专利名称：提取纯化鹿胎素的工艺方法
技术领域：
本发明涉及提取纯化鹿胎素的工艺方法，尤其涉及采用生物技术提取纯化鹿胎素的工艺方法。
胎盘是孕育生命之源，是滋养胎儿生长发育和保护胎儿抵御外来侵害的重要的组织器官，其含有近百种具有高度生物活性的蛋白质和多肽及免疫调节物质，具有极高的促进生长发育、增强机体免疫能力、延缓衰老、调节机体代谢平衡等保健和药用价值。我国传统医学最早发现胎盘具有益肺定喘、补肾益精、益气养血等功效，并至今仍在使用胎盘粉、胎盘膏治疗早产、习惯性流产、气血虚等病症。现代医学也将胎盘不同的提取液用于培养组织细胞，增强机体的抗病能力，并取得一定的临床疗效。由于物种进化和生长环境的不同，不同种属动物的胎盘所含有的组分差别很大，其药用价值有很大不同，其中鹿胎盘具有更高的药用价值。但是鹿胎盘含有多少成分，究竟是那些成分在起那些作用尚不清楚。以往主要采用食品工艺的方法从鹿胎盘中提取鹿胎粉，但这种方法非常粗糙，提取的所谓的鹿胎素实际上是鹿胎盘中所有的结构蛋白质和功能蛋白质及多糖的混合物，具有免疫原性，药用价值低，同时由于酶降解、蛋白质变性、温度变化等因素的影响，所提取的物质生物活性差、临床疗效较差，实际上用现有的方法提取鹿胎素，不仅提取不到鹿胎素而且浪费了大量的宝贵的鹿胎盘资源。
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种产品纯度高、匀一性好、生物活性强以及得率高、成本低的提取纯化鹿胎素的工艺方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特点是，包括以下工艺步骤(1)抽提和盐析，先取新鲜或冷冻的鹿胎盘，在无菌条件下剪除胎膜和大血管，洗净后称重、剪碎，在4～8℃条件下，加入含苯甲基含硫氟化物(Phenylmethylsulfluoride，PMSF)的生理盐水，反复捣碎3～5分钟，制成匀浆，然后置于-25～-70℃的低温下完全冻结后再在25～30℃水溶液中迅速溶化，再进行离心分离，取上清液进行透析得到粗提物；(2)超滤，选用超滤装置对得到的粗提物进行超滤；(3)层析，将经过超滤的粗提物上样于羧甲基交联葡聚糖C50(Carboxymethy(CM)-Sephadex-C50)层析柱，在核酸蛋白检测仪和记录仪的监测下进行洗脱，流速为40～60ml/hr，将洗脱物进行透析、浓缩后得到纯鹿胎素。
所述的步骤(1)中苯甲基含硫氟化物的浓度为每升生理盐水含0.08～1.0mmol。
所述的步骤(1)中生理盐水的浓度为0.8～1.0％重量。
所述的步骤(1)中离心分离的离心速率为6000～7500rpm/min，离心时间为50～60分钟。
所述的步骤(1)中透析所使用的透析袋的截留值为500～1000道尔顿。
所述的步骤(2)中超滤先选用截留值为4000～6000道尔顿，纯水流量为30～40升/平方米·小时的无菌超滤膜，然后再选用截留值为500～1000道尔顿的无菌超滤膜，在低温条件下进行分级超滤和脱盐。
所述的低温条件为0～10℃。
所述的步骤(3)中羧甲基交联葡聚糖C50层析柱按以下步骤进行制备A.活化取羧甲基交联葡聚糖C50用去离子水浸泡后冲洗，抽干后悬浮于含0.05～0.15mol/LNaOH和0.1～1.0mol/LNaCL溶液中浸泡0.5～1小时，然后用大量去离子水冲洗至PH7.5，经磷酸钠缓冲液冲洗后浸泡，置于4～8℃备用；B.贮存羧甲基交联葡聚糖C50柱胶在磷酸钠缓冲液中，置于4～8℃贮存；C.装柱取层析柱，固定后置于4～8℃冷柜中，将羧甲基交联葡聚糖C50柱胶缓慢倒入柱内，用磷酸钠缓冲液洗脱平衡，平衡后待上样使用。
所述的磷酸钠缓冲液浓度为0.05～0.2mol/L，PH＝6.0。
所述的步骤(3)中磷酸盐缓冲洗脱液的NaCL的含量为0.0～0.6mol/L。
