新的天然抗菌肽、其编码序列及用途的制作方法

专利名称：新的天然抗菌肽、其编码序列及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、生殖生物学、分子免疫学和医学领域。具体地说，本发明涉及新的在大鼠附睾头部特异表达的天然抗菌肽-Binlb蛋白，以及编码该抗菌肽的多核苷酸。本发明还涉及此抗菌肽及其编码序列的制备方法和用途。Binlb蛋白还与男性生育，尤其是精子成熟有关。
人类基因组全顺序的阐明会绘出一篇密码图谱，随后的是了解哪一段顺序编码哪一个基因？这一基因在体内的功能是什么？一个生物学功能需要哪几个基因的协同作用？它们又是如何协调控制着生命的正常活动的？以及哪些错误会导致各种病理现象的产生？这一系列艰巨的，极富挑战性的，能直接为人类造福的，也能产生巨大经济效益的解码工作促使人们进入了功能基因组研究时代。
在回顾20世纪和展望21世纪之际，国际同行专家的一致认为生殖生物学发展至今虽然成果颇丰，但如果沿袭过去的思路和方法，局限于组织水平、细胞水平的观察和测定，不借鉴相关学科的新技术，不深入研究生殖的分子机制，不进行多学科的交叉研究，那么其发展将不容乐观。而且，多年来生殖生物学主要侧重于雌性生殖的研究，对雄性生殖领域的涉足不多。人们对揭示生殖规律的基础研究尚不够重视，致使迄今尚无理想的节育药物和技术，且对自身生殖奥秘的认识滞后于现代生命科学的发展。因而生殖生物学在21世纪将面临两项革命(1)重视发展其基础研究，将现代分子生物学、分子免疫学和细胞生物学等新思想、新方法、深入研究控制人类生殖和出生缺陷的机制；(2)加强雄性生殖生物学的研究，大力发展男性避孕措施，为当前生殖健康研究的国际趋势。
中国人口目前占世界人口的22％，但耕地只有世界的7％，淡水量只有世界的6％。即便将人口增长率控制在0.01％，每年也将有0.13亿以上的人口逐年增长。此外，目前所使用的避孕措施主要以女性为主。何况这些避孕药还未完善，有着这样或那样的副作用(其遗传后果还犹待评估)。安全的绝育措施也以女性为主，据WHO的统计，我国四川省男性输精管结扎者只有1/12。实际上，避孕是男女双方都有责任的，而且男性生殖调控在人口数量和质量控制两个方面都更具重要性。因为(1)健康男性在50年生育期内，每天产生1亿精子，而女性生育期只有40年，每个月才排出1个成熟卵。(2)精子容易受环境影响而产生突变。(3)50年来，精子数量和质量下降了40％。(4)45岁以下的男性原发性不育者占5-10％。因此，除了要纠正“避孕是妇女的事”这一误区外，还要特别加强雄性生殖生物学的研究，大力发展男性避孕措施。众所周知，人类生殖健康是全球性战略的头等大事。避孕毕竟是缓解人口危机的权宜之计，而后代在本星球上追求身心健康的生活方式才是恒久主题，生育调节药物的设计应适应新的现实需求，更上一层楼。1999年9月9-10日美国儿童健康与人类发育研究所(NICHD)负责在NIH总部召开了“男性避孕在21世纪”研讨会。交流了现状，提出了目标，布署了措施(组织合作及基金支持等)，打响了战鼓[Trends in Endocrinology and Metabolism2000，11(2)66-69].
目前已知精祖细胞在睾丸中通过有丝分裂、减数分裂和形态学分化成为完全的精子细胞后，进入附睾，在其头部和体部逐渐达到成熟，然后在尾部储存，等待射精。而精子运动能力的形成、顶体功能的完善、代谢类型的转变等一系列程序化的成熟功能的获得并非靠其自身完成，而是在其通过附睾的过程中，与附睾微环境相互作用中按其特定的程序逐渐成熟的。附睾是一根连接睾丸和输精管的盘曲的细长管道。但其每一段落的附睾细胞表达不同的基因及基因产物，分泌种类不同的蛋白及免疫抑制分子、有不同的腔液组成、一定的离子强度、pH等，形成不断变化着的管腔微环境，与精子相互作用，使精子表面蛋白的成分得以部分改变或得以部分修饰(如加减一序列的磷酸化，酯化，酰化，羧基化，醣基化等)而被激活或抑制从而逐步获得成熟时所具备的功能及免疫防御能力，保护其自身能在附睾中储存及通过女性生殖道直至与卵结合。
附睾的这种对精子成熟、储存和保护的作用因具有下述诸特点而早已被认同并视作进行抗生育的一个理想的靶器官(1)功能较为单一。干扰其功能的药物不致引起严重的副反应。
(2)激素作用的终极器官。自身不具有内分泌机能。故作用于附睾的药物一般不会影响激素分泌。
(3)精子在进入附睾前已分化完全，基因转录已停止，其成熟功能的获得一般与蛋白的修饰有关，不涉及DNA复制机能。因此药物的作用不可能引起DNA改变的遗传病。
(4)附睾的研究尚未引起人们的足够重视，因此是一个未被开垦的处女地，大有用武之地。
然而，附睾不同部位形成这些程序化微环境差异的机制绝不是一、两个基因和蛋白所能左右的，而是一组组基因程序性表达产物的协同作用的结果。而对于这种与精子成熟相关的附睾特异基因表达的启动与程序还知之甚少。因此对这方面的研究，不仅有助于揭示精子在附睾中成熟的分子机理，解读一部分基因组密码，而且还为解决精子成熟异常所引起的不孕症提供分子基础，也为开发一些阻断精子成熟的男性避孕药物提供新的设计思路。
纵观文献，对附睾的研究早已受到关注。回顾自70年代至今，主要从三个方面在进行探索(1)从蛋白质水平而言，利用双向蛋白质电泳等技术将附睾不同部位的管腔中的蛋白质或不同部位成熟程度不同的精子上的膜蛋白进行比较，或用这些不同蛋白质制成多抗，用免疫法来进行比较取得了些结果，然而由于受分离分析技术的灵敏度的限制，进展不尽如人意。近年来，由于蛋白组学研究的突飞猛进，法国Dacheux实验室自96年到今年初报道在猪和羊附睾的管腔中鉴定到200多个蛋白。提示与其它器官相比，附睾研究的难度相对较小。然而迄今为止，只有15个附睾特异的蛋白的cDNA被克隆。
(2)通过已知附睾在精子成熟过程中的作用，来研究一些已知功能的蛋白质，是否与附睾某一特定功能相关。如已知附睾能保护精子免受氧自由基的损伤。曾对附睾不同部位6种抗氧化酶mRNA进行检测，发现在其头部E-GPX的mRNA含量最高，而在体部则E-SOD的mRNA含量最高。这些结果提示在附睾不同部位所需的抗氧化酶的种类不一。然而这方面的研究局限在已有的知识基础上，对新基因产物或新功能基因的发现上则很少有帮助。另外，已知附睾内存在大量免疫细胞与免疫抑制分子，保护精子不受自身攻击的免疫微环境，但其形成与筛选调控的分子和细胞机制不清，资料不系统。
(3)90年代以来由于分子生物学的技术日新月异，开始有可能利用差减杂交等方法从mRNA水平上来搜寻附睾特异表达的新基因。如西德实验室用差示筛选cDNA库的方法在人附睾中先后找到6个新mRNA，然而由于人类附睾或其它的材料局限，无法对其功能进行深入研究，因而都在用不同手段在其它实验动物中进行搜索。
因此，本领域迫切需要开发新的与男性生育有关和/或与附睾有关的天然蛋白。
