复合微生物海藻肥的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及肥料技术领域，更具体地说，设及一种复合微生物海藻肥的制备方法。
【背景技术】
[0002] 化肥的长期大量使用已经逐渐造成±壤贫瘡、板结，营养失衡等问题的出现，而农 药的长期滥用也导致了致病菌抗药性增强，污染环境等严重问题。为保证农业的高速可持 续绿色发展，目前，我国农业部已经越来越重视有机肥料的使用，并提出逐步减少化肥及农 药在农业中的使用量。海藻富含多种营养成分，是制造天然有机肥的上佳原料，其经发酵降 级的小分子寡糖类内溶物中含有天然的植物生长调节剂，具有很高的生理活性，促进光合 作用，调节内源激素的平衡。海藻肥含有的糖醒酸巧类物质，能改良±壤性状，提高±壤保 水能力，改善±壤团粒结构，刺激植物根系及有益微生物的生长。然而，目前利用微生物充 分发酵海藻W有效释放其营养物质还存在困难，因为海藻中含有大量难W被分解的多糖类 物质及高浓度的盐。现阶段，发酵法制备海藻肥还存在很多缺陷，一是缺乏高效降解海藻多 糖且可W直接用作菌肥的有效菌种；二是发酵菌种单一，缺乏多菌种间的协同作用，难W有 效降解海藻内大分子物质，影响海藻肥的应用效果；=是为保证发酵效果，缺乏对海藻原料 的有效预处理技术，传统的酸碱法处理海藻，会破坏海藻中营养元素，并对环境造成污染。
【发明内容】
[0003] 本发明针对现有技术中传统化学肥料和普通发酵法制备海藻肥料的不足，利用筛 选到的两株可产多种有益代谢产物的芽抱杆菌发酵制备复合微生物海藻肥料，经过微切助 技术处理之后，海藻原料中的营养成分可被充分释放更易于微生物的利用和降解，极大提 高了海藻肥料的品质。而肥料中含有的有益微生物解淀粉芽抱杆菌WB1和ABT^-2广泛 的抑菌活性又可W-定程度上防治农作物的多种病害问题，减少农药的使用，起到"药肥合 一"的复合功效。
[0004] 为了达到上述目的，本发明一种复合微生物海藻肥的制备方法，包括如下步骤：
[0005]S1、取解淀粉芽抱杆菌炬acillusamyloliquefaciens)WBl和枯草芽抱杆菌 炬acillussubtilis)AB?L-2,分别W种子培养基比发酵培养基体积比5~10%的比例 接种到海藻发酵培养基中，发酵培养得到发酵液；其中，所述种子培养基中菌体浓度1炉~ 10…C即血-1;
[0006]S2、将S1所得发酵液于0~4°C、6000~SOOOrpm离屯、，收集上清液；
[0007] S3、将S2所得上清液用0. 22ym滤膜进行过滤，收集滤出液，得海藻液体肥；
[000引S4、收集S2离屯、后的固形物，25~35°C风干，得海藻固体肥。
[0009] 其中，本发明复合微生物海藻肥的制备方法，步骤S1所述海藻培养基的获得包括 如下步骤：
[0010] S11、海带原料，干燥至含水量不高于10%，粉碎至40~60目；
[0011] S12、加入质量分数1~2%的海藻酸钢，混匀；
[0012] S13、利用高能振动磨产生的微剪切作用对S12中原料处理5~30分钟，得600~ 800目海带粉；
[001引 S14、步骤S13所得海带粉3~5%、尿素0. 1~0. 3%、化C1 2~2. 5%、庶糖0. 1~ 0. 25%、硫酸儀0. 02%、磯酸二氨钟0. 05%、氯化巧0. 01 %，加入蒸馈水，混合，经121°C灭 菌20分钟。
[0014] 优选方式下，步骤S1中所述发酵条件为；发酵温度25~37°C，发酵初始抑7.5， 20化min-i发酵72~10她。最优方式下，两种种子培养基的接种比例相当。
[0015] 此外，所述解淀粉芽抱杆菌WB1和枯草芽抱杆菌AB?k2经活化获得种子培养基。 活化菌种的培养基；过80目筛的海带粉1%，蛋白腺0.5%，化C1 2%、庶糖0.25%、硫酸儀 0. 02%、磯酸二氨钟0. 05%、氯化巧0. 01 %，蒸馈水配置，经121°C灭菌20分钟。
[0016] 与现有技术相比，本发明的优势和积极效果为；本发明从海泥中筛选得到可W高 效降解海藻多糖的解淀粉芽抱杆菌WB1和枯草芽抱杆菌AB?k2,此两种菌株含有丰富的 糖巧酶活性和蛋白酶活性，能有效对海藻进行发酵，产生高浓度有利于植物生长的小分子 褐藻寡糖类物质。微切助技术处理过的海藻超微粉提升了营养物质的释放，再经复合菌株 发酵后，极大增强了海藻肥料的肥效。此外，解淀粉芽抱杆菌WB1和枯草芽抱杆菌ABT^-2 具有广泛的抑菌谱，可一定程度上防治多种植物病害，减少农药的使用，起到"药肥合一"的 复合功效。