采用上述技术方案得到的纯鹿胎盘素经生物活性检测发现对3T3细胞有很强的促细胞分裂活性，其中含0.6mol/lNaCL的缓冲液洗脱物CM3c的生物活性最高(鹿胎素3)。1kg鹿胎盘经上述步骤纯化后可得到鹿胎素1、鹿胎素2、鹿胎素3(依次用不含NaCL、含0.15mol/l NaCL、含0.6mol/l NaCL的磷酸盐缓冲液洗脱得到)的产率分别为610mg、300mg和60mg，见表1。
表1鹿胎素的纯化*
*以1kg鹿胎盘为原料采用本发明得到的鹿胎素的生物学特性如下(一)分子量测定鹿胎素3经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰铵凝胶电泳(SDS-PAGE)后，用溴酚兰染色显示出多条蛋白区带，与已知标准蛋白电泳图谱比较，鹿胎素3的表观分子量分别为35000--45000(鹿胎素3a)、24000--32000(鹿胎素3b)、12000--22000KD(鹿胎素3c)(二)氨基酸组成测定鹿胎素3c的氨基酸组成测定见表2。
表2鹿胎素3c的氨基酸组成
(三)鹿胎素的提取物对3T3细胞活性的影响当在无血清的培养液中加入10ng/ml的鹿胎素3c后，CMEC和ASMC的CPM值分别从2459±268.90和1699.4±203.96增加到4807.0±326.72和3260.4±268.67，增加的百分比分别为95.47％和91.90％，差异极显著(P＜0.01)。
鹿胎盘具有很高的药用价值，由于鹿胎盘较为珍贵，目前国内外对其详细的研究报道不多，但已经发现的促进表皮细胞增殖、延缓细胞凋亡、增加细胞传代等生物学特点使其具有极高的潜在应用价值，过去已经有研究显示鹿胎盘提取物含有较多的免疫球蛋白、活性多糖、生长激素、细胞活性因子等生物活性物质，并且证明其具有增强免疫功能提高机体的抵抗力的作用，也有研究报道其能够刺激肝细胞再生，对重症肝炎具有一定的疗效，近来又有报道显示用鹿胎的粗提物进行美容收到良好的效果。本发明是一种用现代生物技术提取纯化鹿胎盘蛋白组分的工艺方法，该方法主要包括使用了匀浆、盐沉淀、低温离心、低温超滤、葡聚糖层析、核酸蛋白检测和氨基酸组成分析等多项现代生物制药技术，用该方法所获得的鹿胎素具有纯度高、匀一性好、生物活性强和得率多、成本低等特点，这种方法明显的优于目前公开材料所报道的方法，有极大的实用价值，值得进一步开发利用。
附图
为本发明的工艺流程图。
下面结合附图及具体实施例，对本发明作进一步说明。
实施例一、本发明使用的材料1.新鲜鹿胎盘，尽快置于-70℃冰箱内保存，用时迅速解冻至冰点。
2.主要试剂(1)苯甲基含硫氟化物(2)羧甲基交联葡聚糖C50(3)肝素琼脂糖(4)标准分子量蛋白(5)3H-TdR，比活度30mci/mmol3.主要仪器(1)高速组织捣碎机(2)可调速组织捣碎机(3)HitachihimacCR-21低温高速离心机(4)低温冷冻干燥机(5)752-C紫外可见分光光度计(6)M-92型核酸蛋白检测仪(7)制冰机(8)电热恒温箱(9)垂直板状电泳仪(10)CO2恒温细胞培养箱(11)超净工作台(12)Olympus倒置显微镜二、本发明试剂的配置和层析柱的准备1.试剂使用前一日配制，4℃冰箱内贮存。(1)PH标准液PH6.86(2)0.9％NaCL溶液(3)0.1mol/L磷酸钠缓冲液PH6.0(0.1mol/LPBS，PH6.0)(4)10mmol/LTris-HCLPH7.0(5)1.0mmol/LPMSF(6)6.0mol/LHCL(7)1.0mol/LNaOH(8)再生液0.1mol/LNaOH，0.5mol/LNaCL2.层析柱
(1)CM-SephadexC50柱胶的准备A.活化取Carboxymethy(CM)-SephadexC5015g，用去离子水浸泡后冲洗，在布氏漏斗中负压抽干后悬浮于500ml含0.1mol/LNaOH和0.5mol/LNaCL溶液中浸泡0.5小时，然后用大量去离子水冲洗至PH7.5，经0.1mol/LPH6.0的PBS冲洗后浸泡，置4℃备用。
B.贮存CM-SephadexC50柱胶在0.1mol/LPH6.0PBS液中，4℃贮存。