本发明的目的是提供一种新的天然抗菌肽-Binlb蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽和多核苷酸的方法及其用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离或纯化的Binlb多肽，该多肽源自大鼠，它包含具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供了编码分离或纯化的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码SEQ ID NO2或3所示Binlb多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中57-263位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中105-263位的序列；(c)具有SEQ IDNO1中1-336位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有Binlb蛋白活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达Binlb蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有Binlb蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的Binlb多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-1757个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗Binlb多肽活性的化合物，以及抑制Binlb多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是Binlb多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在Binlb蛋白的方法，它包括将样品与Binlb蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Binlb蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与Binlb多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进Binlb多肽活性的激动剂，或者筛选抑制Binlb多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的Binlb蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的Binlb多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗泌尿生殖系统感染等病症。
在本发明的第十一方面，提供了一种杀菌剂，它含有杀菌有效量的本发明Binlb多肽。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本发明人利用mRNA的差异显示分析及差减杂交库分析分别对大鼠和猴附睾不同部位特异表达的基因作了筛选(猴方面的工作与美国北卡大学合作)。不仅鉴定到了那些已被发现的特异基因，而且还获得一系列的特异表达的新基因的全长cDNA克隆(2个在大鼠附睾头部、4个在猴附睾头部、4个在猴附睾体部、3个在猴附睾尾部)。
Binlb是其中之一，它是在大鼠附睾头部特异表达的基因，已取得其全长cDNA和基因组DNA的克隆(其核苷酸和氨基酸序列和结构已在美国NIH基因银行中登陆，登陆号为AF217088，AF217089。在本申请之前，这些序列还未公开)。Binlb基因的表达非常特异，只在大鼠附睾头部的上皮细胞中产生，在大鼠生育旺盛期表达最高，年老后下降。提示可能与生育有关。而且，Binlb基因的表达受雄激素正调控。这为今后利用激素小分子来影响此基因表达以调控精子成熟设计男性避孕药物成为可能。此外，Binlb基因具有抗菌作用，是在大鼠附睾中发现的第一个beta-防卫素类天然抗菌肽，有望发展成为治疗泌尿生殖系统感染的一个天然药物。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。


图1显示了大鼠附睾头(1)、体(2)和尾(3)的DD-RT-PCR电泳图。样品一式两份重复以确保准确性。如箭头所示，Binl在头部区域是差异表达的。
图2A显示了Binlb的基因组序列和结构特性。Binlb的基因组DNA序列(Genebank登录号AF217089)，是通过使用位于Binlb全长cDNA序列(AF217088)两端的引物(上游引物5′-GGACACCCAGTCATCAGTCACAT-3′(SEQ ID NO9)和下游引物5′-TTTGGGGTGCTT CCAGGTCTCT-3′(SEQ ID NO10))，并以大鼠基因组DNA为模板PCR扩增而得的。两个外显子用大写字母表示；编码区用阴影表示；polyA结尾信号；粗体大写字母；内含子小写字母；剪接位点粗体小写字母；推定的信号肽带下划线的氨基酸。在N端有一豆蔻酰化的G残基(用方框表示)，其共有模式(GIRNTV)用粗斜体大写字母标出。圆圈中的S残基可以被PKC磷酸化，其共有模式(SIK)用粗斜体大写字母标出。终止密码子用“*”表示。
图2B显示了Binlb与β-防卫素的序列相似性。保守的6个浅灰阴影标出。BNBD9(AAB25872)，BNBD3(AAB25866)，BNBD7(AAB25870)，TAP(P25068)，LAP(Q28880)，EBD(002775)来自牛；HBD1(Q09753)，HBD2(015263)，HBD3(NP061131)来自人；EP2E(AF263555_1)CBD1(AF188607_1)，CBD2(AF209855_1)来自黑猩猩；MBD1(AAB72003)，MBD2(CAB42815)，MBD3(AF092929_1)，MBD4(AF155882_1)来自小鼠；RBD1(AAC28071)，RBD2(AAC28072)来自大鼠；GBD1(CAA76811)，GBD2(CAA08905)来自山羊；SBD1(019038)，SBD2(019039)来自绵羊；PBD1(062697)来自猪；Gall(P46156)，Gal1a(P46157)和Gal2(P46158)分别是鸡的gallinacin 1，1α和2；THP1(P80391)和THP2(P80392)分别是火鸡的异嗜性肽1和2.EP2E是黑猩猩中与Binlb同源的一种同源蛋白，然而其作者认为它不是β-防卫素家族的成员。
