专利名称：甘露醇和山梨醇衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括甘露醇或山梨醇衍生物的化合物，它们可被用于组成寡聚化合物。本发明还涉及这些寡聚化合物在杂交方面的用途和作为探针的用途。此外，本发明公开了检测核酸的方法，其中使用了寡聚化合物。
背景技术：
在分子诊断领域，用聚合酶链式反应(PCR)检测靶核酸起到了重要的作用。常规筛选血库中人免疫缺损病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)是大规模应用基于PCR的诊断方法的实例。用于基于PCR的分析的自动系统经常在PCR过程中使用扩增产物的实时检测。这种方法的关键是使用携带报告基团或标记物的被修饰的寡核苷酸。
在其最简单的形式中，PCR是酶促合成特定核酸序列的体外方法，该方法使用两个与相对的链杂交，并位于靶序列侧翼的寡核苷酸引物，所述特定核酸序列是靶核酸中令人感兴趣的区域。一系列重复的反应步骤，包括模板变性、引物退火、由DNA(脱氧核糖核酸)聚合酶将退火的引物延伸，导致特定的片段指数性累积，所述片段的末端由引物的5’端限定。
一方面，由PCR方法产生的DNA扩增产物的检测可在独立的操作步骤中完成。这些步骤可包括根据其电泳迁移率表征扩增的片段和/或用杂交探针分析与固体支持物连接的变性的扩增产物。
另一方面，DNA扩增产物的检测可在所谓“同源(homogeneous)”测试系统中进行。“同源”测试系统包括报告分子或标记物，当靶序列被扩增时，报告分子或标记物产生信号。“同源”测试系统的一个实例是TaqMan_，US5,210,015、US5,804,375和US5,487,972对其进行了详细描述。简单地说，该方法基于双标记探针和Taq DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性。所述探针与待由PCR方法扩增的靶序列互补，并且在每个聚合循环步骤中位于两个PCR引物之间。探针具有两个与之连接的荧光标记物。其中一个是报告染料，例如6-羧基荧光素(FAM)，由于它与第二荧光染料6-羧基-四甲基-若丹明(TAMRA)空间上接近，通过能量转移淬灭(quench)其发射光谱。在每个扩增循环的过程中，延长引导的(primed)DNA链的过程中Taq DNA聚合酶置换并降解退火的探针，降解是由聚合酶内在的5’-3’核酸外切酶活性造成的。该机制也是报告染料从TAMRA的淬灭活性中分离出来。结果，荧光活性随探针切割的增加而增加，与形成的PCR产物的量成比例。相应地，通过检测释放的荧光标记物可测量扩增的靶序列。
用所谓的“分子信标(molecular beacons)”将荧光染料分子之间类似的能量转移原理应用于“同源”测试(US6,103,476)。它们是带有内部淬灭荧光团(internally quenched fluorophore)的发夹形核酸分子，当它们与靶核酸结合时，会恢复(restore)荧光(US6,103,476)。它们被设计为分子的环部是探针序列，该探针序列与PCR方法中的靶序列中的区域互补。通过使探针序列末端的互补臂(arm)序列退火而形成茎部(stem)。荧光部分与一个臂的末端连接，淬灭部分与另一个臂的末端连接。茎部使这两部分彼此接近，使得荧光团的荧光通过能量转移而淬灭。由于淬灭体(quencher)部分是非荧光生色团，并以热的形式发出从荧光团接收的能量，因此探针不发出荧光。当探针遇到靶靶分子时形成杂交体(hybrid)，该杂交体比茎杂交体更长、更稳定，它的刚性和长度阻碍了茎杂交体的同时存在。因此，分子信标进行了驱使茎部分离的自发的构象重组，并引起荧光团和淬灭体彼此分离，导致可检测的荧光恢复。
“同源”测试系统的更多实例以LightCycler_仪器所用的形式提供(见例如US6,174,670)，它们中的一些有时被称为“亲吻探针(kissingprobe)”形式。同样，原理是基于染料之间的相互作用。然而，染料的特征是供体染料的发射波长通过荧光共振能量转移激发受体染料。一种示例方法使用了两个修饰的寡核苷酸作为杂交探针，它与PCR方法的靶序列的相邻内部序列(adjacent internal sequences)杂交。位于5’端的修饰的寡核苷酸在其3’端具有作为标记的供体染料。位于3’端的修饰的寡核苷酸在其5’端具有受体染料。在扩增循环过程中，两个修饰的寡核苷酸以头至尾的方向与靶序列退火，随后供体和受体染料非常接近。通过用单色光脉冲特异性地激发供体染料，可以检测受体染料荧光，用于测量形成的PCR产物的量。
在“同源”测试系统中使用的寡聚化合物或修饰的寡核苷酸包括核苷酸或修饰的核苷酸，即单体单元，它与作为报告分子的标记物(例如染料)连接。这样的单体单元的特征是它们(1)能够与核酸的糖-磷酸聚合物主链连接或整合到其中，(2)不阻遏修饰的寡核苷酸与其互补靶序列配对，(3)提供用于连接一个或几个标记物的官能团。
此外，TaqMan_形式要求寡聚化合物能够被模板依赖型DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性消化。
用于将单体单元掺入核酸的几种化合物及其用途是本领域已知的。这样的化合物提供了用于共价连接报告基团或标记物的官能团和/或连接部分。在寡聚化合物的化学合成过程中，“非核苷酸化合物”或“修饰的核苷酸”的骨架结构与“寡核苷酸”的主链连接，例如通过基于亚磷酰胺(phosphoramidite)的化学反应生成磷酸二酯。一种给定的被掺入的化合物代表新生成的“修饰的寡核苷酸”中的修饰的核苷酸。标记物通过连接部分的官能团连接，所述官能团例如但不限于骨架结构本身的(proper)或“连接部分”的氨基官能，所述“连接部分”将骨架与官能团连接。在从待与标记物偶联的官能团上除去任选的保护基团之后，标记物可在合成“修饰的寡核苷酸”之前或之后共价连接到化合物上。
EP0135587描述了常规核苷的修饰，所述常规核苷携带了与核苷碱基的取代基连接的报告基团。EP0313219公开了非核苷试剂，其特征在于带有可与标记物结合的连接部分或侧基的线性烃骨架结构。EP0313219没有描述其他类型的骨架结构和它们的特性。US5,451,463描述了三官能的非核苷酸试剂，特别是具有伯氨基基团的基于1，3-二醇的骨架结构。这样的试剂可用于例如寡核苷酸的3’末端的末端标记。WO97/43451公开了基于碳环(C5至C7)骨架结构的非核苷酸试剂，优选的是取代或未取代的环己烷。根据该文献，这样的结构提供了将官能部分(例如可与报告基团偶联的官能基团)延伸出修饰的寡核苷酸的寡聚物主链所必要的刚性。这是合乎需要的，因为在掺入到修饰的寡核苷酸之后，试剂的偶联效率提高。Sheng-Hui等，Bioorganic& Medicinal Chem.Lett.7(1997)1639-1644，描述了基于环己烷骨架结构的非核苷酸化合物，特别是化合物环己基-4-氨基-1，1-二甲醇。通过在C1位取代甲基残基的官能团，使整合到寡核苷酸主链中成为可能。携带标记物的连接部分与氨基基团连接。
也有有关基于山梨醇或甘露醇的修饰的核苷的公开。来源于1，5-内醚-2，3-二脱氧-己糖醇的化合物已被几份文献公开，然而，这些文献关注的是己糖醇化合物本身或基于己糖醇的修饰的核苷。这样的修饰的核苷可用作药物或用于化学合成，特别是修饰的寡核苷酸的合成。Pravdic，N.等，Croatica Chemica Acta 45(1973)343-356，描述了1，5-内醚-2-乙酰氨基-2，3-二脱氧-D-己糖醇，即甘露醇或山梨醇衍生物(化合物XVIII)的合成。该文献完全没有描述这样的化合物除化学合成外的特定用途。JP60016982描述了1，5-内醚-3-脱氧-D-山梨醇的合成。该化合物用于抑制葡萄糖接受型神经元的活性。WO93/25565，van Aerschot，A.等，Bioorganic & MedicinalChemistry Letters(1993)1013-1018；Verheggen，I.等，J.Med.Chem.36(1993)2033-2040；Verheggen，I.等，J.Med.Chem.38(1995)826-835；和Perez-Perez，M.-J.等，Bioorg. & Med.Chem.Lett.6(1996)1457-1460，描述了1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-己糖醇的衍生物，其在C2位携带羟基残基或氨基残基。WO9605213和Hossain，N.等，J.Org.Chem.63(1998)1574-1582描述了分别来源于1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-山梨醇和甘露醇的修饰的核苷的合成。后两篇文献公开了修饰的寡核苷酸的合成，所述寡核苷酸掺入了基于己糖醇的修饰的核苷。
用于将标记物掺入核酸的化合物必须仔细地筛选，因为它们可能(a)干扰碱基配对，(b)不能提供具有足够刚性的骨架结构，(c)提供很大程度上疏水的结构，导致水溶性低，
(d)仅提供有限的化学修饰可控制性(amenability)，(e)含有对映体混合物。
因此本发明的一个目的是提供用于将标记物掺入核酸中的新化合物。
发明概述本发明涉及含有甘露醇或山梨醇部分的化合物，具体地说，本发明涉及含有甘露醇或山梨醇部分的特定化合物，可用于构建寡聚化合物。本发明还涉及这些寡聚化合物在杂交中的用途和作为探针的用途。此外，本发明公开了检测样品中的核酸的方法，其中使用了寡聚化合物。本发明还提供了分别和直接合成甘露醇和山梨醇立体异构体的方法，从而避免了分离它们二者的混合物。
1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-己糖醇结构提供了具有特别有利的特性的亲水骨架结构。此外，己糖醇结构适于进一步的有效化学合成。例如，由于甘露醇或山梨醇结构仅具有单一的伯醇官能，可以有效地在己糖醇的第6位碳原子的羟基氧上选择性地偶联DMT保护基。本发明化合物的化学合成特别地涉及2-氨基基团，这是特别有利的，因为合成步骤适于选择性地产生两种可能的立体异构体中的任一种。因此可以避免繁琐的分离步骤，同时可以获得确定的化合物。这对于生产诊断用化合物是有利的。生产诊断用化合物要求很高的质量标准，即同样确定的产物而不是对映体，生产成本也是不可忽视的。为避免荧光标记偶联到2-氨基基团，当被掺入核酸或修饰的核酸中时，基于甘露醇或山梨醇的化合物提供了标记物5’或3’方向取向的结构基础。
本领域公知的分子生物学和核酸化学的常规技术，在文献中得到说明。见例如Sambrook等，分子克隆实验指南，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，Gait，M.J.ed.，1984；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)，Hames，B.D.，andHiggins，S.J.，eds.，1984；以及一系列Method in Enzymology，AcademicPress，Inc.，它们都引入本文作为参考。本文涉及的所有的专利、专利申请和出版物，见上文和下文，被引入本文作为参考。
如本领域已知的，“核苷”是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。两类最常见的杂环碱基是嘌呤和嘧啶。
