专利名称：用于阻断交感神经的阿发第一亚型受体的巴福洛麦迪的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可以阻断交感神经的阿发第一亚型受体(α1A-AP)的药剂，特别是关于一种可用来改善因α1A-AP过剩所引致的疾病的药剂。
背景技术：
目前市面上以巴福洛麦迪(buflomedil)为原料所推出的产品，主要是专供糖尿病并发的末梢血管循环障碍治疗使用。由于巴福洛麦迪具有血管舒张作用(Vanhoutte PM，Aarhus LL，Coen E，et al.(1983)Effects of buflomedil onthe responsiveness of canine vascular smooth muscle.J. Pharmacol.Exp.Ther.227613-620)，因此，也用作为雷诺氏症(Raynaud’s Phenomenon)或间歇性跛行(intermittent claudication)的治疗。
学理上，巴福洛麦迪是一种交感神经受体的阻断药(Toda N，Okunishi H，Okamura T，et al(1983)Effect of buflomedil on isolated dogarteries.Arch.Int.Pharmacodyn.et Therap.266117-130)，可抑制造成血管收缩的阿发型受体(α1A-AR)来产生作用。而且，它又有很好的末梢血管扩张功能。然而，巴福洛麦迪却没有显著的血压下降效果(Vanhoutte PM.(1984)Cardiovascular pharmacology of buflomedil.Bibliotheca Cardiol.38209-221)，其原因与机制则是一项尚未解明的谜题。
最近，交感神经的阿发第一型受体(α1A-AR)已再被区分为三个亚型，称为α1A-AR、α1B-AR、α1D-AR等三大类(Hieble JP，Bylund DB，Clarke DE，et al.(1995)Intemational Union of Pharmacology.X.Recommendation fornomenclature of alpha 1-adrenoceptorsconsensus update.Pharmacol.Rev.47267-270)。它们都存在于血管壁，只是，α1B-AR和α1A-AR等两种受体的阻断药较容易产生血压下降的效果(Zhong H，Minneman KP.(1999)al-Adrenoceptorsubtypes.Eur.J；Pharmacol.375261-276)。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于阻断交感神经的阿发第一亚型受体(α1A-AR)的药剂，该药剂包括巴福洛麦迪。
这种药剂可以用以改善因α1A-AR过剩所引致的疾病。
该药剂还可以用以改善前列腺肥大(B.P.H.)。
图1为巴福洛(Buflo)对刺激药苯肾上腺素在大白鼠离体前列腺的收缩抑制作用曲线图。
图2为巴福洛取代[3H]WB-4101在Wistar品系大白鼠离体前列腺对α1A-AR的结合进行α1A-AR的结合曲线图。
图3为巴福洛取代[3H]WB-4101同位素标记结合物在人体前列腺对α1A-AR的结合曲线图。
图4为巴福洛取代[3H]普拉唑新(parzoin)在C2C12细胞对α1A-AR的结合曲线图。
具体实施例方式
实施例实验方法一、实验动物来源购自国立成功大学医学院动物中心的Wistar品系的雄性大白鼠，体重约200-250g之间。同样地，高血压老鼠(SHR)也是购自该中心，年龄在8周以上。两种老鼠皆饲养于该中心，以空调维持室温在25±1℃的动物室，光照时间与黑暗时间各为12小时，让老鼠自由的进食与饮水。
二、给药的方法将“巴福洛(Buflo)”(巴福洛Buflo是信东化学工业股份有限公司以巴福洛麦迪buflomedil为原料所推出的产品)，溶于生理食盐水后，经由给药管灌食到老鼠的胃部；随着动物的体重的差异，灌食不同容量的药液而将灌食量维持在需要的浓度(mg/kg)，以符合临床的使用量。
三、老鼠血压变化的检测本实验使用小动物非侵害式血压仪(UR-5000)，以光电式容积振动法的原理对老鼠的尾动脉压进行非侵害式的自动计测，而记录出老鼠的血压变化。首先，将老鼠放于37℃的预备用保温箱，30分钟后将老鼠移至测定箱(37℃)的CUEF侦测固定架上，头部放入套嘴器，尾巴放入CUFF侦测器，连续测定血压值四次，取平均值。然后，经口灌食药物，依相同方法在30分钟后，开始记录老鼠的血压变化。
