专利名称：抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及抗体应用技术的改进，具体讲是一种由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆(Paralichthys olivaceus)淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)单克隆抗体及其制备方法，属于分子免疫学和病毒学交叉技术领域。
背景技术：
淋巴囊肿病是一种慢性病毒病，患病鱼的表皮、鳍和尾部等处出现许多囊肿。淋巴囊肿病的病原为淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)，属于虹彩病毒科(Iridoviridae)。淋巴囊肿病流行地区较广，呈世界性分布，目前已知至少42科125种以上的鱼可被淋巴囊肿病毒感染。近年来，日本以及我国广东、福建、浙江、山东、河北等省养殖的鲈鱼、石斑鱼、真鲷、大菱鲆和美国红鱼等均发生过此病，此病全年可见，但在水温10-20℃为发病高峰期。发病初期病鱼运动、摄食尚正常，但生长缓慢；病情严重的基本不摄食，部分死亡；网箱和室内水泥池工厂化养殖牙鲆的感染率可高达90％以上。国内外检测鱼类病毒的方法大致归为四类组织病理学检测技术、细胞培养技术、免疫学检测技术、分子生物学检测技术。应用免疫学检测技术的关键在于制备高质量的抗血清，由于常规方法制备的抗血清为多克隆抗体，具有某些交叉反应，因而限制了病毒种型的特异性鉴定。近年来利用单克隆抗体技术，提高了免疫学检测技术的权威性和特异性，使鱼类病毒的诊断与鉴定更加可靠。但至今尚无牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体研制的报道。
发明内容
本发明的目的是填补有关鱼类淋巴囊肿病毒单克隆抗体研究的空白，提供一种由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体及其制备方法。本发明拟以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原，应用免疫学方法，制备出抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体。
本发明的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种由两株杂交瘤细胞分别分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体。该两株杂交瘤细胞的保藏单位CCTCC，地址中国武汉大学内，保藏日期2004/12/14，保藏号CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，该两培养物名称分别为小鼠杂交瘤细胞株LCDV-E1和LCDV-E2；与该两株杂交瘤细胞分泌的特异性抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体(简称淋巴囊肿病毒单抗B和C)发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；该淋巴囊肿病毒单抗B和C的金标记免疫电镜鉴定结果显示在牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即表征与该淋巴囊肿病毒单抗B和C发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；在倒置显微镜下观察，生长状态良好的杂交瘤细胞外观饱满、浑圆、折光性强、细胞形态均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞能够在体外无限繁殖；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗淋巴囊肿病毒的单克隆抗体。
一种由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法，该制备方法是以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原，经免疫balb/c小白鼠，应用免疫学方法，制备出抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体；再选择免疫学的检测鉴定方法，筛选鉴定出淋巴囊肿病毒单抗B和C。所述的选择免疫学的检测鉴定方法之一，是采用间接免疫荧光抗体法，筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗B和C。
所述的选择免疫学的检测鉴定方法之二，是采用斑点免疫印迹法，筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗B和C。
所述的选择免疫学的检测鉴定方法之三，是采用金标记免疫电镜法，筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗B和C，并确定其抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上。
一种由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体，即淋巴囊肿病毒单抗B和C作为在进行鱼类淋巴囊肿病毒流行病学调查过程中的应用。