[0017] 本发明可提高±壤肥力，有利于±壤形成团粒结构从而改良±壤性状，促进植物 种子萌发及生长，增强植物抗逆能力，安全环保，改善产品品质，使产品达到绿色或有机标 准。
[001引本发明提供的复合微生物海藻肥液体肥料可直接作用于植物，含有活性解淀粉芽 抱杆菌WB1和枯草芽抱杆菌AB?k2的海藻菌肥可用于±壤基肥或生产复合肥。
[0019] 保藏说明
[0020] 本发明设及的解淀粉芽抱杆菌炬acillusamyloliquefaciens)WB1，已于2014年 2月27日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏（简称CGMCC;地址；中国 科学院微生物研究所；邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.8873。
[002U本发明设及的微生物（株）为AB?L-2,分类命名为枯草芽抱杆菌炬acillus subtilis)，于2014年11月21日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简 称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCCNO. 10038。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。
【具体实施方式】
[0022] 本发明技术方案如下；
[0023] 一株解淀粉芽抱杆菌炬acillusamyloliquefaciens)WBl，菌种保藏编号为； CGMCCNo. 8873,革兰氏染色阳性，杆状，菌落表面粗趟，有隆起，边缘不规则，可降解海藻多 糖，分泌多种糖巧酶和蛋白酶，具有广泛的抑菌活性。
[0024] 解淀粉芽抱杆菌WB1特征如下；白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌 落；革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，运动，好氧，可耐1 %~10%化C1浓度，最佳生长温度 为30°C，在褐藻胶选择性培养基上菌落形态为白色，圆形，边缘整齐，最适生长抑为7. 0~ 7. 5,最适生长温度25~35 °C。
[002引利用16S通用引物对该菌株进行PCR扩增得到leSrDNA序列，将所得结果在genbank进行同源序列比对，该菌株与解淀粉芽抱杆菌属炬acillusamyloliquefaciens) 的基因组99%相似，由此可W确定该菌株属于解淀粉芽抱杆菌属。
[0026] 一株枯草芽抱杆菌炬acillussubtilis)AB?L-2,菌种保藏编号为；CGMCC NO. 10038,革兰氏染色阳性，杆状，菌落相对较大，表面粗趟，边缘不规则，菌体生长过程中 产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肤等活性物质对多种致病菌有明显的抑制作 用。
[0027] 取解淀粉芽抱杆菌炬acillusamyloliquefaciens)WB1和枯草芽抱杆菌 炬aci1lussubti1iS)ABTOL-2，活化后，等比例接种于海藻培养基中，半固体发酵培养得到 发酵液。发酵液于4°C，lOOOg离屯、，收集上清液。上清液用0.22ym滤膜过滤，收集滤出液， 得到海藻液体肥，富含褐藻寡糖。而离屯、后含有活性解淀粉芽抱杆菌WB1和枯草芽抱杆菌 AB?L-2的海藻肥固形物，低温烘干，得海藻固体肥，用于复混肥的生产。
[002引其中，所述解淀粉芽抱杆菌WB1和枯草芽抱杆菌AB?k2经活化获得。活化菌种 的培养基：过80目筛的海带粉1%，蛋白腺0.5%，化C1 2%、庶糖0.25%、硫酸儀0.02%、 磯酸二氨钟0. 05%、氯化巧0. 01 %，蒸馈水配置，经121°C灭菌20分钟。
[0029