利用球状载体将第八因子/第九因子进行肝脏基因转移治疗血友病的方法

专利名称：利用球状载体将第八因子/第九因子进行肝脏基因转移治疗血友病的方法
技术领域：
本发明是指利用球状载体将第八因子/第九因子进行肝脏基因转移治疗血友病的方法。
背景技术：
血友病是最常见的遗传疾病之一，因第八因子缺失引起的A型血友病发病率为每5,000个新生男婴中有1名；而因第九因子缺失导致的B型血友病发病率为每30,000个新生男婴中有一名发病，而且在所有研究过的人种中，发病率都很一致。长期以来，富集的凝血因子被用来治疗血友病，这种疗法的目的是控制出血而且需要终生重复的静脉注射。由于对血浆制品风险意识的提高，开发新的有效治疗方法的重要性也在不断提升。
人们已经在开发基因治疗的方法来治疗血友病。因其特性，血友病是很适于用基因治疗方法的一种疾病相关的蛋白已被很好地研究，相关的基因已被克隆因而易于获得，大型和小型的相关动物模型也已建立，更重要的是，基因产品不需要器官特异性的表达，而且，由于蛋白的功能是通过蛋白激活来调控的，所以蛋白表达的水平不需要严格的调控。另外，很低的蛋白表达水平就可以在功能上改善疾病。血友病基因治疗最主要的障碍是基因表达的产品需要对病人终身维持。因而，有效的疗法可能需要将基因治疗载体重复导入。
利用逆转录病毒和腺病毒相关病毒(AAV)作为载体的血友病基因治疗的临床试验正在进行，以腺病毒和慢性病毒(LENTIVIRUS)为载体的基因治疗实验也有人偿试过。但是以病毒为载体的基因治疗的通病是它的装载核酸的容量有限，并可导致免疫反应。使用DNA或RNA，在有或没有合成脂质体的条件下，都只有低效的基因转移，非病毒方法只能产生短期、非靶向性的基因表达。
Yamada等人(2001a)最近描述了一种新的对肝有特异性的、表达修饰乙肝病毒表面蛋白的球状载体。产生这种包含乙肝膜蛋白球体的方法为同行所熟知(Kuroda等人1992年和Yamada等人，2001b，在此引用全文)。简述如下通过将鸡溶菌酶基因的信号序列在框地(inframe)接入乙肝表面env L蛋白(SEQ ID I)基因之前，包含pre-S1加pre-S2加S肽的修饰的乙肝表面env L蛋白就可在酵母中有效地表达出来，信号序列在翻译的过程中将蛋白导入内质网，饱含蛋白的球体从内质网中分裂出来，聚集在酵母的细胞质中，这些球体由内质网的脂双层和修饰的env L蛋白为主要蛋白成份组成。通过上述方法形成的颗粒非常稳定，并可通过重复使用氧化铯和蔗糖梯度离心的方法纯化，而这些纯化方法为同业所熟知。
质粒DNA可以通过电极通导(electroporation)法加入含env L蛋白的颗粒，这些包含DNA的颗粒被证实可以促进DNA特异地进入肝细胞(通过在细胞培养水平和直接注射进移植人肝癌细胞的裸鼠的实验)。Yamada等人(2001a)建议这样的球状载体可用于将核酸或其它分子特异性地导入肝脏。

发明内容
本发明的主要目的是提供一种用于血友病治疗的非病毒球状载体，该球状载体，由包含修饰的乙肝病毒env L蛋白的双脂层构成，这样的结构既减弱或消除了S肽引起的免疫反应，又保证了肝靶向性的信号仍暴露在球体的表面。本发明的另一目的是提供一种用于治疗A型和B型血友病的第八因子或第九因子的表达结构，该表达结构可以是单链或双链DNA。含有但不限于下列启动子非组织特异，如细胞肥大病毒(cytomegalovirus)，Rous肉瘤，和组织特异的启动子，如α-胚胎蛋白、球蛋白、白蛋白和α1-微球蛋白，该表达结构还可以包含其它的基因表达调控因子，包括但不限于强化因子(enhancers)，基因内区(introns)，多聚A序列和RNA靶向顺序，促进质粒复制的因子，如SV40复制起始因子也可包括在内，来自AAV的末端重复片断(ITR)序列也可包括在表达结构里，用来促进表达结构的稳定性或用于通过AAV Rep蛋白促进与宿主DNA的嵌合。另外，类似ITR顺序的真核DNA转座子/转座子酶(transposon/transposases)系统也可用来促进与宿主DNA的嵌合。