四、离体前列腺的实验首先，以腹腔注射戊巴比妥(pentobarbital)35mg/kg将老鼠麻醉，沿腹腔中线剪开皮肤及肌肉，取出前列腺。剪成长约0.9cm的条片，供检测上下收缩之用。多形波动记录器首先以1g砝码挂在力量传感器上，校正记录纸的刻度。校正完成后，将剪好的前列腺条片，以挖心夹夹住，悬挂于力量转输器中，记录等长收缩。循环水流恒温槽内为pH7.4的Krebs-Herseleit溶液，温度维持37℃，并且供给95％O2+5％CO2。将基本张力调整为0.5g并且每十至十五分换一次缓冲溶液，约平衡一小时后，才开始进行实验。将循环水流恒温槽内的缓冲溶液定量为10ml，给予适当浓度的药物来刺激；所产生的收缩变化，则借由力量传感器记录在多形波动记录器(ADI Instruments)，再显现于CHART程式的电脑萤幕。本次实验，以苯肾上腺素(phenylephrine)为刺激药，借由浓度累进添加法，逐渐注入循环水流恒温槽。然后，以最大的收缩反应作为100％，求出各个浓度的相对百分比，并绘成“浓度反应曲线”。清流刺激药后约30分，加入测试的药物，使之与前列腺反应20分钟后，再重复上述的累进添加刺激药；比较给药与否的差异。
五、受体结合的取代试验(Displacement of radioligand binding study)依照目前常用的方法(Sladeczek F，Kiek CJ，Bockaert J，et al.(1989)Non classical，multiple-site interaction of[3H]普拉唑新with the al-adrenoceptorof intact BC3H1 cells.Br.J.Pharmacol 971101-1110)，加以修饰所得。取Wistar品是大白鼠的前腺列或使用成功大学附属医院泌尿科所提供的病人摘除的前列腺，加入10ml Kreb’s溶液，均质一分钟。以2850×g的转速，离心10分钟，取上清液；再以48000×g的超高速，离心20分钟，取沉淀物(即细胞膜)。加入适量的Kreb’s溶液后，取0.5ml含细胞膜的Kreb’s溶液与100μl的测试药液(Buflo或其他)反应30分钟，再加入100μl[3H]-普拉唑新反应30分钟，以插在冰上为终止反应。将反应后的药液置于GF/B滤纸(Whatman)，利用抽气法过滤，再用2ml冰的纯水洗三次，洗去未结合的同位素物质。取滤纸加入10ml同位素闪烁液(sonicillation liquid)以β计数器来计数(cpm)。以β计数器计数(cpm)而得的值为总结合的量；控制组(以标准品反应者)所得的值为非特异性结合的量。经由总结合-非特异性结合＝特异性结合的方式，计算得到特异的结合部位的量。然后，以没有添加测试药的组为100％，Buflo或其他测试药在各种浓度所得的计数与的换算成的相对百分比，划出取代曲线。
六、C2C12细胞的制备C2C12(大鼠成肌细胞)细胞用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养液来培养(Sheriff S，Fischer JE，Balasubramaniam A，(1992)Amylin inhibits insulin-stimulated glucose uptake inC2C12muscle cell line through a cholera-toxin-sensitive mechanism.Biochim.Biophys.Acta.1136219-222)；将细胞培养在培养液，生长在直径10公分的培养皿内，以含有5％CO2及95％空气，且温度保持在37℃的培养箱中培养的。直至增殖到整个培养皿的八分满，以0.05％胰蛋白酶，将细胞冲下及以13000rpm离心五分钟，丢弃上清液，加入适量的培养液作继代培养。
以0.05％胰蛋白酶将长到八分满的C2C12细胞冲下，并离心13000rpm，三分钟上清液，再加入适量的培养液并混合均匀，得到细胞悬浮液。取20μl细胞悬浮液和180μl的0.04％台盼蓝的磷酸盐缓冲液混合均匀，此时取出20μl混合液，稀释即为10倍数，利用血球计数器测知细胞数目及存活率。只有细胞数目在每毫升106以上及存活率在80％以上的细胞，才可供实验进行。
