专利名称：：导致番茄高色素-1突变表型(hp-1和hp-1<sup>w</sup>)的分离的核苷酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及导致番茄产生高色素p/gme/i^Z)和高色素-l"(/i/g/i/;/g挑^^r)表型的改变的核苷酸序列。更具体而言，本发明公开了拟南齐(爿m6/^/m:y)和人2XRB7(UV损伤的DNA结合蛋白l)基因的番茄同源物中的点突变，以及该改变的核苦酸序列的应用。
背景技术：
：植物通过调整它们的称为光形态发生的一系列相互作用中的发育过程对光强、方向、持续时间和光谱性质作出反应。已证实光形态发生突变体在光和植物发间的复杂相互作用研究方面是极好的工具，它们中的一些也已用在几个农作物育种计划中。在包括拟南芥(4ra6/rfops/s)、高粱(5W^M柳)、芸苔(5ram.cfl)、烟草、番痴和豌豆的多个物种中已报道了光形态发生突变体。通常，这些突变体可分为光受体缺陷或光信号传导链某方面的改变(Chory，1993)。番茄(/jco/7ers/c^m^sof/^i似挑)中的几种光形态发生突变体已经有过描述。其中，携带单基因隐性似gA/7/g/W^^(，/r/;-广，和—J)和深绿(&)突变的突变体的特征在于它们的过度光反应。这些突变体与它们的半等基因(Semi-isogenic)野生型植株相比显示出较高的花青素水平、较短的下胚轴和较强的果实色素沉积(Mochizuki和Kaiiiimura1984;Wann""/.1985)。在这些突变体中看到的增加的果实色素沉积归结于成熟的红色果实中类胡萝卜素主要是番茄红素水平的显著增加以及类黄酮水平的显著增加。由于它们对果实颜色的影响，/^和rfg突变渗入到几种商业处理和现已作为LycopeneRichTomatoes(LRT)(Wann,1997)上市的新鲜市场(fresh-market)番茄栽培品种中。突变体最初于1917年在CampbellSoupCompany农场(Riverton，NJ)(Reynard,1956)作为自发突变体被发现；/|/7-产突变体出现在经甲磺酸乙酯(EMS)处理的基因型GT种子的栽培植林后代中(Peters""/.1989);突变体于l"5年报道在意大利SanMarzano品种中(Soressi1975);突变体发现于T-DNA转化的植林后代中(Moneymaker栽培品种)(vanTuinenCa/.1997);dg突变体出现在Manapal品种格子状栽培中(Konsler1973)。尽管开始时有些困惑，现在已经清楚，在番茄基因组中存在两个^P基因-HiW和好尸-2，分别定位于2号和1号染色体上(vanTuinen"a/.1997;Yen"1997)。(vanTuinenetal.1997;Yenetal.1997)。在每一上述基因位点，最初鉴定出两个上文提到的突变体等位基因/^-7和/^-,，/*-2和/^-(Kerckhoff和Kendrick1997;VanTumen"a/.1997)。WO99/29866公开了基因的克隆和测序，该基因被发现编码拟南芥核蛋白Z)J^2TO/^r五Z)/(Z^77)的番茄同源物。该文献还公开了都位于iy尸-2的编码序列的3，端的外显子11内的点突变和缺失突变，分别导致先前鉴定的/^-^'和/i/;-2突变体。对于》/7-2突变体，点突变指导内含子10的选择性剪接，导致外显子11的9个碱基对的缺失。共有的WO03/57917公开了另一位于拟南芥基因的番茄同源基因中的点突变，其造成rfg突变，由此在及P-2位点包括第三突变体等位基因。本发明的目的是提供分离的核苷酸序列，该核苷酸序列包含造成番蒜植林A妙/7/g膨fl"(/^7-_/)和A妙/7&附^-,()光形态发生突变体的突变。本发明的另一目的是提供DNA标记物，该标记物可用作鉴定和选择—-7和^-严突变体的分子诊断工具。本发明进一步的目的是提供分子诊断工具，该分子诊断工具可用于番茄红素增加双重突变体生产中的基因型选择。本发明其它的目的和优点会随着继续说明而变得明显。