本发明的再一目的是提供一种注射非病毒球载状体治疗血友病的方法，包含恰当表达顺序核酸结构的球状载体通过静脉或动脉注射入体内，通过观察病人体内蛋白质或RNA的表达或疾病表征的改善了解植入基因产品的表达情况。
对本发明的技术方案详细叙述如下本发明一个非病毒的球状载体，它由下列部份组成一个在球状体表面暴露着乙肝病毒外壳(envelope)env蛋白的球状膜和；一个核酸表达结构，包含完整的第八因子或第九因子的表达序列和在肝细胞中有功能的启动子序列。
其中的env蛋白含有突变以降低其抗原性。
其中的表达结构为DNA。
其中的表达结构为双链质粒DNA。
其中的表达结构为RNA。
其中的启动子为非组织特异的启动子。
其中的非组织特异启动子可来自以下来源细胞肥大病毒(cytomegalovirus)启动子，Rous肉瘤启动子，辅酶Q(Ubiquitin)启动子，鸡β-肌动蛋白(β-actin)启动子和延长因子(elongation factor)(EF)-1α启动子。
其中的启动子为肝脏特异的启动子。
其中的肝脏特异启动子来自以下来源α-胚胎蛋白启动子，球蛋白启动子，α1-微球蛋白和白蛋白。
其中的表达结构包括来自腺病毒相关病毒的反向(Inverted)末端序列(AAV-ITR)。
其中的表达结构包括真核细胞的转座子(transposon)和转座子酶(transposase)序列。
其中的表达结构包括第八因子的表达序列。
其中的第八因子包含无意(silent)突变以增加其表达能力。
其中的表达结构包括第九因子的表达序列。
本发明一个非病毒的球状载体，它由以下部份组成一个在球状体表面暴露着乙肝病毒外壳(envelope)env蛋白的球状膜和；一个包含了完整第八因子或第九因子的蛋白质。
其中的env蛋白包含了突变以降低其抗原性。
本发明一个治疗血友病的方法，它由以下部份组成将由表面暴露着乙肝病毒env蛋白球状膜的非病毒球状载体输入具有血友病的个体的血循环中以及；一个由完整的第八因子或第九因子表达序列和在肝细胞中有功能的启动子序列组成的核酸表达结构，以及，监测该病人疾病改善的情况。
其中输入血循环的方法通过静脉注射。
其中输入血循环的方法通过注射入肝动脉或腹腔动脉(hepatic orportal artery)。
本发明一种利用球状载体将第八因子/第九因子进行肝脏基因转移治疗血友病的方法，其优点和达到的功效是該球状载体结构既减弱或消除了S肽引起的免疫反应，又保证了肝靶向性的信号仍暴露在球体的表面。該注射非病毒球载状体治疗血友病的方法，改善了解植入基因產品的表连情况。疗效好，无副作用。
具体实施例方式
血友病是最常见的遗传疾病之一，可由任何一个凝血因子的突变或缺失引起。最常见的为第八因子或第九因子的缺损。目前的治疗方法需要终身补充凝血因子，涉及重复的静脉输入，同时也使病人承受血制品带来的危险。
基於下列原因，血友病很适于基因治疗。第一，相关基因已克隆并易获得；第二，相关蛋白特性了解清楚，它们的激活是通过蛋白的裂解来调控而不是在转录或转译水平来调控，因而蛋白表达水平不需要严密的控制；第三，低水平的蛋白表达已被证明足以引起表征的恢复；第四，虽然肝脏是产生大多数第八、第九因子的生理器官，在身体哪个部位产生这些因子相对并不重要；第五，不少动物模型可用于分析各种治疗方法的效果。即便如此，到目前为止，还没有一个有效的基因转移载体或治疗血友病的方法被开发出来。
本发明为治疗血友病的球状载体，由天然脂球体和在球体内表达第八或第九因子的表达结构组成。该脂球体最好用酵母或昆虫细胞，如Sf9细胞产生，并将修饰的乙肝病毒dnv L蛋白整合于膜层中。球体的产生根据Kuroda(1992)疫苗的产生方法加上Yamada(2001b)的改进，简述如下乙肝病毒env L蛋白由三个区域组成有108或119个残基的pre-S1区域涉及与肝细胞的直接作用；有55个残基的pre-S2区域涉及白蛋白协调的聚合反应以及主要的有226个残基的S蛋白区域。试图在各种真核细胞里产生L蛋白的尝试都没有成功。可能是由于N端出现的pre-S1短蛋白链。为克服这一问题，我们将L蛋白N端的表达序列用鸡溶菌酶信号序列取代，以将N端导入内质网。这一杂合的序列被嵌入酵母(S.cerevisiae)表达载体，然后通过常用的转化方法导入酵母。