一种制备生物腐植酸的方法

1.本发明涉及一种制备生物腐植酸的方法，属于农业生物技术领域。


背景技术：

2.近年来，我国化肥过量施用带来了一系列环境污染、土壤质量退化和农产品品质下降等问题。随着农业发展方式的转变，开发绿色高效新型肥料是保障我国农田生态安全和农产品质量安全的重大需求。腐植酸是一类具有多环芳烃结构的有机高分子聚合物，含有大量有机质和多种活性基团，可以改良土壤结构，提高土壤保水、保肥能力，促进植物生长发育，增强作物抗逆性，提高化肥利用率(衡曦彤，程娟，何环，等.微生物降解煤产腐植酸及应用研究进展.洁净煤技术，2019，25(6):88-95)。腐植酸已成为农业中土壤调理剂、植物抗旱剂和复合肥料产品的主要有效成分，其开发利用受到肥料研究者和生产企业的重视。
3.目前，根据生产方式腐植酸可分为矿物腐植酸和生物腐植酸两种方式。其中，矿物腐植酸一般是指利用泥炭、褐煤及风化煤等不可再生的煤炭资源，通过化学方法降解或氧化，然后经硝化、碱处理、酸化等步骤提取的腐植酸。矿物腐植酸在生产过程中需要消耗大量的酸、碱等化学物质，有时还需要高温、高压等剧烈条件及严格的工艺和特殊设备。除少量黄腐酸外，大部分矿物腐植酸并没有活性，在硬水或偏酸性条件易絮凝沉淀。生物腐植酸是指以有机废弃物为原料，在人工控制的条件下，经过微生物发酵反应生产的腐植酸。生物腐植酸分子量小、含有活性基团多，易被植物吸收，具有抗二价离子、抗硬水、抗酸碱的特性；同时含有作物生长所需要的有机质、n、p、k以及矿物元素等(张常书，江川.木霉生物腐植酸的应用研究.磷肥与复肥，2018，33(5):28-30)。因此，生物腐植酸在生产成本、设备投入和产品品质等方面都优于矿物腐植酸，受到研究者的广泛关注。
4.以木质纤维素类原料生产生物腐植酸是当前腐植酸研究领域的热点。廊坊师范学院尚校兰等分别利用微生物发酵法和化学法从巨菌草制备腐植酸，发现利用毛霉发酵制备的腐植酸含量是10％氨水提取的腐植酸含量的1.45倍(尚校兰，李宏宇，杨伊婷，等.化学法和生物法制备巨菌草腐植酸的比较.草业科学，2018，35(1):76-84)。山东农业大学王思同等以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌作为菌剂，采用堆肥的方式发酵菌糠制备生物腐植酸，36天内腐植酸含量达23.3％(王思同，辛寒晓，范学明，等.接种生物菌剂对菌糠堆肥过程中腐植酸变化的影响.腐植酸，2017，24(2):21-25)。但上述研究仍存在以下问题：(1)目前发酵菌剂大多是少数几种菌种混合而成，没有根据原料特点针对性地设计配伍，发酵产物组成单一，主要有效成分为腐植酸，不含植物生长活性物质(如氨基酸、有机酸、可溶性糖等促生成分)；(2)当前腐植酸生产主要采用批次发酵的方式，发酵过程难以定向控制，原料转化速率慢，发酵生产周期长，腐植酸产量低。


技术实现要素：

5.针对上述腐植酸发酵产物活性成分单一、腐植酸产量低下和发酵周期较长的问题，本发明的目的在于提供一种制备生物腐植酸的方法，该方法不仅可以缩短原料发酵时
间，而且显著提高生物腐植酸产量和小分子植物生长活性物质含量，实现农业废弃物原料的高效转化和腐植酸的低成本生产。
6.本发明是这样实现的：一种制备生物腐植酸的方法，其具体步骤如下：
7.(1)将原料与辅料粉碎后，按照质量比1:0.2～1:0.8混合均匀，调节物料含水率至60～80％，调节ph至6～8，获得混合料，备用；
8.上述原料可以选择农作物秸秆、食用菌菌渣、尾菜、园林废弃物、麸皮、玉米芯中的一种或多种，辅料为豆粕、花生饼、尿素、蛋白胨中的一种或多种；