“核苷酸”是进一步包括一个磷酸基团的“核苷”，所述磷酸基团与核苷的糖部分共价连接。对于包含呋喃戊糖的“核苷”，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。“核苷酸”是“寡核苷酸”的“单体单元”，在本文中更一般地表示为“寡聚化合物”，或“多核苷酸”，更为一般地表示为“多聚化合物”。另一种一般的表示是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)通过一些修饰而与天然的“核苷酸”不同，但仍由碱基、呋喃戊糖、磷酸部分、碱基样、呋喃戊糖样和磷酸样部分，或它们的组合组成。例如，“标记物”可与“核苷酸”的碱基部分连接，由此得到“修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可被例如7-去氮杂嘌呤(desazapurine)置换，由此也得到“修饰的核苷酸”。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“修饰的核苷”(或“核苷类似物”)通过一些修饰与天然的核苷不同，其方式由上文“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)中给出。
“非核苷酸化合物”与天然“核苷酸”不同，但在本发明的含义中，仍(类似于“核苷酸”)是“寡聚化合物”的“单体单元”。因此，“非核苷酸化合物”能够与“核苷酸”形成“寡聚化合物”。即使“非核苷酸化合物”含有碱基样、呋喃戊糖样或磷酸样部分，但在“非核苷酸化合物”中它们不同时存在。
根据本发明，“寡聚化合物”是由“单体单元”组成的化合物，所述“单体单元”可以单独是“核苷酸”或“非天然的化合物”，更特别地是“修饰核苷酸”(或“核苷酸类似物”)或“非核苷酸化合物”，或它们的组合。在本发明的上下文中，“寡核苷酸”和“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)是“寡聚化合物”的亚组(subgroups)。
在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”是指由大量“核苷酸”作为“单体单元”形成的“多核苷酸”，即“寡核苷酸”属于具有“单体单元”的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的“寡聚化合物”或“多聚化合物”的特别的亚组。根据本发明，术语“寡核苷酸”仅包括由天然存在的核苷酸组成的“寡核苷酸”。磷酸基团通常被指形成“寡核苷酸”的核苷间(intemucleoside)主链。
“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)属于“寡聚化合物”的另一特别的亚组，其具有一个或几个“核苷酸”，一个或几个“非核苷酸化合物”或“修饰的核苷酸”作为“单体单元”。因此，术语“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)是指功能与“寡核苷酸”基本相似的结构，在本申请中可互换使用。从合成角度来看，“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)可例如通过“寡核苷酸”的化学修饰制得，所述化学修饰通过磷酸主链、核糖单元或核苷酸碱基的适当修饰进行(Uhlmann和Peyman，Chemical Reviews 90(1990)543；Verma，S.，和Eckstein，F.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134)。代表性的修饰包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸甲酯、磷酸三酯和氨基磷酸酯核苷间连接代替磷酸二酯核苷间连接；脱氮或氮杂嘌呤和嘧啶代替天然嘌呤和嘧啶碱基，在5或6位具有取代基的嘧啶碱基；在2、6或8位具有改变了的取代基的嘌呤碱基，或在7位具有改变了的取代基的嘌呤碱基如7-脱氮嘌呤；在例如2’位具有取代基的糖；或碳环或无环糖类似物。与本发明的精神一致其他修饰是本领域技术人员公知的。对这样的“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)的最佳描述是与天然的“寡核苷酸”(或按照天然的排列合成的“寡核苷酸”)在功能上可互换，但在结构上不同。更详细地，Verma，S.和Eckstein，F.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134或WO 02/12263公开了例示性的修饰。此外，也可以进行这样的修饰，其中核苷单元通过基团连接，所述基团取代了核苷间磷酸或糖磷酸连接。这样的连接包括Verma，S.和Eckstein，F.，Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134公开的那些。当使用了不同于磷酸连接的连接方式来连接核苷单元时，这样的结构也被描述为“寡核苷”。
和“寡核苷酸”和“修饰的寡核苷酸”一样，本发明的“寡聚化合物”可用本领域原理性描述的方法和本领域技术人员公知的方法来合成。制备特定序列的寡聚化合物的方法是本领域已知的，包括例如适当序列的克隆和限制性作用(restriction)以及直接化学合成。化学合成可包括例如Narang，S.A.等，Methods in Enzymology 68(1979)90-98描述的磷酸三酯法，Brown，E.L.等，Methods in Enzymology 68(1979)109-151公开的磷酸二酯法，Beaueage等，Tetrahedron Letters 22(1981)1859公开的亚磷酰胺法，Garegg等，Chem.Scr.25(1985)280-282公开的H-膦酸法和US 4,458,066公开的共同支持物法。
如上所述，“核酸”是本领域技术人员已知的“核苷酸”多聚化合物。在本文中，它表示待测样品中的“核酸”，即它在样品中是否存在或它在样品中的含量有待确定。因此，换句话说，“核酸”是靶，可被称为“靶核酸”。例如，如果需要确定血液中是否含有人免疫缺损病毒，则“靶核酸”就是人免疫缺损病毒的核酸。
本文所用的术语“引物”是本领域技术人员公知的，指的是“寡聚化合物”，主要是“寡核苷酸”，但也可以是能够“引导(prime)”模板依赖性的DNA聚合酶进行DNA合成的“修饰的寡核苷酸”，所述DNA合成即例如寡核苷酸的3’末端提供游离的3’-OH基团，通过模板依赖性聚合酶将其他“核苷酸”与之连接，形成3’至5’的磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，释放焦磷酸。
术语“探针”指的是合成的或生物产生的核酸(DNA或RNA)，通过设计或筛选，它们含有特定的核苷酸序列，使得它们在预定的严紧性下与“靶核酸”特异性(即优先地(preferentially))杂交。“探针”可以被识别为“俘获探针”，意味着它“俘获”靶核酸，使得靶核酸能从妨碍检测的不需要的物质中分离出来。一旦完成分离，可以用适当的方法对俘获的“靶核酸”进行检测。“俘获”探针通常与固相连接。
“烷基”优选地选自含有1至10个碳原子的烷基，可以是直链的、支链的或环状的。烷基的实际长度依赖于烷基所处的特定位置的空间排列情况。如果存在空间限制，烷基通常较小，优选甲基和乙基。所有的烷基、链烯基和炔基可以是未取代的和取代的。如上所述用杂原子取代有助于提高水溶液中的溶解性。
“烯基”优选地选自含有2至10个碳原子的烯基。对于选择而言，可采用针对烷基基团的类似考虑。它们也可以是直链的、支链的或环状的。最优选的烯基是乙烯基。在烯基中可以有多于一个的双键。
“炔基”优选地具有2至10个碳原子。同样，这些碳原子可以排列成直链、支链或环形。炔基中可以有多于一个的三键。
“保护基”是一种化学基团，它与官能部分连接(例如与羟基中的氧、氨基中的氮或巯基中的硫连接，以取代氢)以保护官能团免于发生不需要的反应。保护基被以下事实进一步限定，即它可在不破坏所形成的分子的生物学活性的条件下被除去。在此，所形成的分子是与化合物结合的核酸。适当的保护基是本领域技术人员已知的。本发明优选的保护基是芴基甲氧羰基(FMOC)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、三氟乙酰基、乙酰丙酰基或甲硅烷基。核苷酸或寡核苷酸5’末端的羟基的优选保护基例如选自三苯甲基，例如二甲氧基三苯甲基(DMT)。式I中外环(exocyclic)氨基基团的优选保护基酰基，最优选苯甲酰基(Bz)、苯氧乙酰基、乙酰基或甲酰基，脒保护基例如N，N-二烷基甲脒基团，优选二甲基-、二异丁基-和二-正丁基甲脒。优选的O保护基是芳酰基、二苯基氨基甲酰基、酰基和甲硅烷基。在这些基团中最优选的是苯甲酰基。优选的甲硅烷基是三烷基甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基和叔丁基-二甲基-甲硅烷基。另一种优选的甲硅烷基是三甲基甲硅烷基-氧-甲基基团(TOM)(WO99/09044)。此外，优选的保护基是邻硝基苄基、2-(4-硝基苯基)乙氧羰基(NPEOC)，光激活化合物如2-硝基苯基-丙氧基-羰基(NPPOC)(Giegrich等，Nucleosides & Nucleotides 17(1009)1987)和烯丙氧羰基。
“标记物”，通常称为“报告基团”，是使核酸，特别是本发明的“寡聚化合物”或“修饰的寡核苷酸”，以及与之结合的任意核酸，从液体多余物(即样品)中区别开来的一般基团(与“标记物”连接的核酸也可被称为标记的核酸结合化合物、标记的探针或被称为探针)。本发明的优选标记物是荧光标记物，所述荧光标记物例如是荧光染料，如荧光素染料、若丹明染料、花青素染料和香豆素染料。
术语“连接部分”指的是一组原子，它们将待用部分(例如“固相”或“标记物”)与“核苷酸”、“修饰的核苷酸”或“非核苷酸化合物”的连接部位连接起来。这可以是例如“核苷酸”或“修饰的核苷酸”(或在特殊情况下甚至“非核苷酸化合物”)的碱基、糖或磷酸部分，或“非核苷酸化合物”或“修饰的核苷酸”的碱基样、糖样或磷酸样部分。“连接部分”可提供柔性(flexibility)，使得本发明的“寡聚化合物”，特别是“修饰的寡核苷酸”，可与待测“靶核酸”结合，而不受“固相”或“标记物”的显著影响。“连接部分”，特别是非疏水(例如基于连续的ethylenoxy单元)的那些，例如如DE3943522公开的，是本领域技术人员公知的。
根据本发明，“固相”可以是用于寡核苷酸合成的受控多孔玻璃(CPG)、聚苯乙烯或硅胶。
如本文所用的，“荧光共振能量转移(FRET)关系”和类似的术语指的是用“供体荧光标记物”标记的“寡聚化合物”和用“受体荧光标记物”标记的另一“寡聚化合物”与“靶核酸”相邻杂交(adjacenthybridization)，使得“供体荧光标记物”能将共振能量转移到“受体荧光标记物”，使“受体荧光标记物”产生可测量的荧光发射。如果“供体荧光标记物”和“受体荧光标记物”相距太远，则“供体荧光标记物”不能将共振能量转移到“受体荧光标记物”而使“受体荧光标记物”发出可测量的荧光，此时“供体荧光标记物”和“受体荧光标记物”没有处于共振能量转移关系。
“阵列”是指一个装置上的一些位置的排列，所述位置是可寻址的(见例如US 5,143,854,US 6,022,963，US 6,156,501，WO 90/15070，WO 92/10092)。所述位置可被排列为二维阵列、三维阵列和其他矩阵格式。位置的数量可以是几个到至少几十万个。最重要地，每个位置代表一个完全独立的反应位点。每个位置携带核酸作为例如“寡聚化合物”，所述核酸可作为另一核酸(特别是靶核酸)的结合伴体。
发明详述在本发明的一个实施方案中提供了式I化合物 (式I)