每毫升活的细胞数目＝细胞数目和/8×104×10总细胞数＝每毫升活的细胞数目×原始悬浮液总体积细胞存活率＝活的细胞数/总细胞数×100％(1)受体结合试验收集己长八分满的C2C12细胞，加入20ml Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，。以200×g的速度，离心5分钟，取上清液；再以48000×g的超高速，离心20分钟，取沉淀物(即细胞膜)。加入适量的Tris-HCl缓冲液后，取0.5ml含细胞膜的Tris-HCl缓冲液与100μl测试的药液反应30分钟，再加入100μl[3H]-普拉唑新反应30分钟，以插在冰上为终止反应。利用抽气法过滤，即将反应后的药液置于GF/B滤纸(Whatman)过滤，再用2ml冰的纯水洗三次，洗去未结合的同位素物质。取滤钳加入10ml的同位素闪烁液后，再以β计数器来计数(cpm)。计算表示方法，同上述的前列腺组织。
(2)药物影响葡萄糖吸入作用参考学者的方法(Klin A，Ramlal T.(1987)Protein kinase C is not requiredfor insulin stimulation of hexose uptake in muscle cells in culture.Biochem.J.242131-136)，加以修饰所得。将前述方法取得的细胞悬浮液，制成浓度约每毫升含106细胞的数目。放入37℃恒温水槽反应30分钟，并加以振荡(120转/分钟)。先加入20μl的葡萄糖(5×10-5M)及等量的阻断剂；若不加阻断剂，则以20μl溶液(DMEM)取代。加入20μl的细胞悬浮液后，开始计时，此时当成零分钟，于37℃恒温水槽反应30分钟，期间并加以振荡。再加入20μl的作用剂，继续反应30分钟。最后加入20μl的0.05mM 2-[14C]-脱氧-D-葡萄糖(323mCi/mmol)；此时，总反应体积为100μl；同位素的最终浓度为0.01mM。于37℃恒温水槽反应5分钟后，将其插入冰块来终止反应。以13000rpm离心3分钟后，用50μl DMEM洗去细胞外粘上的放射线。重复步骤8，清洗三次。加入50μl NaOH溶解细胞。一小时后，再以50μl HCl中和。加入1ml的同位素闪烁液充分振荡后，用β计数器对放射性进行计数。决定非特异性2-脱氧葡萄糖吸入的反应方法是通过加入50μM细胞松弛素B得到的。实验所表示的值皆为特异性吸入，是从总吸入中扣除非特异性吸入的数值得到的。
七、统计分析实验所得的结果以平均值±标准误差(mean±SE)来表示，再以student’st检验来评估两者间的差异，多组比较时则使用ANOVA和Dunnett’s Post-hoc检验来评估之间的差异。P＜0.05，即视为有显著的差异。
实验结果一、“巴福洛”对老鼠的离体前列腺的作用请参照图1，对于苯肾上腺素在大白鼠的离体前列腺所导致的收缩，巴福洛具有阻断的作用；这项效果以浓度相关性出现，另外，目前常用的α1A-AR阻断药汤舒罗新(tamsulosin)也出现竞争性阻断的作用。在同样的浓度时，以0.1μM为例，巴福洛的阻断作用较汤舒罗新为强。可是，巴福洛及汤舒罗新在使用浓度的范围内，对前列腺本身的张力并无任何的影响。
图1为巴福洛(Buflo)对刺激药苯肾上腺素在大白鼠离体前列腺所引起收缩的抑制作用。以汤舒罗新为对照标准，巴福洛会因给药浓度的增高而使苯肾上腺素的剂量相关收缩曲线(dose-response curve)向右平行移动；一种竞争性阻断的变化。本图所示数值(平均值±标准误差)是得自6-8只动物的结果。
二、“巴福洛”对α1A-AR具有结合能力的作用取大白鼠的前列腺，研磨均匀并制得细胞膜，用于同位素标记结合物(radioligand)的[3H]WB-4101进行α1A-AR的结合，得到特异的结合量。由图2可知，巴福洛会取代这项同位素标记结合物对α1A-AR的结合；取代能力会因巴福洛的浓度增高而变为更强。由取代曲线图可知，巴福洛的有效浓度约在2.5μM左右。
另外，使用病人的前列腺，由成大附属医院泌尿科医师在处理前列腺肥大(B.P.H.)手术所提供，依照上述的方法制得细胞膜，用于同位素标记结合物的[3H]WB-4101进行α1A-AR的结合。由图3可知，巴福洛会取代这项同位素标记结合物在人体前列腺对α1A-AR的结合；取代能力会因巴福洛的浓度增高而变为更强。由取代曲线图可知，巴福洛的有效浓度约在0.25μM左右。另外，若将同位素标记结合物换成[3H]普拉唑新的话，巴福洛的取代有效浓度也在0.35μM左右。