9.上述调节ph至6～8优选以磷酸二氢钾溶液或磷酸氢二钾溶液调节ph至6～8。
10.上述粉碎优选将将原料与辅料的长度粉碎至3cm以下。
11.本步骤利用原料提供碳源，辅料提供氮源。
12.(2)向混合料中接入复合微生物菌剂，于20～30℃好氧发酵3～7天，待物料长满白色菌丝后，获得返混料；所加入复合微生物菌剂质量占混合料干重质量的0.1～2％；
13.所述复合微生物菌剂组成为：哈茨木霉1～5
×
108孢子/g、拟康氏木霉1～5
×
108孢子/g、深绿木霉1～5
×
108孢子/g、绒毛木霉1～5
×
108孢子/g、裂褶菌1～5
×
108孢子/g。
14.(3)将步骤(2)获得的返混料加入到新的步骤(1)获得的混合料中，获得二次发酵原料；所加入的返混料占二次发酵原料质量的1～10％；
15.将二次发酵原料于20～30℃好氧发酵10～15天，待物料中腐植酸含量达总物料干重的30％(质量百分数)以上(含30％)时结束发酵，获得腐熟料；
16.(4)按照腐熟料:水＝1:5～1:10(m/v，g/ml)的比例向腐熟料中加入清水，充分搅拌，过滤，获得生物腐植酸。
17.进一步而言，上述步骤(4)的过滤优选以16目纱布过滤，具体实施时，可以使用多层纱布过滤，如8层。
18.与现有腐植酸制备方法相比，本发明的有益效果体现在：
19.(1)本发明所述的复合微生物菌剂在物料发酵过程中高效利用多种有机物，产生大量微生物代谢产物，哈茨木霉分泌木聚糖酶将半纤维素转化为木寡糖，拟康氏木霉和深绿木霉利用木质纤维素产生琥珀酸、香豆酸、没食子酸、香草酸、阿魏酸和柠檬酸等有机酸，绒毛木霉利用蛋白质产生氨基酸，裂褶菌利用纤维素和半纤维素产生胞外多糖和寡糖，因此，和现有方法相比，本发明方法制备的腐植酸含有氨基酸、有机酸和可溶性糖等小分子植物生长活性物质，不仅可以直接为植物提供营养物质，而且可以调节植物生长发育，提高植物抗逆性，对作物生长发育具有更好的促进作用。
20.(2)本发明所述的物料返混发酵工艺，通过一次发酵在物料中扩繁有益功能微生物，产生醌基物质等腐植酸前体物质，在返混发酵阶段，利用富集的有益功能微生物促进小分子有机物围绕醌基物质聚合形成腐植酸，实现物料的快速发酵和定向转化，大幅提高生物腐植酸的生产效率和产品质量。
21.(3)本发明所述的生物腐植酸制备方法所需原料和化学投入品成本低廉，工艺操作简单易行，无需专门设备，可用于肥料生产企业、食用菌栽培企业、蔬菜种植大户和环保企业高效利用农业废弃物，提升其经济效益和产品附加值。
附图说明
22.图1不同施用量下生物腐植酸(t1和t2)和市售腐植酸(ct)的番茄果实大小照片。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明作进一步详细描述：
24.实施例中涉及的微生物菌株来源：
25.实施例中使用的哈茨木霉、拟康氏木霉、深绿木霉、绒毛木霉均为常规菌株，如文献“中国云贵川渝陕农田生态系统木霉多样性及其生防菌株的筛选”(王金亮，浙江大学)所公开的菌株；裂褶菌为文献“裂褶菌液体菌种培养技术研究”(马布平，李朝东，闻绍峰，等.中国食用菌.2019,38(11))所公开的菌株,以下实施例使用的微生物菌株直接来源于江苏省农业科学院农业资源与环境研究所。
26.双孢菇菌渣购自江苏裕灌现代农业科技有限公司；
27.实施例1
28.原料准备：双孢菇菌渣500kg，豆粕100kg，粉碎至3cm以下；
29.复合微生物菌剂组成：哈茨木霉1
×
108孢子/g、拟康氏木霉2
×
108孢子/g、深绿木霉1
×
108孢子/g、绒毛木霉2
×
108孢子/g、裂褶菌4
×
