表面具有微纳米结构的生物陶瓷支架及其制备方法和应用

1.本发明涉及表面具有微纳米结构的生物陶瓷支架及其制备方法和应用，其具体涉及一种四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架及其制备方法和用途，属生物材料领域。


背景技术：

2.恶性骨肿瘤的治疗一直是临床上的巨大难题。目前，治疗恶性骨肿瘤的手段很多，比如手术切除、化学疗法、放射疗法等。手术切除后会在切除部位留下较大的缺损，必须通过植入物对其进行修复，并且手术切除不能彻底清除肿瘤细胞。放疗和化疗会对肿瘤周围正常的组织产生较大的伤害，也会使肿瘤细胞对药物产生一定的抵抗力。因此，开发兼具肿瘤清除能力和骨修复能力的生物材料仍然具有很大的挑战。化学动力学疗法利用亚铁离子高效歧化肿瘤微环境中累积的过氧化氢，产生强氧化性的活性氧，进而引起肿瘤细胞的蛋白变性、dna断裂、线粒体破坏等一系列氧化损伤，进而引起肿瘤细胞的凋亡。此外，利用磁热疗法可以辅助促进化学动力学疗法中羟基自由基的产生效率，实现磁热调控化学动力学疗法治疗肿瘤。磁热疗法不受深度的影响，效率高，且副作用小，因此可以用来治疗骨肿瘤这一类的深层次的肿瘤。三维支架表面的微结构可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。


技术实现要素：

3.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种兼具肿瘤清除和骨修复能力的生物陶瓷支架。
4.一方面，本发明提供一种四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架材料，包括镁黄长石支架和生长在镁黄长石支架表面的四硫化三铁层微米花颗粒，所述镁黄长石支架孔道直径在100～400μm；所述四硫化三铁微米花颗粒是微纳米结构，由直径为0.5～3μm的片状颗粒组装成，其直径在5～50μm。
5.四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架，支架表面生长的四硫化三铁具有铁磁性，可以在交变磁场的感应下由于磁滞效应、弛豫效应等原因迅速升温，并且可以在酸性环境下释放铁离子催化肿瘤微环境中过表达的过氧化氢，通过芬顿或类芬顿反应产生羟基自由基，具体反应过程如下：fe
2+
+h2o2→
fe
3+
+oh
‑
+
·
oh，磁热可以提高活性氧的产生效率进而达到磁热和化学动力学疗法协同有效杀死肿瘤细胞。同时，微纳米结构可以通过整合素α5β1等介导肌动蛋白f
‑
actin来调控细胞行为，进而促进成骨分化，因此微纳米结构在促进骨修复方面有一定的优势。支架表面的四硫化三铁微米花形成的微纳米结构可以通过整合素介导肌动蛋白f
‑
actin来通过调控细胞的形态进而调控骨髓间充质干细胞的分化能力，起修复骨缺损的作用。此外，镁黄长石具有良好的成骨活性，镁黄长石支架自身可以释放活性离子(如ca、mg和si)促进骨修复，而四硫化三铁微结构可以与活性离子协同进一步镁黄长石支架的成骨性能。因此，本发明的四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架具有良好的清除肿瘤能力和修复骨缺损的能力，可以用于骨肿瘤的术后治疗。
6.较佳地，所述生物陶瓷支架是通过将镁黄长石支架在feso4·
7h2o和l
‑
半胱氨酸的
水溶液中利用水热法在镁黄长石支架表面生长出四硫化三铁微米花颗粒制备到得。所述水热反应温度优选为160～200℃，反应时间为12～24小时。
7.较佳地，所述水溶液中feso4·
7h2o的浓度为
‑
0.01～0.05mol/l，l
‑
半胱氨酸的浓度为0.01～0.05mol/l。