其中Y选自O、S和NR4，R4是烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、保护基或H；X是连接部分，n是0或1；R1独立于R2、R3和R4，R1选自(1)保护基，(2)标记物，和(3)固相；R2和R3相互独立，并独立于R1或R4，R2和R3选自(1)H，(2)保护基，(3)固相和连接部分X，(4)亚磷酰胺，(5)H-膦酸(H-phosphonate)，和(6)三磷酸(triphosphate)；条件是R3而不是R2可以是三磷酸，如果R3是三磷酸，则R1不是固相；R2和R3不都是固相，不都是亚磷酰胺，不都是H-膦酸、不都是-H，不都是保护基，不是亚磷酰胺和H-膦酸，不是固相和亚磷酰胺，或不是固相和H-膦酸；当选自R1、R2或R3的一个残基是固相时，选自R1、R2或R3的其他两个残基不是固相。
在最优选的实施方案中，Y是O。
在另一个优选实施方案中，R1独立于R2、R3和R4，R1选自保护基和标记物，最优选R1是标记物。
本发明特别优选的是用于合成本发明的寡聚化合物的化合物。因此，在优选实施方案中，R2和R3彼此独立，并独立于R1或R4，R2选自固相和连接部分X、亚磷酰胺和H-膦酸，R3是-H或保护基，优选R3是保护基。在更优选的实施方案中，R2和R3彼此独立，并独立于R1或R4，R2是固相和连接部分X，R3是-H。在另一个更优选的实施方案中，R2和R3彼此独立，并独立于R1或R4，R2是亚磷酰胺或H-膦酸，优选R2是亚磷酰胺，R3是保护基，R1是标记物或保护基，优选R1是标记物。在此情况下，优选X是连接部分，n是1。
在本发明的优选实施方案中，X是连接部分，n是1。在另一优选实施方案中，本发明的化合物的连接部分X包含碳和氧原子。在更优选的实施方案中，连接部分X包含-(CH2)m或-(CH2CH2O)m部分，m是0和10之间的整数，优选1和10之间的整数。在更优选的实施方案中，连接部分X选自(1)-CO-(CH2)m-Z-(2)-CO-(CH2CH2O)m-CH2CH2-Z-其中m是0和10之间的整数，优选1和10之间的整数，Z选自NH、CO、O和S。在本发明非常优选的实施方案中，Z是NH或CO。在一个实施方案中，连接物是草酰基衍生物，即X是-CO-CO-，这意味着-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝0。然而，更优选地，m是2或3。因此最优选地，连接物是琥珀酸衍生物，即X是-CO-(CH2)2-CO-，这意味着-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝2。在另一优选实施方案中，连接物是戊二酸衍生物，即X是-CO-(CH2)3-CO-，这意味着-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝3。
在本发明的优选实施方案中，保护基选自-芴基甲氧羰基，-二甲氧基三苯甲基，-单甲氧基三苯甲基，-三氟乙酰基，-乙酰丙酰基(levulinyl)，和-甲硅烷基。
在本发明的优选实施方案中，R1是标记物，优选荧光标记物，如选自下列的荧光染料-荧光素染料，-若丹明染料，-花青素染料，和-香豆素染料。
在本发明的另一优选实施方案中，化合物是下式1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-山梨醇的衍生物
或是下式1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-甘露醇的衍生物 本发明特别优选的实施方案是下式的山梨醇-FAM-亚磷酰胺化合物
本发明另一特别优选的实施方案是下式的甘露醇-FAM-亚磷酰胺化合物 本发明另一特别优选的实施方案是下式化合物(保护基FMOC9-芴基-甲氧羰基) 在本发明的特别优选的实施方案中，寡聚化合物包含式II的单体单元
(式II)其中Y选自O、S和NR4，R4是烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、保护基或H；X是连接部分，n是0或1；R7独立于R4、R5和R6，R7选自(1)-H，(2)保护基，(3)标记物，(4)寡核苷酸，和(5)固相，R5和R6彼此独立，并且独立于R4或R7，R5和R6选自(1)-H，(2)固相和连接部分X，(3)磷酸，和(4)带有核苷酸、修饰的核苷酸、寡核苷酸和修饰的寡核苷酸的磷酸二酯，条件是R5和R6不都是-H，都是固相和连接部分X，都是磷酸，或是-H和磷酸；当选自R5、R6或R7的一个残基是固相时，选自R5、R6或R7的其他残基不是固相。
在优选实施方案中，Y是O。
在本发明的另一优选实施方案中，单体单元是下式1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-山梨醇的衍生物
或是下式1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-甘露醇的衍生物 在另一优选实施方案中，R7独立于R4、R5和R6，R7选自-H、固相、保护基和标记物，最优选R7是-H或标记物，更优选R7是标记物。
在另一优选实施方案中，R5和R6彼此独立，并且独立于R7或R4，R5和R6选自-H、磷酸、带有寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的磷酸二酯。在另一优选实施方案中，R5和R6彼此独立，并且独立于R4或R7，R5和R6是带有寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的磷酸二酯。
在本发明的优选实施方案中，X是连接部分，n是1。在另一优选实施方案中，本发明的寡聚化合物的连接部分X含有碳和氧原子。在更优选实施方案中，连接部分X包含-(CH2)m或-(CH2CH2O)m部分，m是0和10之间的整数，优选1和10之间的整数。在更优选的实施方案中，连接部分X选自(1)-CO-(CH2)m-Z-(2)-CO-(CH2CH2O)m-CH2CH2-Z-其中m是0和10之间的整数，优选1和10之间的整数，Z选自NH、CO、O和S。在本发明非常优选的实施方案中，Z是NH或CO。在一个实施方案中，连接物是草酰基衍生物，即X是-CO-CO-，这意味着-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝0。然而，更优选地，m是2或3。因此最优选地，连接物是琥珀酸衍生物，即X是-CO-(CH2)2-CO-，这意味着-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝2。在另一优选实施方案中，连接物是戊二酸衍生物，即X是-CO-(CH2)3-CO-，这意味着-CO-(CH2)m-Z-中Z＝CO并且m＝3。
在优选实施方案中，本发明的寡聚化合物的保护基选自(1)芴基甲氧羰基，(2)二甲氧基三苯甲基，(3)单甲氧基三苯甲基，(4)三氟乙酰基，(5)乙酰丙酰基，或(6)甲硅烷基。
在本发明的另一优选实施方案中，本发明的寡聚化合物的R7是标记物，优选荧光标记物(或荧光染料)，优选选自(1)荧光素染料，(2)若丹明染料，(3)花青素染料，和(4)香豆素染料。
最优选的荧光标记物是荧光素或若丹明染料。
在本发明的另一优选实施方案中，本发明的寡聚化合物包含一种单体单元，它是(1)与核苷酸的碱基、糖或磷酸部分连接的第二标记物，优选第二荧光标记物，更优选带有第二荧光标记物的连接部分，或(2)与修饰的核苷酸或非核苷酸化合物连接的第二标记物，优选第二荧光标记物，更优选带有第二荧光标记物的连接部分。
第二荧光标记物优选是荧光素染料、若丹明染料、花青素染料或香豆素染料。最优选的第二荧光标记物是若丹明染料或花青素染料。
只有在存在第二标记物或荧光标记物的情况下，为清楚起见，标记物或荧光标记物也可被表示为第一标记物或第一荧光标记物。
在本发明的另一优选实施方案中，本发明的寡聚化合物包含一种单体单元，它是(1)与核苷酸的碱基、糖或磷酸部分连接的被保护的连接部分，(2)带有与修饰的核苷酸或非核苷酸化合物连接的保护基的连接部分。
在本发明的另一实施方案中，本发明的寡聚化合物的修饰的寡核苷酸包含一种单体单元，它包含选自下列的部分(1)环己烷-1，1-二甲醇(如US 6,130,323所述)，(2)1，3-丙二醇(如US 5,451,463所述)，(3)2，2-二-(3-氨基丙基)-1，3-二羟基丙烷(如EP0313219)，和(4)1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-己糖醇。
优选地，本发明的寡聚化合物的修饰的寡核苷酸包含一种单体单元，它包含本发明的1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-己糖醇部分。
为了以LightCycler_Instrument所用的形式使用，本发明的化合物在合成过程中优选地指向寡聚化合物的3’或5’末端。
优选地为了以TaqMan_形式使用，与本发明的寡聚化合物连接的标记物R7在本发明的寡聚化合物内部合成之后，可位于本发明的寡聚化合物的5’末端或3’末端。标记物优选地是荧光标记物，优选荧光素或若丹明染料。本发明的寡聚化合物可进一步包含其他标记物，其中标记物之一的发射波长与另一标记物的吸收波长重叠。优选地，寡聚化合物还包含用作淬灭剂的第二标记物，其淬灭荧光标记物(可以是荧光素)的荧光发射。优选的淬灭剂是荧光若丹明或花青素染料或非荧光标记物如dabcyl(“暗淬灭物”)。
在最优选的实施方案中，本发明的寡聚化合物不能酶促延伸，以用作TaqMan_形式中的探针，如US 5,210,015、US 5,478,972或US5,804,375原理性指出的。优选地，寡聚化合物3’末端的单体单元是2’，3’-二脱氧核苷酸或3’-磷酸化核苷酸。优选地为了用于TaqMan_形式，带有标记物(优选荧光标记物)的本发明的单体单元，以及带有另一标记物(优选第二荧光标记物)的第二单体单元，可位于本发明的寡聚化合物的内部，或位于本发明的寡聚化合物的5’末端和/或3’末端。
本领域技术人员会认识到本发明的化合物或本发明的寡聚化合物的己糖醇环可携带其他取代基，并仍能在本发明的方法中起作用。具体地说，己糖醇和连接部分可进一步携带卤素或烷基、烯基、炔基、任选含有杂原子的芳基或任选被已标出的取代基取代的杂芳基取代基。通过例如1.5.中、LightCycler_instrument或TaqMan_所用的测试方式中、利用亚磷酰胺或与固相连接的化合物的本发明的化学合成方法中描述的与互补寡核苷酸的简单杂交实验，可以检测这些化合物是否可用于本发明的方法或用途。
在进一步的实施方案中，本发明的化合物，其中R2是亚磷酰胺或带有连接部分X的固相，R3是保护基，被本发明的修饰的寡核苷酸的化学合成。在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物被用于与核酸的杂交反应。这也可以用所谓阵列方式进行。在本发明的另一实施方案中，本发明的寡聚化合物被用作引物、探针或俘获探针。
本发明的寡聚化合物可用本领域原理性描述的和本领域技术人员已知的方法合成。特别优选的结构单元(building blocks)是本发明的化合物。制备寡聚化合物，如特定序列的寡核苷酸和修饰的寡核苷酸的方法，是本领域已知的，包括例如适当序列的克隆和限制性处理，以及直接化学合成。化学合成方法可包括例如Narang，S.A.等，Methods inEnzymology 68(1979)90-98描述的磷酸三酯法，Brown，E.L.等，Methods in Enzymology 68(1979)109-151公开的磷酸二酯法，Beaucage等，Tetrahedron Letters 22(1981)1859公开的亚磷酰胺法，Garegg等，Chem.Scr.25(1985)280-282公开的H-磷酸酯法，和US4,458,066公开的固体支持物法。特别优选的是亚磷酰胺法。因此，在本发明的另一实施方案中，提供了本发明的寡聚化合物的化学合成方法，其包括以下步骤(a)提供本发明的化合物，其中R2是亚磷酰胺，R3是保护基，(b)提供通过3’-OH基团与固相结合的核苷或修饰的核苷的5’-OH基团，或提供通过3’-OH基团与固相结合的寡核苷酸或修饰的核苷的5’-OH基团，所述3’-OH基团是寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的3’末端的核苷酸或修饰的核苷酸的3’-OH基团，(c)将亚磷酰胺的磷原子与5’-OH基团反应，形成亚磷酸酯，将亚磷酸酯氧化为磷酸三酯，(d)任选地在下面步骤中将步骤(c)中任意的未反应的5’-OH基团与另一化合物反应，以避免步骤(c)中未反应的5’-OH基团发生进一步的反应(“加帽(Capping)”反应)，(e)任选地在除去本发明的化合物的保护基后，用核苷或修饰的核苷的亚磷酰胺衍生物重复步骤(a)至(d)，(f)从固相上切下寡聚化合物，除去保护基，由此将磷酸三酯转变为磷酸二酯，(g)分离寡聚化合物。