所述的鱼类淋巴囊肿病毒流行病学调查的鱼类有许氏平鲉；真鲷；花鲈；云纹石斑鱼。
所述的淋巴囊肿病毒单抗B和C作为在进行淋巴囊肿病毒的靶器官调查过程中的应用。
所述的调查的组织或器官有牙鲆的肠道组织，和/或表皮组织，和/或鳃组织，和/或胃组织。
本发明的优点在于由于一种由两株杂交瘤细胞分别分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体，该两株杂交瘤细胞的保藏号CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，与该两株杂交瘤细胞分泌的特异性抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；该淋巴囊肿病毒单抗B和C的金标记免疫电镜鉴定结果显示在牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即表征与该淋巴囊肿病毒单抗B和C发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上，所以使得本发明的淋巴囊肿病毒单抗B和C产品真实存在，并有应用价值。杂交瘤细胞在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该细胞外观饱满、浑圆、折光性强、细胞形态均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞能够在体外无限繁殖；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗淋巴囊肿病毒单抗。
由于本发明采用了免疫荧光抗体方法和斑点免疫印迹方法，所以使得确认该淋巴囊肿病毒单抗与淋巴囊肿病毒发生的特异性结合反应真实存在。本发明尤其重要的是采用了金标记免疫电镜方法，将免疫标记技术与电镜技术结合起来，使之兼有两技术的优点，因此能够更加进一步直观地显示该淋巴囊肿病毒单抗与淋巴囊肿病毒发生的特异性结合反应在牙鲆淋巴囊肿病毒粒子的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即证实与该淋巴囊肿病毒单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于淋巴囊肿病毒的囊膜上。本发明的金标记免疫电镜结果直接显示出淋巴囊肿病毒单抗的抗原决定簇位于该病毒的囊膜上的这一成果，为建立淋巴囊肿病毒病的单克隆抗体诊断方法，为从分子水平上定位该病毒的靶器官，为研究该病毒感染动态及增殖特点、流行病学规律等奠定了坚实的基础。另外，该单抗的成功制备不仅为该病毒亚单位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗等的研制提供了理论依据和实践指导，而且可为不同地域、不同宿主病毒的区分和研究病毒的保护性抗原提供手段和方法。
由于本发明所述的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法是以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原，经免疫balb/c小白鼠，应用免疫学方法，制备出抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体；再经过免疫学检测鉴定技术筛选出淋巴囊肿病毒单抗。这样的制备技术路线充分发挥了现有免疫学技术的检测鉴定方法的作用和效果，尤其是金标记免疫电镜结果直接显示出淋巴囊肿病毒单抗的抗原决定簇位于该病毒的囊膜上，更显其优越性和先进性。
附图及其具体实施方式
本发明的实施例结合附图进一步说明如下图1为本发明的淋巴囊肿病毒单抗制备方法的工艺流程方框图。
图2为本发明的淋巴囊肿病毒单抗与病毒反应机理。
图3为采用免疫电镜方法鉴定结果图。
图4为采用免疫电镜方法鉴定结果图。
图5为采用间接免疫荧光抗体方法鉴定结果图。
图6为采用间接免疫荧光抗体方法鉴定结果图。
图7为采用免疫斑点印迹方法鉴定结果图。
图8间接免疫荧光抗体方法检测许氏平鲉囊肿细胞结果图。
本发明的
参见图1-8图1表示本发明的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法的工艺流程是以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原，应用免疫学方法，制备出抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体；再经免疫学的检测鉴定方法筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗。
图2中有1表示标记的羊抗小鼠IgG抗体(标记物分别为金粒子、酶、荧光素等)；2表示该淋巴囊肿病毒单抗；3表示淋巴囊肿病毒粒子。
图3显示在牙鲆淋巴囊肿病毒粒子的囊膜4上结合有大量的胶体金粒子5，此结果直接证明了淋巴囊肿病毒单抗的抗原决定簇位于淋巴囊肿病毒6的囊膜4上，图中标尺为100nm。
图4显示在牙鲆淋巴囊肿病毒粒子上结合有大量的胶体金粒子，此结果直接证实淋巴囊肿病毒单抗的抗原决定簇位与病毒的囊膜上。图中的标尺为100nm图5显示在间接免疫荧光抗体法检测结果中，发现囊肿细胞的细胞质边缘出现散布有块状、楔状的强阳性信号，并且数个成链圈状排列。
图6显示在间接免疫荧光抗体法检测结果中，发现囊肿切片中，细胞质边缘出现散布的块状强阳性信号，并且成链圈状排列。
