一种体内产生和运输蛋白的方法

专利名称：一种体内产生和运输蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种体内蛋白产生和运输的方法。特别是涉及在红细胞的前体细胞中产生蛋白以及利用红细胞来传输蛋白至血流中的方法。
由于基因治疗技术的飞速发展，利用基因疗法来治愈或减轻遗传病和后天获得疾病的观念已经被人们所接受。研究人员已经完成了必需的第一步转入的基因在人体内可被诱导产生功能。然而，迄今为止，在全世界有记载的2000多个进行基因治疗实验的患者中，尚无一人的健康状况得到明显改善。缺乏令人信服的治疗效率反映出研究人员未完成的初步探索面临一种困难的新技术，并且困难远远大于所预料的。
人细胞中独立的基因是DNA的一段序列，在大多数情况下，其充当产生特异性蛋白的蓝图。人体中所有的细胞在其细胞核染色体中都携带相同的基因。但是不同的细胞利用或表达不同的基因产物因此产生不同的蛋白。
依据细胞的类型(以及细胞需要)，基因表达的不同调控通过不同细胞中称为启动子和/或增强子的DNA片段被调控。只有启动子或有时和增强子同时存在下，基因才被表达。基因表达是一个具有两个步骤的过程。第一步是从DNA模板产生RNA的转录，第二步是从RNA模板合成蛋白的翻译。
在蛋白合成完成之后，蛋白将被从产生位点运输到预定的功能位点。蛋白从合成其的细胞中输出有两个途径。第一个途径是组成性分泌，此途径是指蛋白和脂类的宏观流动机制。第二个途径是一个胞吐调控过程。在此途径中，蛋白仅在接受一种特定的触发信号时被释放，例如，被激素触发。
天然蛋白的合成与输出机制是过去几十年基因治疗中研究的主要方向，目前则集中于组织或细胞的特异性研究。研究者一直在寻找组织特异性基因及其传递到靶器官或组织中的方法，在此器官或组织中蛋白被自然的合成，并且天然蛋白通过天然途径被运输且被传递到它们的功能位点。例如，天然嗜血杆菌因子ⅩⅢ和人血清白蛋白在肝细胞中产生然后被传输到血流中用于发挥其功能。胰岛素产生于胰腺β细胞且也被运输到血流中发挥功能。
尽管基因治疗的理想方式是治疗基因特定地传输到它们的天然产生位点，但是在体内或体外实施起来都是很困难的。在体外，几乎不可能获得足够的靶细胞来导入治疗基因。结果，获得的靶细胞不能够合成足够量的用于治疗的目的蛋白。在体内，治疗基因有一种可能性导入任意的细胞类型，不管它们是逆转录病毒载体，脂质体包裹逆转录病毒载体或裸露DNA。随后，少量DNA(治疗基因)将被传递到靶细胞中。因此，目前基因治疗方法的成功严格依赖于是否一个组织特异性基因可被特异地传递到靶器官或组织。尽管进行了极大努力的研究，发现组织特异性方法极端困难并且离成功尚有很远的距离。
另一方面，非组织特异性方法也遭遇严重的困难。尽管体内的许多细胞类型是很容易获得的，例如肌肉或皮肤细胞，但利用非组织特异性细胞作为宿主用于基因治疗有一些缺点。在一些情况下，宿主细胞天然地不具有上述两种蛋白输出机制。在其它的情况下，即使宿主细胞具有用于其天然蛋白的输出机制，它们在非天然或客体蛋白输出上的作用并不相同。输出客体蛋白的低效率或天然输出途径的完全阻断已经被报道。
最近，通过利用病毒的自然能力来进入细胞并带入它们的遗传物质，基因治疗获得了长足的进步。许多微生物被工程改造作为载体，或传输载体来用于基因转移。在不同的病毒中，逆转录病毒是迄今为止所研究的最具希望的基因传递系统(Friedmann,Scientific American,June 1997,96)。逆转录病毒在被感染的细胞中转化RNA为DNA并整合DNA进入染色体。该整合的DNA然后控制病毒蛋白质的合成。
在正常的情况下，整合的逆转录病毒DNA将控制病毒蛋白质以及RNA的合成，其然后装配在原始病毒的克隆中。已经研究出了改造逆转录病毒的方法。被改造的逆转录病毒，缺少产生病毒蛋白的结构，不能产生后代。病毒实际上从细胞中消失，仅遗留外源基因以及仅促进基因表达的核苷酸序列。
