的室内平板对峙效果。其中a是病原菌单接种图片(ck)；b是枯草芽孢杆菌j-5对病原菌的室内平板对峙图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

在本发明中，如无特别说明，用于说明浓度或比例的“％”均为重量百分比。

实施例1：本发明的一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥制备

1)制备枯草芽孢杆菌j-5菌粉。将保藏号为cgmccno.11750的枯草芽孢杆菌菌株斜面用接种针挑取一环，接种至1只装有50ml牛肉膏液体培养基(1000ml该培养基的配方为：3g牛肉膏、10g蛋白胨、5gnacl和1000ml蒸馏水，ph7.0～7.2.)的250ml的摇瓶中，重复上述接种过程8次，即把枯草芽孢杆菌菌株接种到8只同样的装有50ml牛肉膏液体培养基的250ml的摇瓶中；于35℃、200r/min条件下摇床振荡培养36小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液；将上述培养的400ml培养液转入装有15lpb液体培养基(1000ml该培养基的配方为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl5g和1000ml自来水，调整ph值至7.2～7.4)的50l发酵罐中，于35℃、180r/min的恒温条件下培养48小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液，用离心机5000r/min离心5分钟，获得枯草芽孢杆菌的芽孢及菌体，与硅藻土按1∶1的比例混匀，低温干燥后粉碎，形成有效活菌数为100×10⁸cfu/g～120×10⁸cfu/g的枯草芽孢杆菌j-5粉剂。

2)将上步骤制备的枯草芽孢杆菌j-5菌粉与目前市场上销售的产品胶冻样类芽孢杆菌菌粉、哈茨木霉菌菌粉、棘孢木霉菌菌粉、淡紫拟青霉菌菌粉、壳聚糖、腐殖酸钾、磷酸二氢钾、硅藻土等按照10∶6∶24∶26∶20∶0.1∶30∶20∶40的重量比混合，得到本发明的一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥。

3)检测：按照“农用微生物菌剂(gb20287-2006)”标准检测，本实施例制备的一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥的总有效活菌数≥52×10⁸cfu/g。

实施例2：本发明的一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥制备

1)制备枯草芽孢杆菌j-5菌粉。将保藏号为cgmccno.11750的枯草芽孢杆菌菌株斜面用接种针挑取一环，接种至1只装有50ml牛肉膏液体培养基(1000ml该培养基的配方为：3g牛肉膏、10g蛋白胨、5gnacl和1000ml蒸馏水，ph7.0～7.2.)的250ml的摇瓶中，重复上述接种过程8次，即把枯草芽孢杆菌菌株接种到8只同样的装有50ml牛肉膏液体培养基的250ml的摇瓶中；于35℃、200r/min条件下摇床振荡培养36小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液；将上述培养的400ml培养液转入装有15lpb液体培养基(1000ml该培养基的配方为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl5g和1000ml自来水，调整ph值至7.2～7.4)的50l发酵罐中，于35℃、180r/min的恒温条件下培养48小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液，用离心机5000r/min离心5分钟，获得枯草芽孢杆菌的芽孢及菌体，与硅藻土按1∶1的比例混匀，低温干燥后粉碎，形成有效活菌数为100×10⁸cfu/g～120×10⁸cfu/g的枯草芽孢杆菌j-5粉剂。

2)将上步骤制备的枯草芽孢杆菌j-5菌粉与目前市场上销售的产品胶冻样类芽孢杆菌菌粉、哈茨木霉菌菌粉、棘孢木霉菌菌粉、淡紫拟青霉菌菌粉、壳聚糖、腐殖酸钾、磷酸二氢钾、硅藻土等按照16∶12∶18∶18∶28∶1∶20∶30∶50的重量比混合，得到本发明的一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥

3)检测：按照“农用微生物菌剂(gb20287-2006)”标准检测，本实施例制备的一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥的总有效活菌数≥53×10⁸cfu/g。

实施例3：本发明一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥制备

1)制备枯草芽孢杆菌j-5菌粉。将保藏号为cgmccno.11750的枯草芽孢杆菌菌株斜面用接种针挑取一环，接种至1只装有50ml牛肉膏液体培养基(1000ml该培养基的配方为：3g牛肉膏、10g蛋白胨、5gnacl和1000ml蒸馏水，ph7.0～7.2.)的250ml的摇瓶中，重复上述接种过程8次，即把枯草芽孢杆菌菌株接种到8只同样的装有50ml牛肉膏液体培养基的250ml的摇瓶中；于35℃、200r/min条件下摇床振荡培养36小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液；将上述培养的400ml培养液转入装有15lpb液体培养基(1000ml该培养基的配方为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl5g和1000ml自来水，调整ph值至7.2～7.4)的50l发酵罐中，于35℃、180r/min的恒温条件下培养48小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液，用离心机5000r/min离心5分钟，获得枯草芽孢杆菌的芽孢及菌体，与硅藻土按1∶1的比例混匀，低温干燥后粉碎，形成有效活菌数为100×10⁸cfu/g～120×10⁸cfu/g的枯草芽孢杆菌j-5粉剂。