图7显示在免疫斑点印迹鉴定结果中A淋巴囊肿病毒单抗与病毒发生特异性结合反应。反应结果为紫褐色；B阴性对照，以磷酸盐缓冲液代替淋巴囊肿病毒单抗进行孵育。反应结果为无色。
图8显示许氏平鲉囊肿细胞中散布有点状或带状的阳性信号。
参见图1-8，本发明研制成功了一种由两株杂交瘤细胞分别分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体。该两株杂交瘤细胞的保藏号CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，与该两株杂交瘤细胞分泌的特异性抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；该淋巴囊肿病毒单抗B和C的金标记免疫电镜鉴定结果显示在牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即表征与该淋巴囊肿病毒单抗B和C发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；在倒置显微镜下观察，生长状态良好的杂交瘤细胞外观饱满、浑圆、折光性强、细胞形态均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞能够在体外无限繁殖；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗淋巴囊肿病毒单抗。
本发明所述的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法，具体实施方式
如下实施例1研制抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体1、牙鲆淋巴囊肿病毒提纯(1)取患病牙鲆，先用70％酒精棉球消毒患部，再用灭菌手术刀切下囊肿，加入适量石英砂和10倍体积的TNE缓冲液(100mM NaCl，1mM EDTA，50mM Tris，pH 7.4)，匀浆；(2)匀浆液离心4℃，500g，30min，取上清；(3)上清液离心4℃，1800g，，30min，再次取上清；(4)用蔗糖和上清液配成30％(W/V)的蔗糖溶液，4℃，78500g离心120min，弃上清；(5)向沉淀添加TNE至1ml，将其轻置于蔗糖梯度液(37％、40％、47％、52％、57％、62％)(W/V)上方，4℃，78500g离心120min；(6)用一次性注射器小心吸出蔗糖梯度中的病毒带，调整蛋白含量为1mg/ml，-80℃保存，备用。
2、免疫免疫用小白鼠为4周龄雌性balb/c小白鼠，免疫共分4次进行，前2次免疫间隔为2周，后2次免疫间隔为1周。第1次，基础免疫，腹腔注射提纯病毒液加等体积福氏完全佐剂的混合液，免疫剂量为0.1ml；第2次，加强免疫，腹腔注射提纯病毒液加等体积福氏不完全佐剂的混合液，免疫剂量为0.1ml；第3次，加强免疫，尾静脉注射提纯的病毒液，免疫剂量为0.1ml；第4次，融合前的扩增免疫，尾静脉注射提纯的病毒液，免疫剂量为0.1ml。
3、细胞融合扩增免疫后的第三天，处死小白鼠，无菌取出脾细胞，与P3-X63-Ag8U1骨髓瘤细胞进行融合。
细胞融合操作步骤如下(1)乙醚麻醉供脾小鼠，无菌取出脾脏和胸腺后，分别过100目网筛，用RPMI-1640溶液吹下形成单细胞悬液。
(2)将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液分别离心1000转/分、3min，脾细胞沉淀用RPMI-1640溶液重悬，胸腺细胞沉淀用RPMI-1640选择性培养基(含10％小牛血清和1％HAT)重悬。
(3)取3×107个处于对数生长期的瘤细胞，离心1000转/分、3min，去上清液后，用RPMI-1640溶液重悬瘤细胞沉淀。
(4)将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，离心1000转/分、3min，完全吸去上清液，轻弹离心管底，使两种细胞沉淀充分混匀。
(5)将离心管置于37℃水浴预温的盛水烧杯中，用吸管吸取37℃的聚乙二醇溶液1ml，并缓缓滴加到细胞沉淀中，然后在水浴中静置5min。
(6)继续滴加已经预温到37℃的RPMI-1640溶液15ml，使聚乙二醇稀释而失去作用。
(7)补加RPMI-1640溶液至40ml，经离心1000转/分、5min，弃去上清液。
(8)将沉淀的细胞轻悬于3mlRPMI-1640选择性培养基中，冻存2ml后，补加RPMI-1640选择性培养基40ml和制备好的饲养细胞，混合均匀后滴加到96孔板内，每孔100μl。放置于CO2培养箱中培养。
4、筛选和克隆(一)筛选融合后，等到杂交瘤细胞群落长到96孔培养板的孔底面积1/3时开始检测，采用间接免疫荧光抗体法筛选阳性杂交瘤细胞。
首先，冰冻切片的制作取新鲜囊肿组织，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用。
其次，荧光抗体染色(1)杂交瘤细胞培养上清为第一抗体，滴加在切片上。
(2)37℃湿盒中孵育45min。
(3)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。
(4)异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体，滴加在切片上。
(5)37℃湿盒中避光孵育45min。
(6)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。