美国专利US5399346(Anderson等)公开了提供给人给药治疗蛋白的的方法。该方法包括插入编码一个治疗蛋白的DNA片段到初级人细胞中，并且导入此初级人细胞到人体中。该初级人细胞在体内表达和分泌治疗蛋白。Anderson等人进一步揭示了初级人细胞是成核血细胞以及祖代细胞及其前体，这种细胞能够培养繁殖。此外Anderson等人揭示，遗传工程细胞可以和药学上可接受的载体结合制成适当的人用药。载体可以为液态(例如生理盐水溶液)或固态载体，例如一种植入物。在使用液态载体时，工程细胞可被导入，例如，静脉内，皮下，肌内地，腹膜内的，病灶内等方式。Anderson等人揭示了治疗蛋白残基的天然状态或修饰状态在体内初级人细胞中的功能。
治愈人类疾病的早期基因疗法之一是使用遗传工程血红蛋白来治疗β珠蛋白生成障碍性贫血，其为血红蛋白的一种失调，患者的红血细胞缺乏β-珠蛋白，其和α-珠蛋白以及血红素结合产生血红蛋白。缺少β-珠蛋白引起血红蛋白的不足和α珠蛋白的过量，其结果引起严重的贫血。研究者使用β珠蛋白启动子和β珠蛋白基因(来源于红细胞)来产生所期望的β珠蛋白。在这些应用中，血红蛋白启动子没有被用于红血细胞异种蛋白(非来源于红细胞)的基因工程上。
另一方面，多种天然启动子已被用于构建携带编码对于宿主细胞而言同源或异源的治疗蛋白的基因的载体。然而，因为集中努力于组织特异性基因治疗的方法，因此，构建的载体被主要集中于成核细胞，其具有用于细胞特异性靶运输的表面标记。
最近，用于治疗基因转运的多种非病毒方法也被进一步开发。例如，脂质体被用于包裹逆转录病毒载体(来自称为噬菌体的细菌病毒的稳定的DNA环)其原始基因已经被用于治疗的基因所替换。裸DNA(无脂类缠绕的)注射给病人也进行了研究。被注射入动物肌肉的裸DNA被表达为蛋白并且获得了局部浓度相当高的蛋白(Felgner,Scientific American,June1997,102)。然而，当蛋白被稀释到含有三升血浆的血流中时，在肌肉中产生的局部高浓度的蛋白对于治疗象糖尿病或血友病这样的疾病是不足的。
显然迫切需要新的策略和方法去克服基因治疗的困难，并且达到体内有足够量的蛋白合成与运输的目的。
本发明提供了一种在体内产生和运输蛋白的方法。在一个实施例中，该方法包括步骤(1)在载体中插入一个启动子以及一个编码蛋白的基因，(2)从哺乳动物中收集适量的细胞，(3)在体外用载体处理宿主细胞，(4)将经处理的宿主细胞回输哺乳动物。处理后的宿主在体内产生红细胞以及蛋白，其中的蛋白只存在于红细胞中。其后，蛋白通过红细胞的破裂被释放进入哺乳动物的血流中。该方法还可以包括在载体中插入一个或多个增强子。
在另一个实施例中，方法包括步骤(1)在载体中插入一个血红蛋白启动子以及一个编码非血红蛋白的基因，(2)从哺乳动物中收集适量的宿主细胞，(3)在体外用上述载体处理该宿主细胞，(4)将经处理的宿主细胞回输哺乳动物。在将处理后的宿主细胞重新回输哺乳动物后，宿主细胞在体内产生血细胞。蛋白只存在于红细胞中，因为插入到载体中的血红蛋白启动子只在红细胞的前体中才有活性。在生命周期的末期红细胞破裂并且将蛋白释放入血流中。
用本发明的方法，载体是一个病毒载体并且缺失负责病毒表达的片段。优选的载体为一个逆转录病毒载体，慢病毒载体和一个腺病毒载体。
适用于本发明方法的启动子为一个基因的原始启动子，其能够诱导基因在红细胞的祖代细胞中表达蛋白。可选择地，启动子也可以为一个基因的突变的启动子。优选地，启动子为一个血红蛋白启动子。
本发明方法中适合的宿主细胞为干细胞，和其它的红细胞的祖代细胞。
本发明的方法不但利用干细胞和红细胞的祖代细胞作为加工场所产生蛋白，也利用红细胞作为蛋白的转运工具。通过红细胞破裂蛋白被释放入血流中。
红细胞破裂可以是一个自然或诱导的过程。在本发明的方法中，因为在体内连续不断的产生红细胞和蛋白，连续不断的蛋白供应将被提供用于病人的治疗目的。