图2C是Binlb与灵长目同源蛋白的序列比较。与Binlb相比，灵长目同源蛋白EP2D(AF263554_1)和HE2β1(AF168617_1)具有更长的N端和C端。EP2E(AF262555_1)仅具有更长的C端。在图中，HE2β1用HE1b1表示。
图3显示了Binlb全长cDNA的体外转录和翻译试验的结果。
图3A是对Binlb全长cDNA的体外转录和翻译产物的分析电泳图。泳道1和2为一式两份的重复样品。
图3B是用与图3A中相同的系统，对阴性对照(无质粒DNA)和荧光素酶SP6和T7对照进行分析的电泳图。其中，因分子量差异而在12％SDS-PAGE中电泳。泳道1为阴性对照(无质粒DNA)，泳道2为荧光素酶SP6对照，泳道3为荧光素酶T7对照。
图3C.质粒pSPT18-Binlb的结构图。
图4显示了重组的Binlb融合蛋白的表达。融合蛋白DHFR-Binlb的分子量为31KD，如箭头所指。各泳道如下NI未诱导，I诱导，CL澄清裂解液，FT流穿液，W洗涤缓冲液，E1洗脱1，E2洗脱2，M分子量标准。
图5显示了Binlb的定位以及发育调控。(A).用Northern分析确定的Binlb组织分布情况。(B).用原位杂交确定的Binlb在附睾中的区域分布情况，Binlb位于大鼠附睾头部区域的中间(Mid)。Ins初始段。(C)用反义探针确定的Binlb细胞定位。Binlb位于附睾上皮细胞(Prc)中。(D).有义探针。(E)作为阳性对照的18s探针。(F).在整个生命期间(15-720天)，大鼠附睾中Binlb mRNA的表达图。(泳道1，2和3分别表示来自附睾头、体、尾区域的mRNA)。
图6.在用EDS(Ethylene Dimethamesulfonate)处理后，对大鼠头部总RNA进行的Northern印迹分析结果。
图6A为Northern印迹电泳杂交图。
图6B显示了Binlb的表达受雄激素的上调。其中，带“▲”的曲线表示在注射EDS后间隔不同时间，大鼠血清中的睾丸激素的水平；带“◆”的曲线表示了用18s水平校正后大鼠Binlb表达水平的变化。
图7显示了Binlb的抗菌活性以及对炎症作出的表达上调。(A).头部和尾部培养物抗菌活性的比较。在试验前16小时，将100 CFU大肠杆菌加至培养物中。(B).反义Binlb对头部培养物抗菌活性的影响。用反义或有义寡核苷酸(5微克/微升)转染培养物20小时。(C).通过结扎大鼠输精管而引起炎症(2周)，在附睾头部Binlb mRNA增加，而尾部没有变化。
在本发明中，术语“Binlb蛋白”、“Binlb多肽”或“抗菌肽-Binlb”可互换使用，都指具有天然抗菌肽Binlb氨基酸序列(SEQ ID NO2或3)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的天然抗菌肽Binlb，以及含有或不含有信号肽的Binlb蛋白。成熟的Binlb蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO3。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸和多肽如果与天然状态一起存在的其他物质分开，则为分离纯化的。“分离”、“纯化”包括将重组表达的Binlb蛋白与其他蛋白、糖类等物质分开。
如本文所用，“分离或纯化的Binlb蛋白或多肽”是指Binlb多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Binlb蛋白。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括Binlb蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Binlb蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类特殊的Binlb类似物是在其他哺乳动物(如牛、羊、兔、狗、猴、人等)中Binlb的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据本发明公开的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。
在本发明中，术语“Binlb多肽”指具有Binlb蛋白活性的SEQ ID NO.2或3序列的多肽。该术语还包括具有与Binlb蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2或3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Binlb蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与Binlb DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Binlb多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Binlb多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了Binlb多肽的可溶性片段。通常，该片段具有Binlb多肽序列的至少约15个连续氨基酸，通常至少约25个连续氨基酸，更佳地至少约35个连续氨基酸，最佳地至少约40个连续氨基酸。
发明还提供Binlb蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然Binlb多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“Binlb蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2或3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2或3的蛋白质，但与SEQ ID NO1中相应编码区序列有差别的核酸序列。
编码Binlb成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列+各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列+任选的附加编码序列+非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知，等位变异体是一种多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但这种变化不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Binlb核苷酸序列。