(7)甘油封片。
(8)荧光显微镜下观察。
(二)克隆采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下(1)乙醚麻醉小鼠，无菌取出胸腺后，在100目网筛上研磨，用RPMI-1640溶液吹下形成单细胞悬液。
(2)把胸腺细胞悬液离心1000转/分、3min，胸腺细胞沉淀用RPMI-1640细胞培养基(含10％的胎牛血清)重悬。
(3)要克隆的阳性细胞孔中的细胞用血球记数板记数，然后用RPMI-1640细胞培养基以10的整次倍稀释，取出100个杂交瘤细胞，放入加有胸腺细胞的RPMI-1640细胞培养基悬液中。
(4)细胞悬液用滴管吹打均匀，滴入96孔板，使每个孔平均含有一个杂交瘤细胞。
(5)放入CO2培养箱中培养。
(6)两周后间接免疫荧光抗体方法检测阳性克隆孔，把所得阳性克隆孔的杂交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证形成单克隆。
5、冻存取处于对数生长期的杂交瘤细胞，用滴管吹打制成细胞悬液，加入冻存液(9份RPMI-1640培养基+1份二甲亚砜)，使最终细胞密度为5×106个/ml。以1ml细胞悬液分装于2ml冻存管中，将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放置-70℃超低温冰箱，8-12hr后，浸入液氮内长期保存。
实施例2本发明的牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的鉴定1、间接免疫荧光抗体法鉴定首先，冰冻切片的制作取新鲜囊肿，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用。
其次，荧光抗体染色(1)将上述筛选和克隆出的杂交瘤细胞培养上清为第一抗体，加在切片上。
(2)37℃湿盒中孵育45min。
(3)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。
(4)异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体，加在切片上。
(5)37℃湿盒中避光孵育45min。
(6)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。
(7)甘油封片。
(8)Olympus荧光显微镜下观察。
结果免疫荧光抗体方法鉴定发现囊肿细胞的细胞质边缘散布有块状、楔状的强阳性信号，并且数个成链圈状排列。
2、斑点免疫印迹法鉴定(1)取0.5μl提纯的病毒悬液，点在硝酸纤维素膜上，晾干，放入2-3％的牛血清白蛋白封闭液中37℃封闭45min。取出硝酸纤维素膜，用磷酸盐缓冲液(含0.05％Tween-20)洗3次，每次5min。
(2)硝酸纤维素膜放入抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体中37℃孵育1hr。取出硝酸纤维素膜，用磷酸盐缓冲液(含0.05％Tween-20)洗3次，每次5min。
(3)硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体中37℃孵育1hr。取出硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液(含0.05％Tween-20)洗3次，每次5min。
(4)把硝酸纤维素膜放入NBT-BCIP发色液中发色。
(5)观察结果。
结果免疫斑点印迹鉴定的结果为淋巴囊肿病毒单抗与病毒能发生特异性结合反应。反应结果为紫褐色。
3、金标记免疫电镜法鉴定(1)吸取病毒悬液10μl，滴在腊盘上。
(2)将载膜的铜网向下放在悬滴上，经10-15min吸附，多余的液体用滤纸吸干。
(3)吸取适当稀释的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体10μl滴在腊盘上，将载样品的铜网放在液滴上，感作2min；用0.15M磷酸盐缓冲液冲洗5次。
(4)吸取胶体金标记羊抗小鼠IgG抗体10μl滴在腊盘上，将载样品的铜网放在胶体金液滴上，感作3-15min；用0.15M磷酸盐缓冲液冲洗5次，双蒸水冲洗2次，用滤纸吸干。
(5)用2％磷钨酸(pH6.5)负染色约30秒，用滤纸吸干，电镜观察。
结果在牙鲆淋巴囊肿病毒粒子上结合有大量的胶体金粒子，此结果直接证实淋巴囊肿病毒单抗的抗原决定簇位与病毒的囊膜上。
实施例3利用研制出的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，鉴定许氏平鲉(Sebastesschlegeli)淋巴囊肿病毒；首先，冰冻切片的制作取发病许氏平鲉囊肿组织，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；其次，荧光抗体染色(1)吸取抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体15μl，加在切片上。
(2)37℃湿盒中孵育45min；(3)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。
(4)异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体，加在切片上。
(5)37℃湿盒中避光孵育45min。