C.装柱取2.5×50cm层析柱，固定后置于4℃冷柜中，将CM-SephadexC50柱胶缓慢倒入柱内，无气泡后接核酸蛋白检测仪，用0.1mol/LPH6.0的PBS洗脱平衡，洗脱体积为1000ml，平衡后待上样使用。
D.再生将使用过的CM-SephadexC50柱胶用去离子水洗净后，置于含0.1mol/LNaOH及0.5NNaCL的再生液中浸泡30分钟，然后用大量的去离子水将其洗至OD值(280nm)＜0.02。
三、本发明鹿胎素的分离纯化(1)抽提和盐析取新鲜或冷冻的鹿胎盘，在无菌条件下剪除胎膜和大血管，用生理盐水洗净残余的血块后称湿重，剪碎，在4℃条件下，每公斤组织块加入1升含0.5mmol/L苯甲基含硫氟化物(Phenylmethylsulfluoride，PMSF)的0.9％重量的冰生理盐水，重量/体积为1/1，悬浮胎盘碎块，用组织捣碎机反复捣碎3分钟，制成匀浆；然后置于-4℃完全冻结后再在25℃水溶液中迅速溶化，如此反复三次，加正辛醇到终浓度至0.25％重量，置于4℃4小时或过夜；在7500rpm/min离心60分钟，弃沉淀及脂肪，将溶液置于截留值500的透析袋中对生理盐水彻底透析，或将透析容器放置于负压中，在0.1Pa恒压下透析12小时，使上低分子物质进入透析液，然后收集透析液，过滤除菌；10ml分装，每10ml中约含12克鹿胎盘组织的粗提物，其紫外线吸收峰在254-258nm之间，OD260/OD280＞2，多肽含量约926±158ug/ml；此粗提物可以进一步冷冻干燥保存，或可以制成鹿胎蛋白肽的原浆液，或可以进一步提纯其内的不同的蛋白组分。
(2)超滤根据条件可选用浅道系统超滤装置或封闭系统有搅拌装置或中空纤维系统超滤装置，其中以中空纤维超滤装置效率最佳；超滤膜的选择主要包括两个方面，一方面是膜截留值分子量的选择，主要根据被处理的物质的分子量大小和要求达到得分离效果来选择膜，另一方面选择分离效果比较好滤出速度又比较快的膜，本发明先选用截留值为4000道尔顿，纯水流量为30～40升/平方米·小时的SPK高分子合金无菌超滤膜，然后再选用截留值为600道尔顿的SPK高分子合金无菌超滤膜，在0-10℃的低温条件下进行分级超滤和脱盐。
(3)透析和浓缩将粗提物用少量冷去离子水溶解后，置于截留值＜4000的透析袋内，在4℃下不断搅拌，对水彻底透析；收集透析液并浓缩，计算总体积，测定蛋白质浓度。
(4)羧甲基交联葡聚糖C50柱层析将鹿胎素粗提物浓缩液20～40ml，对0.1mol/LPH6.0磷酸钠缓冲液透析，然后上样于预先用同样缓冲液平衡过的羧甲基交联葡聚糖C50(Carboxymethy(CM)-Sephadex-C50)2.5×50cm层析柱，在核酸蛋白检测仪和记录仪的监测下进行洗脱，流速为50ml/hr，可得到第一个蛋白峰CMF1，待蛋白峰下降至基线位置时，再依次用含0.15mol/LNaCL和0.6mol/LNaCL的上述磷酸盐缓冲液洗脱，分别可得到第二个蛋白峰CMF2和第三个蛋白峰CMF3；分别收集上述CMF1、CMF2和CMF3组份，分别命名为鹿胎素1，鹿胎素2和鹿胎素3待测其蛋白质浓度和生物活性。
四、本发明鹿胎素的生物学测定(一)分子量测定鹿胎素3经SDS-PAGE后，用溴酚兰染色显示出多条蛋白区带，与已知标准蛋白电泳图谱比较，鹿胎素3的表观分子量分别为35000--45000(鹿胎素3a)、24000--32000(鹿胎素3b)、12000--22000KD(鹿胎素3c)(二)氨基酸组成测定鹿胎素3c的氨基酸组成测定见表2。
(三)含不同鹿胎素的提取物对3T3细胞活性的影响当在无血清的培养液中加入10ng/ml的鹿胎素3c后，CMEC和ASMC的CPM值分别从2459±268.90和1699.4±203.96增加到4807.0±326.72和3260.4±268.67，增加的百分比分别为95.47％和91.90％，差异极显著(P＜0.01)。
权利要求