2)将上步骤制备的枯草芽孢杆菌j-5菌粉与目前市场上销售的产品胶冻样类芽孢杆菌菌粉、哈茨木霉菌菌粉、棘孢木霉菌菌粉、淡紫拟青霉菌菌粉、壳聚糖、腐殖酸钾、磷酸二氢钾、硅藻土等按照13∶9∶21∶22∶24∶0.9∶25∶25∶45的重量比混合，得到本发明的一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥。

3)检测：按照“农用微生物菌剂(gb20287-2006)”标准检测，本实施例制备的一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥的总有效活菌数≥53×10⁸cfu/g。

实施例4：试验用制剂1的制备(本制剂配方中，不添加枯草芽孢杆菌j-5菌粉，其份数用等量沙土代替)

1)将沙土和目前市场上销售的产品胶冻样类芽孢杆菌菌粉、哈茨木霉菌菌粉、棘孢木霉菌菌粉、淡紫拟青霉菌菌粉、壳聚糖、腐殖酸钾、磷酸二氢钾、硅藻土等按照13∶9∶21∶22∶24∶0.9∶25∶25∶45的重量比混合，得到试验用制剂1。

2)检测：按照“农用微生物菌剂(gb20287-2006)”标准检测，本试验用制剂1的总有效活菌数≥46×10⁸cfu/g。

实施例5：试验用制剂2的制备(本制剂配方中，不添加腐殖酸钾和磷酸二氢钾，其份数用等量沙土代替)

1)制备枯草芽孢杆菌j-5菌粉。将保藏号为cgmccno.11750的枯草芽孢杆菌菌株斜面用接种针挑取一环，接种至1只装有50ml牛肉膏液体培养基(1000ml该培养基的配方为：3g牛肉膏、10g蛋白胨、5gnacl和1000ml蒸馏水，ph7.0～7.2.)的250ml的摇瓶中，重复上述接种过程8次，即把枯草芽孢杆菌菌株接种到8只同样的装有50ml牛肉膏液体培养基的250ml的摇瓶中；于35℃、200r/min条件下摇床振荡培养36小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液；将上述培养的400ml培养液转入装有15lpb液体培养基(1000ml该培养基的配方为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl5g和1000ml自来水，调整ph值至7.2～7.4)的50l发酵罐中，于35℃、180r/min的恒温条件下培养48小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液，用离心机5000r/min离心5分钟，获得枯草芽孢杆菌的芽孢及菌体，与硅藻土按1∶1的比例混匀，低温干燥后粉碎，形成有效活菌数为100×10⁸cfu/g～120×10⁸cfu/g的枯草芽孢杆菌j-5粉剂。

2)将上步骤制备的枯草芽孢杆菌j-5菌粉与目前市场上销售的产品胶冻样类芽孢杆菌菌粉、哈茨木霉菌菌粉、棘孢木霉菌菌粉、淡紫拟青霉菌菌粉、壳聚糖、沙土、硅藻土等按照13∶9∶21∶22∶24∶0.9∶50∶45的重量比混合，得到本试验用制剂2。

3)检测：按照“农用微生物菌剂(gb20287-2006)”标准检测，本试验用制剂2的总有效活菌数≥53×10⁸cfu/g。

实施例6：试验用制剂3的制备(本制剂配方中，不添加淡紫拟青霉菌菌粉，其份数用等量沙土代替)

1)制备枯草芽孢杆菌j-5菌粉。将保藏号为cgmccno.11750的枯草芽孢杆菌菌株斜面用接种针挑取一环，接种至1只装有50ml牛肉膏液体培养基(1000ml该培养基的配方为：3g牛肉膏、10g蛋白胨、5gnacl和1000ml蒸馏水，ph7.0～7.2.)的250ml的摇瓶中，重复上述接种过程8次，即把枯草芽孢杆菌菌株接种到8只同样的装有50ml牛肉膏液体培养基的250ml的摇瓶中；于35℃、200r/min条件下摇床振荡培养36小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液；将上述培养的400ml培养液转入装有15lpb液体培养基(1000ml该培养基的配方为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl5g和1000ml自来水，调整ph值至7.2～7.4)的50l发酵罐中，于35℃、180r/min的恒温条件下培养48小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液，用离心机5000r/min离心5分钟，获得枯草芽孢杆菌的芽孢及菌体，与硅藻土按1∶1的比例混匀，低温干燥后粉碎，形成有效活菌数为100×10⁸cfu/g～120×10⁸cfu/g的枯草芽孢杆菌j-5粉剂。

