专利名称：血红素的制备方法
技术领域：
本发明涉及血红素制备方法的改进，具体而言就是对原料进行了加工处理，将血液或红细胞用蛋白沉淀剂沉淀制成血粉后，再用酸性丙酮抽提制备血红素。
背景技术：
血红素是一种优良的铁强化剂及抗贫血药，已被药理和临床研究所证实。它作为补铁剂可直接被人体吸收，吸收率高达10％～20％，疗效显著，副作用少。此外，血红素是制备肝脏机能改善剂原卟啉二钠盐和激光血卟啉诊治癌症药物的原料，可以作为食品制作中的色素添加剂，应用范围十分广泛。
通常血红素是从动物全血或其红细胞作原料来分离制备的。文献报道有许多方法，诸如冰醋酸法、丙酮法、碱基物---有机溶剂法，离子交换纤维素法和酶解法等。冰醋酸法是俄国学者Schalfeieff最早用于实验室提取、分离血红素的一种方法。系利用冰醋酸、氯化钠和血共热得血红素结晶，在当今工业上仍被采用。但是此法有很多缺点，冰醋酸耗量大，生产成本较高；生产中产生大量溶解在醋酸里的蛋白质废液，回收处理困难，工艺中提取和回收必须用耐腐蚀的装置；原料应新鲜，否则，收率和纯度均会显著下降。碱基物---有机溶剂法为日本佐藤治男发明，系用含有碱基物质的有机溶剂，使血红蛋白中的血红素与珠蛋白分解。血红素呈溶解状态，而珠蛋白则以固状物被沉淀下来，因此，两者较易分离开来。碱基物质为二乙氨、二氯醋酸、吡啶等有机胺、氨、苛性碳酸钠、苛性碱等金属氢氧化物。有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇等低级醇和丙酮、丁酮等酮类。此法使用大量的碱，也会造成工业污染，收率也不高(3～4g/L红细胞)。离子交换纤维素法是1983年芬兰科学家发明的，利用羧甲基纤维素(CMC)吸附血红素加以提取，该法得到的是CMC-血红素粉，要得到血红素纯品，还需进一步精制，成本提高，工艺也变得复杂。利用各种蛋白酶将血红蛋白水解成水溶性的氨基酸和多肽，将不溶于水的血红素分离出来，也是一种无化学污染的好办法，但是水解时间长，所得血红素也是粗品，仍需精制，生产成本提高。
早期的酸性丙酮提取法制备血红素，是用酸性丙酮直接提取溶血液，并加入醋酸钠，使血红素从提取液中析出，该法存在的问题是，若丙酮用量少，杂蛋白去除不净，用量大则可造成成本高，同时也给生产带来设备、周期等一系列难题，实用性大打折扣，所得血红素纯度只有60％左右。目前也有用酸性丙酮提取血粉得高纯度血红素的报道，但是血粉一般是采用低温冷冻法，或喷雾干燥法制成，需要特殊设备，使成本大大提高。目前国内一些厂家的产品因纯度不高售价仅￥6～10/g，纯度高的，售价约￥90/g，而纯度高的进口同类产品，售价高达￥300/g左右。
发明内容
综合比较以上工艺路线，本发明提出了采用蛋白沉淀剂沉淀全血或红细胞制备血粉，生产周期缩短，设备要求降低，产品纯度高，收率高，成本低，￥3～5/g，适合工业化生产。
经过试验发现，多种蛋白沉淀剂均有使血红蛋白及全血蛋白沉淀下来的效果，本发明采用的蛋白沉淀剂是下述溶液中的一种1)5％～30％三氯醋酸溶液2)5％～20％磺基水杨酸溶液3)10％～20％单宁酸溶液4)5％～15％磷钨酸钠溶液5)0.1mol/L～1.0mol/L BaCl2溶液6)0.8mol/L～1.5mol/L (NH4)2SO4溶液7)0.5mol/L～1.2mol/L CuSO4溶液8)0.1mol/L～1.5mol/L ZnSO4溶液9)0.1mol/L～1.5mol/L Zn(Ac)2溶液10)0.1mol/L～1.5mol/L CaCl2溶液11)0.5mol/L～1.5mol/L Pb(Ac)2溶液12)0.1mol/L～1.5mol/L MgSO4溶液13)丙酮14)95％乙醇-氯仿(1∶2～2∶1)15)60％～100％乙醇
16)60％～100％甲醇17)氯仿18)丙醇蛋白沉淀剂的用量是全血体积的2～3倍，是红细胞体积的0.5～1倍。本发明提供的血红素制备方法，工艺简单，操作容易，生产周期短，设备要求简单，收率及纯度高，适合工业化生产，下面结合实例具体说明。