发明内容现已发现造成和/^-2"突变体表型的突变位于人和拟南芥紫外线破坏的DNA结合蛋白1(UVDAMAGEDDNABINDINGProtein1，Z)Z)57)基因的番茄同源基因中。本发明主要涉及造成番茄和/t/^r表型的分离的核苷酸序列，其中每一所述序列包括改变的番茄基因序列或其片段或同源物。对于突变，在所述序列或片段或同源物中的改变包括Z)Z)^编码序列的番茄同源物中单个A^到T短的碱基颠换。对于V-严突变，在所述序列或片段或同源物中的改变包括ZXO必J编码序列的番茄同源物中单个G2392到A2392的转换。在本发明一个优选的实施方式中，编码^-/突变的分离的核苷酸序列包括序列表中SEQIDNO:l定义的序列。要注意的是，所附序列表中包含的所有序列应被认为形成了本公开内容的组成部分。在本发明另一优选的实施方式中，编码/^-,突变的分离的核苷酸序列包括序列表中SEQIDNO:2定义的序列。可以理解的是，本发明还包括在其范围内的编码和突变的上述定义序列的所有片段，其中所述片段包括包含突变核苷酸的D/)fi2基因序列区域，也就是说，对于突变该区域包含核香酸931,对于突变该区域包含核苷酸2392。本发明还涉及检测在植物材料中的和(独立地)/^-r7突变存在的方法。因此，这方面的一个实施方式中，本发明提供了一种在植物中检测/^-J突变存在的方法，包括从所述植物分离基因组DNA、通过使用PCR技术从所述基因组DNA扩增含有/y7-J突变的基因片段和在所述基因组DNA中测定所述A/7-2突变存在的步骤。在另一实施方式中，本发明提供了一种在植物中检测/r/^"突变存在的方法，包括从所述植物分离基因组DNA、通过使用PCR技术从所述基因组DNA扩增含有突变的基因片段和在所述基因组DNA中测定所述A/7-r突变存在的步骤。任何合适的技术可用于测定植物材料中和(独立地)—-严突变的存在。但是，在优选的实施方式中，所述突变的存在使用焦磷酸测序(pyrosequencing)技术进行测定，其中由该技术获得的序列数据与SEQIDNO:1(对于Zip")和SEQIDNO:2(对于/i/7-r)定义的序列进行比较。在特别优选的实施方式中，以上定义的测定/li7-J和(独立地)/z/7-,突变的存在的方法应用于从物种番痴(Z^a/^/"s/c0WescM/e/i似附)得到的材料。在一个特别优选的实施方式中，以上公开的测定/^-J和(独立地)^-广突变的存在的方法用作种子生产的质量控制或后控制，用于检测栽培品种和它们的母本品种中々等位基因的存在。这里使用的术语后控制是指在种子生产后的质量控制检验，用以确认所述种子的预期基因型。另一方面，本发明还涉及在植林中测定两种不同的光形态发生突变存在的方法，其中一种所述突变是/^pJ或突变，包括通过基因型或表型选择手段检测不同于A/7-7或突变的光形态发生突变的存在，以及通过以上公开的方法检测Zi/;-7或/i/7-严突变的存在。本发明这方面的一个优选实施方式中，用于测定非/i/;-7、非—-尸光形态发生突变存在的表型选择手段包括在温控室中在对于波长小于500nm光不通透的黄色塑料屏下，使获得自要测定突变存在的植物的种子发芽，并选择非黄化的幼苗。本发明还涉及制备具有基因型—-///^-/的Z^a/7ers/c賴"cm/^^m附双重突变体品种的方法，其中表示任何隐性的遗传上与/^刁突变不连锁的光形态发生番茄红素增加突变，该方法包括步骤a)将纯合/^-J//1/^品种或植林与纯合/^P品种或植林交叉杂交以产生双重杂合户/+F,植林；b)将步骤(a)获得的F!植抹自交以产生F2种子；c)通过应用权利要求7定义的方法和检测p突变存在的方法鉴定双重纯合植林/^-J/Z^-Jd)将步骤(c)鉴定的双重纯合植林自交以产生F3种子，并使所述种子发芽。在本发明这方面一个优选的实施方案中，突变户是&突变。这种情况下，所述方法的步骤(c)中对rfg突变存在的测定可使用在共有的、同时待决的申请PCT/IL03/00023中公开的用于*突变的标记物来进行。