108孢子/g；
30.以双孢菇菌渣为原料制备生物腐植酸的方法：
31.(1)将10kg双孢菇菌渣和2kg豆粕混合均匀，加入清水调节混合料含水率至65％，以0.2mol/l磷酸氢二钾溶液调节物料ph至7.5，获得混合料；
32.(2)向上述混合料中接入0.12kg复合微生物菌剂，于25℃静置发酵4天，待物料长满白色菌丝，获得返混料；
33.(3)将490kg双孢菇菌渣和98kg豆粕混合均匀，加入(2)中所述返混料，混合均匀，加入清水调节混合料含水率至70％，调节ph至6.5，于28℃好氧发酵10天，期间每2天搅拌1次，获得腐熟料；
34.(4)向腐熟料中加入3000l清水，充分搅拌，通过8层16目纱布过滤获得生物腐植酸。
35.利用ph计测定ph，总养分含量和腐植酸含量测定方法为中华人民共和国农业行业标准“有机肥料”(ny/t525-2021)中所公开的方法，氨基酸含量测定方法为中华人民共和国农业行业标准“含氨基酸水溶肥料”(ny1429-2010)中所公开的方法，有机酸含量测定方法为文献“高效液相色谱法测定紫花苜蓿青贮中的有机酸”(许庆方，玉柱，韩建国，等.草原与草坪.2007,2:63-67)，可溶性糖含量测定方法为文献“盐度对互花米草生长及脯氨酸、可溶性糖和蛋白质含量的影响”(肖强，郑海雷，陈瑶，等.生态学杂志.2005,24(4):373-376)中所公开的方法。
36.本实施例所得生物腐植酸经检测，ph5.8，总养分(n+p2o5+k2o)含量118g/l，腐植酸含量42g/l，氨基酸含量3.28g/l，有机酸含量1.36g/l，可溶性糖含量4.17g/l。证明本实施例通过微生物发酵技术成功将原料中的大分子有机物转化为氨基酸、有机酸、可溶性糖等营养成分。
37.实施例2
38.原料准备：小麦秸秆40kg，麸皮10kg，花生饼36kg，尿素4kg，粉碎至3cm以下；
39.复合微生物菌剂组成：哈茨木霉2
×
108孢子/g、拟康氏木霉1
×
108孢子/g、深绿木霉1
×
108孢子/g、绒毛木霉4
×
108孢子/g、裂褶菌5
×
108孢子/g；
40.以小麦秸秆和麸皮为原料制备生物腐植酸的方法：
41.(1)将4kg小麦秸秆、1kg麸皮、3.6kg花生饼、0.4kg尿素混合均匀，加入清水调节混合料含水率至60％，以0.2mol/l磷酸二氢钾溶液调节ph至6；
42.(2)向上述混合料中接入0.18kg所述复合微生物菌剂，于27℃静置发酵6天，待物料长满白色菌丝，获得返混料；
43.(3)将36kg小麦秸秆、9kg麸皮、32.4kg花生饼、3.6kg尿素混合均匀，加入(2)中所述返混料，混合均匀，加入清水调节混合料含水率至65％，调节ph至7，于25℃好氧发酵14天，期间每3天搅拌1次，获得腐熟料；
44.(4)向腐熟料中加入800l清水，充分搅拌，通过8层16目纱布过滤获得生物腐植酸。
45.所得生物腐植酸经检测，ph6.6，n+p2o5+k2o含量144g/l，腐植酸含量36g/l，氨基酸含量5.15g/l，有机酸含量1.02g/l，可溶性糖含量3.95g/l。
46.上述ph采用ph计测定，总养分含量和腐植酸含量测定方法为中华人民共和国农业行业标准“有机肥料”(ny/t525-2021)中所公开的方法，氨基酸含量测定方法为中华人民共和国农业行业标准“含氨基酸水溶肥料”(ny1429-2010)中所公开的方法，有机酸含量测定方法为文献“高效液相色谱法测定紫花苜蓿青贮中的有机酸”(许庆方，玉柱，韩建国，等.草原与草坪.2007,2:63-67)，可溶性糖含量测定方法为文献“盐度对互花米草生长及脯氨酸、可溶性糖和蛋白质含量的影响”(肖强，郑海雷，陈瑶，等.生态学杂志.2005,24(4):373-376)中所公开的方法。