本发明的优选实施方案涉及合成本发明的化合物的方法，包括以下步骤(a)提供式III化合物，式III 其中R8和R9表示第一和第二O-保护基或一起形成苯亚甲基残基，其亚甲基与式III的两个氧原子相连；(b)将式III化合物与离去基团如对甲苯磺酰氯反应，得到式IV衍生物，式IV Tosyl表示对甲苯磺酰残基；(c)将式IV化合物与叠氮化物反应，得到式V化合物；式V
(d)在式V化合物的4位和6位氧原子上去保护，得到式VI化合物；式VI (e)用4，4’-二甲氧基三苯甲基残基保护6-OH部分，得到式VII化合物，式VII DMT表示4，4’-二甲氧基三苯甲基残基；(f)用还原剂如三苯基膦(triphenylphosphane)还原叠氮官能团，得到式VIII化合物；式VIII (g)将残基R1或任选带有连接部分X的残基R1与2氨基官能团偶联，得到式IX化合物，其中n是0或1，式IX (h)将亚磷酰胺官能团加到4位氧上，得到式X化合物，其中n
是0或1，式X (i)分离化合物。
本发明的一个优选实施方案涉及合成本发明的化合物的方法，包括以下步骤(a)提供式III化合物，式III (b)R8和R9表示第一和第二O-保护基或一起形成苯亚甲基残基，其亚甲基与式III的两个氧原子相连；(c)将式III化合物与离去基团如对甲苯磺酰氯反应，得到式IV衍生物，式IV Tosyl表示对甲苯磺酰残基；(d)将式IV化合物与另一离去基如溴化物反应，得到式XI化合物；
式XI (e)将式XI化合物与叠氮化物反应，得到式XII化合物；式XII (f)在式XII化合物的4位和6位氧原子上去保护，得到式XIII化合物；式XIII (g)用4，4’-二甲氧基三苯甲基残基保护6-OH部分，得到式XIV化合物，式XIV DMT表示4，4’-二甲氧基三苯甲基残基；(h)用还原剂如三苯基膦还原叠氮官能团，得到式XV化合物；
式XV (i)将残基R1或任选带有连接部分X的残基R1与2氨基官能团偶联，得到式XVI化合物，其中n是0或1，式XVI (j)将亚磷酰胺官能团加到4’位氧上，得到式XVII化合物，其中n是0或1，式XVII (k)分离化合物。
在本发明的另一实施方案中，试图(contemplate)用末端转移酶将本发明的化合物转变为多核苷酸或寡核苷酸。主要的方法是本领域技术人员已知的。在本发明的一个实施方案中，提供了酶促合成本发明的多聚或寡聚化合物的方法，其包括以下步骤(a)将本发明的化合物，其中所述化合物的R3是三磷酸酯，(b)在末端转移酶存在下，与多核苷酸、寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的3’末端的核苷酸或修饰的核苷酸的3’-OH基团温育，使化合物与3’-OH基团连接，释放焦磷酸化物，并(c)释放多聚或寡聚化合物。
在另一实施方案中，试图进行本发明的寡聚化合物的在后标记(post-labelling)。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了将标记物与本发明的寡聚化合物连接的方法，其中寡聚化合物的R7是保护基，所述方法包括以下步骤-除去保护基R7，并-将寡聚化合物的去保护部分与标记物反应。
去保护部分是NH2、OH或SH部分，优选NH2部分。
进行这些反应步骤的方法是本领域技术人员已知的。
在本发明的另一实施方案中，提供了检测样品中靶核酸的方法，包括以下步骤(a)提供怀疑含有靶核酸的样品，(b)提供本发明的寡聚化合物，其与靶核酸的一部分或全部基本上互补，(c)任选地用模板依赖型DNA聚合酶和引物扩增靶核酸，(d)在使寡聚化合物和靶核酸结合的条件下，使样品和寡聚化合物接触，(e)确定靶核酸和寡聚化合物之间的结合产物或杂交程度，作为靶核酸存在、不存在或它的含量的量度。
优选地，本发明的寡聚化合物含有两个标记物，优选两个荧光标记物。
扩增反应优选地用聚合酶链式反应进行，其特异性地将靶核酸扩增到可检测的量。其他可能的扩增反应是连接酶链式反应(LCR；Wu，D.Y.和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569；和Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)；聚合酶连接酶链式反应(Barany，F.，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)；Gap-LCR(WO90/01069)；修复链反应(EP 0439182A2)，3SR(Kwoh，D.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，J.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；WO 92/08808)和NASBA(US5,130,238)。此外，还有链取代扩增(SDA)，转录介导的扩增(TMA)和Qβ扩增(综述见Whelen，A.C.和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.D.和Myers，T.W.，Current Opinion inBiotechnology 4(1993)41-47)。
优选的模板依赖型DNA聚合酶是Taq聚合酶。
在方法的优选实施方案中，试图用TaqMan_测试所用的形式，其中本发明的寡聚化合物被用作探针。因此，本发明的寡聚化合物包含标记物如R7，其优选是荧光标记物，优选荧光素。本发明的寡聚化合物还可包含其他荧光标记物，其中荧光标记物中的一个的发射波长与另一荧光标记物的吸收波长重叠。优选地，寡聚化合物还包含作为淬灭剂的第二荧光标记物，其淬灭荧光标记物(可以是荧光素)的荧光发射。优选淬灭剂是荧光若丹明和花青素。淬灭剂也可以是非荧光化合物或染料如dabcyl(“暗淬灭物”)。本发明的寡聚化合物不能酶促延伸，以用作TaqMan_形式中的探针，如US 5,210,015、US5,478,972或US 5,804,375原理性指出的。优选地，寡聚化合物3’末端的单体单元是2’，3’-二脱氧核苷酸或3’-磷酸化核苷酸。优选地为了用于TaqMan_形式，带有标记物的本发明的化合物，以及带有标记物的第二化合物，可位于本发明的修饰的寡核苷酸的内部，或位于本发明的修饰的寡核苷酸的5’末端和/或3’末端。作为TaqMan_测试所用形式的结果，在方法的测定步骤中，荧光标记物和第二标记物(即淬灭剂)的空间关系在杂交之后发生改变，优选地通过模板依赖型DNA聚合酶(优选Taq聚合酶)对核酸结合化合物进行核酸外切酶水解来进行；作为核酸外切酶水解的结果，标记物得到释放。本发明的寡聚化合物和核酸之间杂交的程度由杂交之后从本发明的寡聚化合物中释放的标记物的量来确定。因此，本发明的优选实施方案是在步骤(d)中，杂交的程度是由从与核酸杂交的寡聚化合物中释放的标记物的量确定的，所述释放是通过模板依赖型DNA聚合酶的核酸外切酶水解进行的。
在本发明的与TaqMan_测试密切相关的非常优选的实施方案中，提供了检测样品中靶核酸的方法，包括以下步骤(a)使含有单链核酸的样品与寡核苷酸和寡核苷酸以及本发明的寡聚化合物接触，所述寡核苷酸含有与靶核酸的一个区域互补的序列，本发明的寡聚化合物中R7是荧光标记物，寡聚化合物含有第二荧光标记物，所述寡聚化合物含有与相同靶核酸序列链的第二区域互补的序列，但不包含寡核苷酸所限定的序列；在杂交条件下产生双链混合物，所述双链含有与寡核苷酸和寡聚化合物退火的靶核酸，使得第一寡核苷酸的3’末端位于寡聚化合物5’末端的上游；(b)使步骤(a)的混合物保持有5’至3’核酸酶活性，所用的条件足以使聚合酶的5’至3’核酸酶活性切割退火的寡聚化合物，释放标记的片段；(c)检测和/或测量标记的片段的释放情况。
在本发明的另一实施方案中，提供了用于LightCycler_Instrument的形式，如US 6,174,670所描述的。为用于LightCycler_Instrument的形式，本发明的化合物优选在合成寡聚化合物之后位于寡聚化合物的3’或5’末端，即3’或5’末端的单体单元。这些形式应用了荧光共振能量转移技术(见例如美国专利4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)，并基于这样一个事实，即当供体和相应的受体荧光标记物处于一定距离之内时，在两个荧光标记物之间会发生能量转移，这可被看到或检测到和/或量化。如本文所用的，两个探针(各自含有荧光标记物，其中至少一个是本发明的寡聚化合物)可以在特定位置与扩增产物杂交，所述特定位置是通过探针与靶核酸的互补性确定的。本发明的寡聚化合物的荧光标记物可以是供体或受体荧光标记物。通过探针与扩增产物在适当位置的杂交，产生了FRET信号。可用例如光子记数epifluorescent显微系统(包括适当的二色性镜和滤镜，以监测特定范围内的荧光发射)、光子记数光倍增系统或荧光计，进行荧光分析。可用氩离子激光、高亮度水银(Hg)弧灯、纤维光学光源或其他高亮度光源来进行起始能量转移的激发，所述光源经过适当过滤以在所需范围内进行激发。关于本文所用的供体和相应的受体荧光标记物，“相应的”是指受体荧光标记物具有与供体荧光标记物的发射光谱重叠的激发光谱。相应地，在两者之间可产生有效的非辐射能量转移。优选的荧光标记物是以荧光素作为供体荧光标记物，受体荧光标记物是若丹明，但优选花青素染料，优选US 6,174,670描述的Cy5。
因此，在本发明的实施方案中，提供了检测样品中靶核酸是否存在的方法，包括以下步骤进行至少一个循环步骤，其中循环步骤包括扩增步骤和杂交步骤，其中扩增步骤包括将样品与引物接触，如果样品中存在靶核酸，则产生扩增产物；杂交步骤包括将样品与一对探针接触，探针对中的成员在彼此不超过5个核苷酸的条件下与扩增产物杂交，其中探针对中的第一探针用供体荧光标记物标记，探针对中的第二探针用相应的受体荧光标记物标记；检测所述第一探针的供体荧光标记物和所述第二探针的受体荧光标记物之间是否存在荧光共振能量转移，其中FRET存在表明样品中存在靶核酸，FRET不存在表明样品中不存在靶核酸。
因此，在本发明的优选实施方案中，提供了检测样品中靶核酸的方法，包括以下步骤在两个核酸探针存在下通过聚合酶链式反应扩增核酸，探针是本发明的寡聚化合物，与靶核酸的相邻区域杂交，探针中的一个用受体荧光标记物标记，另一探针用荧光能量转移对的供体荧光标记物标记，使得两个探针与靶核酸杂交之后，供体和受体荧光标记物彼此在25个核苷酸之内；所述聚合酶链式反应包括以下步骤向样品中加入热稳定聚合酶、核苷酸和靶核酸引物，在至少一个变性温度和一个延伸温度之间使样品热循环，用被供体荧光标记物吸收的一定波长的光激发生物样品，检测来自荧光能量转移对的荧光发射。