类似地，本发明还涉及制备具有基因型/^-rv/^-r/7//7的Z^copef^om"cw/ew似附双重突变体品种的方法，其中/7表示任4可隐性的遗传上与突变不连锁的光形态发生番茄红素增加突变，该方法包括步骤a)将纯合/^-广Mp-r1品种或植林与纯合p//7品种或植林交叉杂交以产生双重杂合/^-,/+p/+Ft植林；b)将步骤(a)获得的R植林自交以产生F2种子；c)通过应用权利要求7定义的方法和检测p突变存在的方法鉴定双重纯合植抹/^-^T/Zip-F;^;d)将步骤(c)鉴定的双重纯合植林自交以产生F3种子，并使所述种子发芽。在本发明这方面一个优选的实施方案中，突变p是々突变。这种情况下，所述方法的步骤(c)中对rfg突变存在的测定可使用在共有的、同时待决的申请PCT/IL03/00023中公开的rfg突变标记物来进行。本发明在其范围内还包括由以上公开的方法制备的具有基因型/r/7-J//r/7-J和(独立地)/jp-/w/A!/;-尸的物种Z^c。/;w'cow"C"fcrt故/M的双重突变体杂种植林。通过其优选实施方式的以下说明性和非限制性的实例，本发明以上的和其它的全部特征和优点会得到进一步的理解。附图简述1用来设计用于突变的焦磷酸测序引物的基因组片段的核苷酸序列(单核苷酸多态性为加有下划线的大粗体字母，正向和反向引物加有下划线，测序引物以斜体表示)。图2番茄DD^基因的部分定位结果(番茄2号染色体图谱，显示丑尸-7基因(hp)的位点，来自Yen""/.(1997))。图3位点的/r/7-7突变的典型焦磷酸测序基因定型结果(由于测序引物的反向，突变体基因型的特征在于A，正常基因型的特征在于T)。图4D2)5J的部分ClustalW蛋白质比对，显示Zi/^(a)和(b)氨基酸替换的定位显示的有拟南芥DDB1A(At—DDB1A-NP一192451，拟南芥DDB1B(At—DDB1B=NP一193842)，AilsaCraig番茄栽培品种(Le=AY452480)，大米(Os=BAB20761)，人(Hs=DDBl—Human)，果绳(Dm=XP_081186)，鸡(Gg=BAC56999)和裂殖酵母(&po附&)(Sp=NP—外3580)。相同的残基加有黑阴影，而类似的残基加有灰阴影。图5正常野生型番茄/XDB/基因的完整核苷酸编码序列(起始点ATG和终点TAG密码子加有下划线。其颠换和转换导致和表型的A短和G""位点分别为大粗体字母)。图6正常野生型番茄DDfiJ基因的完整氨基酸序列(其替换导致和表型的天门冬酰胺311和谷氨酸798分别为大粗体字母)。实现发明的最佳方式如上所描述的，在其一方面，本发明提供了在植株中检测/^-J和/^-产突变存在的方法。对于/^-J突变来说，该方法包括以下步骤分离出包括D/XBJ基因区域的基因组DNA片段，该基因区域包含造成/^-J表型的单核苷酸多态性(SNP)(在核苷酸931位点)；克隆所述片段；对所述克隆片段测序并通过对测序的基因组片段931位点A/T颠换的检测而测定突变的存在。在本发明所述方法的特别优选的实施方式中，对克隆片段的测序通过焦磷酸测序反应实现。在焦磷酸测序反应之前，包含SNP的基因组片段通过PCR技术扩增，以下将描述其细节。在上文和下文使用的术语"PCR"(或聚合酶链式反应)技术指一类技术，它们基于热稳定性聚合酶的使用通过反复的聚合酶反应实现特定DNA序列的扩增(即增加拷贝数)。该反应可用于替代克隆所需的一切为核酸序列的信息。设计与感兴趣序列互补的引物以进行PCR。接着通过自动DNA合成生成引物。在现有技术中PCR和其它的扩增DNA和/或RNA的方法是公知的，基于这里提供的教导和指示它们可以用于本发明而无需过度的试验。几种PCR方法(以及相关技术)描述在例如美国专利4,683,195，4,683,202，4,800,159，4,965,188以及InnisW"/.所编的PCRProtocols:Aguidetomethodandapplications。