47.实施例3
48.为验证本发明所述生物腐植酸的应用效果，采用实施例1制备的生物腐植酸在番茄上进行了田间试验。试验区域分为9个小区，每个小区长11m，宽1.5m，面积为15.95m2，每小区种植60株番茄。番茄苗定植前基施有机肥和化肥，施用量为：鸡粪有机肥(有机质含量297.63mg/g、总氮含量17.68mg/g)1t/亩、钙镁磷肥(购自湖北金明珠化肥有限公司，p2o5＞12％，氧化镁含量8％，氧化钙含量25％)50kg/亩、复合肥(购自江苏华昌化工股份有限公司，n+p2o5+k2o≥45％)1t/亩、硼肥(购自上海益田生物有限科技公司，纯度≥98％)1kg/亩。对照组为施用0.15g/m2普通市售腐植酸(ct)，购自陕西鼎天济农腐殖酸制品有限公司，处理组为施用0.15g/m2生物腐植酸(t1)和施用0.6g/m2生物腐植酸(t2)，在番茄定植和坐果期分别根施两次腐植酸，每个处理三个平行。测定番茄植株生长、果实产量和品质等指标，以综合评价生物腐植酸的应用效果。试验结果见表1、表2和图1。
49.表1中叶绿素含量采用便携式叶绿素测定仪(spad-502plus，柯尼卡美能达科技公司，日本)测定。
50.表2中维生素c含量、可溶性糖含量、有机酸含量和糖酸比测定方法为文献“腐植酸肥料对滨海盐碱地土壤性状及番茄生长和品质的影响”(丁守鹏，张国新，姚玉涛，等.河北农业科学,2021,25(6):65-70)中所公开的方法，可溶性蛋白含量测定方法为文献“含腐植酸水溶肥和水溶硼肥对茄果类蔬菜产量和品质的影响”(孙勰，姜春月，陆芳，等.浙江农业科学,2021,62(11):2133-2136)中所公开的方法。
51.表1不同生物腐植酸施用水平对番茄植株生长的影响
[0052][0053]
注：平均值
±
标准差(n＝3)；不同字母表示各处理之间的差异显著(p＜0.05)。ct：0.15g/m2市售腐植酸；t1：0.15g/m2生物腐植酸；t2：0.6g/m2生物腐植酸。
[0054]
表2不同生物腐植酸施用水平对番茄产量和品质的影响
[0055][0056]
注：平均值
±
标准差(n＝3)；不同字母表示各处理之间的差异显著(p＜0.05)。ct：0.15g/m2市售腐植酸；t1：0.15g/m2生物腐植酸；t2：0.6g/m2生物腐植酸。
[0057]
由表1可见，和市售腐植酸相比，当施用0.15g/m2、0.6g/m2生物腐植酸时，番茄植株株高分别提高了9.5％、13.8％，茎粗分别提高了13.8％、17.4％，叶绿素含量分别提高了3.9％、4.5％。说明不同施用水平下生物腐植酸均可促进番茄植株生长发育，效果优于市售腐植酸。
[0058]
由表2可见，和市售腐植酸相比，当施用0.15g/m2、0.6g/m2生物腐植酸时，番茄单果重分别提高了20.8％、26.4％，单株产量分别提高了8.1％、21.2％，番茄维生素c含量分别提高了10.0％、23.0％，可溶性蛋白含量分别提高了18.7％、24.8％，可溶性糖含量分别提高了17.4％、39.2％，有机酸含量分别下降了7.1％、12.9％，糖酸比分别提高了27.73％、44.52％。说明不同施用水平下生物腐植酸均可提高番茄果实产量和品质，效果优于市售腐植酸。
[0059]
图1中，a、b、c分别为ct组、t1组和t2组的番茄果实照片，可见，t1、t2组番茄果实质量明显高于ct组。
[0060]
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。