专利名称：大蹼铃蟾神经营养因子及其制备方法和其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)神经营养因子及其制备方法和其基因，属生物医学领域。
脑的增龄性变化从20多岁就已经开始，到50多岁后在有些脑区如额叶皮层呈现明显的退行性变化，在黑质和蓝斑的神经细胞的数量减少到30％-40％。与脑的老年性退行性变化有关的疾病主要有帕金森氏病，阿尔茨海默病，肌萎缩性侧索硬化等疾病。脑的老年性退行性变化主要表现为智能减退和精神功能障碍，称为老年性痴呆。动物实验研究表明，神经营养因子(或者叫神经营养肽)对神经细胞具有保护作用，可以减缓神经细胞的衰老和修复神经细胞的损伤，增强学习与记忆能力。因此，神经营养因子已成为开发新型预防和治疗老年性疾病药物的热点。
很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。大蹼铃蟾主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点。据文献报道，国外学者已从东方铃蟾(Bombina orientalis)中分离出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。从蟾蜍和林蛙皮肤中得到的降压肽类物质bufokinin和ranakinin有舒张血管和降血压的作用，已在治疗心血管疾病方面显示出诱人的应用前景；最近，一种两栖类核酸酶对HIV的选择性抑制作用更引起了人们对两栖类活性物质的注意。近十几年对170多种两栖类皮肤活性肽和类似物进行了筛选，证明有40多种活性肽有较好的药物开发前景。
发明人将本发明的大蹼铃蟾神经营养因子全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽，与从欧洲花铃蟾((Bombina variegata)皮肤中得到的神经营养肽Bv8有7个氨基酸的差异，也与我们从大蹼铃蟾中发现的另一种神经营养肽有6个氨基酸的差异。发明人将本发明的神经营养因子编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种主要用于开发减缓神经细胞衰老和修复神经细胞损伤，增强学习记忆和治疗老年性疾病药物的大蹼铃蟾神经营养因子及其制备方法和其基因。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案大蹼铃蟾神经营养因子，为我们从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombinamaxima)皮肤分泌物中分离得到的第二个神经营养因子，它由77个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量8125.8，等电点8.6，多肽氨基酸全序列一级结构为丙氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-甘氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-色氨酸-丝氨酸-精氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-组氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸-组氨酸-赖氨酸-缬氨酸-脯氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-赖氨酸-精氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-赖氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-丝氨酸。
AVITGACDRDVQCGSGTCCAASLWSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCKSGLTCSKSGEKFQCS大蹼铃蟾神经营养因子的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)，冷冻干燥后，分子筛凝胶过滤分离，收取所得峰III再经高效液相色谱(HPLC)反相C18柱分离纯化，取第二步HPLC反相C18柱层析分离出的峰(箭头所示)即可。然后用HPLC方法鉴定其纯度，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
大蹼铃蟾神经营养因子具有显著的神经细胞保护营养作用，作为制备神经性疾病，抗衰老，增强学习记忆治疗药物的应用。
大蹼铃蟾神经营养因子基因的克隆包括大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，在根据欧洲花铃蟾神经营养因子Bv8信号肽序列的基础上设计引物，利用PCR方法筛选神经营养因子基因。根据信号肽序列所设计的扩增引物LR52，其长度为24个核苷酸，其序列为5’TTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGC3’，PCR另一扩增引物为位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码大蹼铃蟾神经营养因子的基因由447个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为CAGAGGCTGAGACAGACTTATACAAAGTATTGCTGCAGGTCTCCAAGAACTTTAGCCCTGAGGTTTAGTTTTACTATTCAGTTTATCATGAAGTGTTTTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGCTTGTCATAGCCTTCTCACATGGTGCTGTCATCACTGGGGCATGTGATAGAGACGTACAGTGCGGGTCAGGTACCTGTTGTGCTGCCAGTTTGTGGTCACGTAACATCAGATTTTGCGTCCCACTTGGAAATAACGGGGAGGAATGTCACCCAGCCAGCCATAAGGTGCCTTATAATGGAAAGCGGTTGAGTTCCTTGTGCCCCTGCAAGTCCGGACTAACTTGCTCCAAGTCTGGAGAAAAATTTCAGTGTTCTTAATAGTGATATTAAGTGAAAACGTAAAAGGACAATAAAACATGAGCCTTGTAAATTAAAAAAAAAAAAAAA其中编码成熟大蹼铃蟾神经营养因子为第145-375位核苷酸，其氨基酸序列为AVITGACDRDVQCGSGTCCAASLWSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCKSGLTCSKSGEKFQCS大蹼铃蟾神经营养因子基因作为基因工程制备神经营养因子的应用。下面结合附图用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
图1为本发明大蹼铃蟾神经营养因子的Sephadex G-50凝胶过滤层析图。
