专利名称：酸碱法制备熊果酸的制作方法
技术领域：
本发明属于天然药物技术领域。具体涉及一种酸碱法制备熊果酸的方法。
背景技术：
熊果酸(Ursolic acid)又名乌索酸，系五环三萜类化合物。分子式C30H48O3，分子量456，广泛存在于山茱萸、山楂、车前草、夏枯草、女贞子、冬凌草、白花蛇舌草等植物中。
式I 式II熊果酸(式I)及其同分异构体——齐墩果酸(Oleanolic acid，式II)熊果酸具多种生理活性，除有抗炎、抗癌、抗病毒及抗皱等活性外(孙文基、张全房天然活性成分简明手册P579-580，中国医药科技出版社，1998)，近年又发现熊果酸具有抗肥胖(WO2003 011267)、抗动脉粥样硬化(J.Ethnopharmacology 84(2-3)2003)、诱导癌细胞凋亡(Anticancer Res 21(5)2001)、逆转肿瘤细胞为正常细胞(J.Cancer Res Clin.Oncol 1994)等功能。
目前熊果酸都从植物中提取、分离而得。常用材料为香茶菜(陈德昌中药化学对照品，中国医药科技出版社，2000)、车前草(孙文基天然药物成分提取分离与制备，中国医药科技出版社，1999)、夏枯草(中国中药杂志18(11)，1993)、长春花(CN1365978A)、女贞叶(CN1358733A)和女贞子(药物分析杂志13(5)，1993)等。在这些植物中，有的如车前草、夏枯草等含熊果酸不多，含量不及生药的0.5％；有的如香茶菜、女贞子则在含熊果酸的同时另含大量其它萜类化合物，同类杂质多，给提取、纯化带来困难。已知香茶菜中含有的萜类化合物，仅二萜类就多达五百余种(孙汉董、许云龙、姜北香茶菜属植物二萜化合物，科学出版社，2001)。
本发明人经研究比较分析了十种资源植物中的熊果酸及其同分异构体——齐墩果酸的含量，发现枇杷叶中的熊果酸在所测植物中含量最高，约是女贞叶的1.9倍，金钱草的2.5倍，白花蛇舌草的2.9倍，夏枯草的3.5倍，车前草的3.7倍，山茱萸的4.3倍。另外，枇杷叶中的齐墩果酸类杂质，亦远比女贞子等为低，枇杷叶所含的齐墩果酸量不到其熊果酸量的1/4，而女贞子中所含的齐墩果酸量比熊果酸多2.9倍(见表1)。
表1十种资源植物中的熊果酸(UA)和齐墩果酸(OA)含量比较*资源植物 UA量(％) UA相对含量 OA量(％) UA∶OA枇杷叶0.803100.00.163100∶20.3山楂肉0.80099.7 0.124100∶15.5女贞子0.62077.3 1.795100∶289.5连翘果0.60174.8 0.506100∶84.2女贞叶0.42853.3 0.104100∶24.3金钱草0.31739.5 0.057100∶18.0白花蛇舌草0.27834.7 0.061100∶21.9夏枯草0.22828.5 0.050100∶21.9车前草0.21627.0 0.066100∶30.6山茱萸0.18823.4 0.048100∶25.5*样品处理各取干燥粉碎的资源植物2g于30ml石油醚中，脱脂30分钟，然后分别加乙醚30ml，超声提取10分钟，各取乙醚提取液2ml，水浴蒸干，各用甲醇溶解并分别定容至5ml，供HPLC测定。
测定条件固定相为Beckman Ultrasphere C18反相柱(4.6×250mm，加4.6×50mm保护柱)；流动相为甲醇∶磷酸缓冲液(89∶11)，流量1ml/min，进样量20μl，检测波长215nm。
由此可见，枇杷叶确是制备熊果酸的好资源。
熊果酸的分离目前常用柱层析法，见林克勤等，中草药26(8)1995；樊明文等CN1358733A，2002；Kim SH et alPhytotherapyresearch VoL12.553-556，1998，尽管柱层析法能很好地分离熊果酸和近似杂质，但该法上样量小，收得率低，同时洗脱剂需用石油醚、苯、氯仿、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂，成本大，亦不利于生产安全。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述方法的不足之处，研究设计一种成本低、安全性好的简易制备熊果酸的方法。