1.一种提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特征在于，包括以下工艺步骤(1)抽提和盐析，先取新鲜或冷冻的鹿胎盘，在无菌条件下剪除胎膜和大血管，洗净后称重、剪碎，在4～8℃条件下，加入含苯甲基含硫氟化物的生理盐水，反复捣碎3～5分钟，制成匀浆，然后置于-25～-70℃的低温下完全冻结后再在25～30℃水溶液中迅速溶化，再进行离心分离，取上清液进行透析得到粗提物；(2)超滤，选用超滤装置对得到的粗提物进行超滤；(3)层析，将经过超滤的粗提物上样于羧甲基交联葡聚糖C50层析柱，在核酸蛋白检测仪和记录仪的监测下进行洗脱，流速为40～60ml/hr，将洗脱物进行透析、浓缩后得到纯鹿胎素。
2.根据权利要求1所述的提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特征在于，所述的步骤(1)中苯甲基含硫氟化物的浓度为每升生理盐水含0.08～1.0mmol。
3.根据权利要求1所述的提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特征在于，所述的步骤(1)中生理盐水的浓度为0.8～1.0％重量。
4.根据权利要求1所述的提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特征在于，所述的步骤(1)中离心分离的离心速率为6000～7500rpm/min，离心时间为50～60分钟。
5.根据权利要求1所述的提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特征在于，所述的步骤(1)中透析所使用的透析袋的截留值为500～1000道尔顿。
6.根据权利要求1所述的提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特征在于，所述的步骤(2)中超滤先选用截留值为4000～6000道尔顿，纯水流量为30～40升/平方米·小时的无菌超滤膜，然后再选用截留值为500～1000道尔顿的无菌超滤膜，在低温条件下进行分级超滤和脱盐。
7.根据权利要求6所述的提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特征在于，所述的低温条件为0～10℃。
8.根据权利要求1所述的提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特征在于，所述的步骤(3)中羧甲基交联葡聚糖C50层析柱按以下步骤进行制备A.活化取羧甲基交联葡聚糖C50用去离子水浸泡后冲洗，抽干后悬浮于含0.05～0.15mol/LNaOH和0.1～1.0mol/LNaCL溶液中浸泡0.5～1小时，然后用大量去离子水冲洗至PH7.5，经磷酸钠缓冲液冲洗后浸泡，置于4～8℃备用；B.贮存羧甲基交联葡聚糖C50柱胶在磷酸钠缓冲液中，置于4～8℃贮存；C.装柱取层析柱，固定后置于4～8℃冷柜中，将羧甲基交联葡聚糖C50柱胶缓慢倒入柱内，用磷酸钠缓冲液洗脱平衡，平衡后待上样使用。
9.根据权利要求8所述的提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特征在于，所述的磷酸钠缓冲液浓度为0.05～0.2mol/L，PH＝6.0。
10.根据权利要求1所述的提取纯化鹿胎素的工艺方法，其特征在于，所述的步骤(3)中磷酸盐缓冲洗脱液的NaCL的含量为0.0～0.6mol/L。
全文摘要
本发明涉及提取纯化鹿胎素的工艺方法,它包括以下工艺步骤:(1)抽提和盐析,(2)超滤,(3)羧甲基交联葡聚糖C
文档编号C07K1/14GK1367178SQ0110527
公开日2002年9月4日 申请日期2001年1月22日 优先权日2001年1月22日
发明者张建军, 陈书艳 申请人:张建军