图2为本发明大蹼铃蟾神经营养因子的HPLC反相C18柱层析图。
图3为本发明大蹼铃蟾神经营养因子基因核苷酸序列。
图4为本发明成熟大蹼铃蟾神经营养因子氨基酸序列。
实施例一1，制备大蹼铃蟾神经营养因子活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存。
第一步SephadexG-50凝胶过滤按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；上样品于经0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液平衡的SephadexG-50凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，经0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液洗脱，收集峰III。
第二步，反相高压液相层析(RP-HPLC)SephadexG-50凝胶过滤得到的峰III以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰(箭头标记)即大蹼铃蟾神经营养因子。
2.纯化的大蹼铃蟾神经营养因子用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
通过上述方法制备的大蹼铃蟾神经营养因子，为我们从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的第二个神经营养因子，它由77个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量8125.8，等电点8.6，多肽氨基酸全序列一级结构为丙氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-甘氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-色氨酸-丝氨酸-精氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-组氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸-组氨酸-赖氨酸-缬氨酸-脯氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-赖氨酸-精氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-赖氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-丝氨酸。
AVITGACDRDVQCGSGTCCAASLWSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCKSGLTCSKSGEKFQCS大蹼铃蟾神经营养因子具有显著的神经细胞保护营养作用，作为制备神经性疾病，抗衰老，增强学习记忆治疗药物的应用。
实施例二1，大蹼铃蟾神经营养因子基因克隆1)，大蹼铃蟾皮肤总RNA提取活体大蹼铃蟾用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBC0BRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟，加入等体积酚/氯仿溶液，，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀，上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为大蹼铃蟾皮肤总RNA。
2)，大蹼铃蟾皮肤mRNA的纯化采用美国PROMEGA公司的mRNA分离纯化试剂盒。取大蹼铃蟾皮肤总RNA500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠(SA-PMP)的洗涤将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的大蹼铃蟾皮肤mRNA。加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异戊醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
3)，大蹼铃蟾皮肤cDNA文库构建采用美国GIBC0BRL公司SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒，但方法操作有改进。cDNA第一链合成(mRNA反转录)，于1.5ml试管中加入2μl Not I引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl 5X第一链合成缓冲液，2μl 0.1MDTT，1μl 10mM dNTP混合物，在加入1μl SuperScript II反转录酶，于37℃保温1小时后放入冰浴。cDNA第二链合成，在第一链合成试管中加入95μl DEPC水，30μl 5X第二链合成缓冲液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μlT4 DNA多聚酶继续保温5分钟。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移到干净试管中，加入70μl 7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。SalI adapter的连接，上述沉淀溶于25μlDEPC水中，加入10μl 5XT4 DNA连接酶缓冲液，10μl SalI adapter，5μl T4 DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶水解，于cDNA溶液中加入5μl React 3缓冲液，4μl Not I酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μlTEN缓冲液中。将cDNA样品过DNA分级分离柱(试剂盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的组份合并，体积为200μl，加入5ml酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸铵，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μlTEN缓冲液中。合成的cDNA连接到pSPORT 1质粒，取10μl溶解于TEN缓冲液中的cDNA，加入4μl 5XT4 DNA连接酶缓冲液，1μl pSPORT 1质粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μlDEPC水，1μl T4 DNA连接酶，反应体积20μl，室温3小时，可准备转化大肠杆菌HB101感受态细胞。感受态细胞的制备，挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于，50ml LB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液540nm OD值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl2悬浮，再2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl2重悬，分装后置冰浴内备用。连接产物的转化取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿(15cm直径)，37℃培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10％甘油冻存。构建的cDNA含4×104个单独克隆。