在本发明的另一优选实施方案中，提供了检测样品中靶核酸的方法，包括以下步骤在两个核酸探针存在下通过聚合酶链式反应扩增核酸，探针是本发明的寡聚化合物，与核酸的相邻区域杂交，探针中的一个用受体荧光标记物标记，另一探针用荧光能量转移对的供体荧光标记物标记，使得两个探针与靶核酸杂交之后，供体和受体荧光标记物彼此在25个核苷酸之内；所述聚合酶链式反应包括以下步骤向样品中加入热稳定聚合酶、核苷酸和靶核酸引物，在至少一个变性温度和一个延伸温度之间使样品热循环，用被供体标记物吸收的一定波长的光激发生物样品，监测来自荧光能量转移对的温度依赖性荧光。
在另一优选实施方案中，本发明试图保护部件的试剂盒，试剂盒包括具有3’至5’核酸外切酶活性的温度依赖型聚合酶，优选Taq聚合酶，一组引物，核苷酸和本发明的寡聚化合物。本领域已知这样的试剂盒还包括可在扩增过程中使用的塑料器皿，例如96或384孔微量滴定板，或者由例如Eppendorf、Hamburg、Germany制造的普通反应管，以及所有其他用于完成本发明方法的试剂。
在本发明的另一优选实施方案中，试剂盒包括用于分离核酸的其他试剂。因此，试剂盒可另外包括对核酸有亲和性的材料，对核酸有亲和性的材料优选地包括有二氧化硅表面的材料。有二氧化硅表面的材料优选地是玻璃。最优选地，对核酸有亲和性的材料是如WO96/41811或WO 01/37291中描述的含有磁性玻璃颗粒的组合物。试剂盒可另外包括使细胞裂解的裂解缓冲液，所述缓冲液含有例如离液剂(chaotropic agents)、去污剂、醇或它们的混合物；以及独立的蛋白酶，例如蛋白酶K，用于酶解不需要的蛋白。本发明的试剂盒的这些组分可在管或贮存容器中分别提供。根据组分的特性，它们甚至可在单一的管或贮存容器中提供。试剂盒可另外包括洗涤溶液，其适用于当DNA或RNA与磁性玻璃颗粒结合时洗涤磁性玻璃颗粒的步骤。洗涤溶液可在一种或几种缓冲液中含有乙醇和/或离液剂，所述缓冲液是酸性pH的，不含乙醇和/或如上文所述的离液剂。洗涤溶液或其他溶液通常以贮存液形式提供，在使用前稀释。试剂盒可另外包括洗脱液或洗脱缓冲液，即将与磁性玻璃颗粒结合的DNA或RNA洗脱下来的溶液或缓冲液(例如10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)或纯水。此外还可以有用于纯化核酸(即DNA或RNA)的其他试剂或缓冲液。
提供以下实施例、参考文献、序列表和附图以帮助理解本发明，本发明的实际保护范围由所附权利要求书给出。应理解在不背离本发明精神的条件下，可以对本发明的方法进行修改。
图1基于1，5-内醚-3-脱氧-D-甘露醇(8)和山梨醇(15)的荧光素标记的亚磷酰胺的合成。
图2得自Biogenex的标记试剂FAM-和HEX-cx-亚磷酰胺(FAM荧光素；HEX六氯荧光素)。
图36-O-DMT-1，5-内醚-2，3-二脱氧-2-(N-Fmoc-6-氨基己酰基氨基)-D-甘露醇-4-亚磷酰胺(17)的合成。
图4用修饰的寡核苷酸进行的杂交实验，所述修饰的寡核苷酸通过来源于己糖醇的本发明的化合物掺入了FAM残基(Flu＝FAM-本发明的甘露醇化合物，FAM表示通过连接部分与甘露醇部分连接的荧光素)。
1.实施例1.1制备实施例-合成的一般性描述新的结构单元8和15的合成由商业上可得到的4，6-O-苯亚甲基-1，5-内醚-3-脱氧-D-山梨醇1起始，如图1所示。首先，2-羟基以89％的产率被甲苯磺酰化，得到2，其作为最终甘露醇异构剂(isomeric reagent)的中间体。为了得到相应的山梨醇衍生物，C-2的构型必须转变。这通过用溶于吡啶的溴化锂进行SN2型亲核取代反应来完成，以66％的产率得到9。中间体2和9与溶于DMF的叠氮钠反应，通过SN2型亲核取代反应再次转变C-2的构型，分别以97％和66％的产率得到甘露醇异构体2-叠氮基衍生物3和山梨醇异构体2-叠氮基衍生物10。用80％乙酸几乎定量地进行苯亚甲基的去保护，得到4(93％)和11(98％)。其后，以77％的产率加入二甲氧基三苯甲基基团，得到中间体5和12。通过Staudinger反应还原叠氮基团，分别以93％和91％的产率得到2-氨基衍生物6和13。6和13与6-羧基荧光素二新戊酰(dipivaloate)(其被溶于DMF和N-甲基吗啉的氯甲酸异丁酯原位激活)反应，以75％的产率得到化合物7和14。与溶于二氯甲烷的2-氰基乙氧基-二异丙基氨基-氯-膦和Hünigs碱反应，分别以81％的产率得到甘露醇构型(8)的相应的荧光素标记的亚磷酰胺，以88％的产率得到山梨醇构型(15)的相应的荧光素标记的亚磷酰胺。
从4，6-O-苯亚甲基-1，5-内醚-3-脱氧-D-山梨醇1起始，可以得到总产率为34.9％的二新戊酰基(dipivaloyl)保护的用6-羧基荧光素标记的甘露醇构型的亚磷酰胺8，对相应的山梨醇构型的亚磷酰胺15而言总产率为17.6％，该产率比Biogenex连接物合成途径(US 6,130,323)的总产率高。
用1H-NMR、31P-NMR和HPLC表征FAM标记的亚磷酰胺8和15。与Biogenex衍生物相比，新的单体除了在合成的方便性和产率方面具有出色的合成可达性(accessibility)之外，还具有其他优点。通过使用甘露醇构型(8)或山梨醇构型(15)的结构单元，可以容易地使寡核苷酸中的标记物分子朝向5’方向或3’方向。这对于一些FRET应用是有利的。在使用亲脂标记物时，在己糖醇环中加入醚官能团对溶解性来说是有利的。
1.2制备实施例-合成的详细描述1.2.1 1，5-内醚-2-O-甲苯磺酰基-4，6-O-亚苄基-3-脱氧-D-山梨醇(2)将15g(63.8毫摩尔)1，5-内醚-4，6-O-亚苄基-3-脱氧-D-山梨醇(CMS化学公司)和16.6g(86.2毫摩尔)对甲苯磺酰氯溶解于80毫升的吡啶中，室温下搅拌过夜。然后加入300毫升的水，使产物结晶。反应混合物在+4℃下搅拌5小时，使结晶完全。过滤出固体，用冷水清洗，在高真空下用示蓝(blue-indication)硅凝胶干燥，得到22.0g(88％)的无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.86(d，2H，Tos)，7.51(d，2H，Tos)，7.41-7.34(m，5H，苯亚甲基)，5.56(s，1H，苯亚甲基-CH)，4.56(m，1H，山梨醇-C-2)，4.18/4.14(dd，1H，山梨醇-CH)，3.84/3.80(dd，1H，山梨醇-CH)，3.62-3.53(m，2H，山梨醇-CH)，3.43-3.37(m，1H，山梨醇-CH)，3.31-3.25(m，1H，山梨醇-CH)，2.43(s，3H，CH3)，2.14(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.75(q，1H，山梨醇-C-3-H)1.2.2 1，5-内醚-2-叠氮基-4，6-O-亚苄基-2，3-二脱氧-D-甘露醇(3)将10g(25.0毫摩尔)1，5-内醚-2-O-甲苯磺酰基-4，6-O-亚苄基-3-脱氧-D-山梨醇(2)和6.5g(100毫摩尔)叠氮钠溶解于250毫升的DMF中，130℃下搅拌4.5小时。然后蒸发掉DMF。残余物溶解于400毫升乙酸乙酯中，用200毫升0.1M的pH7.5的磷酸缓冲液清洗两次。分离出有机层，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发。残余物溶解于25毫升的乙酸乙酯中，通过快速(flash)层析用硅凝胶纯化(正己烷/乙酸乙酯2∶3)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到6.5g(97％)的无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.43-7.35(m，5H，苯亚甲基)，5.65(s，1H，苯亚甲基-CH)，4.17-4.12(m，2H，甘露醇-CH)，3.90-3.80(m，2H，甘露醇-CH)，3.72-3.65(m，2H，甘露醇-CH)，3.39-3.32(m，1H，甘露醇-C-2-H)，2.12-2.07(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1.93 1.84(m，1H，甘露醇-C-3-H)1.2.3 1，5-内醚-2-叠氮基-2，3-二脱氧-D-甘露醇(4)将13g(49.9毫摩尔)1，5-内醚-2-叠氮基-4，6-O-亚苄基-2，3-二脱氧-D-甘露醇(3)溶解于700毫升80％的乙酸中，80℃下搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至室温，蒸发至干燥。将残余物溶解于50毫升的乙酸乙酯中，加入250毫升的正己烷。将反应瓶在4℃下保存过夜。移出上清，将油性的残余物在高真空下干燥，得到8.0g(93％)的黄色油。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)4.98(sb，1H，OH)，4.58(sb，1H，OH)，3.81-3.77(m，1H，甘露醇-CH)，3.70-3.65(m，1H，甘露醇-CH)，3.57-3.37(m，3H，甘露醇-CH)，3.04-2.99(m，1H，甘露醇-C-2-H)，2.09-2.02(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1.66-1.58(m，1H，甘露醇-C-3-H)1.2.4 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-1，5-内醚-2-叠氮基-2，3-二脱氧-D-甘露醇(5)将7.6g(44毫摩尔)1，5-内醚-2-叠氮基-2，3-二脱氧-D-甘露醇(4)与3×40毫升的吡啶共蒸发，然后溶于120毫升的吡啶。在搅拌下于1小时之内室温下加入溶于120毫升吡啶的19.6g(53.3毫摩尔)的4，4’-二甲氧基三苯甲基氯。在室温下将反应混合物再搅拌2小时。蒸发掉吡啶，将残余物溶于800毫升的乙酸乙酯，用400毫升5％的碳酸氢钠溶液清洗2次。分离出有机层，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于30毫升的乙酸乙酯中，通过快速层析用硅凝胶纯化(正己烷/乙酸乙酯/1％三乙胺梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到15.8g(77％)的淡黄色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.41(d，2H，DMT)，7.32-7.18(m，7H，DMT)，6.87(d，4H，DMT)，4.86(d，1H，OH)，3.89(m，2H，甘露醇-C-1-H)，3.73(s，6H，OCH3)，3.60-3.55(m，1H，甘露醇-CH)，3.48-3.43(m，1H，甘露醇-CH)，3.34-2.27(m，2H，甘露醇-C-6-H)，2.99(m，1H，甘露醇-C-H-2)，2.09-2.04(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1.68-1.59(m，1H，甘露醇-C-3-H)1.2.5 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-甘露醇(6)将6.5g(13.7毫摩尔)6-O-DMT-1，5-内醚-2-叠氮基-2，3-二脱氧-D-甘露醇(5)溶于70毫升吡啶和50毫升32％氨水中，然后加入6.1g(23.3毫摩尔)三苯基膦。反应混合物在室温下搅拌18小时。然后蒸发反应混合物。将残余物溶于400毫升的乙酸乙酯，用200毫升5％的碳酸氢钠溶液清洗2次。分离出有机层，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于10毫升的乙酸乙酯中，通过快速层析用硅凝胶纯化(乙酸乙酯/甲醇/1％三乙胺梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到5.7g(93％)的无色泡沫。