本发明提供了一种酸碱法制备熊果酸的方法，该方法包括下列步骤一、水煮将枇杷叶加水(1∶8～10v/v)煮沸，弃水煮液，以除去枇杷叶中所含有机酸、糖类、鞣质等水溶性杂质；二、醇提用回流提取法使枇杷叶中的熊果酸溶于85～95％1∶10～15倍v/v乙醇中，回流提取1～2小时；三、脱色用0.1-1.0％活性炭搅拌吸附，30～60分钟以除去叶绿素、叶黄素等杂质；四、调碱将枇杷叶的醇提液用苛性钾或苛性钠调pH至10～14，静置过夜后过滤，除去杂质；五、酸析将碱性醇提液用HCl调pH至1～3，减压浓缩，熊果酸即可从酸醇溶液中析出，而黄酮、甾醇类杂质仍留酸醇中；六、水洗将酸醇析出物分别用酸性、碱性和中性蒸溜水洗涤，用量1∶100-200v/v，可进一步去除生物碱、盐和水溶性色素等杂质；七、析晶将上述水洗后的水不溶物，于85-100％乙醇中加热溶解，使呈过饱和状态，按水不溶物中的实测熊果酸量计，使浓度达6-10mg/ml，冷却后即有熊果酸结晶析出。
上述水煮、醇提、脱色、调碱、酸析、水洗、析晶各步骤可重复2-3次，以充分提取和去杂，其顺序也可适当颠倒或删减。按本法从枇杷叶中制备的熊果酸，经紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振谱、薄层和高效液相色谱及差示扫描量热法测定，均与熊果酸标准品相一致。用本工艺制备熊果酸收得率可达0.8-1.2％，通过反复结晶，熊果酸纯度可大于90％。
本工艺除适用枇杷叶制备熊果酸外，亦适用于从女贞叶、金钱草、女贞子、山楂、连翘、小蔓长春花、山茱萸、白花蛇舌草、夏枯草、车前草植物中制备熊果酸。
用酸碱法制备熊果酸，主要是利用熊果酸不溶于水，易溶于热乙醇，在酸性条件下易析出，在过饱和醇液中易结晶的特性设计的。
本发明提出用酸碱法制备熊果酸，除应用水和乙醇外，毋需其它有机溶剂，设备投资小，简便易行，得率高，产品纯。
图1、熊果酸标准品的HPLC图谱图2、枇杷叶熊果酸的HPLC图谱图3、枇杷叶熊果酸和熊果酸标准品的HPLC分析，显示枇杷叶熊果酸和熊果酸标准品的HPLC吸收峰相重叠。
图4、枇杷叶熊果酸的热分析图谱图5、熊果酸标准品的热分析图谱从图4、5显示两者的外推始点均为286℃，顶峰温度均为289℃。
具体实施例方式实施例1取市售枇杷叶(青)10kg，粉碎后，加水100kg，浸润30分钟后煮沸1小时，过滤，弃煮水液，滤渣再加60kg水，煮沸1小时，取滤渣、烘干、粉碎；取水煮后枇杷叶渣(干)1份，加85-95％乙醇10份(g/v)，于中药提取器中回流浸取2小时，过滤后收集醇提液(1)，残渣再用90-95％乙醇(1∶8，g/v)回流提取2小时，得醇提液(2)；合并(1)(2)醇提液；
在醇提液中加入0.3％活性炭(g/v)，搅拌吸附60分钟，过滤、除残渣，得枇杷叶脱色醇提液；将上述脱色醇提液用1mol/L NaOH调pH至11，静置过夜，离心或抽滤，除沉淀杂质，得碱性醇提物；碱性醇提物用6mol/L HCl调pH至3，经减压浓缩，抽滤得枇杷叶酸醇析出物。
在枇杷叶酸醇析出物中，加100倍(v/v)pH3酸性蒸馏水，搅拌溶洗15分钟，倾去水层后继用100倍(v/v)pH12碱性水溶洗15分钟，再用中性蒸馏水洗涤2次，得水不溶物；测定水不溶物中的熊果酸含量，按熊果酸含量计，以6-8mg/ml浓度溶于95％-100％乙醇中，加热溶解后，置10-20℃下自然析晶，将析晶体在无水乙醇中重结晶，用冷乙醇淋洗后，60℃真空干燥，即为枇杷叶熊果酸产品。
用HPLC仪对本品作色谱分析，对照品为中国药品生物制品检定所提供的熊果酸标准品(0742-200010)，仪器Waters HPLC仪，分析柱Inertsil ODS-3柱(4.6×250mm)，流动相∶乙腈∶水∶三氟醋酸＝85∶15∶0.1(v/v/v)，样品用甲醇溶解，浓度3.8mg/ml，进样量20μl，检测波长210nm，结果本品的延迟时间(RT)为19.493分，标准品为19.499分，两者的吸收峰叠合一起，提示本品与标准品为同一化合物——熊果酸(图1)。