通过本发明方法合成和运输的蛋白包括但不限于，抗体，酶，辅因子，干扰素，激素以及肽。此外，蛋白包括天然蛋白，融合蛋白，以及突变蛋白。
本发明的一个目的是提供一个非组织特异性方法其利用合适的宿主细胞来合成蛋白。
本发明的另一个目的是特异性控制蛋白在红细胞的前体中的表达和产生。
本发明的一个进一步的目的是利用天然红细胞的巨大产量提供有效的蛋白合成以及足够的蛋白供应来用于治疗目的。另一个目的是利用红细胞的无核特性来提供一个有利于蛋白产生后稳定性的环境。
然而，本发明的另一个目的是绕过蛋白从制造场所释放的分泌和胞吐途径，利用红细胞在生命周期末期的破裂作为一种传输机制来提供足够量的蛋白到血流中。
本发明的另外一个目的是利用血红蛋白启动子来控制蛋白在红细胞前体的表达和合成。此外，利用血红蛋白启动子的强度来提高蛋白合成的效率。
本发明的一个进一步的目的是用一般机制产生广谱蛋白，治疗各种疾病。


图1是本发明的一实施例的图表说明。
图2是实施例中描述的携带β-gal基因的逆转录病毒载体构建的说明。
优选实施例的详述本发明提供了一个在体内产生并传输蛋白的方法。在一个实施例中，该方法包括步骤(1)在载体中插入一个启动子以及一个编码蛋白的基因，(2)从哺乳动物中收集适量的宿主细胞，(3)在体外用上述载体处理宿主细胞，(4)将经处理的宿主细胞回输哺乳动物。将处理后的宿主细胞重新回输哺乳动物后，处理后的宿主在体内产生红细胞以及蛋白，其中的蛋白只存在于红细胞中。红细胞在其生命周期的末期破裂并且将蛋白释放入血流中。可选择地，除了启动子外一或多个增强子也插入到载体中。
为了本发明的目的，宿主细胞为干细胞，以及其它的红细胞祖代。骨髓是干细胞的适宜的来源，并且其优点在于其含有红细胞的前体。载体DNA可以通过本领域公知的任意基因转移方法被插入到哺乳动物宿主细胞中，例如逆转录病毒介导的基因转移方法，电转移，微注射，细胞融合，或原生质体融合。
此处所用的术语″载体″在广义上是指能够从一个细胞到另一个细胞转移DNA的重组DNA物质。载体可以是线性或环形的单链DNA，并且除了本发明的主要功能元件外，也可包括例如对于特殊用途必需的其它序列。例如，载体可以具有其它特性，如一个或多个可选择的标记基因和/或帮助翻译或产生克隆产物的其它方面的特性。
优选的，载体为一个病毒载体。病毒载体缺失负责病毒表达的片段，例如不完全复制。更优选地，载体为一个逆转录病毒载体，慢病毒载体，以及腺病毒载体。
此处所用的术语″启动子″在广义上是指能够在红细胞的祖代细胞中引发基因表达蛋白的任意启动子。启动子可以是一个基因的原始启动子，或一个基因的突变启动子。一个原始启动子是存在于其蛋白对于细胞而言是原始的基因中的启动子。可选择地，启动子可与其它的启动子串联存在，并且可以包括一个或多个增强子元件。优选的，启动子是血红蛋白启动子。
此处所用的术语″增强子″在广义上是指能够增强启动子利用的任意增强子，并且在定向以及相对于启动子的任意位置(上游或下游)上起作用。
此处所用的术语″基因″是指一个DNA序列，优选为编码蛋白的结构基因。用于本发明目的的蛋白包括但不限于抗体、酶、辅因子、干扰素、激素以及肽。此外，蛋白包括天然蛋白、融合蛋白以及突变蛋白。蛋白可以完全与宿主细胞异源。蛋白也可以是商业用途的多肽或肽，例如一种药剂。
此处所用的术语″异源″和″非原始″指一个基因或蛋白是非天然存在的，或一个生物过程在宿主细胞中是非天然发生。
在另一个实施例中，方法包括步骤(1)在载体中插入一个血红蛋白启动子以及一个编码非血红蛋白的基因，(2)从哺乳动物中收集适量的宿主细胞，(3)在体外用上述载体处理宿主细胞，(4)将经处理的宿主细胞回输该哺乳动物。在将处理后的宿主细胞重新回输哺乳动物后，宿主细胞在体内产生血细胞。蛋白只存在于红细胞中，因为插入到载体中的血红蛋白启动子只在红细胞的前体中才有活性。红细胞在生命周期的末期破裂并且将蛋白释放入血流中。