(6)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min。
(7)甘油封片。
(8)Olympus荧光显微镜观察。
结果在间接免疫荧光抗体检测中，发现在许氏平鲉囊肿细胞中散布有点状或带状的阳性信号。表明许氏平鲉囊肿细胞中存在淋巴囊肿病毒。
实施例4利用研制出的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，鉴定真鲷(Pagrosomus major)淋巴囊肿病毒；首先，冰冻切片的制做取发病真鲷囊肿组织，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；其次，荧光抗体染色步骤同实施例3。
结果在间接免疫荧光抗体检测中，发现在真鲷囊肿细胞中散布有阳性信号。表明真鲷囊肿细胞中存在淋巴囊肿病毒。
实施例5利用研制出的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，鉴定花鲈(Lateolabrax japonicus)淋巴囊肿病毒；1、冰冻切片的制做取发病花鲈囊肿组织，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；2、荧光抗体染色步骤同实施例3。
结果在间接免疫荧光抗体检测中，发现在花鲈囊肿细胞中散布有阳性信号。表明花鲈囊肿细胞中存在淋巴囊肿病毒。
实施例6利用研制出的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，鉴定云纹石斑鱼(Epinephelus moara)淋巴囊肿病毒；首先，冰冻切片的制做取发病云纹石斑鱼囊肿组织，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；其次，荧光抗体染色步骤同实施例3。
结果在间接免疫荧光抗体检测中，发现在云纹石斑鱼囊肿细胞中散布有阳性信号。表明云纹石斑鱼囊肿细胞中存在淋巴囊肿病毒。
实施例7利用研制出的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，检测患病牙鲆的肠道组织的淋巴囊肿病毒；1、冰冻切片的制做取病鱼的肠道组织，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；2、荧光抗体染色(1)吸取抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体15μl，加在切片上。
(2)37℃湿盒中孵育45min；(3)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗三次，每次5min。
(4)异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体，加在切片上。
(5)37℃湿盒中避光孵育45min。
(6)取出载玻片，用0.01M磷酸盐缓冲液洗三次，每次5min。
(7)甘油封片。
(8)Olympus荧光显微镜观察。
结果在肠粘膜上皮表面存在强阳性信号，并且可见是由圆形细胞聚集而成。
实施例8利用研制出的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，检测患病牙鲆的表皮组织的淋巴囊肿病毒；1、冰冻切片的制做取病鱼的表皮组织，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；2、荧光抗体染色步骤同实施例7。
结果表皮组织中，阳性信号呈点状出现于皮下肌纤维，而且表面的信号明显强于内部。
实施例9利用研制出的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，检测患病牙鲆胃粘膜上皮中的淋巴囊肿病毒；1、冰冻切片的制做取病鱼的胃，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；2、荧光抗体染色步骤同实施例7。
结果胃组织切片中，阳性信号呈片状出现在粘膜上皮表层。
实施例10利用研制出的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，检测患病牙鲆鳃中的淋巴囊肿病毒；1、冰冻切片的制做取病鱼的鳃，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂包埋，-20℃放置30min，冰冻切片机-20℃下切片，切片厚度5μm。切片用丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；2、荧光抗体染色步骤同实施例7。
结果鳃组织切片中，在鳃小片边缘出现阳性信号。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
本发明所用仪器及试剂如下福氏完全佐剂(购自Sigma公司)；福氏不完全佐剂(购自Sigma公司)；冰冻切片机(购自Leica公司)；冷冻包埋剂(购自Leica公司)；荧光显微镜(购自Olympus公司)；相差显微镜(购自Olympus公司)；TWEEN-20(购自Sigma公司)；1640(购自Gibco公司)；胎牛血清(购自Hyclone公司)；HAT(购自Gibco公司)；异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG抗体(购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(购自Sigma公司)；硝酸纤维素膜(购自Pall公司)；碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(购自Sigma公司)；NBT-BCIP(购自Sigma公司)；二甲亚砜(购自Sigma公司)；胶体金标记羊抗小鼠IgG抗体(购自Sigma公司)。