8.较佳地，所述四硫化三铁微米花原位生长于所述镁黄长石支架表面，所构成的整个层的厚度为1～10μm。
9.另一方面，本发明提供了一种四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架的制备方法，包括镁黄长石陶瓷支架的制备；将镁黄长石陶瓷支架在feso4·
7h2o和l
‑
半胱氨酸的水溶液中进行水热处理即得到四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架。
10.在一方案中，所述镁黄长石生物活性陶瓷支架的通过如下方法制备：将镁黄长石粉末：粘结剂以质量比为(1～1.5):1进行混合得到糊状物；将所得糊状物置入三维打印机中进行三维打印，得到坯体；将所得坯体在1300～1400℃烧结3～5小时，制得镁黄长石生物活性陶瓷支架。
11.较佳地，所述粘结剂包括常见的粘结剂海藻酸钠、普兰尼克f127水溶液、和/或聚乙烯醇等。
12.将所得到的镁黄长石支架在feso4·
7h2o和l
‑
半胱氨酸的水溶液中进行水热处理过程中，优选四硫化三铁水热前驱体的浓度为0.01～0.05mol/l。
13.本发明中，通过三维打印技术制备镁黄长石支架，制备方法简单，可制备形状复杂的支架。此外，水热法可以在支架表面修饰四硫化三铁微米花，制备简单且重复性好。
14.再一方面，本发明还提供了一种四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架在骨肿瘤术后的治疗与修复的材料中的应用。
附图说明
15.图1为纯镁黄长石和四硫化三铁修饰的镁黄长石支架的光学照片(a)，纯镁黄长石支架的sem图(b1
‑
b3)，不同水热条件下四硫化三铁修饰的镁黄长石支架(c1
‑
f3)，具体对应的反应条件如下：(c1
‑
c3)0.02mol/l前驱体，反应温度160℃，反应时长12小时，命名为0.02l
‑
fs
‑
akt；(d1
‑
d3)0.04mol/l前驱体，反应温度160℃，反应时长12小时，命名为0.04l
‑
fs
‑
akt；(e1
‑
e3)0.02mol/l前驱体，反应温度180℃，反应时长12小时，命名为0.02f
‑
fs
‑
akt；(f1
‑
f3)0.04mol/l前驱体，反应温度180℃，反应时长12小时，命名为0.04f
‑
fs
‑
akt，其中，从e1
‑
e3可以看出，在这一条件下支架表面形成了尺寸均匀的微米花结构；图2示出了四硫化三铁修饰的支架的磁热性能；图中曲线从上至下分别为：6a、7a、8a；图3为四硫化三铁修饰的镁黄长石支架催化过氧化氢产生活性氧的性能；图4为骨髓间充质干细胞在支架上培养1、3、7天后的吸光度(a)，成骨相关基因骨钙蛋白(ocn)(b)、骨桥素(opn)(c)和骨细胞特异转录因子(runx2)(d)的表达水平；图4的(a)中从左至右分别是akt、0.02l
‑
fs
‑
akt、0.04l
‑
fs
‑
akt、0.02f
‑
fs
‑
akt、0.04f
‑
fs
‑
akt(已在图1中具体说明)，图中可以看出0.02f
‑
fs
‑
akt有效促进骨髓间充质干细胞的增殖，以及相比于其它组可以显著提高成骨相关基因的表达；图5为lm
‑
8骨肉瘤细胞在支架磁热和活性氧协同作用下的存活率；
图6为裸鼠肿瘤皮下模型中支架的抗肿瘤能力，升温曲线(a)，肿瘤体积变化(b)，裸鼠在第0和14天的照片(c)，肿瘤组织照片(d)和肿瘤组织的h&e染色图(e)；图6的(b)中曲线从上至下分别为：空白组、fe3s4‑
akt组、fe3s4‑
akt+交变磁场(amf)组；图7为新西兰大白兔骨缺损模型动物实验的ct分析结果。
具体实施方式
16.以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