本发明的Binlb核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，因为Binlb编码序列的长度较短。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Binlb蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的Binlb多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码Binlb多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，Binlb多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Binlb编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的Binlb蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗泌尿生殖系统感染疾病，和用于筛选促进或对抗Binlb蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组Binlb蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激Binlb蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对Binlb DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于Binlb基因产物或片段。较佳地，指那些能与Binlb基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制Binlb蛋白的分子，也包括那些并不影响Binlb蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的Binlb基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；或嵌合抗体等。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的Binlb基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达Binlb蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292.1976Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hvbridomas.Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断Binlb蛋白功能的抗体以及不影响Binlb蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用Binlb基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与Binlb基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗Binlb蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的Binlb蛋白。此外，与Binlb蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Binlb蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于泌尿生殖系统感染方面的治疗。在使用本发明Binlb蛋白时，还可同时使用其他药剂，如青霉素等抗菌素。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明Binlb多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的Binlb蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。此外，Binlb核苷酸序列也可用于多种治疗目的。
能与Binlb蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。
本发明还涉及定量和定位检测Binlb蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的Binlb蛋白水平，可以用作解释Binlb蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断Binlb蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在Binlb蛋白的方法是利用Binlb蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与Binlb蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Binlb蛋白。
Binlb核苷酸序列可用于Binlb蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，Binlb核苷酸序列可用于检测Binlb蛋白的表达与否或在疾病状态下Binlb蛋白的异常表达。如Binlb DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断Binlb蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用Binlb蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测Binlb蛋白的转录产物。
检测Binlb基因的突变也可用于诊断Binlb蛋白相关的疾病。Binlb蛋白突变的形式包括与正常野生型Binlb DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明Binlb蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