以下提供实施例用于说明性目的以及为了更加详细地解释和描述本发明。但是本发明并不限于公开于这些实施例中的特定实施方式。实施例材料与方法植物材料和杂交来自正常的自由传粉的番痴(Lycopersiconesculentum)AilsaCraig栽培品种(cv.)和/^-/突变的近等基因和纯合品种的种子由美国纽约伊萨卡BoyceThompson植物研究所(BoyceThompsonInstituteforPlantResearch,Ithaca，NY,USA)的J.J.Giovannoni友好提供。来自突变(LA3004)纯合的Rutgers栽培品种的种子以及来自/^-r7/^-r突变体植林和它们的GT背景方面(LALA4012和LA4011,分别地)的等基因(isogenic)正常植林的种子由美国加利福尼亚州戴维斯市加利福尼亚大学的番茄遗传合作组织(TomatoGeneticsCooperative,UCDavis,CA，USA)的R.T.Chetelat提供。基因型GT为番茄繁殖系，对花叶病毒有抵抗力并在形态学上与起初从荷兰的BleiswijkDeruiterzonen(Deruiterzonen，BIeiswijk，theNetherlands)获得的Moneymaker栽培品种(Koornneef"fl/.1990)类似。/^-^7/^-尸突变体植林出现在经EMS处理的基因型GT种子培育的植林的后代中(Peterset"1989)。因此，这些植林与正常GT基因型高度等基因。与/^^//i/^植林相比，突变体/^-rv/^-7w植林显示更加极端的表型，并且清楚显示A/7-7和/^-严为等位的(Peterset"fl/.1989)。加工(processing)/z/7-2/Zi/7-J突变体杂种，LRT89，两种繁殖品系，L525和L527，以及正常的繁殖品系，N671，由VolcaniCenter已故的R.Frankel，D.Lapushner和I.Levin开发。来自以色列HazeraGeneticsInc.开发的两种加工杂种HA3501和HA3502的种子由Mr.EzriPeleg.提供。杂合/|/^/+栽培品种cv.124的种子也由以色列HazeraGeneticsInc.提供。本研究中4吏用的几种正常的+/+番茄栽培品种即Moneymaker,M82，Brigade,VF陽36，189,Manapal，NC8288和Florida来自Volcanicenter的种子库。DNA也从单个植株AB427,AB510和AB747提取，该三种/^-J/Zi/^加工杂种由以色列ABSeedsInc.开发。正常的AilsaCraig栽培品种植林与它们的近等基因Zi/7-J突变体植林杂交产生R种子。这些Ft植林自花授粉以产生F2种子。123F2幼苗的样本用于本研究进行的连锁分析。基因组DNA提取和Southernblot杂交基因组DNA按照Fulton"fl/.(1995)的方法从单个植林提取。为了测定番茄基因组中/>1>5/基因的拷贝数，按照以下程序进行Southernblot杂交从^cw/ew似/w(栽培品种M82)和1./7ert"e〃//二者提取的基因组DNA用I，Eco及V,Z)raI，好"eIII，SeaI和AfvflI限制性内切酶消化。在1.0%琼脂糖凝胶电泳和Southern转移后，使DNA与p"标记的包含i)2)^基因5'编码序列1346碱基对的DNA探针杂交。Southernblot转移和DNA杂交按照Levin和Smith(1990)进行。PCR引物设计序列分析和位点特异性引物的设计采用DNAMAN,序列分析软件4.1版(LyrnionBioSoft，Quebec,Canada)进行。所用的全部DNA引物购自以色列Ness-Ziona的M.B.CMolecularBiologyCenterLtd.。PCR反应PCR反应用于作图、克隆和扩增DNA产物，用于直接测序和焦磷酸测序。