如图2所示，巴福洛取代[3H]WB-4101在大白鼠离体前列腺对α1A-AR的结合进行α1A-AR的结合。将所得同位素的量(总结合量)扣除以0.1μMWB-4101处理所得的同位素量(非特异性结合)，即可得到特异的结合量。图2是以溶剂处理所得的结合量为100％，加入不同浓度的巴福洛所得以相对百分率表示；由三次实验所得的平均值。由图可知，巴福洛会因浓度增高而更有效地取代这项同位素标记物的结合。
如图3所示，巴福洛取代[3H]WB-4101这项同位素标记结合物在人体前列腺对α1A-AR的结合。本图的实验方法及表示方式皆同于图2，只是，使用的样品为成大附属医院泌尿科医师提供的。
三、使用培养的细胞评估“巴福洛”对α1A-AR的阻断作用以培养的细胞(C2C12Cell)会因α1A-AR的活化使葡萄糖的摄入更为增强的原理，本研究使用10μM的苯肾上腺素来刺激α1A-AR。由表一可知，10μM的苯肾上腺素可使葡萄糖在细胞(C2C12Cell)的摄入上升到116％左右。阻断α1A-AR的药物WB-4101自10nM开始，以浓度相关的作用方式，抑制了苯肾上腺素的作用。同样的，巴福洛也自10nM开始，以浓度相关的作用方式，抑制了苯肾上腺素的作用(表一)。另外，临床用药的汤舒罗新则也在1μM的高浓度才将这项苯肾上腺素的作用抑制到103.95±4.7％(N＝6)。
为了验证巴福洛在这项培养的细胞(C2C12Cell)也会结合到α1A-AR，因此，进行受体结合的取代实验。请参照图4，使用[3H]普拉唑新为同位素标记结合物，依照上述的方法，看到巴福洛自10μM开始，会因浓度增高而作用更强的方式，取代了[3H]普拉唑新在细胞(C2C12Cell)对α1A-AR的结合；有效的取代浓度也在0.52μM左右。
表一、巴福洛对由于刺激α1A-AR在细胞(C2C12Cell)所导致葡萄糖摄入增强的抑制作用。
本表的数值(平均值±标准误差)是得自6次细胞测试的结果；以普通的葡萄糖摄入作为100％，通过苯肾上腺素10μM刺激所得的变化。Vehicle是指用相同量溶剂所得的增加值，用与两种药物(Buflo及WB-4101)在所示浓度前处理的改变值相互比较；*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001 vs.vehicle。
如图4所示，巴福洛取代[3H]普拉唑新在细胞(C2C12Cell)对α1A-AR的结合。图4的实验方法及表示方式均同于图2，只是，使用的样品为培养细胞(C2C12Cell)的细胞膜蛋白。由图4可知巴福洛会因浓度增高而作用更强的方式取代了[3H]普拉唑新的结合。
四、口服“巴福洛”对老鼠产生的血压作用以灌食将“巴福洛”注入到高血压老鼠(SHR)的体内，既使到了150mg/kg的高量，口服120分钟后所产生的血压或心跳次数，皆与给药前的数值相似(表二)；看不到统计学上的差异(p＞0.05)。同样的情形，在普通老鼠也可看到，既使到了150mg/kg的高量，口服120分钟后，对血压或心跳次数，皆无影响(表二)。
表二、巴福洛对老鼠的血压或心跳次数的影响。
本表的数值(平均值士标准误差)是得自8只的高血压老鼠或6只的普通老鼠，以非侵害性的仪器检测清醒的老鼠所得血压(mmHg)及心跳次数(beat/min)。实验的老鼠皆经口灌食150mg/kg量的巴福洛，然后，每隔30分钟检测一次；所得的数值都与给药前的数值没有差异(P＞0.05)。
实验讨论经由本次实验的结果，可知“巴福洛”对交感神经的阿发第一亚型受体(α1A-AR)具有专一的阻断效果。首先，在大白鼠的离体前列腺，巴福洛(buflo)会阻碍苯肾上腺素所引致的收缩。在前列腺的交感神经的阿发第一型受体，目前都认为是以α1A-AR为主(Walden PD，Durkin MM，Lepor H，et al.(1997)Localization of mRNA and receptor binding sites for the al-adrenoceptor subtypein the rat，monkey and human urinary bladder and prostate.J.urol.1571062-1038)。本项也以汤舒罗新作为标准对照品，因为汤舒罗新被认为对α1A-AR具有专一的阻断作用(Harada K，Ohmori M，Kitoh Y，et al.