2)将上步骤制备的枯草芽孢杆菌j-5菌粉与胶冻样类芽孢杆菌菌粉、哈茨木霉菌菌粉、棘孢木霉菌菌粉、沙土、壳聚糖、腐殖酸钾、磷酸二氢钾、硅藻土等按照13∶9∶21∶22∶24∶0.9∶25∶25∶45的重量比混合，得到本试验用制剂3。

3)检测：按照“农用微生物菌剂(gb20287-2006)”标准检测，本试验用制剂3的总有效活菌数≥40×10⁸cfu/g。

实施例7：试验用制剂4的制备(本制剂配方中，不添加哈茨木霉菌菌粉，其份数用等量沙土代替)

1)制备枯草芽孢杆菌j-5菌粉。将保藏号为cgmccno.11750的枯草芽孢杆菌菌株斜面用接种针挑取一环，接种至1只装有50ml牛肉膏液体培养基(1000ml该培养基的配方为：3g牛肉膏、10g蛋白胨、5gnacl和1000ml蒸馏水，ph7.0～7.2.)的250ml的摇瓶中，重复上述接种过程8次，即把枯草芽孢杆菌菌株接种到8只同样的装有50ml牛肉膏液体培养基的250ml的摇瓶中；于35℃、200r/min条件下摇床振荡培养36小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液；将上述培养的400ml培养液转入装有15lpb液体培养基(1000ml该培养基的配方为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl5g和1000ml自来水，调整ph值至7.2～7.4)的50l发酵罐中，于35℃、180r/min的恒温条件下培养48小时，得到芽孢浓度8×10⁸～10×10⁸cfu/ml的芽孢悬浮液，用离心机5000r/min离心5分钟，获得枯草芽孢杆菌的芽孢及菌体，与硅藻土按1∶1的比例混匀，低温干燥后粉碎，形成有效活菌数为100×10⁸cfu/g～120×10⁸cfu/g的枯草芽孢杆菌j-5粉剂。

2)将上步骤制备的枯草芽孢杆菌j-5菌粉与胶冻样类芽孢杆菌菌粉、沙土、棘孢木霉菌菌粉、淡紫拟青霉菌菌粉、壳聚糖、腐殖酸钾、磷酸二氢钾、硅藻土等按照13∶9∶21∶22∶24∶0.9∶25∶25∶45的重量比混合，得到本试验用制剂4。

3)检测：按照“农用微生物菌剂(gb20287-2006)”标准检测，本实施例制备的本试验用制剂4的总有效活菌数≥40×10⁸cfu/g。

实施例8：温室黄瓜抗重茬应用试验

试验品种：田娇五号

试验时间：2019年10月5日-2020年1月31日

茬口安排：越冬茬(9月2日育苗，10月5日定植，11月10日开始上市，第二年5月底采收完成)所有试验数据的调查统计工作在2020年1月31日前结束。

试验地点；河北省昌黎县马坨店乡某农户连续种植黄瓜4年的温室大棚。

处理组：处理组有7个处理，分别是处理1、处理2、处理3、处理4、处理5、处理6、处理7，按照每亩10kg施用量，分别对应将实施例1、2、3、4、5、6、7制得的黄瓜专用抗重茬生物菌肥或试验用制剂拌土35kg，在黄瓜秧移栽定植前用打孔器打孔穴施，穴深10厘米，其它栽培管理措施均按照当地温室黄瓜生产技术规范执行。

对照组(ck)：对照组仅有1个处理，具体的栽培管理措施是：除不使用石灰氮或威百亩对土壤消毒外，其余的栽培管理措施均按照昌黎当地温室黄瓜生产技术规范执行。昌黎地区温室种植黄瓜，一般是利用石灰氮或威百亩对土壤进行消毒。由于施入石灰氮对土壤进行消毒需要闷棚15-20天，施用威百亩也需要盖膜等措施，现实生产中很难实现在一个温室内仅对其几个区域采取高温闷棚或覆膜措施。另外，频繁进出温室，线虫和土传病菌均可通过农具、鞋底等传播，会影响试验效果，所以，对照组的处理的具体的栽培管理措施是：除不使用石灰氮或威百亩对土壤消毒外，其余的栽培管理措施均按照昌黎当地温室黄瓜生产技术规范执行。