自然地，红细胞由骨髓中干细胞产生。干细胞是骨髓中细胞的亚型，产生全谱的血细胞并在人的一生中替换死亡细胞。
红细胞在骨髓产生几天之后运动到外周血中。成熟红细胞主要含有血红蛋白和细胞质。在成熟的红细胞中没有细胞核，血细胞的主要功能是通过血红蛋白运输氧到机体中。在外周血中，红细胞的半衰期大约为60天。在血细胞周期的末期，红细胞在脾脏中破裂并且释放血红蛋白到血流中。释放的血红蛋白在肝脏中聚集并重新用于红细胞的产生。
血红蛋白是非常稳定的蛋白，其已被用于药物运输的载体(US5759517)。血红蛋白只产生于红细胞中且保留在外周血循环中。
本发明的方法在蛋白产生且特别在蛋白运输到机体方面是新颖的。本发明方法中，蛋白仅由红细胞的祖代细胞产生并通过红细胞携带，代替用于传统的基因治疗的组织特异性细胞。与以前的组织特异性方法不同，本发明的方法省略了将编码蛋白的基因运输到用于蛋白产生的特异性器官或组织中的过程。本方法利用血红蛋白来控制蛋白只在红细胞祖代中产生，并且然后利用红细胞作为载体来运输蛋白到它的功能位点。
本发明方法中，蛋白包含在红细胞中未被暴露于细胞外环境或成核细胞的酶环境。蛋白被细胞膜保护抵抗细胞外环境的干扰，直至红细胞破裂。从前的方法中，裸DNA及脂质体的方法被利用来传递DNA，其传导入病人或动物的身体后DNA降解。本发明的方法阻止蛋白暴露于苛刻的环境，并且在体内合成蛋白后提供其稳定性。
在蛋白的运输方面，本发明的方法利用红细胞的额外功能作为蛋白转运的运输载体。本方法利用红细胞的自然破裂运输所产生的蛋白到血流中。本发明的方法的蛋白运输机制基本上不同于自然细胞的分泌或调节的胞吐。
本发明的方法具有很多优点。首先，本发明的方法提供了有效的蛋白合成，并且能够产生大量的蛋白合成用于基因治疗。较特别的，一旦一个基因被导入干细胞，例如通过转染或转导，干细胞将产生红细胞并不断合成蛋白。这意味着即使只有所有被处理干细胞的一小部分达到成功的基因转染或转导，由这些干细胞产生的红细胞量将含有足够的蛋白量。因为红细胞的产生是一个连续的过程，蛋白也是以连续的方式合成。
利用本发明的方法，蛋白是由红细胞的祖代细胞产生，并且由红细胞携带和运输。一旦运输蛋白的红细胞释放入外周血中，红细胞自身没有能力进一步表达蛋白。在红细胞破裂蛋白释放出之前，红细胞是蛋白的暂时储存场所，这是红细胞和其它的成核细胞的主要区别。后者可以在外周血中表达蛋白。
第二，红细胞提供防止蛋白降解的自然保护。蛋白只存在于红细胞中因为血红蛋白启动子只在红细胞的祖代细胞中具有活性。红细胞没有核。因此，产生的蛋白不会被核酶降解。与其它的成核细胞例如白细胞相比，蛋白在红细胞中更稳定。红细胞中蛋白稳定性的实例通过天然血红蛋白在红细胞的整个生命周期中都存在而被证实。另外，红细胞在蛋白进入血循环之前也保护蛋白抵抗细胞外环境。
第三，本发明的方法提供了一种有效的蛋白运输机制。天然红细胞在外周血中的半衰期大约为60天。因此，通过利用红细胞的破裂作为蛋白供应的运输机制是连续并恒定的。对于一些疾病例如血友病和与激素相关的疾病，连续的蛋白供应是所期望的。其它的疾病，例如癌症，连续的蛋白供应不仅提供了治疗，而且有助于预防疾病。此外，在一些情况下，虽然连续的蛋白供应不是天然的供应模式，但是其有治疗意义而且是有益的。这种情况的适宜的例子是为糖尿病患者供应胰岛素。
第四，本发明的方法传输没有天然细胞功能限制的蛋白。更特殊地，如果利用的宿主细胞并非天然产生蛋白的特异性器官或组织的细胞，该方法避免了宿主细胞在蛋白输出或运输上的困难。例如，通过遗传方法在皮肤组织产生的特定蛋白在血流中用于治疗之前必须从宿主皮肤组织中充分地释放。由于宿主细胞并非天然蛋白产生过程的原始器官或组织的细胞，它们可能不具备输出特异性客体蛋白的分泌功能。在后一种情况下，客体蛋白将在宿主细胞中积累并且导致细胞最终死亡。