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)7.42(d，2H，DMT)，7.34-7.19(m，7H，DMT)，6.84(d，4H，DMT)，3.89-3.80(m，1H，甘露醇-CH)，3.79(s，6H，OCH3)，3.69-3.65(m，1H，甘露醇-CH)，3.52-3.46(2m，2H，甘露醇-CH)，3.32-3.26(m，2H，甘露醇-C-H-1)，3.13(m，1H，甘露醇-C-H-2)，2.10-1.90(m，4H，甘露醇-C-3-H，NH2，OH)，1.68-1.59(m，1H，甘露醇-C-3-H)1.2.6 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊酰基-荧光素基-6-甲酰氨基)-1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-甘露醇(7)将0.76g(1.27毫摩尔)6-羧基荧光素-二新戊酰和155微升(1.4毫摩尔)N-甲基吗啉在氩气氛下溶于15毫升DMF中。将反应混合物冷却至-25℃，加入170微升(1.3毫摩尔)氯甲酸异丁酯。在-25℃下搅拌反应混合物30分钟后，于15分钟内加入溶于10毫升DMF的0.56g(1.27毫摩尔)6-O-DMT-1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-甘露醇(6)和140微升(1.3毫摩尔)N-甲基吗啉。在-25℃下搅拌反应混合物1小时。然后蒸发DMF。将残余物溶于200毫升乙酸乙酯，用100毫升0.1M的pH7.5的磷酸钠溶液清洗2次。分离出有机层，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于5毫升的乙酸乙酯中，通过快速层析用硅凝胶纯化(正己烷/乙酸乙酯/1％三乙胺梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到0.92g(75％)的无色固体。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)8.09(d，1H，荧光素)，7.93(d，1H，荧光素)，7.56(s，2H，荧光素)，7.41(d，2H，DMT)，7.33-7.25(m，7H，DMT)，7.09(s，2H，荧光素)，6.85-6.79(m，8H，4H来自DMT，4H来自荧光素)，6.55(d，1H，NH)，4.35(m，1H，甘露醇-CH)，3.91-3.70(2m，2H，甘露醇-CH)，3.81(s，6H，OCH3)，3.64-3.60(m，1H，甘露醇-CH)，3.52-3.46(m，1H，甘露醇-CH)，3.36-3.30(m，2H，甘露醇-CH)，2.88(m，1H，甘露醇-CH)，2.39(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1.70-1.60(m，2H，甘露醇-C-3-H，OH)，1.37(s，18H，叔丁基)1.2.7 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊酰基-荧光素基-6-甲酰氨基)-1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-甘露醇-4-O-[N，N-二异丙基-(2-氰乙基)]-亚磷酰胺(8)在氩气氛下将0.92g(0.94毫摩尔)6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊酰基-荧光素基-6-甲酰氨基)-1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-甘露醇(7)溶于30毫升二氯甲烷中。然后加入285微升(1.67毫摩尔)N-乙基二异丙基胺，并在15分钟内加入溶于15毫升二氯甲烷的氯-2-氰乙氧基-二异丙基胺-膦。反应混合物在室温下搅拌1小时。然后加入150毫升的二氯甲烷。用100毫升0.1M的pH7.5的磷酸钠缓冲液清洗反应混合物2次。分离出有机层，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于5毫升的正己烷/丙酮1∶1溶液中，通过快速层析用硅凝胶纯化(正己烷/丙酮梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到0.9g(81％)的无色泡沫。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)8.02-6.76(m，23H，13H来自DMT，9H来自荧光素，NH)，4.35-3.12(m，11H，CH2OP，7H来自甘露醇，CH(iPr))，3.80/3.79(2s，6H，OCH3)，2.47(t，2H，CH2CN)，2.35-2.13(m，1H，甘露醇-C-H-3)，1.85-1.72(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1.37/1.32(3s，18H，叔丁基)，1.07-0.84(3d，12H，CH3来自iPr)31P-NMR(CDCl3，in ppm)150.1/148，21.2.8 1，5-内醚-2-溴-4，6-O-亚苄基-2，3-二脱氧-D-甘露醇(9)将30g(7.8毫摩尔)1，5-内醚-2-O-甲苯磺酰基-4，6-O-亚苄基-3-脱氧-D-山梨醇(2)和2.2g(25毫摩尔)溴化锂溶于60毫升吡啶中，60℃下搅拌7天。然后蒸发吡啶。将残余物溶于5毫升的乙酸乙酯中，通过快速层析用硅凝胶纯化(正己烷/乙酸乙酯梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到1.5g(64％)的无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.44-7.34(m，5H，苯亚甲基)，5.72(s，1H，苯亚甲基-CH)，4.80(m，1H，甘露醇-CH)，4.17(m，1H，甘露醇-CH)，4.08(m，1H，甘露醇-CH)，3.94(m，2H，甘露醇-CH)，3.75(t，1H，甘露醇-CH)，3.46-3.39(m，1H，甘露醇-CH)，2.29-2.18(m，2H，甘露醇-C-3-H)1.2.9 1，5-内醚-2-叠氮基-4，6-O-亚苄基-2，3-二脱氧-D-山梨醇(10)将1.45g(4.85毫摩尔)1，5-内醚-2-溴-4，6-O-亚苄基-3-脱氧-D-甘露醇(9)和1.26g(19.4毫摩尔)叠氮钠溶于30毫升DMF中，在90℃下搅拌7天。然后蒸发反应混合物，通过快速层析用硅凝胶纯化(正己烷/乙酸乙酯6∶1)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到0.83g(66％)的无色固体。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.44-7.36(m，5H，苯亚甲基)，5.62(s，1H，苯亚甲基-CH)，4.20-4.15(m，1H，山梨醇-CH)，4.00-3.96(m，1H，山梨醇-CH)，3.86-3.59(2m，3H，山梨醇-CH)，3.32-3.21(m，2H，山梨醇-CH)，2.42-2.38(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.59(q，1H，山梨醇-C-3-H)1.2.10 1，5-内醚-2-叠氮基-2，3-二脱氧-D-山梨醇(1 1)将0.8g(3.1毫摩尔)1，5-内醚-2-叠氮基-4，6-O-亚苄基-2，3-二脱氧-D-山梨醇(10)溶于80毫升80％乙酸中，80℃下搅拌1小时。反应混合物冷却至室温，蒸发至干燥。将残余物溶于4毫升乙酸乙酯中，加入40毫升正己烷。移出上清，在高真空下干燥油性残余物，得到0.52g(98％)无色的油。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)5.02(db，1H，OH)，4.52(tb，1H，OH)，3.90-3.85(m，1H，山梨醇-CH)，3.67-3.58(m，2H，山梨醇-CH)，3.40-3.31(m，2H，山梨醇-CH)，3.05-2.92(2m，2H，山梨醇-CH)，2.28(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.32(q，1H，甘露醇-C-3-H)1.2.11 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-1，5-内醚-2-叠氮基-2，3-二脱氧-D-山梨醇(12)将0.52g(3.0毫摩尔)1，5-内醚-2-叠氮基-2，3-二脱氧-D-山梨醇(11)溶于9毫升吡啶中。在搅拌下于30分钟之内室温下加入溶于9毫升吡啶的1.1g(3.2毫摩尔)4，4’-二甲氧基三苯甲基氯。反应混合物在室温下再搅拌3小时。然后蒸发吡啶，将残余物溶于100毫升乙酸乙酯中，用60毫升5％的碳酸氢钠溶液清洗两次。分离出有机层，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于5毫升的乙酸乙酯中，通过快速层析用硅凝胶纯化(正己烷/乙酸乙酯/1％三乙胺梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到1.1g(77％)的无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.40(d，2H，DMT)，7.32-7.18(m，7H，DMT)，6.87(d，4H，DMT)，4.99(d，1H，OH)，3.99-2.98(m，7H，山梨醇-CH)，3.73(s，6H，OCH3)，2.30(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.34(m，1H，山梨醇-C-3-H)1.2.12 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-山梨醇(13)将1.1g(2.3毫摩尔)6-O-DMT-1，5-内醚-2-叠氮基-2，3-二脱氧-D-山梨醇(12)溶于11毫升吡啶和9毫升32％氨水中，然后加入1.0g(3.9毫摩尔)三苯基膦。反应混合物在室温下搅拌18小时。蒸发反应混合物。将残余物溶于180毫升乙酸乙酯中，用100毫升5％的碳酸氢钠溶液清洗2次。分离出有机层，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于5毫升的乙酸乙酯中，通过快速层析用硅凝胶纯化(乙酸乙酯/甲醇/1％三乙胺梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到0.94g(91％)的无色泡沫。