本发明的Binlb为治疗泌尿生殖系统感染等疾病以及开辟男性避孕方法提供新的途径，因而具有巨大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1Binlb mRNA的差异片段的发现基本上按Liang，P.等在“Science”上发表的方法[P.Liang，and A.B.Pardee，Science 257，967(1992)]，从Sprague-Dawley大鼠附睾的头部、体部、尾部分别抽提总RNA，并用不含RNase的DNase消化去除留存的染色体DNA。经沉淀后，用2ug分别来自头、体、尾部的纯化的总RNA进行反转录，反转录反应中，使用2.5uM的下游引物T11CA(5′-TTTTTTTTTTTCA-3′)和400单位的MMLV反转录酶。以1/20的反转录产物为模板，进行PCR扩增，在20ul反转录体系中，包含2.5uM的上游引物502(5′-TGGATTGGTC-3′)，0.5uM的下游引物T11CA，10mM Tris-HCl pH 9.0，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.1％Triton X-100，4μM each dNTP，1μCi32P-dATP和3单位Taq聚合酶。反应条件为94℃ 5min；然后是40个循环94℃ 30秒，40℃ 60秒，72℃ 50秒；最后是72℃ 10min。PCR反应产物经沉淀后，在0.2mm厚的6％的测序胶上分离。
在大鼠附睾头部有一条特异表达340bp的条带(命名为Binl，如图1中箭头所示)。将该条带割出后，于沸水中洗脱15分钟。被洗脱出的DNA经乙醇沉淀后，用上面相同的条件进行PCR扩增，但需改变dNTP的浓度为40uM并且不加同位素。扩增出来的DNA片段克隆于pBluescript SK-质粒中。用反向Northern方法从52个克隆中筛选出在附睾头部有特异杂交信号的克隆，并命名为Binlb。在这个基因片段基础上，进一步采用5′-RACE的方法克隆该基因的全长cDNA。
实施例2Binlb全长cDNA的克隆和结构分析根据已有的cDNA片段设计引物，通过类似的RT-PCR反应向5′-末端延伸。使用了两种5′-RACE的方法获得cDNA全长。
第一种方法参照Apte，A.N.的报道[A.N.Apte，P.D.Siebert，in ReverseTranscriptase PCR J.W.Larrick，P.D.Siebert，Eds.(Ellis Horwood，London，1995)pp.232-244.]，利用DNA oligo和cDNA第一链连接的方式。
另外一种方法修订于Maruyama，K.[K.Maruyama and S.Sugano，Gene 138，171(1994)]的报道，我们做了一定的修改，这种方法克服了前一种方法的缺陷，可以确保获得cDNA的5′-帽子位点。它使用DNA oligo代替RNA oligo和总RNA进行连接。具体过程如下将50ug大鼠附睾头部的总RNA用400单位的细菌碱性磷酸酶(Bacterial Alkaline phosphatase，BAP)于37℃消化30分钟，随后65℃消化30分钟。接着，用50ng/ul的蛋白酶K于37℃酶解30分钟，以便消化BAP。经纯化后，将其中10ug RNA用2单位的烟草酸焦磷酸酶(Tobacco AcidPyrophosphatase，TAP)于37℃酶解2小时，经苯酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀。分别取0.75ug(3pmol)未经任何处理的RNA、BAP处理的RNA、和TAP处理的RNA与1.25pmol DNA oligo#7209(5′-AATGGTACCGTGACGTGGTCC-3′)(SEQ ID NO5)在10ul反应体系中于17℃连接18小时，连接反应体系中包括1.2单位/ulT4 RNA连接酶，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM MgCl2，1mM氯化六氨合高钴(hexammine)colbalt chloride)，25％PEG8000，1mM ATP。1/50的连接产物被用来进行RT-PCR反应，反应体系采用GIBCO BRL公司的SuperScript IIOne-Step RT-PCR System，反应体积为20ul。另外，还包括200nM的Binlb基因特异的引物(GSP)(5′-TGGCCCCGCTGCATGAAGCAC-3′)(SEQ ID NO6)和200nM的DNA oligo#7209(5′-AATGGTACCGTGACGTGGTCC-3′)(SEQ ID NO5)。反应条件为50℃ 30min，94℃ 2min，然后按照以下条件进行35个循环，94℃ 5秒，60℃ 15秒，72℃ 45秒，最后于72℃延伸5min。取0.2ul RT-PCR反应产物作为模板进行第二轮PCR反应，反应体积为10ul，反应体系中含有50mMTris-HCl pH 8.3，1-3mM MgCl2，250μg/ml BSA，0.5％Ficoll 400，1mM tartrazine，200μM dNTP，500nM Binlb GSP，500nM DNA oligo#7209，和0.4单位的Taq聚合酶。反应在毛细管中进行，反应条件为94℃ 1min，然后按下列条件进行60个循环94℃ 0秒，60℃ 0秒，77℃ 15秒，最后于77℃延伸5min。PCR产物克隆于pBluescript SK+T-载体中，并进行测序。这样，本发明人就获得了Binlb的3′和5′两个cDNA片段。
在2个cDNA片段的两端分别设计引物(5’-GGACACCCAG TCATCAGTCA-3’(SEQID NO7)和5’-CAGCAAGTGT TTATTGAGCA-3’(SEQ ID NO8))，使用RT-PCR反应产物作为模板，通过PCR反应获得Binlb的全长cDNA克隆。这个序列在6只不同龄的大鼠中得到了验证。Binlb的全长cDNA为385bp(SEQ ID NO1)(如图2A所示)。它编码一个68个氨基酸的多肽(命名为Binlb蛋白)(SEQ ID NO2)，在其N端有一个16个氨基酸的信号肽，它的C-端45个氨基酸为理论上的成熟多肽(另有7个氨基酸在pro-Binlb转变为成熟蛋白时被切除)。
通过Genebank的Blastn程序查询发现，Binlb在编码区180-241位与人精子抗原HE2(673bp)的非编码区(457-518位)有83％的相似性。此外，通过Genebank的Blastp程序查询发现Binlb编码的多肽与哺乳动物β-防卫素家族有一定程度的相似性(如图2B所示)。