本发明的方法利用红细胞的自然破裂进行蛋白的传输。可选择地，如果需要的话，红细胞的自然破裂也可被诱导。例如，红细胞的生命循环时间可被通过遗传突变来调整。本发明的方法通过红细胞在外周血中循环提供蛋白，对于治疗目的，本方法将蛋白保留在血流中优于其它的传统的蛋白载体。
第五，本发明的方法中，通过收集和处理的宿主细胞的量，蛋白产生和传输的量可被控制。当从骨髓中收集干细胞时，处理后的骨髓可种植在最初的收集位置，或装入一个sag中，然后植回病人的骨髓。如果需要大量的蛋白，例如人血清白蛋白，蛋白产生的量可通过移植位点的数目来控制。如果一个病人继承了一个遗传缺陷并且终生需要连续供应正常基因产物，则可选择永久的移植。如果仅仅短期需要基因的活性，例如激活免疫系统抵抗癌细胞或感染因子，当治疗完成后或不再需要时，SAG可从体内取出。
第六，在本发明的方法中，蛋白仅存在于红细胞中。一旦处理过的干细胞从体内取出，红细胞的产生将立即停止。携带蛋白的外周血液中余下的红细胞，将在生命循环的末期破裂。到那时，蛋白的供应将完全停止。因此，本发明的方法提供一种简单安全的用于治疗过程的控制机制。如上所述，成熟的红细胞本身不表达蛋白质。在红细胞从骨髓中释放到外周血液后便没有蛋白产生。与红细胞不同，成核血细胞，例如白细胞，在外周血液中表达蛋白直至细胞死亡或丧失功能。因此，当遗传工程成核细胞被导入血液循环时，没有蛋白产生的控制。更特殊地，当蛋白与宿主成核细胞异源时，外源蛋白和原始蛋白间的相容性或相互作用，以及核酶在细胞生命的自始至终将是基因治疗的安全问题。在另一方面，由于红细胞不能在外周血液中产生蛋白，蛋白产生在始干细胞中被限制，其可通过移植的量被控制。
本发明的方法应用广泛，特别适用于具有争议的基因治疗，其中一个健康的基因替换了一个丢失的或有缺陷的基因的产物，但不是完全地替换有缺点的DNA本身。用本发明方法进行基因治疗的一个实例是治疗一个血友病患者。在此情况下，用血红蛋白启动子和血友病因子ⅩⅢ基因来构建一个逆转录病毒。然后，收集患者大量的骨髓并且用载体转导干细胞。载体构建与基因转导用本领域已知的技术完成。骨髓在处理后植回患者。之后，转导的干细胞将产生血细胞。血友病因子ⅩⅢ将仅在经治疗的患者外周血液中循环的红细胞中产生。在这些红细胞的生命循环的末期，血友病因子ⅩⅢ将通过红细胞的破裂释放到血流中。因为通过被转导的干细胞连续产生红细胞以及红细胞在生命循环的末期连续破裂，经过这种治疗的患者将具有连续不断的血友病因子ⅩⅢ的供应。
上述基因表达与蛋白运输过程可以通过全血细胞血友病因子ⅩⅢ DNAPCR分析，红细胞蛋白免疫测定或染色反应，以及血清蛋白免疫测定或染色反应被检测。一个阳性的全血细胞血友病因子ⅩⅢ DNA PCR分析结果显示了体内基因表达的成功。一个阳性的红细胞蛋白免疫测定或染色反应结果表明在由转导的干细胞产生的红细胞中产生蛋白的成功。一个阳性的血清蛋白免疫测定或染色反应结果表明在体内基因表达和蛋白产生后蛋白传输到血流中的成功。
本发明的方法在治疗遗传病或后天获得的疾病上有着广泛的应用。一般而言，任何蛋白，或在血流中有作用的，例如血友病因子ⅩⅢ，或者能够通过血流被传递到功能位点的，例如激素，都能够利用本发明的方法得到。一些应用的类别可以被归类，其中本发明的方法可以被用于提供所需要的与疾病相关或不相关的蛋白。
一个合适的应用类型是治疗遗传性疾病。这样的疾病包括(但不限于)胆囊纤维化，脊髓病性肌营养不良，血友病A，杭廷顿氏舞蹈病，家族性血胆甾醇过多，Ⅹ-易碎综合症。第二种应用的类型是提供一种用于其它疾病治疗的具有酶功能的蛋白，例如家族性脾性贫血。第三种应用的类型是提供一种具有激素功能的蛋白。对这种类型蛋白可治疗的病有为甲状腺激素、生长激素疾病以及糖尿病。第四种应用的类型是用于治疗由特定条件引起的蛋白水平的降低。这种应用的适宜的病例为由肝脏产生的低水平的人血清白蛋白，低水平的血红蛋白刺激因子，皮质醇缺乏，以及由某些肾病导致的醛甾酮缺乏。特定的垂体环境导致的生长素的缺乏，促性腺素的缺乏，甲状腺刺激激素的缺乏以及肾上腺皮质素的缺乏也可用本方法快速治疗。第五种应用的类型是提供一种具有治疗功能的哺乳动物或非哺乳动物蛋白。这些蛋白包括动物蛋白(例如蛇)，微生物蛋白(例如干扰素)，以及具有治疗功能的植物蛋白。