17.本发明中，通过水热反应在镁黄长石支架表面修饰四硫化三铁，一方面，四硫化三铁可以利用磁热和催化过氧化氢产生活性氧，协同杀死肿瘤细胞；另一方面，四硫化三铁微米花可以调控骨髓间充质干细胞的成骨分化，并且镁黄长石本身有利于骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化。因此本发明的四硫化三铁微米花修饰的镁黄长石支架具有良好的清除肿瘤和骨修复的能力(参见后述的生物活性测试)，可以作为骨肿瘤术后治疗的材料，兼具肿瘤治疗与骨组织再生的双功能。
18.本发明的一个实施方式提供一种四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架，其包括镁黄长石支架和生长在镁黄长石支架表面的四硫化三铁微米花层，四硫化三铁是以水热法生长在支架表面，水热法以l
‑
半胱氨酸为硫源(l
‑
半胱氨酸可以溶于水，形成均匀的水溶液，呈酸性，其中的巯基(
‑
sh)性质活泼可以和金属离子反应)，以feso4·
7h2o为铁源，一步法均匀地在支架表面上生长四硫化三铁微米花。图1示出发明一个示例的镁黄长石支架和四硫化三铁修饰的镁黄长石支架的光学照片(a)和sem图(b1～f3)。从图中可以看出，四硫化三铁均匀地生长在镁黄长石支架表面，微米花的直径可以为5～50μm。
19.上述四硫化三铁修饰的生物陶瓷支架的制备可以包括：利用3d打印技术制备出镁黄长石支架；将制得的镁黄长石支架在feso4·
7h2o和l
‑
半胱氨酸的水溶液中进行水热处理，清洗干燥得到四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架。
20.在利用3d打印技术制备镁黄长石支架的一个示例中，采用镁黄长石粉末为原材料，并将粉末与粘结剂混合均匀，并且调整两者混合的比例，例如镁黄长石粉末与粘结剂的质量比为(1～1.5):1，其中粘结剂可为海藻酸钠、普兰尼克(f127)和/或聚乙烯醇等。然后利用3d打印软件(主要包括设计支架具体参数，调控支架的形状、尺寸等)，进行打印。
21.将3d打印后的镁黄长石生坯进行烧结，制得镁黄长石陶瓷支架。其中烧结条件可在1300～1400℃烧结3～5小时。
22.利用水热法在镁黄长石支架表面生长出四硫化三铁微米花颗粒。在一个示例中，水热生长的方法是将支架在feso4·
7h2o和l
‑
半胱氨酸的水溶液中进行水热，之后清洗干燥。其中水热前驱体浓度为0.01～0.05mol/l，feso4·
7h2o的浓度为0.01～0.05mol/l，l
‑
半胱氨酸的浓度为0.01～0.05mol/l，当前驱体浓度低于0.01mol/l时，支架表面很难形成均匀的微米花层，当浓度高于0.05mol/l时，支架表面的四硫化三铁过多，影响支架的生物活性；水热反应温度为160～200℃，反应时间为12～24小时。
23.以下，作为示例，说明本发明中四硫化三铁修饰的镁黄长石支架的制备方法。
24.将镁黄长石粉末和f127水溶液按照质量比(1～1.5):1混合均匀，利用3d打印技术制备出镁黄长石生坯支架。
25.将打印好的支架生坯在1300～1400℃烧结3～5小时，得到镁黄长石陶瓷支架。
26.将制得的镁黄长石支架在feso4·
7h2o和l
‑
半胱氨酸的水溶液中进行水热处理，得到四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架。
27.通过光学照片和扫描电镜对支架的形貌进行表征。
28.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
29.实施例1纯镁黄长石粉体5g，与4gf127均匀混合，利用3d打印技术制备出镁黄长石支架；将镁黄长石支架生坯在1360℃煅烧4小时，即得到纯的镁黄长石支架；将镁黄长石放入0.02mol/l的feso4·