对所有这些目的来说，扩增反应(25ml终体积)在10ng模板DNA，25mMTAPS(pH=9.3，250C)，50mMKC1，2mMMgCl2，ImMB-巯基乙醇，四种脱氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)各0.2mM，两种引物各10pmole和1单位的热稳定TaqDNA聚合酶(SuperNovaTaqpolymerase,MadiLtd.，RishonLeZion，Israel)下进行。反应在自动温度循环器(MJResearchInc.，Watertown,MA，USA)中进行。为了作图和直接测序，起始温浴941C3分钟，接着是35个循环的941C30秒钟变性，58"C30秒钟退火，72*C由PCR产物大小决定的l-2分钟的聚合反应。完成上述循环后，最后的聚合反应在72"C进行5分钟。通过在1.0%琼脂糖凝胶中电泳可观察到PCR扩增产物，并通过溴化乙锭染色进行检测。对焦磷酸测序反应前的PCR扩增，起始温浴94匸2分钟，接着是35个循环的94"C30秒钟变性，57t:30秒钟退火，72X:20秒钟的聚合反应。完成上述循环后，最后的聚合反应在72TC进行5分钟。Z)腦基因定位基因定位通过Z^co/7g/^/cow/^/me〃//渐渗品系(introgressionlines)进行(Eshed"a/.1992)。从包括它们的原始母本品种(lines)M82和丄.i^wwe////的各个渐渗品种的单个植林中提取的DNA用作PCR反应的模板。用于这些定位反应的引物为mTDDBF和mTDDBR(表1)。这些引物来源于InstituteofGenomicResearch(TIGR)数据库登记号(accession)TC117372(http:〃www.tigr.org/)，发现它们与A.thaliana基因的两个拷贝高度同源。为了获得M82和L/^wie////间的多态性，PCR反应后的PCR产物用尸WI内切酶消化。对来自和突变体植林的番茄/)/)必JcDNA的克隆和测序从25mg的单独的和A/7-尸突变体幼苗以及它们的近等基因自由授粉野生型基因型(分别为AilsaCraig和GT)的叶片组织提取总RNA。RNA提取采用TRIzol试剂系统(GibcoBRLLifeTechnologies,Gaithersburg,MD，USA)进行。总RNA用作第一链cDNA合成的模板，采用Superscript前扩增系统(GibcoBRLLifeTechnologies,Paisley,UK)。制备的cDNA用作PCR反应的模板，从突变体和正常遗传accessions二者中扩增编码番茄/)/)^的基因的重叠片段。随后直接地对PCR产物测序，或按照厂家建议(Promega，Madison,WI，USA)在使用pGEM-TEasyVectorSystems将PCR产物克隆进pGEM-TEasyVector后再对其测序。在克隆进pGEM-TEasyVector后，基于载体T7、SP6和番茄DDBJ基因的互补引物对每个重叠扩增片段的四或五个独立克隆测序。当采用直接测序时，对代表与番茄D"B7基因互补的每一引物组合的至少两种PCR产物进行测序。测序采用ABIPRISM377自动DNA测序仪(AppliedBiosystems,FosterCity，CA，USA)进行。番茄D/XB/基因3'区采用与TIGR数据库登记号TC117372互补的引物(http:〃www.tigr.org/)扩增的重叠片段直接测序，该TIGR数据库登记号TC117372与A.thalianaDD57基因的两个拷贝高度同源。这些引物列于以下表l中表l正向(F)和反向(R)引物，与TIGR数据库登记号TC117372互补，用于番茄/>/>^基因3'区测序。