(1999)A comparison of the antagonistic activities of tamsulosin and terazosin againsthuman vascularα1-adrenoceptor.Jpn，J.Pharmacol.80209-215)，看到它可使苯肾上腺素的收缩反应曲线(dose-response curve)向右平行移动(图1)；显示两者为竞争型阻断(competitive antagonism)。由此可知，苯肾上腺素是α1A-AR的刺激药(Kenny BA，Miller AM，Williamson IJ，et al.(1996)Evaluationof the pharmacological selectivity profile of alpha 1 adrenoceptor antagonists atprostatic alpha 1 adrenoceptorsbinding，functional and in vivo studies.Br.J.Pharmacol 118871-878)。同样地，巴福洛也会使苯肾上腺素的收缩反应曲线向右平行移动(图1)。而且，随着巴福洛的浓度增高，更向右平行移动(图1)。因此，巴福洛对α1A-AR具有阻断作用是不容置疑者。
接着，使用受体结合的技术来看巴福洛对α1A-AR的结合能力。运用同位素标记结合物来和受体结合，药物若能减少这项结合，就显示它能占住这个受体的位置(Sladeczek F，Kiek CJ，Bockaert J，et al.(1989)Non classical，multiple-site interaction of[3H]-parzoin with the α1-adrenoceptor of intact BC3H1cells.Br.J.Pharmacol 971101-1110)。巴福洛确实能随着浓度的增高，使同位素标记结合物的结合量逐渐的减少；不论是[3H]普拉唑新或[3H]WB-4101皆同。另外，这种现象不只在大白鼠的前列腺可看到，在病人的前列腺检体也有相同作用。由此可知，巴福洛确实能结合到前列腺的α1A-AR；也更支持了“巴福洛可作为α1A-AR阻断药”的说法。
另外，为了通过活化了解巴福洛对α1A-AR的阻断是否只在前列腺，更使用了培养的细胞(C2C12Cell)；根据α1A-AR会使葡萄糖的摄入更为增强的原理(Cheng JT，Liu IM.(2000)Stimulatory effect of caffeic acid on α1A-adrenoceptorsto increase glucose uptake into cultured C2C12cells.Naunyn-Schmiedebergs Arch.Pharmacol.362122-127)，本研究使用10μM的苯肾上腺素来刺激α1A-AR。看到巴福洛与另一种以α1A-AR阻断药-的WB 4101(Minneman KP，Han C，Abel PW.(1988)Comparison of α1-adrenergic receptor subtypes distinguished bychlorethylclonidine and WB 4101.Mol.Pharmacol.33509-514)一样，会因浓度的增高而更显著的抑制了苯肾上腺素使葡萄糖摄入的作用(表一)。由此可知，巴福洛对以α1A-AR的阻断是属于一般的药理作用，而非只在前列腺。这项说法，也再度使用受体结合的取代实验(图4)得到了验证；巴福洛会有效的取代同位素标记结合物在培养细胞(C2C12Cell)的结合。
于是，想要知道巴福洛对交感神经的阿发第一受体(α1A-AR)亚型之间的影响，使用受体结合的取代实验来看α1A-AR与α1B-AR之间的差异。目前认为交感神经的阿发第一受体(α1A-AR)在前列腺以α1A-AR为主，而在脾脏则是α1B-AR较多(Zhong H，Minneman KP.(1999)α1-Adrenoceptorsubtypes.Eur.J.Pharmacol.375261-276)。以同一的同位素标记结合物来比较巴福洛对两者之间的取代差异，由日本的山田静雄博士的协助得知，巴福洛对α1A-AR的结合取代能力较对α1B-AR结合能力来得强，约1.7左右。因此，使用剂量适当，巴福洛只会对α1A-AR产生阻断而已。这项说法，由巴福洛对高血压老鼠(SHR)不会产生血压下降或心跳改变的作用可加以验证。