7h2o和l
‑
半胱氨酸的水溶液中进行水热处理，温度为180℃,时间为12小时；水热后，将支架用去离子水和无水乙醇冲洗，在60℃烘箱中烘干，即得到四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架。对其进行结构表征，结果如图1所示，从图中可以看出镁黄长石支架孔道直径在100～400μm；四硫化三铁均匀生长在镁黄长石支架表面；微米花颗粒是由直径为0.5～3μm的片状颗粒交错组装成的，微米花直径在5～50μm。然后采用下述方法进行成骨活性和抗肿瘤能力的评价。
30.支架的磁热性能将支架置于交变磁场(磁场参数,线圈直径：10cm；频率：560khz；输出电流：7.5a)中，利用热成像仪以及flir r&d软件实时监控支架的温度变化，并输出温度变化曲线，结果参见图2.a。同样的磁场下，支架经历5个磁场开
‑
关循环，并记录温度曲线，结果参见图2.b。改变磁场的输出电流，在干、湿状态下测试支架的磁热性能，结果参加图2.c和2.d。从图2中可以看出支架具有良好的磁热性能，可以在短时间内迅速升温，达到肿瘤治疗所需要的温度45℃以上。
31.支架催化过氧化氢产生活性氧的性能将四硫化三铁微米花修饰的支架置于1ml的磷酸氢二钠
‑
柠檬酸缓冲溶液(ph＝6.5，含200μh2o2和25mg/l亚甲基蓝)中，利用磁场调控支架的温度到42、47、52和57℃，保持10min后，测试溶液在664nm处的吸收光光谱，并与原始溶液进行比较，结果参见图3。图中可以看出随着温度升高，活性氧产生的效率随之提高。
32.四硫化三铁修饰的陶瓷支架与骨髓间充质干细胞的相互作用将骨髓间充质干细胞分别种在镁黄长石支架和四硫化三铁修饰的镁黄长石支架上，培养1、3、7天，分别采用cck8法检测干细胞的增殖能力。利用rt
‑
pcr法测试骨髓间充质干细胞在支架上的成骨分化相关基因的表达，结果参见图4。图4中骨髓间充质干细胞在四硫化三铁微米花修饰的支架上培养1，3，7天后可以保持良好的增殖，3天的成骨相关基因ocn、opn、runx2显著上调，结果表明，四硫化三铁修饰的支架仍能够保持生物活性，可以促进干细胞的增殖，并且可以提高成骨相关基因的表达，说明四硫化三铁微米花修饰的镁黄长石支架可以诱导骨髓间充质干细胞成骨分化。
33.四硫化三铁修饰的支架的体外抗肿瘤能力将lm
‑
8骨肉瘤细胞种在48孔板中，培养12小时后，一半的孔内培养基换成ph＝6.5,200μh2o2的培养基，之后分别放入支架，在磁场的调控下，将温度分别升到42、47和52℃，保温10分钟。处理后的细胞继续培养12小时，利用cck8试剂盒(碧云天生物技术有限公司，产品编号c0038)测细胞的存活率，结果参见图5。图5中经过52℃磁热和活性氧协同作用下，肿瘤存活率仅为1.5％，结果表明支架可以催化过氧化氢产生活性氧和磁热协同高效地杀死肿瘤细胞。
34.四硫化三铁修饰的生物陶瓷支架体内抗肿瘤能力在裸鼠皮下注入lm
‑
8骨肉瘤细胞，建立皮下肿瘤模型。之后将支架植入肿瘤部位，并在交变磁场下升温，记录升温曲线，温度保持在51℃左右十分钟，连续治疗四天。每两天记录一次肿瘤体积，在14天处死裸鼠，并取出肿瘤组织，进行h&e染色分析，结果见图6。图6为经过3天磁热和活性氧的治疗，肿瘤体积逐渐变小，14天肿瘤消失，h&e染色图中也没有肿瘤细胞存在，结果表明四硫化三铁修饰的支架具有优异的抗肿瘤性能。
35.四硫化三铁修饰的生物陶瓷支架体内抗肿瘤能力在新西兰大白兔的股骨处构建直径为6mm的骨缺损模型，植入四硫化三铁微米花修饰的支架，12周后取材并进行ct扫描分析。micro
‑