引物名称引物序列序列表参考号5TDDBF51'-ACGACCTATCGTGGACTTCTGT-.3,SEQIDNO:35TDDBR5''-CTGGACTTGAGAATTGAAGCCT-SEQIDNO:4工ri5TDDBF51'-GAGCCTATAAGGATGGATCAC-3''SEQIDNO:5ATDDBF5'-CAGCAGTTGGAATGTGGACAG-3'SEQ工DNO:mTDDBF5'-GCAATCGCTAAAGAAGGTGAGT-31SEQIDNO:7mTDDBR5'-GCATTATAGTCTCTGGCTCGCT-3,SEQIDNO:8i丽TDDBF5,-GGACATTTGCTCTATGCAGT-3'SEQIDNO'-9inmTDDBR5'-AGGCATTTAGAGAGTAGACAGC-31SEQ工DNO:10TDDBF5,-TTTGGAGAAGCTGCAGACAA-3'SEQIDNO:11TDDBR5'-CACAACCTCACAGAAGAAGAAG-3,SEQIDNO.-12In3TpDBR5'-CCACTCTCTTCATTAGTTCCTC-3'SEQIDNO:13DDB1基因5'区起初从pBluescriptSK(+/-)phagemidcDNA文库利用以下引物克隆T7=5,-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(SEQIDNO:14)以及5'TDDB—R=5'-CTGGACTTGAGAATTGAAGCCT-3'。由以色列VolcaniCenter的R.Barg和Y.Salts友好提供的该cDNA文库是从直径4-6mm的幼小单性果实(ca.开花后4-8天)制备的，该单性果实来源于兼性单性生殖有限花序品种(facultativeparthenocarpicdeterminateline)L-179(/mf-2^;fl"2)。该品种以前曾描述过(Barget"a/.1990)。该文库按照厂家指导用StratagenInc.的cDNASynthesisKit#200400、Zap-cDNASynthesisKit#200401和ZapcDNAGigapackIIIGoldCloningKit#200450制备。来自和—rv/i/^w突变体品种以及它们的相应近等基因(nearlyisogenic)正常品种的番茄DDB1基因5'区采用上述的引物(5'TDDB—R)和引物TDB一UTR=5'-atagcgggaagagggaagatac-3((SEQIDNO:15)，其互补于番茄DZXB7基因的5'UTR。几种与以上片段互补的重叠引物例如那些用于焦磷酸测序基因定型的(参见下文)用于番茄DDB1基因5'编码序列的序列验证。连锁分析采用突变体植林和野生型植林(AilsaCraig栽培品种)间杂交的F2种子进行番茄Z)DjB7位点和以过度的光形态发生去黄化反应为特征的—-2突变体间的连锁分析。在环境控制生长室(白天25TC/晚上18"C)中，使这些种子在防止波长小于500nm光穿透的黄色塑料屏下(Mochizuki和Kamimura1984)发芽。这些发芽和起初的生长条件导致突变体和正常植株间下胚轴长度的巨大差异(Mochizuki和Kamimura1984)。各个F2幼苗的下胚轴长度在播种后8天测量，它们的基因型采用这里公开和描述的基于焦磷酸测序的DNA标记物来测定。焦磷酸测序基因定型开发出基于上述的突变体品种和它的AilsaCraig背景近等基因正常品种间的单核苷酸多态性(SNP)的焦磷酸测序基因定型(genotyping)系统。为此，对包含该SNP的基因组片段进行克隆和测序，如图1所示。用于该反应的生物素标记的正向引物为5'-tgttttccagagttaccggact-3'(SEQIDNO:16);反向引物为s'-tagcttgagccaatgaagacaa-3'(SEQIDNO:17);测序引物为51-atgaagacaaaagcat-3((SEQIDNO:18)。该反应中扩增子(amplicon)的大小为106bp。焦磷酸测序反应之前的PCR扩增反应如同以上所描述的(见PCR反应)。2pmole的测序引物在焦磷酸测序分析前添加到扩增反应中。采用MegaBASE1000仪器(DanyelBiotech,NesZiona，Israel)进行分析。因为测序引物为反向的，所以正常的基因型的特征在于在SNP位点为T，而纯合突变体/i/7^基因型的为A，如图3所示。