本实施例的处理组和对照组的每一个处理，均3次重复，处理组7个处理，对照组1个处理，所有处理随机排列，每个处理的小区面积10m²。

试验结果：见表1：不同处理对黄瓜枯萎病、黄瓜线虫病发病情况及产量的影响。

表1的结果清楚表明，本发明一种黄瓜专用抗重茬生物菌肥能有效降低黄瓜枯萎病、黄瓜线虫病的发病率和降低病情指数，并增加了产瓜量。

其中处理3(实施例3制得的黄瓜专用抗重茬生物菌肥)防治黄瓜枯萎病的效果达到84.62％，与威百亩对黄瓜枯萎病的87.03％的防治效果接近，而威百亩对人体健康和环境有害，法国已宣布禁用。处理3防治黄瓜根结线虫病的防治效果为85.71％，高于威百亩水剂对黄瓜根结线虫的56.7％的防治效果(《农业科技通讯》2013年05期137-138，241：不同药剂处理防治黄瓜根结线虫试验研究，周海霞吴小波)，但低于石灰氮防治黄瓜根结线虫的93.26％的防治效果。表1的结果表明：处理3、处理2的各项指标表现较为出色，黄瓜枯萎病、根结线虫病的病情指数显著降低，黄瓜产量均明显增加。

对于防治黄瓜根结线虫病，从表1中可见，淡紫拟青霉菌菌粉对黄瓜根结线虫的抑制效果最大(表1中的处理6即穴施实施例6制备的试验用制剂3，因没有添加淡紫拟青霉菌菌粉，防治线虫的效果仅为57.95％，说明淡紫拟青霉菌菌粉对黄瓜根结线虫的抑制效果最大)。处理4即穴施实施例4制备的试验用制剂1，试验用制剂1中没有添加枯草芽孢杆菌j-5菌粉，防治黄瓜根结线虫效果为64.23％；处理7即穴施实施例7制备的试验用制剂4，试验用制剂4中没有添加哈茨木霉菌菌粉，防治黄瓜根结线虫效果为65.07％。由上可见，枯草芽孢杆菌j-5菌粉对黄瓜根结线虫的抑制效果略低于淡紫拟青霉菌菌粉，哈茨木霉菌对黄瓜根结线虫的抑制效果又略低于枯草芽孢杆菌j-5菌粉。处理1、处理2、处理3中都含有淡紫拟青霉菌菌粉、枯草芽孢杆菌j-5菌粉、哈茨木霉菌菌粉等三种组分，防治根结线虫病的效果优于处理4、处理6、处理7，说明通过淡紫拟青霉菌菌粉、枯草芽孢杆菌j-5菌粉、哈茨木霉菌菌粉三者之间的相互协同作用，进一步降低了黄瓜根结线虫病的发病率，提高了对黄瓜线虫病的防治效果，增加了黄瓜的采收量。

表1黄瓜专用抗重茬复合剂对连作黄瓜产量的影响

表中数值采用以下算法得到：

植株发病率＝(染病株数/调查总株数)×100％

植株病情指数＝[∑(各级病株数×相应级数)/调查总株数×最高级别值]×100％

相对防治效果(％)＝(ck区病情指数-处理区病情指数)/ck区病情指数×100

黄瓜枯萎病的病级分级标准及调查方法：

病级分级标准：

0级：植株外表无病症；

1级：枯萎叶面积占全株叶面积的25％以下；

2级：植株轻度萎蔫，茎出现坏死斑，枯萎叶面积占全株叶面积的25％～50％；

3级：植株中度萎蔫，叶片下垂黄化，枯萎叶面积占全株叶面积的50％以上或仅生长点存活；

4级：植株严重萎蔫，倒伏枯死。

调查方法：2019年12月4日调查，每小区随机调查20株。

黄瓜根结线虫病的病级分级标准及调查方法：

病情分级标准：0级为根系完整，无根结；1级为有少量根结，根坏死少于25％；2级为根结数占根系数的26％-50％；3级为根结数占根系数的51％-75％；4级为根结特多且较大，占根系数的76％-100％。

调查方法：2020年1月31日，待调查统计黄瓜产量工作结束后，调查黄瓜根结线虫的发病情况。用工具扒开根际表土，观察根部根结线虫发病情况。按照根结线虫病分级标准，记录发病株数，与对照ck比较，确定病情指数和防治效果。

产瓜期连续1个月的产量：自2020年1月1日开始至1月31日结束。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。