目前相信血管收缩的调控以α1B-AR及α1D-AR为主(Zhong H，MinnemanKP.(1999)α1-Adrenoceptor subtypes. Eur.J.Pharmacol.375261-276)，而以α1A-AR的角色为辅。因此，临床使用的前列腺肥大治疗药皆以不影响血压的低量，也就是不阻断α1B-AR及α1D-AR的剂量，来抑制α1A-AR所得效果(Shibata K，Hirasawa A，Moriyama N，et al.(1996)Alpha la-adrenoceptorpolymorphismpharmacological characterizatlon and association with benignprostatic hypertrophy.Br.J，Pharmacol.1181403-1408)。本次实验所用的高血压老鼠(SHR)具有显著的α1B-AR及α1D-AR存在于血管，巴福洛对其不会产生显著的作用(表二)，显示巴福洛对α1B-AR及α1D-AR的影响不强。同样地，在普通老鼠也出现一致的结果。
事实上，巴福洛早就被指出其心血管作用不强(Vanhoutte PM.(1984)Cardiovascular pharmacology of buflomedil.Bibliotheca Cardiol.38209-221)；本次的研究更说明这项原因。巴福洛具有良好的微小血管舒张作用(Daum PS，Bowers WD Jr，Tejada J，et al.(1989)An evaluation of the ability of the peripheralvasodilator buflomedil to improve vascular patency after acute frostbite.Cryobiology 2685-92)，其原因也可能源自α1A-AR的阻断。只是，这项推论尚需要更多的研究结果来加以验证。
综合以上的结果，巴福洛是一种对α1A-AR具有阻断作用的药物。
临床上，交感神经的阿发第一型受体(α1A-AR)阻断药常被用来改善“前列腺肥大(B.P.H)”(Shibata K，Hirasawa A，Moriyama N，et al.(1996)Alphala-adrenoceptor polymorphismpharmacological characterization and associationwith benign prostatic hypertrophy.Br.J.Pharmacol.1181403-1408.)。前列腺肥大是一项老年人常见的异常；国内广泛使用的产品都是使用比降血压作用出现的更低剂量来长期服用。然而，病人使用的药量不当，极易出现低血压的副作用。最近，文献更指出控制前列腺的交感神经的阿发第一型受体(α1-AR)是以α1A-AR为主(walden PD，Durkin MM，Lepor H，et al.(1997)Localizationof mRNA and receptor binding sites for tbe α1-adrenoceptor subtype in the rat，monkey andhman urinary bladder and prostate.J.urol.1571062-1038)。所以，本发明的含巴福洛的药剂，对前列腺肥大等因α1A-AR过盛所产生的疾病有相当好的疗效，且无低血压的作用。
借助α1A-AR的阻断，巴福洛的临床用途似乎可再增加；例如“前列腺肥大的治疗”等。
综上所述，虽然本发明己以一较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习该领域的人，在不脱离本发明的精神和范围内，可采用各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定的为准。
权利要求
1.一种用于阻断交感神经的阿发第一亚型受体的药剂，其特征在于所述的药剂包括巴福洛麦迪。
2.如权利要求1所述的药剂用以改善因α1A-AR过剩所引致的疾病。
3.如权利要求2所述的药剂用以改善前列腺肥大。
全文摘要
本发明提供一种改善因α
文档编号C07D207/04GK1490311SQ0214582
公开日2004年4月21日 申请日期2002年10月14日 优先权日2002年10月14日
发明者郑瑞棠 申请人:英属维尔京群岛福源集团有限公司, 郑瑞棠