1H-NMR(DMSO-d6，in ppm)7.40(d，2H，DMT)，7.31-7.12(m，7H，DMT)，6.87(d，4H，DMT)，4.67(sb，1H，OH)，3.77(m，1H，山梨醇-CH)，3.72(s，6H，OCH3)，3.50-3.06(m，5H，3H山梨醇-CH，NH2)，2.96(dd，1H，山梨醇-CH)，2.82(t，1H，山梨醇-CH)，2.63(m，1H，山梨醇-CH)，2.06(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.07(q，1H，山梨醇-C-3-H)1.2.13 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊酰基-荧光素基-6-甲酰氨基)-1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-山梨醇(14)将1.22g(2.0毫摩尔)6-羧基荧光素-二新戊酰和255微升(2.25毫摩尔)N-甲基吗啉在氩气氛下溶于25毫升DMF中。将反应混合物冷却至-25℃，加入289微升(2.1毫摩尔)氯甲酸异丁酯。在-25℃下搅拌反应混合物30分钟后，于30分钟内加入溶于20毫升DMF的0.90g(2.0毫摩尔)6-O-DMT-1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-山梨醇(13)和225微升(2.0毫摩尔)N-甲基吗啉。在-25℃下搅拌反应混合物1小时。然后蒸发DMF。将残余物溶于150毫升乙酸乙酯，用100毫升0.1M的pH7.5的磷酸钠溶液清洗2次。分离出有机层，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于10毫升的乙酸乙酯中，通过快速层析用硅凝胶纯化(正己烷/乙酸乙酯/1％三乙胺梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到1.44g(75％)的无色固体。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)8.09(d，2H，荧光素)，7.42(d，2H，DMT)，7.33-7.22(m，8H，7H来自DMT，1H来自荧光素)，7.06(d，2H，荧光素)，6.85-6.77(m，8H，4H来自DMT，4H来自荧光素)，6.33(d，1H，NH)，4.18(m，1H，山梨醇-CH)，4.03-3.98(m，1H，山梨醇-CH)，3.79(s，6H，OCH3)，3.75(m，1H，山梨醇-CH)，3.46(m，1H，山梨醇-CH)，3.31-3.26(m，2H，山梨醇-CH)，3.14-3.03(m，2H，山梨醇-CH)，2.31(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1,62(m，1H，甘露醇-C-3-H)，1,40(b，1H，OH)，1,38(s，18H，叔丁基)1.2.14 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊酰基-荧光素基-6-甲酰氨基)-1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-山梨醇-4-O-[N，N-二异丙基-(2-氰乙基)]-亚磷酰胺(15)在氩气氛下将0.48g(0.49毫摩尔)6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-(O，O’-二新戊酰基-荧光素基-6-甲酰氨基)-1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-山梨醇(14)溶于15毫升二氯甲烷中。然后加入1 60微升(0.89毫摩尔)N-乙基二异丙基胺，并在15分钟内加入溶于7毫升二氯甲烷的170mg(0.67毫摩尔)氯-2-氰乙氧基-二异丙基胺-膦。反应混合物在室温下搅拌1小时。然后加入100毫升的二氯甲烷。用50毫升0.1M的pH7.5的磷酸钠缓冲液清洗反应混合物2次。分离出有机层，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于5毫升的正己烷/丙酮1∶1溶液中，通过快速层析用硅凝胶纯化(正己烷/丙酮梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到0.51g(88％)的无色固体。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)8.12(m，2H，荧光素)，7.52-7.21(m，10H，9H来自DMT，1H来自荧光素)，7.08(m，2H，荧光素)，6.86-6.78(m，8H，4H来自DMT，4H来自荧光素)，6.51/6.39(2d，1H，NH)，4.30-3.17(m，11H，CH2OP，7H来自山梨醇，CH(iPr))，3.80/3.79(2s，6H，OCH3)，2.54/2.36(t，2H，CH2CN)，2.45(m，1H，山梨醇-C-H-3)，1.78-1.60(m，1H，山梨醇-C-3-H)，1.38/1.37(2s，18H，叔丁基)，1.11-0.88(4d，12H，CH3来自iPr)31P-NMR(CDCl3，in ppm)148.9/147.7
1.2.15 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-[N-(9-芴基甲氧羰基)-6-氨基己酰酰胺]-1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-甘露醇(16)将0.87g(2.8毫摩尔)N-Fmoc-6-氨基己酸和300微升(3.0毫摩尔)N-甲基吗啉在氩气氛下溶于25毫升DMF中。将反应混合物冷却至-25℃，加入350微升(2.8毫摩尔)氯甲酸异丁酯。在-25℃下搅拌反应混合物30分钟后，于15分钟内加入溶于15毫升DMF的1.12g(2.5毫摩尔)6-O-DMT-1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-甘露醇(6)和270微升(2.5毫摩尔)N-甲基吗啉。在-25℃下搅拌反应混合物1小时。然后蒸发DMF。将残余物溶于200毫升乙酸乙酯，用100毫升0.1M的pH7.5的磷酸钠溶液清洗2次。分离出有机层，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于10毫升的正己烷/乙酸乙酯1∶4溶液中，通过快速层析用硅凝胶纯化(正己烷/乙酸乙酯梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到1.35g(70％)的无色泡沫。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)7.76(d，2H，Fmoc)，7.58(d，2H，Fmoc)，7.43-7.17(m，13H，9H来自DMT，4H来自Fmoc)，6.84(d，4H，DMT)，5.93(d，1H，NH)，4.89(tb，1H，NH)，4.37(d，2H，Fmoc)，4.20(m，2H，1H来自甘露醇-CH，1H来自Fmoc)，3.79-3.67(m，1H，甘露醇-CH)，3.77(s，6H，OCH3)，3.56-3.01(5m，7H，5H甘露醇-CH，CH2N)，2.25(m，1H，甘露醇-C-3-H)，2.17(t，2H，CH2CO)，1.65-1.33(3m，8H，甘露醇-C-3-H，OH，CH2来自己酰基)1.2.16 6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-[N-(9-芴基甲氧羰基)-6-氨基己酰酰胺]-1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-甘露醇-4-O-[N，N-二异丙基-(2-氰乙基)]-亚磷酰胺(17)在氩气氛下将1.3g(1.69毫摩尔)6-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-[N-(9-芴基甲氧羰基)-6-氨基己酰酰胺]-1，5-内醚-2，3-二脱氧-D-甘露醇(16)溶于45毫升二氯甲烷中。然后加入550微升(3.07毫摩尔)N-乙基二异丙基胺，并在15分钟内加入溶于20毫升二氯甲烷的590mg(2.31毫摩尔)氯-2-氰乙氧基-二异丙基胺-膦(phosphane)。反应混合物在室温下搅拌1小时。然后加入100毫升的二氯甲烷。用100毫升0.1M的pH7.5的磷酸钠缓冲液清洗反应混合物2次。分离出有机层，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于10毫升的正己烷/丙酮1∶1溶液中，通过快速层析用硅凝胶纯化(正己烷/丙酮梯度)。将产物级分合并，在高真空下蒸发并干燥，得到1.5g(90％)的无色泡沫。
1H-NMR(CDCl3，in ppm)7.77(d，2H，Fmoc)，7.61(d，2H，Fmoc)，7.50(d，2H，Fmoc)，7.43-7.19(m，11H，9H来自DMT，2H来自Fmoc)，6.82(d，4H，DMT)，6.31(d，1H，NH)，4.90(t，1H，NH)，4.38(d，2H，Fmoc)，4.22-3.10(5m，14H，7H来自甘露醇-CH，1H来自Fmoc，CH2OP，CH2N，CH(iPr))，3.78(s，6H，OCH3)，2.78/2.58(2t，2H，CH2CN)，2.35(m，1H，甘露醇-C-3-H)，2.19(m，2H，CH2CO)，1.78-1.27(2m，7H，甘露醇-C-3-H，CH2来自己酰基)，1.06/0.89(2d，12H，CH3(iPr))31P-NMR(CDCl3，in ppm)150.0/148.31.3用亚磷酰胺合成修饰的寡核苷酸用自动寡核苷酸合成技术和亚磷酰胺途径可以将FAM-甘露醇-(8)或FAM-山梨醇-(15)-亚磷酰胺掺入寡核苷酸中，并与例如FAM-cx-Biogenex连接物(图2)比较。可以用标准方法对不同形式(format)中的不同探针进行检测，并根据背景信号、信号增益和cT值(例如在TaqMan_形式中)进行比较。
1.4用在后标记(postlabelling)合成修饰的寡核苷酸为了具有在合成后掺入标记物的机会，将用Fmoc保护的6-氨基己酰基连接部分与甘露醇结构单元6偶联，然后，用上述的类似物反应条件(1.2.15和1.2.16)以优良的产率将中间体16转变成相应的6-O-DMT-1，5-内醚-2，3-二脱氧-2-[N-Fmoc-6-氨基己酰酰胺]-D-甘露醇-4-亚磷酰胺(17)(图3)。用1H-NMR、31P-NMR和HPLC表征化合物17。单体17可以以高偶联产率掺入寡核苷酸。在从合成支持物上切割并去保护之后，成功地掺入了几个标记物(香豆素、若丹明、花青素等)。
1.5修饰的寡核苷酸的杂交实验如上所述(1.3)合成图4中公开的寡核苷酸和修饰的寡核苷酸，通过用标准方法确定熔化温度来检测它们在PCR缓冲液(50mM Tris，3mM氯化镁)中的杂交情况。熔化温度的测定是用Uvikon 931光度计(Kontron Instruments)在260nm下进行的。每种寡核苷酸链在Tm缓冲液中的终浓度是1μM。温度方案15℃-95℃于160分钟内(加热和冷却)；时间斜率(ramp time)0.5℃/min。
可以看出，修饰的寡核苷酸保持了与互补寡核苷酸杂交的能力(见图4)。