继而，本发明人用类似的PCR方法克隆了Binlb的基因组DNA(SEQ ID NO4)(如图2A所示)。证明了Binlb基因结构也附合β-defensin家族的规律，即由一个内含子和两个外显子组成。
目前，关于HE2的研究发展很快，有两家实验室相继报导了人HE2和大猩猩HE2(EP2)的多个异构体。有一些异构体虽然它们的表达量很低，然而与Binlb有非常好的同源性(如图2C所示)。
实施例3Binlb蛋白的表达在该实施例中，通过体外转录和翻译实验，验证了Binlb表达出多肽的大小与理论上推断的一致，约为31kDa。
将带有约75bp polyA尾部且包括编码仅68个氨基酸(7799道尔顿)的ORF的Binlb全长cDNA，克隆在pSPT18(Promega)的EcoRI和HindIII之间，位于T7启动子下游，形成质粒pSPT18-Binlb(图3C)。用HindIII线性化的质粒，在含有放射性标记的35S-Met的TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System中分析，并用16.5％Tricine-SDS-PAGE凝胶进行分析(按Schagger和Von Jagow所述的方法)，结果如图3A所示。同时，使用阴性对照(无质粒DNA)和荧光素酶SP6和T7对照进行比较(图3B)。
实施例4Binlb的融合表达及抗体制备将Binlb cDNA的126-281位的片段接入融合表达载体pQE-40(Qiagen公司)中。挑选出的阳性克隆，经1mM IPTG诱导表达后，用Ni-NTA-琼脂糖(Qiagen公司)纯化。该实验的具体操作过程详见QiaExpressionist(Qiagen公司)。
纯化后的融合表达蛋白DHFR-Binlb的大小为31KD(如图4所示)。将纯化的蛋白免疫兔子，取得抗DHFR-lb的抗血清。然而，该抗血清的抗Binlb的滴度不高，有待进一步改进。
实施例5Binlb表达的组织分布Binlb表达的组织分布的Northern印迹分析，按1984年Church和Gilbert首先报道的方法进行。从Sprague-Dawley大鼠附睾的头部、睾丸、前列腺、肝、心、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、凝结腺(Coagulating gland)、精囊、下丘脑、纹状体、垂体、海马、小脑、大脑皮层中分别抽提总RNA。各取20ug总RNA，在1.2％的甲醛琼脂糖电泳上分离，并转膜HybondTM-N+尼龙滤膜(AmershamPharmacia Biotech)。Binlb的探针用Promega公司的Prime-a-GeneSystem试剂盒标记。杂交结果表明，Binlb只在大鼠附睾头部有表达(如图5A所示)。这也促使我们用原位杂交来更精确地定位Binlb的表达特异性。
实施例6Binlb表达在附睾中的定位在该实施例中，用原位杂交法对Binlb进行定位，方法如下(1)45天龄大鼠附睾，以4％多聚甲醛室温固定4小时以上，固定后的组织经常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、56-58℃高温石蜡包埋，常规切片，切片厚10微米，贴于硅烷处理的载玻片上，42℃烤片48-72小时，密封于玻璃染色缸内，保存于4℃。
(2)组织切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水至DEPC-H2O中，于0.2M HCl中处理20分钟，DEPC-H2O洗5分钟，2×SSC 70℃ 30分钟，DEPC-H2O洗5分钟，切片经TE(pH 7.5)37℃平衡30分钟后，置于含3ug/ml的蛋白酶K的TE(pH7.5)中，37℃消化10分钟。以含0.2％甘氨酸的PBS和PBS溶液各洗2次，每次1分钟，再以4％多聚甲醛室温后固定20分钟，之后浸于1.5％乙酸酐/0.25M三乙醇胺中，室温10分钟，PBS洗5分钟。
(3)用餐巾纸吸去载玻片上多余的水分，将预杂交液[每5ml杂交A液中含有0.65ml DEPC-H2O，2.5ml甲酰胺，1.25ml 20X杂交盐液(3M NaCl，0.1MPIPES，0.1M EDTA pH 6.8)，0.5ml 100X Denhardt′s，0.1ml 10％SDS。将125ul鱼精DNA/酵母tRNA(10mg/ml)煮沸5分钟，立即冷却于碎冰中，加入4.875ml杂交A液，混合后，其中4ml作为预杂交液，1ml留作制备杂交液。]滴在组织切片上，然后水平放置于湿盒内，60℃ 4小时。
(4)取适量Dig标记的反义RNA探针和有义RNA探针(探针的标记参照Dig RNALabeling Kit，宝灵曼公司)，分别加入等量的甲酰胺，煮沸30秒，立即冷却于碎冰中，加入适量预杂交液，充分混合即为杂交液。用吸水纸吸去切片上的预杂交液，将杂交液滴加在组织切片上，每张切片40ul，其中含1.2ug探针，探针浓度为30ng/ul(可作不同的浓度，以滴定出最佳浓度)。同时做抗体对照(不加探针，加抗体)和空白对照(探针、抗体都不加)。在杂交液上加盖玻片，切片水平放置在密封湿盒内，60℃杂交过夜。
(5)将载玻片置4×SSC中去掉盖玻片，再以4×SSC洗四次，每次5分钟，于含有20ug/ml RNase A的RNase缓冲液(含0.5M NaCl的TE)中37℃消化30分钟，再于RNase缓冲液中30℃吸30分钟，于2×SSC中50℃洗2次，每次15分钟，于0.1×SSC中50℃洗2次，每次15分钟。
(6)切片置TBS(100mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl)中洗5分钟，将含有0.5％封闭剂(宝灵曼公司)的封闭液滴在组织切片上，室温封闭1小时，吸去封闭液，滴加1∶1000(可滴定)封闭液稀释的Anti-Dig-AP抗体，室温结合90分钟或4℃过夜，TBS洗4次，每次5分钟。切片置于显色缓冲液CDS(100mM Tris-HClpH 9.5，100mM NaCl，50mM MgCl2)中5分钟，将显色液[每ml含4.5ul氮蓝四唑(nitroblue tetrazolium(NBT)，75mg/ml)，3.5ul 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate(BCIP)，50mg/ml)，2ul 1MLevamisole，CDS 990ul]滴于组织切片上，置于避光湿盒内，37℃显色1-5小时或室温显色过夜。显色后以TE pH 8.0洗3次，每次5分钟，终止反应。再以双蒸水洗5分钟，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。经显微镜观察，Binlb定位在大鼠附睾头部中央的上皮细胞中(如图5B-E所示)。