杂合的L蛋白被大量地生产出来(可达整个酵母蛋白的42％)，并被准确地插入膜层。球状体从内质网上分裂出来，形成23纳米的圆球或线状颗粒，并将蛋白包含在颗粒的膜层中。酵母细胞用玻璃球破碎以释放出这些球体，然后这些球体通过数轮不连续的氯化铯和蔗糖梯度离心纯化。从昆虫细胞生产和纯化球状体也通过类似的过程。通过匀浆(homogenization)和差速(differential)离心，一个粗的膜组分可以象从酵母中一样从昆虫细胞中得到。这个粗的膜组分可以象处理酵母细胞一样，通过氯化铯和蔗糖梯度离心分离出纯化的球状体。上述方法可廉价、大量地生产球状体以适应基因转移的需要。这些球状体在低温保存情况下长期稳定，但在重复融解、冷冻情况下会变得不稳定。
球状载体可用来将任何核酸结构，单、双链DNA或RNA或其他基因产品导入肝脏。本发明的一个优选具体化例(preferred embodiment)中，核酸为一双链DNA质粒。该结构至少含有人第八因子(SEQ1 D2)或第九因子(SEQ1 D3)来治疗A型或B型血友病，并含有促进血友病基因转录的启动子。这一结构还可含有其他的调控因子或强化因子(enhancer)来调节基因表达，基因内区(intron)或多聚A序列以促进RNA加工(processing)和基因表达，RNA靶向序列，AAV-ITR或真核转座子(transposon)序列以促进表达盘(cassettes)的稳定和与宿主基因组的整合，以及病毒复制起始序列以促进质粒在宿主中的扩增，这些序列为同业人士所熟知。球状体核酸结构中可包含的序列不象基于病毒基因组的其它基因转移方法那样受限制，因为球状体可容纳相当大量的核酸。
相当数量的启动子(promoter)序列可在肝脏中起作用，这些包括非组织专一的启动子(promoter)如CMV、RSV、辅酶Q(Ubiquitin)、鸡β-肌动蛋白(β-actin)和延长因子(elongation factor)(EF)-1α；也包括组织特异性启动子(promoter)如α-胚胎蛋白，球蛋白α1-微球蛋白及白蛋白。
AAV-ITR序列可被置于所有除了复制起始点以外所有表达和调控序列的两端，这些AAV-ITR序列被证实可以增加基因治疗方法里转入结构的稳定性。另外，这些AAV-ITR序列在AAV-Rep蛋白的帮助下可促进与人类基因组定点的整合，而AAV-Rep蛋白的提供可通过直接将蛋白整合入含核酸结构的球状体或将其表达盘(cassettes)包入同一球状体。
与AAV-ITR序列相似，真核转座子(transposon)序列可结合于所有表达和调控序列之外，促进整合的转座子酶(transposase)可从同一表达盘(cassette)中表达，也可用位于同一球状体中的独立表达盘(cassette)中加以表达。
表达第八因子时需特别注意以下这点。研究表明人类第八因子包含一序列(核甘酸1741到1771，SEQ1 D2)能降低异源(heterologous)蛋白的表达(Fallaux等人，1996)，该序列AT含量高，被证实与一细胞核因子结合，并抑制细胞中报告结构(reporterconstruct)的表达。切除该序列或将该序列随机突变产生的是没有活性的第八因子。但是，在基因产品中引入不导致氨基酸顺序变化的silent突变的方法是为同行所熟知可以促进第八因子的表达的。
在一个优选具体化例(preferred embodiment)，本发明的核酸结构是通过电极通导(electroporation)的过程进入球状体的。核酸结构与球状体充分混合，加上水达到最终所需体积，然后转入一电极通导糟(electroporation curette)电压和电阻因curette(糟)的大小(空隙长度)和糟(curette)中物质的体积而有很大差异。行业中人士熟知如何调节这些参数以达到最大程度地转移核酸进入球状体并将球状体的损伤降到最低。