4)，大蹼铃蟾神经营养因子基因克隆筛选利用PCR筛选法筛选大蹼铃蟾神经营养因子基因，所用正向引物LR52，根据欧洲花铃蟾神经营养因子Bv8的编码信号肽的核苷酸序列所设计，长度为24个核苷酸，其序列为5’TTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGC3’；和位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。PCR反应在如下条件下进行94℃1分钟，45℃1分钟和72℃1分钟，30个循环。首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板(Costar)上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl)，37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。
5)，大蹼铃蟾神经营养因子基因序列测定和结果提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystems373A全自动核昔酸序列测定仪，测序引物为SP6和T7启动子，SP6启动子序列5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’，T7启动子序列5 TAATACGACTCACTATAGGGA3’。基因测序结果自5’端至3’端(见图3)。图3所示大蹼铃蟾神经营养因子基因核苷酸的序列表为序列长度，447个碱基，序列类型核酸，链数单链，拓扑学直链状，序列种类cDNA，来源大蹼铃蟾皮肤，序列特征1编码成熟神经营养因子为第145-375位核苷酸，其氨基酸序列见图4，大蹼铃蟾神经营养因子基因作为基因工程制备神经营养因子的应用。
权利要求
1，大蹼铃蟾神经营养因子，其特征是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的由77个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量8125.8，等电点8.6，多肽氨基酸全序列一级结构为丙氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-甘氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-色氨酸-丝氨酸-精氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-组氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸-组氨酸-赖氨酸-缬氨酸-脯氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-赖氨酸-精氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-赖氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-丝氨酸。
2，大蹼铃蟾神经营养因子的制备方法，其特征是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。
3，大蹼铃蟾神经营养因子基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由447个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为CAGAGGCTGAGACAGACTTATACAAAGTATTGCTGCAGGTCTCCAAGAACTTTAGCCCTGAGGTTTAGTTTTACTATTCAGTTTATCATGAAGTGTTTTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGCTTGTCATAGCCTTCTCACATGGTGCTGTCATCACTGGGGCATGTGATAGAGACGTACAGTGCGGGTCAGGTACCTGTTGTGCTGCCAGTTTGTGGTCACGTAACATCAGATTTTGCGTCCCACTTGGAAATAACGGGGAGGAATGTCACCCAGCCAGCCATAAGGTGCCTTATAATGGAAAGCGGTTGAGTTCCTTGTGCCCCTGCAAGTCCGGACTAACTTGCTCCAAGTCTGGAGAAAAATTTCAGTGTTCTTAATAGTGATATTAAGTGAAAACGTAAAAGGACAATAAAACATGAGCCTTGTAAATTAAAAAAAAAAAAAAA
4，根据权利要求3所述的大蹼铃蟾神经营养因子基因核苷酸序列，其特征在于，编码成熟大蹼铃蟾神经营养因子为第145-375位核苷酸，其氨基酸序列为AVITGACDRDVQCGSGTCCAASLWSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCKSGLTCSKSGEKFQCS
全文摘要
本发明涉及大蹼铃蟾神经营养因子及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。其神经营养因子为从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的由77个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量8125.8，等电点8.6，多肽氨基酸全序列一级结构为AVITGACDRDVQCGSGTCCAASLWSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCKSGLTCSKSGEKFQCS。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。编码神经营养因子的基因由447个核苷酸组成，其中编码成熟神经营养因子为第145－375位核苷酸。其基因作为基因工程制备神经营养因子的应用。
文档编号C07K14/435GK1390850SQ01108520
公开日2003年1月15日 申请日期2001年6月8日 优先权日2001年6月8日
发明者张云, 赖仞, 刘衡, 李文辉 申请人:中国科学院昆明动物研究所