实施例7Binlb在大鼠发育过程中的变化Binlb在大鼠发育过程中的变化的Northern印迹分析方法同实施例5，RNA样品提取自15天龄大鼠的附睾头、30、45、60、120、270、720天龄大鼠的附睾头、附睾体和附睾尾。
结果表明，Binlb的表达水平在性成熟期(包括性活跃期)达到最高，然后逐渐下降(如图5F所示)。这提示Binlb与男性精子成熟有关，并可能可以调控Binlb进而实现男性避孕。
实施例8Binlb的表达受激素等小分子的调控在该实施例中，通过EDS模型观察到Binlb的表达至少是部分受雄激素正调控的。
用二甲亚砜-水(1∶3，v/v)中的EDS(7.5mg/100g体重)，对成年Sprague-Dawley大鼠进行腹膜内注射一次。在之后间隔1天，3天，7天，14天，21天，28天，42天等不同时间，将大鼠杀死。另一组未注射EDS的大鼠也被杀死，作为空白对照。从大鼠附睾头部区域抽提的总RNA(20微克)，用1.2％甲醛-琼脂糖凝胶电泳分级，印迹于Hybond+尼龙滤膜，然后再依次与Binlb 3′端cDNA探针和18s核糖体RNA探针杂交。
在注射EDS后，雄激素的分泌会受抑制而下降，但约2周后雄激素的分泌又会恢复。与雄激素水平的变化相比，可以看出Binlb的表达受雄激素的正调控(图6A和6B)。
这提示，可以通过激素小分子来影响Binlb基因的表达，从而调控精子的成熟，进而为设计男性避孕药开辟了新途径。
实施例9Binlb是一个天然抗菌肽上述的一系列研究提示，Binlb是β-防卫素家族的一个成员且与精子成熟相关。在该实施例中，证实了Binlb的抗菌活性。
为了验证Binlb杀菌功能，检验了大鼠附睾头部细胞培养的分泌物的杀菌功能。100CFU(colony forming units)的大肠杆菌(E.coli)与大鼠附睾头部和尾部的上皮细胞分别共培养。16个小时以后，收集细胞的培养液，用来检测杀菌活力，发现头部上皮细胞的培养液有很强的杀菌活力而尾部的则无(如图7A所示)。这首先肯定了附睾头部细胞的分泌物有杀菌活力。
虽然Binlb表达在附睾的头部，但为了确定杀菌活力是否属于Binlb蛋白，本发明人在与大肠杆菌共培养之前，先加入Binlb的反义RNA，用以阻断Binlb的表达。结果发现，Binlb的反义RNA来抑制Binlb蛋白的产生后，附睾头部细胞的分泌物的杀菌活力随之消失，从而证实了Binlb的抗菌性。(如图7B所示)。
综上所述，Binlb蛋白为一未见报道的属于β-防卫素家族的新型天然抗菌肽。
实施例10Binlb的表达受炎症上调将大鼠输精管结扎，引起附睾中精子堆积而发生炎症感染时，附睾头部BinlbmRNA比结扎前增加约3倍，而在尾部则无任何改变(如图7C)。这表明，Binlb的表达受炎症上调。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(ii)发明名称新的天然抗菌肽、其编码序列及用途(iii)序列数目6(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度385bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GGACACCCAG TCATCAGTCA CATCTGCTTT CCTGCACAGA GAGAGCGCCA TAAAACATGA60AGGTTTTGTT ACTCTTTGCT GTTTTCTTCT GCTTGGTCCA AAGAAACTCA GGGGACATAC120CACCTGGAAT CAGAAACACC GTGTGCTTCA TGCAGCGGGG CCACTGTAGG CTCTTCATGT180GCCGTTCTGG GGAGAGAAAG GGGGATATTT GCTCTGACCC CTGGAACAGA TGCTGCGTAT240CCAGTTCCAT TAAAAACAGA TGATAGAAGA CTCATTGGAA GATCTGAGAT GTGGGGTGCA300AGCTCTTGGA AGCTAGAGAC CTGGAAGCAC CCCAAAGGCT TTGAGTATGT GTGGCTAATG360GTGCGTGCTC AATAAACACT TGCTG 385(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度68个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2MKVLLLFAVF FCLVQRNSGD IPPGIRNTVC FMQRGHCRLF MCRSGERKGD 50ICSDPWNRCC VSSSIKNR68(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度45个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO3GIRNTVCFMQ RGHCRLFMCR SGERKGDICS DPWNRCCVSS SIKNR 45(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度1696碱基(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO4GGACACCCAG TCATCAGTCA CATCTGCTTT CCTGCACAGA GAGAGCGCCA TAAAACATGA 60AGGTTTTGTT ACTCTTTGCT GTTTTCTTCT GCTTGGTCCA AAGAAACTCA Ggtaaatgtc 120ttctgagtag ccctggagaa ggcaggatgc ccttttaggt ttgtagacca cattgaggtg 180tgtccaggta tcaacattgg gcacagatgg tgggccactc tggggctcag ggtcggacca 240ctttcctaac gaagaggttt tattttgatt tttttttgtt tgttcatttg tcaagagttg 300caaattttac agcacggaga cacagaggcc tatattctcc attgtgaata agaaggtctg 360attgtaactt gagagtttat tcaggacaga attacagccg tacctgtgtc aaaagtgtaa 420ttttactgcc tcgctgtgag cagagaaggt