第六种应用的类型是提供与癌症相关的蛋白，合适的蛋白有抗原癌基因(肿瘤抑制因子)蛋白，肿瘤坏死基因蛋白和干扰素。已知在不同类型的癌症患者中，相对于正常人某些蛋白浓度很低或无。特定蛋白的缺少可能决定恶性细胞的生长，或可能导致癌症患者的免疫系统或代谢系统的严重损伤。在本发明的方法中，特定蛋白的提供在前一情况下具有治疗的功能，或减轻后者的症状或并发症。另外，特定蛋白的提供也用来预防特定类型的癌症。更特殊地，此功能特别适用于那些他们的天然蛋白产生能力上有遗传缺陷的癌症高危人群。众所周知的例子为乳腺癌、卵巢癌，以及前列腺癌。以前所述的组织特异性方法在此情况下可能没有功能，因为靶组织或细胞不能与基因缺陷的基因转移细胞相容。因此，本发明的方法在此类型的应用中有显著的临床价值。
第七种应用的类型是提供治疗免疫系统疾病的蛋白。疾病适宜的例子为抗体缺失综合症，例如Bruton血γ球蛋白缺乏(IgG,IgM以及IgA的减少)，普通可变的免疫缺失IgG,IgM以及IgA的减少)，以及选择性的IgA缺乏(IgA减少)。另一个病例是吞噬细胞失调，例如Clr,Clq,C2缺陷，C3缺陷，C4缺陷，以及C5-C9缺陷。第八种应用的类型是提供突变，融合的以及合成的蛋白。
利用红细胞的祖代细胞作为宿主细胞用于蛋白的产生以及利用后红细胞用于蛋白运输的方法也可被用于其它类似的细胞类型。例如，可以利用一种特定的启动子通过干细胞以与上述实施例中描述的相同方式来控制巨核细胞(血小板的前体)中蛋白的产生。当巨核细胞在体内破裂蛋白将被传输到血流中。
本发明的方法通过下面的实施例进一步地描述，其为了解释而不是为了限制。
实施例(a)用β-gal基因构建逆转录病毒载体首先，一个含有psi序列(逆转录病毒的组装功能)和一个异源基因(在此β-gal)的逆转录病毒载体将通过本领域公知的重组方法被构建。在逆转录病毒载体中，逆转录病毒的gag,pol以及env基因将被异源基因(附图2,(A))所替换。病毒生产细胞系也将被创建，其含有特定的野生型逆转录病毒基因，例如gag,pol以及env基因，在反式结构(附图2,(B))中。之后，上述的逆转录病毒载体将被用于转导生产细胞系。转导导致了携带含有异源基因(在此β-gal)的载体的不完全复制的逆转录病毒粒子的产生。逆转录病毒粒子能够和靶细胞(干细胞)连接在一起并插入其成分到细胞中。在细胞中，逆转录病毒RNA通过逆转录作用转为DNA，逆转录病毒DNA将通过整合被插到细胞染色体组中(附图2,(C))。
两种逆转录病毒载体用上述方法构建。两种逆转录病毒载体含有相同的β-gal基因。这两种逆转录病毒载体仅有的区别在于启动子或/和增强子。第一种逆转录病毒载体含有β-gal基因上游的SV40启动子。此载体能够在几乎所有的哺乳动物(人或动物)细胞中表达β-gal基因。第二种逆转录病毒载体含有β-gal基因上游的异源启动子。此载体仅能够在红细胞中表达β-gal基因。
此外，两种调控逆转录病毒载体也将被构建。调控逆转录病毒载体具有一个SV40启动子或一个异源启动子。然而，两种调控逆转录病毒载体都不含有β-gal基因。
通过β-gal基因转导的含有逆转录病毒载体的生产细胞系然后37℃培养在标准细胞培养基中。逆转录病毒粒子将从生产细胞系中释放到培养基中。通过离心从培养基中收集逆转录病毒粒子。收集的粒子通过DNA分析来证实β-gal逆转录病毒粒子的产生。
通过上述的方法，对于人细胞的β的转导效率以及β-gal蛋白表达将首先用市售的人细胞系检测。基于β-gal蛋白的特性，转导结果可通过本领域公知的染色反应来证实。