实施例2取枇杷叶(黄)水煮后，残渣用95％乙醇分3次回流提取，每次乙醇用量为残渣重量的6-10倍；合并醇提液，加醇提液体积0.5％(g/v)的活性炭，在50-60℃下搅拌脱色60分钟；脱色醇提液加NaOH，使达0.1Mol/L，静置后过滤，除沉淀，滤液减压浓缩至流浸膏；用100倍量的pH1-2的酸水加于流浸膏中搅拌溶解，得水不溶物；水不溶物用蒸馏水洗涤至中性；
水洗后不溶物按实施例1方法，在乙醇中析晶和重结晶。
用本工艺从枇杷叶中制备的晶体，作差示扫描量热法(DifferentialScanning Calorimetry，DSC)测定，参比物用中国药品生物制品检定所提供的熊果酸标准品(0742-200010)，结果其热分析图谱(DSC曲线)两者基本一致，未见温度差(ΔT)，即作为定性的特征温度——外推始点(Onset)温度，两者均为286℃；峰顶温度(熔融温度)亦均为289℃，提示本晶体与参比物一样为纯一的熊果酸。(图2)。
实施例3按实施例1方法，将枇杷叶经水煮、醇提、脱色后得脱色醇提液；用6mol/L HCL调pH至1.5，回收乙醇得酸醇析出物和酸液；酸醇析出物用pH3-4水洗涤(1∶100v/v)，得水不溶物(1)；将酸液减压浓缩至流浸膏，用50-80℃pH1-2的酸水搅拌溶解，抽滤或离心，收集水不溶物(2)；将水不溶物(1和2)，用80-100倍95％乙醇回流溶解，用KOH调pH至12，于10-15℃处静置12小时。
离心或抽滤，除沉淀物，滤液用HCL调pH至3-4，减压浓缩至无醇味，静置过夜，过滤后得酸醇析出物；酸醇析出物用蒸馏水洗涤，直至无氯离子反应，烘干后用95％乙醇析晶和重结晶，方法同实施例1。
将所得结晶，在硅胶G薄层板上用下列展开剂作TLC分析，点样、展层后用10％硫酸乙醇显色剂显色(105℃5分钟)，对照品用中国药品生物制品检定所熊果酸标准品(110742-200212)，根据显色斑点计算迁移率(Rf)，结果两者经下列五种展开剂展层后，其迁移率(Rf值)完全一致(表2)，提示用本工艺从枇杷叶中提取的晶体和标准品一样均为熊果酸。
表2样品和熊果酸标准品的薄层层析(TLC)分析
权利要求
1.一种酸碱法提取熊果酸的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)水煮将粉碎的枇杷叶用1∶8-10倍V/V水煮沸，除去水溶性杂质；(2)醇提水煮后残渣经烘干后，用85-95％乙醇1∶10-15倍V/V回流提取1-2小时；(3)脱色醇提液加0.1-1.0％活性炭，搅拌吸附30-60分钟，以脱色；(4)调碱脱色醇提液用苛性钠或苛性钾调pH至10～14，静置后使杂质沉淀，除去；(5)酸析碱性醇提液用HCL或H2SO4调pH1～3，减压浓缩后使熊果酸从酸醇中析出，而其它植物色素、黄酮和甾体类杂质仍留存于酸醇液中；(6)水洗将酸析出物分别用酸性、碱性和中性水洗涤，得水不溶物；(7)析晶根据水不溶物中的熊果酸含量，按6-10mg/ml浓度，将水不溶物加热溶于85～100％乙醇中，冷却后即可析出熊果酸晶体。
2.按权利要求1所述生产熊果酸方法，其特征在于方法中的各步骤均可按需要重复2-3次操作；
3.按权利要求1所述生产熊果酸的方法，其特征在于其中所用原料为枇杷叶、山楂、女贞叶、女贞子、金钱草、连翘、小蔓长春花、白花蛇舌草、夏枯草、车前草或山茱萸。
全文摘要
本发明属天然药物技术领域。本发明提供了用酸碱法制备熊果酸的新工艺，通过将枇杷叶水煮、乙醇提取、活性炭脱色、调碱除杂、调酸析出及水洗、析晶等步骤提得熊果酸。采用本工艺生产熊果酸不仅得率高、产品纯，且生产中不用水和乙醇以外的其它有机溶剂，方法简便，成本低廉，生产安全。
文档编号C07J63/00GK1629180SQ20031012271
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月19日 优先权日2003年12月19日
发明者杨庆尧, 冯慧琴, 糜可, 杨晓彤, 于晓明, 周韵丽 申请人:杨庆尧, 周文轩