权利要求
1.一种由两株杂交瘤细胞分别分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体，其特征在于该两株杂交瘤细胞的保藏号CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，与该两株杂交瘤细胞分泌的特异性抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体(简称淋巴囊肿病毒单抗B和C)发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；该淋巴囊肿病毒单抗B和C的金标记免疫电镜鉴定结果显示在牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即表征与该淋巴囊肿病毒单抗B和C发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上；在倒置显微镜下观察，生长状态良好的杂交瘤细胞外观饱满、浑圆、折光性强、细胞形态均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞能够在体外无限繁殖；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗淋巴囊肿病毒的单克隆抗体。
2.一种权利要求1所述由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法，该制备方法是以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原，经免疫balb/c小白鼠，应用免疫学方法，制备出抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体；其特征在于再选择免疫学的检测鉴定方法，筛选鉴定出淋巴囊肿病毒单抗B和C。
3.根据权利要求2所述由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的选择免疫学的检测鉴定方法之一，是采用间接免疫荧光抗体法，筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗B和C。
4.根据权利要求2所述由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的选择免疫学的检测鉴定方法之二，是采用斑点免疫印迹法，筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗B和C。
5.根据权利要求2所述由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的选择免疫学的检测鉴定方法之三，是采用金标记免疫电镜法，筛选鉴定淋巴囊肿病毒单抗B和C，并确定其抗原决定簇位于牙鲆淋巴囊肿病毒的囊膜上。
6.一种权利要求1所述由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体，即淋巴囊肿病毒单抗B和C作为在进行鱼类淋巴囊肿病毒流行病学调查过程中的应用。
7.根据权利要求6所述由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体，其特征在于所述的鱼类淋巴囊肿病毒流行病学调查的鱼类有牙鲆；许氏平鲉；真鲷；花鲈；云纹石斑鱼。
8.根据权利要求7所述由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体，其特征在于所述的淋巴囊肿病毒单抗B和C作为在进行牙鲆淋巴囊肿病毒的靶器官调查过程中的应用。
9.根据权利要求8所述由杂交瘤细胞分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体，其特征在于所述的调查的组织或器官有牙鲆的肠道组织，和/或表皮组织，和/或鳃组织，和/或胃组织。
全文摘要
本发明是由两株杂交瘤细胞分别分泌的抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体B和C。该两株杂交瘤细胞的保藏号CCTCC－C200419和CCTCC－C200420，与该两单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于淋巴囊肿病毒的囊膜上；常规培养2－3天的杂交瘤细胞培养液含有大量该单抗B和C；该单抗B和C的金标记免疫电镜鉴定显示在该病毒的囊膜上结合有大量的胶体金粒子，即表征在该病毒囊膜上存在单抗B和C的抗原决定簇，其更显其优越性和先进性。该两单抗B和C将为建立该病毒的单抗诊断技术，将为在分子水平上定位该病毒的靶器官，将为研究该病毒感染动态及增殖，将为搞清该病毒传播、流行病学规律，奠定坚实的基础。
文档编号C07K16/28GK1660907SQ200410075528
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年12月17日
发明者战文斌, 程顺峰 申请人:中国海洋大学