统计学分析通过JMPStatisticalDiscoverysoftware(SASInstitute,Cary,NC，USA)进行方差分析(ANOVA)。通过QGENEsoftwareVersion3.06d(Nelson1997)进行连锁分析和LOD值测定。采用Clustal方法(Higgins和Sharp1988)进行氨基酸序列比对。实施例1鉴定和克隆DDB1番茄同源物DDBl蛋白质是由两个亚基DDBl和DDB2构i的异二聚体。与大米、鸡、人、小鼠、果蝇()和裂殖酵母(5"c始05Yia^"ro附ycey)不同，AA"/zVmfl基因组具有两份高度同源的Z>/)^/基因拷贝(Schroedereffl/.2002;Zolezzief/.2002;Fue,fl/.2003;Ishibashief/2003):DDB1A和DDB1B，二者长度1088氨基酸(Genbank蛋白质登记号分别为NP一192451和NP_193842)。当将这两个蛋白质登记号的每个用作在包含番茄表达序列标签(EST)的TIGR数据库(http:〃www.tigr.org/)中的tblastn分析查询词时，二者都揭示了两高度同源的序列TC117371(394bp)和TC117372(2206bp)。A,/^//fl朋登记号NP—192451被发现与番痴TC117371和TC117372登记号分别有87和86%的同一性。另一方面，登记号NP_193842与番茄TC117371和TC117372登记号分别有87和83%的同一性。基于起初的较长的TIGR登记号TC117372和后来的我们从cDNA文库克隆的单基因的仔细序列分析，使得我们清楚番茄TIGR登记号TC117371和TC117372都互补于相同的基因序列。另外，以DDBJ基因序列作为探针的番茄基因组DNASouthern-blot转移和杂交揭示出实际上番茄基因组包含DD^7基因的单个拷贝(未提供数据)。实施例2番痴D"^基因的定位部分定位结果，包括番茄"i)^基因的大致定位位点，示于图2。这些结果表明位于具有基因的渐渗品种中的番茄2号染色体(Yen"fl/.1997)。实施例3/^-J和/tjp-7"突变体中番痴DD必7的序列表征采用互补于番茄D1XB7基因(TIGR登记号TC117372)3，区域的几种正向和反向引物(表l)，以对制备自AilsaCraig背景的/y-J和正常植林的幼苗叶片的cDNA进行直接测序。在该区域没有获得和正常植林间的多态性。由此对两基因型中的/XD5/基因的5，区域也进行克隆和全序列测序。计算机处理的所有序列翻译结果显示番茄DDB1是1090氨基酸的蛋白质。来自/1/;-J和它的近等基因正常基因型的ZXDB7编码序列的序列分析揭示出在突变体植林/)/)必J基因编码序列中存在单个A931到T931的碱基颠换。该颠换导致保守的天冬酰胺311到酪氨酸311的替换(图4)。基于在AilsaCraig背景中获得的序列信息，我们还对突变体植林和它的GT背景中近等基因正常对应植林中的DP^基因的全部编码区进行了序列分析。由于与/1/;-J等位，~-尸突变体Z)"W基因的编码序列中的大突变(majormutation)将有力地支持这样的设想，即番茄DD^基因导致/^"和/i/7-广突变体表型。事实上，已在—-广突变体植林的DDBJ编码序列中观察到单个G2392到A2392的转换，其引起保守的谷氨酸798到赖氨酸798的替换(图4)。正常野生型番茄PD丑7基因完整的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别示于图5和图6。实施例4品种和栽培品种的基因定型通过直接测序和焦磷酸测序方法的结合对多种来源的19个品种(lines)或栽培品种进行基因定型(图3)。其中包括单杂合的/1/7-7/+，10个和8个正常的+Z+accessions。已发现在JW)^基因中鉴定的SNP和已知的植林HP-1位点的基因型完全相符(结果未示出)。