(b)用β-gal逆转录病毒转导骨髓细胞用兔和狗作实验和对照受试者。在麻醉的条件下通过手术从受试者的髋骨中收集骨髓细胞。通过本领域公知的技术例如密度梯度法从骨髓细胞中分离干细胞。干细胞在标准的细胞培养条件下培养在培养皿或瓶中。培养2到3天后，上述产生的实验病毒(带有β-gal基因的SV40启动子，和携带β-gal基因的异源启动子)，以及对照病毒(不携带β-gal基因的SV40启动子，和不携带β-gal基因的异源启动子)加到细胞培养物中用于转导。在转导5至7天后，通过β-gal DNA分析检测转导细胞的样品来检测转导的效率。通过β-gal蛋白分析检测余下的转导细胞来检测β-gal基因表达的效率。
转导的干细胞然后被移植回实验动物。这些移植物的区域被标记作为识别标记用于将来除去移植的细胞。
(c)体内基因表达与蛋白运输的结果骨髓移植后，在适当的时间间隔，从实验组和对照组动物中收集外周全血样。用常规方法从实验以及对照的受试者的全部血样中分离红细胞与白细胞。洗涤分离的细胞以减少残留的血清然后用溶剂溶解。通过β-gal蛋白试验或染色反应分析上清液。
具有用第一种实验载体转导的细胞的移植物的实验动物，所以在红细胞与白细胞的上清液中均获得阳性的β-gal蛋白测定。另一方面，具有用第二种实验载体转导的细胞的移植物的受试者仅在红细胞的上清液中获得阳性的β-gal蛋白测定。对于具有用对照载体转导的细胞的移植物，其β-gal蛋白分析的结果是阴性的。
此外，受试者具有用第二种实验载体转导的细胞的移植物的，其血清通过全部血样的离心被分离并通过免疫测定或染色反应被分析。阳性的血清β-gal蛋白分析的结果表明了下述的成功(1)基因在经转导的干细胞产生的干细胞以及红细胞中的表达，(2)红细胞中蛋白的产生，以及(3)蛋白运输到血流中，例如，从红细胞中释放。
本发明通过引用优选的实施例来描述。然而，应理解为本发明并不受其限制，并且本发明的范围应当由下面的权利要求而不是前面的说明书来确定。
本申请引用的所有专利与出版物在此一并被整体引用。
权利要求
1．一种体内产生和运输蛋白的方法，包括步骤(a)在载体中插入启动子和编码蛋白的基因；(b)从哺乳动物中收集适量的宿主细胞；(c)用所述载体处理宿主细胞；(d)将处理后的宿主细胞回输所述的哺乳动物，其中处理后的宿主细胞在所述哺乳动物体内产生红细胞与所述蛋白，并且其中所述的蛋白仅包含在所述红细胞中，其后所述的蛋白通过所述红细胞的破裂释放到所述哺乳动物的血流中。
2．如权利要求1所述的方法进一步包括在所述载体中插入一个增强子。
3．如权利要求1所述的方法，其中所述的启动子是一个天然启动子。
4．如权利要求1所述的方法，其中所述的启动子是一个突变启动子。
5．如权利要求1所述的方法，其中所述的启动子是一个来自红细胞的非同源性启动子。
6．如权利要求1所述的方法，其中所述的载体是一个病毒载体。
7．如权利要求6所述的方法，其中所述的病毒载体选自逆转录病毒载体，腺病毒载体，慢病毒载体。
8．如权利要求1所述的方法，其中所述的宿主细胞为干细胞和所述红细胞的祖代细胞。
9．如权利要求1所述的方法，其中所述的红细胞的破裂是一个体内的过程。
10．如权利要求11所述的方法，其中所述的红细胞的破裂是一个体内诱导的过程。
11．如权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白选自抗体，酶，辅因子，干扰素以及激素的组。
12．如权利要求1所述的方法，其中所述的蛋白是肽。
13．如权利要求11或12所述的方法，其中所述的蛋白是天然产生的蛋白。
14．如权利要求11或12所述的方法，其中所述的蛋白是融合蛋白。
15．如权利要求11或12所述的方法，其中所述的蛋白是突变蛋白。