另外，核酸可以通过同业中熟知的用包含核酸脂质体与球状体融合的方法将核酸导入球状体(Dzau等人，1996)发明中的核酸结构通过混合(vortexing)包埋入脂质体，脂质体的组成可是已知的磷脂和膜组分(如磷酸胆碱，胆固醇)或市场上可买到的特有的膜组分混合物(如Gibco BRL生成的Lipofectamine)。包埋了核酸的脂质体与来源于酵母或昆虫细胞的球状体在37℃下共同培育10-30分钟后将自行融合。
此外，第八因子或第九因子蛋白本身可以直接包入本发明中的球状体。第八(SEQ ID4)或第九(SEQ ID5)因子蛋白可以通过多种为同业人士所熟知的方法获得。含有这些蛋白的高浓度溶液可与纯化的球状体混合，通过渗透压冲击(Osmotic shock)或超声(sonication)的方法促进蛋白进入球体。蛋白也可通过混合(Vortexing)或超声(sonication)先包入人工膜，这些包含蛋白的人工膜然后可以与源于乙肝病毒的球状体融合。
本发明包含核酸或蛋白的非病毒球状载体可由静脉或动脉注射进入人体。为增加输送效率，球状载体可以直接注射进肝动脉或腹腔动脉(hepatic or portal artery)。病人被定期观测第八或第九因子的出现或体征的改善。注射非病毒球状体的量因启动子的强弱、整合序列、每个球状体包含质粒的量以及许多为同业所熟知的其它因素而改变。由于检测病人健康状况的方法为人熟知，有效的剂量很容易被确定。
序列表<110>肯尼斯·R·.陈星岛雅彦<120>利用球状载体将第八因子/第九因子进行肝脏基因转移治疗血友病的方法<130>6627-PA1170<150>60/286,314<151>2001-04-25<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9029<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1gcttagtgct gagcacatcc agtgggtaaa gttccttaaa atgctctgca aagaaattgg 60gacttttcat taaatcagaa attttacttt tttcccctcc tgggagctaa agatatttta120gagaagaatt aaccttttgc ttctccagtt gaacatttgt agcaataagt catgcaaata180gagctctcca cctgcttctt tctgtgcctt ttgcgattct gctttagtgc caccagaaga240tactacctgg gtgcagtgga actgtcatgg gactatatgc aaagtgatct cggtgagctg300cctgtggacg caagatttcc tcctagagtg ccaaaatctt ttccattcaa cacctcagtc360gtgtacaaaa agactctgtt tgtagaattc acggatcacc ttttcaacat cgctaagcca420aggccaccct ggatgggtct gctaggtcct accatccagg ctgaggttta tgatacagtg480gtcattacac ttaagaacat ggcttcccat cctgtcagtc ttcatgctgt tggtgtatcc540tactggaaag cttctgaggg agctgaatat gatgatcaga ccagtcaaag ggagaaagaa600gatgataaag tcttccctgg tggaagccat acatatgtct ggcaggtcct gaaagagaat660ggtccaatgg cctctgaccc actgtgcctt acctactcat atctttctca tgtggacctg720gtaaaagact tgaattcagg cctcattgga gccctactag tatgtagaga agggagtctg780gccaaggaaa agacacagac cttgcacaaa tttatactac tttttgctgt atttgatgaa840gggaaaagtt ggcactcaga aacaaagaac tccttgatgc aggataggga tgctgcatct900gctcgggcct ggcctaaaat gcacacagtc aatggttatg taaacaggtc tctgccaggt960ctgattggat gccacaggaa atcagtctat tggcatgtga ttggaatggg caccactcct 1020