gttcacattt atgccccttc cctacccatt 480acatccacag aacaccagat gtatgcttta aatgaatttt caaatgagag aaaaataggt 540tcctttaaga aagctagagt ccaggtcctg aagccttgaa ttgctggcag ttctgtcaag 600gtggactaca cccacatctc catgaacctt cccaaccatg gtaaaccgga tgaacacagt 660atcacaaatc agtccccagc tgaagtccgg ctattgcagg agaccagttt cctaaatgtt 720acaggcatag gttgggccgc tgttgctttt taacacaggg tgtgcaacat tgttaaaaag 780gtttttttta accatctctt tcccatggtg ctttcttttg ggggactcta gttgtttttg 840ttttgtttta ttgttttact tagaaggaca cacaagacac attgttatct ttcttcttct 900tattgtagtc ataagagtga aaacccaacc atgagctgag acagacccgc tcctaacttt 960tctatggcct gagacccagc tcctgttatt ctgttctgtt ttctttttct tttttaattt 1020atttatttta tgtatgtgag tacagtgtca ctgtcttcag acacaccaga agagggtgtc 1080agatcccatt acagatggtt gtgagccacc atgtggttgc tgggaattga actcgggacc 1140tctggaagag cagtcagtgc tcttaaccgc tgagccatct ttccagcccc tgttctgttt 1200tcttaaatac cactccccca ctccacaatg tacctctatc tctgggcagc tgcagagccc 1260tggcctgcaa tgggctaggt gacttcacac tcagtctgtc atgccatccc cgaaacacca 1320cgagatataa atggttgcta ttgaaagcta aggaggaaaa tctcagtgac gccgaaactc 1380tggaagagtg gagcagattc ttcgagaggg gctgggggct gggggctggg ggctggagcc 1440actgttttat ctcagtctgt tgtttccaca gGGGACATAC CACCTGGAAT CAGAAACACC 1500GTGTGCTTCA TGCAGCGGGG CCACTGTAGG CTCTTCATGT GCCGTTCTGG GGAGAGAAAG 1560GGGGATATTT GCTCTGACCC CTGGAACAGA TGCTGCGTAT CCAGTTCCAT TAAAAACAGA 1620TGATAGAAGA CTCATTGGAA GATCTGAGAT GTGGGGTGCA AGCTCTTGGA AGCTAGAGAC1680CTGGAAGCAC CCCAAA1696(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度21碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5AATGGTACCG TGACGTGGTC C 21(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度21碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6TGGCCCCGCT GCATGAAGCA C21(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度20碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7GGACACCCAG TCATCAGTCA 20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度20碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8CAGCAAGTGT TTATTGAGCA 20(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9GGACACCCAG TCATCAGTCA CAT 23(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO10TTTGGGGTGC TTCCAGGTCT CT2权利要求
1.一种分离或纯化的多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列。
3.一种分离或纯化的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码SEQ ID NO2或3所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
7.一种具有Binlb蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达Binlb蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有Binlb蛋白活性的多肽。
8.一种能与权利要求1所述的Binlb蛋白特异性结合的抗体。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
10.一种杀菌剂，其特征在于，它含有有效量的权利要求1所述的多肽。
全文摘要
本发明提供了一种新的Binlb蛋白,以及编码Binlb蛋白的多核苷酸。Binlb蛋白不仅是天然抗菌肽,而且还与精子成熟等有关。本发明还公开了该Binlb蛋白及其核酸的制法和用途。此Binlb蛋白用于治疗多种疾病如泌尿生殖系统感染等。本发明还提供了含Binlb蛋白的药物组合物。
文档编号C07K14/47GK1367180SQ0110528
公开日2002年9月4日 申请日期2001年1月22日 优先权日2001年1月22日
发明者张永莲, 陈小章, 李鹏, 何彬, 苏兆祥, 钟耀华, 商权, 张友端 申请人:中国科学院上海生物化学研究所