参考文献Abramson，R.D.和Myers，T.W.，Current Opinion in Biotechnology 4(1993)41-47Andersen，M.W.等，Tetrahedron Lett.37(1996)8147-8150Barany，F.，PCR Meth.and Applic.1(1991)5-16Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193Beaucage，S.L.等，Tetrabedron Lett.22(1981)1859-1862Brown，E.L.等，Meth.in Enzymol.68(1979)109-151DE 3943522EP 0135587EP 0313219EP 0439182 A2Gait，M.J.，ed.，Oligonucl.Synth.，1984Garegg等，Chem.Scr.25(1985)280-282Giegrich等，Nucleosides & Nucleotides 17(1998)1987Guatelli，J.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878Hames，B.D.和Higgins，S.J.，eds.，Nucl.Acid Hybrid.，1984Hossain，N.等，J.Org.Chem.63(1998)1574-1582JP 60016982Kwoh，D.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177
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WO 90/01069WO 92/08808WO 93/25565WO 96/41811WO 9605213WO 97/43451Wu，D.Y.和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569
序列表<110>Roche Diagnostics GmbHF.Hoffmann-La Roche AG<120>甘露醇和山梨醇衍生物<130>21545<140>
<141>
<150>EP02028714.0<151>2002-12-20<150>US60/440,212<151>2003-15-01<150>EP03001215.7<151>2003-20-01<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>1caccccgtgc tgctgaccga 20<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸
<400>2gggcctcggt cagcagcacg gggtg25<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<220>
<223>第21位的N表示本发明的FAM-甘露醇化合物，其中FAM表示通过连接部分与甘露醇部分连接的荧光素<400>3caccccgtgc tgctgaccga n21<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>4gggcctcggt cagcagcacg gggtg25<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<220>
<223>第11位的N表示本发明的FAM-甘露醇化合物，其中FAM表示通过连接部分与甘露醇部分连接的荧光素
<400>5caccccgtgc ngctgaccga 20<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；寡核苷酸<400>6gggcctcggt cagcagcacg gggtg 2权利要求
1.式I化合物(式I) 其中Y选自O、S和NR4，R4是烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、保护基或H；X是连接部分，n是0或1；R1独立于R2、R3和R4，R1选自(1)保护基，(2)标记物，和(3)固相；R2和R3相互独立，并独立于R1或R4，R2和R3选自(1)-H，(2)保护基，(3)固相和连接部分X，(4)亚磷酰胺，(5)H-膦酸，和(6)三磷酸；条件是R3而不是R2可以是三磷酸，如果R3是三磷酸，则R1不是固相；R2和R3不都是固相，不都是亚磷酰胺，不都是H-膦酸、不都是-H，不都是保护基，不是亚磷酰胺和H-膦酸，不是固相和亚磷酰胺，或不是固相和H-膦酸；当选自R1、R2或R3的一个残基是固相时，选自R1、R2或R3的其他两个残基不是固相。
2.权利要求1的化合物，其特征在于连接部分X包含碳和氧原子。
3.权利要求1或2的化合物，其特征在于连接部分X包含-(CH2)m或-(CH2CH2O)m部分，其中m是1和10之间的整数。
4.权利要求1至3中任一项的化合物，其特征在于，连接部分X选自(1)-CO-(CH2)m-Z-(2)-CO-(CH2CH2O)m-CH2CH2-Z-其中m是0和10之间的整数，Z选自NH、CO、O和S。
5.权利要求4的化合物，其特征在于Y是0。
6.权利要求1至5中任一项的化合物，其特征在于保护基选自(1)芴基甲氧羰基，(2)二甲氧基三苯甲基，(3)单甲氧基三苯甲基，(4)三氟乙酰基，(5)乙酰丙酰基，和(6)甲硅烷基。
7.权利要求1至6中任一项的化合物，其特征在于标记物选自(1)荧光素染料，(2)若丹明染料，(3)花青素染料，和(4)香豆素染料。
8.权利要求1至7中任一项的化合物，其特征在于该化合物是1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-甘露醇或1，5-内醚-2-氨基-2，3-二脱氧-D-山梨醇的衍生物。
9.一种寡聚化合物，其包含式II单体单元 式II其中Y选自O、S和NR4，R4是烷基、烯基、炔基、芳基、酰基、保护基或H；X是连接部分，n是0或1；R7独立于R4、R5和R6，R7选自(1)-H，(2)保护基，(3)标记物，(4)寡核苷酸，和(5)固相，R5和R6彼此独立，并且独立于R4或R7，R5和R6选自(1)-H，(2)固相和连接部分X，(3)磷酸，和(4)带有核苷酸、修饰的核苷酸、寡核苷酸和修饰的寡核苷酸的磷酸二酯，条件是R5和R6不都是-H，都是固相和连接部分X，都是磷酸，或是-H和磷酸；当选自R5、R6或R7的一个残基是固相时，选自R5、R6或R7的其他残基不是固相。
10.权利要求9的寡聚化合物，其特征在于连接部分X包含碳和氧原子。
11.权利要求9或10的寡聚化合物，其特征在于连接部分X包含-(CH2)m或-(CH2CH2O)m部分，其中m是1和10之间的整数。
12.权利要求9至11中任一项的寡聚化合物，其特征在于，连接部分X选自(1)-CO-(CH2)m-Z-(2)-CO-(CH2CH2O)m-CH2CH2-Z-其中m是0和10之间的整数，Z选自NH、CO、O和S。
13.权利要求12的寡聚化合物，其特征在于Z是NH并且Y是O。
14.权利要求9至13中任一项的寡聚化合物，其特征在于保护基选自(1)芴基甲氧羰基，(2)二甲氧基三苯甲基，(3)单甲氧基三苯甲基，(4)三氟乙酰基，(5)乙酰丙酰基，和(6)甲硅烷基。
15.权利要求9至14中任一项的寡聚化合物，其特征在于标记物是荧光标记物。
16.权利要求9至15中任一项的寡聚化合物，其特征在于修饰的寡核苷酸包括一种单体单元，它是(1)带有与核苷酸连接的第二标记物的连接部分，或(2)带有与修饰的核苷酸或非核苷酸化合物连接的第二标记物的连接部分。
17.权利要求16的寡聚化合物，其特征在于第二标记物是第二荧光标记物。
18.权利要求15至17中任一项的寡聚化合物，其特征在于荧光标记物或第二荧光标记物选自(1)荧光素染料，(2)若丹明染料，(3)花青素染料，和(4)香豆素染料。
19.权利要求9至18中任一项的寡聚化合物，其特征在于寡聚化合物不能被酶促延伸。
20.权利要求19的寡聚化合物，其特征在于寡聚化合物3’末端的单体单元是2’，3’-二脱氧-核苷酸或3’-磷酸化核苷酸。
21.权利要求1至8中任一项的化合物在化学合成权利要求9至20中任一项的寡聚化合物中的用途，化合物中R2是带有连接部分X的亚磷酰胺或固相，R3是保护基。
22.权利要求9至20中任一项的寡聚化合物在与核酸的杂交反应中的用途。
23.权利要求9至20中任一项的寡聚化合物作为引物、探针或俘获探针的用途。
24.一种化学合成权利要求9至20中任一项的寡聚化合物的方法，其包括以下步骤(a)提供权利要求1至8中任一项的化合物，其中R2是亚磷酰胺，R3是保护基，(b)提供通过3’-OH基团与固相结合的核苷或修饰的核苷的5’-OH基团，或提供通过3’-OH基团与固相结合的寡核苷酸或修饰的核苷的5’-OH基团，所述3’-OH基团是寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的3’末端的核苷酸或修饰的核苷酸的3’-OH基团，(c)将亚磷酰胺的磷原子与5’-OH基团反应，形成亚磷酸酯，将亚磷酸酯氧化为磷酸三酯，(d)任选地在下面步骤中将步骤(c)中任意的未反应的5’-OH基团与另一化合物反应，以避免步骤(c)中未反应的5’-OH基团发生进一步的反应，(e)任选地在除去权利要求1至8中任一项的化合物的保护基后，用核苷或修饰的核苷的亚磷酰胺衍生物重复步骤(a)至(d)，(f)从固相上切下寡聚化合物，除去保护基，由此将磷酸三酯转变为磷酸二酯，(g)分离寡聚化合物。
25.一种酶促合成权利要求9至20中任一项的多聚化合物或寡聚化合物的方法，其包括以下步骤(a)将权利要求1至8中任一项的化合物，其中所述化合物的R3是三磷酸，在末端转移酶存在下，与多核苷酸、寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的3’末端的核苷酸或修饰的核苷酸的3’-OH基团温育，使化合物与3’-OH基团连接，释放焦磷酸，并(b)分离多聚或寡聚化合物。
26.一种将标记物与权利要求9至20中任一项的寡聚化合物连接的方法，寡聚化合物的R7是保护基，所述方法包括以下步骤(a)除去保护基R7，(b)将寡聚化合物的去保护部分与标记物反应。
27.一种检测样品中的靶核酸的方法，其包括以下步骤(a)提供怀疑含有靶核酸的样品，(b)提供权利要求9至20中任一项的寡聚化合物，其与靶核酸的一部分或全部基本上互补，(c)任选地用模板依赖型DNA聚合酶和引物扩增靶核酸，(d)在使寡聚化合物和靶核酸结合的条件下，使样品和寡聚化合物接触，(e)确定靶核酸和寡聚化合物之间的结合产物或杂交程度，作为靶核酸存在、不存在或它的含量的量度。
28.权利要求27的方法，其中寡聚化合物是权利要求15至20中任一项的寡聚化合物。
29.权利要求27或28的方法，其中步骤(d)中的杂交程度是通过从与靶核酸杂交的寡聚化合物释放的第一或第二荧光标记物的量确定的，所述释放是通过模板依赖型DNA聚合酶进行核酸外切酶水解而完成的。
30.一种检测样品中是否存在靶核酸的方法，其包括以下步骤进行至少一个循环步骤，其中循环步骤包括扩增步骤和杂交步骤，其中扩增步骤包括将样品与引物接触，如果样品中存在靶核酸，则产生扩增产物；杂交步骤包括将样品与一对探针接触，探针中的至少一个是权利要求9至20中任一项的寡聚化合物，其中R7是标记物，探针对中的成员在彼此不超过5个核苷酸的条件下与扩增产物杂交，其中探针对中的第一探针用供体荧光标记物标记，探针对中的第二探针用相应的受体荧光标记物标记；检测所述第一探针的供体荧光标记物和所述第二探针的受体荧光标记物之间是否存在荧光共振能量转移，其中荧光共振能量转移存在表明样品中存在靶核酸，荧光共振能量转移不存在表明样品中不存在靶核酸。
31.部件的试剂盒，其包括-具有3’至5’核酸外切酶活性的模板依赖型聚合酶；-一组引物，-核苷酸，和-权利要求9至20中任一项的寡聚化合物，其中R7是标记物。
全文摘要
本发明涉及包括甘露醇或山梨醇衍生物的化合物，它们可被用于组成寡聚化合物。本发明还涉及这些寡聚化合物在杂交方面的用途和作为探针的用途。此外，本发明公开了检测核酸的方法，其中使用了寡聚化合物。
文档编号C07D335/02GK1513849SQ200310123130
公开日2004年7月21日 申请日期2003年12月19日 优先权日2002年12月20日
发明者F·伯格曼, F 伯格曼, H·冯德埃尔茨, 掳６ , C·赛德尔, 露, K·温德尔 申请人:霍夫曼-拉曼奇有限公司