ct结果(参见图7)显示植入四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架在缺损处形成了较多的新骨。结果表明，四硫化三铁微米花修饰的支架在磁热和活性氧的协同作用下可以高效抑制骨肿瘤，生物活性离子和表面微结构可以共同促进骨修复，具有良好的体内促进骨缺损修复的能力。
36.实施例2纯镁黄长石粉体5g，与4gf127均匀混合，利用3d打印技术制备出镁黄长石支架；将镁黄长石支架生坯在1360℃煅烧4小时，即得到纯的镁黄长石支架；将镁黄长石放入0.04mol/l的feso4·
7h2o和l
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半胱氨酸的水溶液中进行水热处理，温度为160℃,时间为24小时；水热后，将支架用去离子水和无水乙醇冲洗，在60℃烘箱中烘干，即得到四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架。
37.实施例3纯镁黄长石粉体5g，与5gf127均匀混合，利用3d打印技术制备出镁黄长石支架；将镁黄长石支架生坯在1300℃煅烧3小时，即得到纯的镁黄长石支架；将镁黄长石放入0.02mol/l的feso4·
7h2o和l
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半胱氨酸的水溶液中进行水热处理，温度为160℃,时间为12小时；水热后，将支架用去离子水和无水乙醇冲洗，在60℃烘箱中烘干，即得到四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架。
38.实施例4纯镁黄长石粉体5g，与4.5gf127均匀混合，利用3d打印技术制备出镁黄长石支架；将镁黄长石支架生坯在1350℃煅烧3小时，即得到纯的镁黄长石支架；将镁黄长石放入0.04mol/l的feso4·
7h2o和l
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半胱氨酸的水溶液中进行水热处理，温度为200℃,时间为24小时；水热后，将支架用去离子水和无水乙醇冲洗，在60℃烘箱中烘干，即得到四硫化三
铁微米花修饰的生物陶瓷支架。
39.实施例5纯镁黄长石粉体5g，与4gf127均匀混合，利用3d打印技术制备出镁黄长石支架；将镁黄长石支架生坯在1300℃煅烧5小时，即得到纯的镁黄长石支架；将镁黄长石放入0.05mol/l的feso4·
7h2o和l
‑
半胱氨酸的水溶液中进行水热处理，温度为180℃,时间为24小时；水热后，将支架用去离子水和无水乙醇冲洗，在60℃烘箱中烘干，即得到四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架。
40.然后采用上述实施例1的方法对实施例2
‑
5制造的支架进行成骨活性和抗肿瘤能力的评价，其结果表明，四硫化三铁修饰的支架具有良好的磁热性能；可催化过氧化氢产生活性氧并诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，通过催化过氧化氢产生活性氧和磁热协同高效地杀死肿瘤细胞，从而具有优异的体内外抗肿瘤能力。
41.本发明提供的四硫化三铁微米花修饰的生物陶瓷支架具有优异的磁热性能，并且能催化肿瘤微环境的过氧化氢产生活性氧，磁热与活性氧可以协同高效地杀死肿瘤细胞。裸鼠皮下肿瘤实验进一步证实，四硫化三铁修饰的支架具有很好的抗肿瘤能力。四硫化三铁修饰的镁黄长石支架，表面微结构可以调控骨髓间充质干细胞的成骨分化，并且支架本身有利于骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化。因此，四硫化三铁微米花修饰的镁黄长石支架具有优异的抗肿瘤能力和促进骨组织再生的能力，可以作为骨肿瘤术后治疗的骨填充材料。