具体实施例方式
实施例1新鲜猪血1000ml，加0.8％柠檬酸三钠作抗凝剂，柠檬酸三钠可用少量蒸馏水溶解并事先加入容器中，剧烈搅拌下加入丙酮1500ml，待蛋白沉淀完全后，抽滤。收集沉淀，挥干溶剂后碾碎成粉，加入盐酸丙酮2000ml，搅拌抽提10min，抽滤，用盐酸丙酮500ml分次洗涤沉淀至灰白色，合并滤液。滤液用1mol/L NaOH溶液调pH至6～7，析出沉淀，3000r/min离心10min，取沉淀。沉淀用0.1mol/L NaOH溶液200ml溶解，1mol/L HCl调pH至酸性，析出大量紫红色沉淀，3000r/min离心10min，去上清，沉淀用水洗至中性，37℃干燥，得血红素2.9g，产品纯度99.5％。
实施例2新鲜猪血1000ml，加0.8％柠檬酸三钠作抗凝剂，柠檬酸三钠可用少量蒸馏水溶解并事先加入容器中，3000r/min离心15min，倾出上清液，收集红细胞，再用0.9％NaCl溶液洗涤红细胞2次，得干净红细胞420ml。向红细胞中加入等体积的双蒸水，搅拌30min使溶血，然后加入30％三氯醋酸溶液200ml，搅拌10min，待沉淀完全后，3000r/min离心10min，得血红蛋白沉淀，加入酸性丙酮(pH＜3)2000ml，搅拌抽提10min，抽滤，沉淀用酸性丙酮洗至灰白色，合并滤液，约2500ml。滤液用1mol/L NaOH溶液调pH至中性，析出沉淀，3000r/min离心10min，收集沉淀。沉淀用0.1mol/L NaOH溶液200ml溶解，1mol/L HCl调pH至酸性，析出大量沉淀，3000r/min离心10min，沉淀用水洗至中性，37℃干燥，得血红素2.8g，产品纯度99.8％。
实施例3新鲜猪血1000ml，加0.8％柠檬酸三钠作抗凝剂，柠檬酸三钠可用少量蒸馏水溶解并事先加入容器中，3000r/min离心15min，倾出上清液，收集红细胞，再用0.9％NaCl溶液洗涤红细胞2次，得干净红细胞440ml，加入丙酮500ml，搅拌10min，待沉淀完全后，3000r/min离心10min，得血红蛋白沉淀，加入酸性丙酮(pH＜3)2000ml，搅拌抽提10min，抽滤，沉淀用酸性丙酮洗至灰白色，合并滤液，约2500ml。滤液用1mol/L NaOH溶液调pH至中性，析出沉淀，3000r/min离心10min，收集沉淀，沉淀用0.1mol/L NaOH溶液200ml溶解后，1mol/L HCl调pH至酸性，析出大量沉淀，3000r/min离心10min，沉淀用水洗至中性，37℃干燥，得血红素2.8g，产品纯度99.7％。
实施例4新鲜猪血1000ml，加0.8％柠檬酸三钠作抗凝剂，柠檬酸三钠可用少量蒸馏水溶解并事先加入容器中，3000r/min离心15min，倾出上清液，收集红细胞，再用0.9％NaCl溶液洗涤红细胞2次，得干净红细胞420ml。向红细胞中加入等体积的双蒸水，搅拌30min使溶血，然后加入0.5mol/L CuSO4溶液200ml，搅拌10min，待沉淀完全后，3000r/min离心10min，得血红蛋白沉淀，加入酸性丙酮(pH＜3)2000ml，搅拌抽提10min，抽滤，沉淀用酸性丙酮洗至灰白色，合并滤液，约2500ml。滤液用1mol/L NaOH溶液调pH至中性，析出沉淀，3000r/min离心10min，收集沉淀。沉淀用0.1mol/L NaOH溶液200ml溶解，1mol/L HCl调pH至酸性，析出大量沉淀，3000r/min离心10min，沉淀用水洗至中性，37℃干燥，得血红素2.7g，产品纯度99.8％。
实施例5新鲜猪血1000ml，加0.8％柠檬酸三钠作抗凝剂，柠檬酸三钠可用少量蒸馏水溶解并事先加入容器中，剧烈搅拌下加入15％磺基水杨酸溶液1000ml，待蛋白沉淀完全后，抽滤。收集沉淀，挥干溶剂后碾碎成粉，加入盐酸丙酮2000ml，搅拌抽提10min，抽滤，用盐酸丙酮500ml分次洗涤沉淀至灰白色，合并滤液。滤液用1mol/L NaOH溶液调pH至6～7，析出沉淀，3000r/min离心10min，取沉淀。沉淀用0.1mol/L NaOH溶液200ml溶解，1mol/L HCl调pH至酸性，析出大量紫红色沉淀，3000r/min离心10min，去上清，沉淀用水洗至中性，37℃干燥，得血红素2.9g，产品纯度99.5％。