16．体内产生和运输蛋白的方法包括步骤(a)在载体中插入血红蛋白启动子和编码非血红蛋白蛋白的基因；(b)从哺乳动物中收集适量的宿主细胞；(c)用所述载体处理宿主细胞；(d)将处理后的宿主细胞回输所述的哺乳动物，其中处理后的细胞在所述哺乳动物体内产生红细胞与所述蛋白，并且其中所述的蛋白仅包含在所述红细胞中，其后所述的蛋白通过所述红细胞的破裂释放到所述哺乳动物的血流中。
17．如权利要求16所述的方法进一步包括在所述载体中插入一个增强子。
18．如权利要求16所述的方法，其中所述的启动子是一个天然启动子。
19．如权利要求16所述的方法，其中所述的启动子是一个突变启动子。
20．如权利要求16所述的方法，其中所述的载体是一个病毒载体。
21．如权利要求20所述的方法，其中所述的病毒载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体和慢病毒载体。
22．如权利要求16所述的方法，其中所述的宿主细胞为干细胞和所述红细胞的祖代细胞。
23．如权利要求16所述的方法，其中所述的红细胞的破裂是一个体内的过程。
24．如权利要求23所述的方法，其中所述的红细胞的破裂是一个体内诱导的过程。
25．如权利要求16所述的方法，其中所述的蛋白选自抗体、酶、辅因子、干扰素以及激素。
26．如权利要求16所述的方法，其中所述的蛋白是肽。
27．如权利要求25或26所述的方法，其中所述的蛋白是天然产生的蛋白。
28．如权利要求25或26所述的方法，其中所述的蛋白是融合蛋白。
29．如权利要求25或26所述的方法，其中所述的蛋白是突变蛋白。
30．一种在体内产生和运输蛋白的方法，包括步骤(a)在载体中插入血红蛋白启动子和编码非血红蛋白的基因；(b)从哺乳动物中收集适量的宿主细胞；(c)在体外用所述载体处理宿主细胞；(d)将处理后的宿主细胞回输所述的哺乳动物，其中处理后的宿主细胞在所述哺乳动物体内产生红细胞与所述蛋白，并且其中所述的蛋白仅包含在所述红细胞中，其后所述的蛋白通过所述红细胞的破裂释放到所述哺乳动物的血流中。
31．如权利要求30所述的方法进一步包括在所述载体中插入一个增强子。
32．如权利要求30所述的方法，其中所述的血红蛋白启动子是一个天然启动子。
33．如权利要求30所述的方法，其中所述的血红蛋白启动子是一个突变启动子。
34．如权利要求30所述的方法，其中所述的载体是一个病毒载体。
35．如权利要求34所述的方法，其中所述的病毒载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体和慢病毒载体。
36．如权利要求30所述的方法，其中所述的宿主细胞为干细胞和所述红细胞的祖代细胞。
37．如权利要求30所述的方法，其中所述的红细胞的破裂是一个体内的过程。
38．如权利要求37所述的方法，其中所述的红细胞的破裂是一个体内诱导的过程。
39．如权利要求30所述的方法，其中所述的蛋白选自抗体、酶、辅因子、干扰素以及激素。
40．如权利要求30所述的方法，其中所述的蛋白是肽。
41．如权利要求39或40所述的方法，其中所述的蛋白是天然产生的蛋白。
42．如权利要求39或40所述的方法，其中所述的蛋白是融合蛋白。
43．如权利要求39或40所述的方法，其中所述的蛋白是突变蛋白。
全文摘要
一种在体内产生和运输蛋白的方法。该方法包括:在载体中插入启动子和编码蛋白的基因;从哺乳动物中收集适量的宿主细胞;在体外用载体处理宿主细胞;然后将处理后的细胞回输所述的哺乳动物。在体内,处理后的细胞在所述哺乳动物产生红细胞与包含在红细胞中的蛋白。蛋白通过所述天然的或诱导的红细胞的破裂释放到哺乳动物的血流中以供应给机体。
文档编号C07K14/00GK1322142SQ00800181
公开日2001年11月14日 申请日期2000年2月17日 优先权日1999年2月19日
发明者陈海星 申请人:Acgt公司