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权利要求
1.一个非病毒的球状载体，其特征在于它由下列部份组成一个在球状体表面暴露着乙肝病毒外壳(envelope)env蛋白的球状膜和；一个核酸表达结构，包含完整的第八因子或第九因子的表达序列和在肝细胞中有功能的启动子序列。
2.依据权利要求1所述之该球状载体，其中的env蛋白含有突变以降低其抗原性。
3.依据权利要求1所述之该球状载体，其中的表达结构为DNA。
4.依据权利要求1所述之该球状载体，其中的表达结构为双链质粒DNA。
5.依据权利要求1所述之该球状载体，其中的表达结构为RNA。
6.依据权利要求1所述之该球状载体，其中的启动子为非组织特异的启动子。
7.依据权利要求6所述之该球状载体，其中的非组织特异启动子可来自以下来源细胞肥大病毒(cytomegalovirus)启动子，Rous肉瘤启动子，辅酶Q(Ubiquitin)启动子，鸡β-肌动蛋白(β-actin)启动子和延长因子(elongation factor)(EF)-1α启动子。
8.依据权利要求1所述之该球状载体，其中的启动子为肝脏特异的启动子。
9.依据权利要求8所述之该球状载体，其中的肝脏特异启动子来自以下来源α-胚胎蛋白启动子，球蛋白启动子，α1-微球蛋白和白蛋白。
10.依据权利要求1所述之该球状载体，其中的表达结构包括来自腺病毒相关病毒的反向(Inverted)末端序列(AAV-ITR)。
11.依据权利要求1所述之该球状载体，其中的表达结构包括真核细胞的转座子(transposon)和转座子酶(transposase)序列。
12.依据权利要求1所述之该球状载体，其中的表达结构包括第八因子的表达序列。
13.依据权利要求12所述之该球状载体，其中的第八因子包含无意(silent)突变以增加其表达能力。
14.依据权利要求1所述之该球状载体，其中的表达结构包括第九因子的表达序列。
15.一个非病毒的球状载体，其特征在于它由以下部份组成一个在球状体表面暴露着乙肝病毒外壳(envelope)env蛋白的球状膜和；一个包含了完整第八因子或第九因子的蛋白质。
16.依据权利要求15所述之该球状载体，其中的env蛋白包含了突变以降低其抗原性。
17.一个治疗血友病的方法，其特征在于它由以下部份组成将由表面暴露着乙肝病毒env蛋白球状膜的非病毒球状载体输入具有血友病的个体的血循环中以及；一个由完整的第八因子或第九因子表达序列和在肝细胞中有功能的启动子序列组成的核酸表达结构，以及；监测该病人疾病改善的情况。
18.依据权利要求17所述之该方法，其中输入血循环的方法通过静脉注射。
19.依据权利要求17所述之该方法，其中输入血循环的方法通过注射入肝动脉或腹腔动脉(hepatic or portal artery)。
全文摘要
本发明是利用球状载体将第八因子/第九因子进行肝脏基因转移治疗血友病的方法，用于血友病治疗的非病毒球状载体，由包含修饰的乙肝病毒env L蛋白的双脂层构成，这样的结构既减弱或消除了S肽引起的免疫反应，又保证了肝靶向性的信号仍暴露在球体的表面。本发明还包括用于治疗A型和B型血友病的第八因子或第九因子的表达结构，该表达结构可以是单链或双链DNA。本发明还包括注射非病毒球状载体治疗血友病的方法，包含恰当表达顺序核酸结构的球状载体通过静脉或动脉注射入体内，通过观察病人体内蛋白质或RNA的表达或疾病表征的改善了解植入基因产品的表达情况。
文档编号C07K14/02GK1520259SQ02810734
公开日2004年8月11日 申请日期2002年4月25日 优先权日2001年4月25日
发明者肯尼斯·R·陈, 肯尼斯 R 陈, 彦, 星岛雅彦 申请人:加州大学校务委员会