血红素定性测定1.性状本法制备所得血红素，在反射光下呈钢蓝色粉末状晶体，显微镜下观察呈红色针状晶体，易溶于碱性溶液，如氨水和氢氧化钠溶液，不溶于盐酸、70％～80％乙醇、乙醚和水，在水中稳定，与对照品相同。
2.红外光谱分别取血红素对照品和样品以溴化钾压片，红外光谱扫描，结果表明，样品的红外图谱和对照品基本一致。
3.紫外光谱分别称取血红素对照品和样品适量，配成一定浓度，在波长300～500nm处扫描。结果显示，样品在385±1nm波长处有最大吸收，与对照品相同。
血红素定量测定1.绘制标准曲线精密称取血红素对照品18mg，至100ml容量瓶中，加0.1mol/L NaOH溶液适量使完全溶解后再用0.1mol/L NaOH溶液稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml置100ml容量瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液稀释至刻度，摇匀。用溶剂作空白，于波长385nm处测定吸光度值，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制标准曲线。
2.样品测定精密称取血红素样品约20mg，置100ml容量瓶中，加0.1mol/L NaOH溶液适量使完全溶解后，再用0.1mol/L NaOH溶液稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液3.0ml置100ml容量瓶中用0.1mol/L NaOH溶液稀释至刻度，摇匀。用溶剂作空白，于波长385nm处测定吸光度值，并计算含量。
权利要求
1.一种利用动物血液提取血红素的方法，用酸性丙酮溶液对动物血粉进行提取，其特征在于血粉的制备方法是采用在全血或红细胞中加入蛋白沉淀剂加以沉淀制备得到的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是采用的蛋白沉淀剂可以是下述溶液中的一种1)5％～30％三氯醋酸溶液2)5％～20％磺基水杨酸溶液3)10％～20％单宁酸溶液4)5％～15％磷钨酸钠溶液5)0.1mol/L～1.0mol/L BaCl2溶液6)0.8mol/L～1.5mol/L (NH4)2SO4溶液7)0.5mol/L～1.2mol/L CuSO4溶液8)0.1mol/L～1.5mol/L ZnSO4溶液9)0.1mol/L～1.5mol/L Zn(Ac)2溶液10)0.1mol/L～1.5mol/L CaCl2溶液11)0.5mol/L～1.5mol/L Pb(Ac)2溶液12)0.1mol/L～1.5mol/L MgSO4溶液13)丙酮14)95％乙醇～氯仿(1∶2～2∶1)15)60％～100％乙醇16)60％～100％甲醇17)氯仿18)丙醇
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是蛋白沉淀剂的用量是全血体积的2～3倍，是红细胞体积的0.5～1倍。
全文摘要
本发明涉及血红素的提取制备方法，向动物全血或其红细胞中加入适量蛋白沉淀剂沉淀蛋白，得到血粉，血粉用盐酸丙酮溶液抽提血红素，抽提液中加入碱液，调pH值6～7，析出血红素固体。利用本工艺生产血红素，生产周期短，设备要求简单，成本低，适合工业化生产。
文档编号C07F15/00GK1594337SQ20041004004
公开日2005年3月16日 申请日期2004年6月21日 优先权日2004年6月21日
发明者余蓉, 李晓红, 李秀玲, 杨继虞 申请人:四川大学