实施例5分析位点和光形态发生反应间的连锁进行连锁分析研究以测试DZ)B2位点和突变体幼苗(即抑制下胚轴伸长表型)显示出的特征性过敏光形态发生反应间的联系。为此，在调控生长室中黄色塑料屏下使有限的(determinate)/i/7-J突变体植林和野生型植林(AilsaCraig栽培品种)间杂交的F2种子发芽。播种8天后，记录单个幼苗的下胚轴长度，并如上所述在焦磷酸测序DNA标记物的协助下对它们的D2XBJ位点进行基因定型。结果证实了/)Z)B7位点(locus)和下胚轴长度间的明显相关性，如以下表2所示表2番茄DDBl位点和hp-l突变体幼苗显示出的光形态发生反应间的连锁分析。幼苗播种后在黄色塑料屏下生长8天。不同的上标字母表示依Tukey-KramerHSD测试(Kramer1956)的均值间统计学显著差异(P〈0.05)。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>与其它两种基因型群体相比，纯合隐性/^-7M/7-7幼苗显示高度显著的下胚轴伸长抑制，表现出更加过度的光形态发生去黄化反应(25<LOD值<26，R2=62.8%)。这些结果证实/i/^突变体植林位点中鉴定的突变与其主要特征性表型之一即幼苗中抑制的下胚轴伸长相关。有趣地是，这项研究中获得了A，/等位基因的轻微的部分显性效果。该效果可从+/+和/^7-//+群体均值间统计学显著差异了解到(表2)。说明和描述本发明各种实施方式的进一步非限制性实施例(可行的和理论上的)在以下部分给出。对这些实施方式进行描述仅出于说明性目的，并非企图以任何方式限定本发明的范围。实施例6鉴定一-J和/iff-r突变的诊断工具由Ronaghi2001详尽评述的焦磷酸测序DNA标记物系统被开发用作分子诊断工具以基于测序结果(图1)鉴定/^p"突变体植林。该DNA标记物是基于这项研究中发现的—J//^7突变体品种和它的AilsaCraig背景栽培品种近等基因正常品种间的单核苷酸多态性(SNP)。为此，对包含该SNP的基因组片段克隆和测序。基因组片段的序列示于图1用于该反应的生物素标记正向引物为5'-tgttttccagagttaccggact-3'(SEQIDNO:16);反向引物为5'-TAGCTTGAGCCAATGAAGACAA-3'(SEQIDNO:17);效寸序引物为5'-ATGAAGACAAAAGCAT-3'(SEQIDNO:18)。该反应的扩增子大小为106bp。焦磷酸测序反应之前的PCR扩增反应如同以上所描述的(见PCR反应)。2pmole的测序引物在焦磷酸测序分析前添加到扩增反应中。采用以色列NesZicma的DanyelBiotech公司的MegaBASE1000仪器进行分析。因为测序引物为反向的，所以正常的基因型的特征在于在SNP位点为T，而纯合突变体hp-l基因型的为A，如图3所示。利用焦磷酸测序方法和上述的引物，可看到^p-J和野生型植林间明显的多态性，如图3所证实的。对于纯合/i/7-J突变体植林，在SNP位点观察到代表腺噤呤(A)的单峰，而在野生型植林中在SNP位点上观察到代表胸腺嘧啶(T)的单峰(图3)。正如所料，—-7突变杂合植林产生双峰，代表A和T两种核苦酸(图3)。基于在/f/-尸突变体植林中观察到的SNP,类似的基于焦磷酸测序的标记物系统已经建立。实施例7将两种遗传上不连锁的番茄红素增加突变并入单个番茄杂种试验方迭育种人员的一种通常做法是将两种或多种积极影响相同特征的突变结合或合并。这种方法可通过费时费力的测交进行检验。这里产生的诊断工具有助于将两种光过敏番茄红素增加突变并入单个植林或繁殖品种。番茄中的几种突变积极影响成熟番茄果实中的番茄红素含量。其中，至少5种显示出显著的过敏光反应。这些包括<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>/^-J和突变定位于番茄2号染色体的HP-1位点(YenWa/.1997，与本发明一致)。^J和&突变定位于番茄1号染色体的〃尸-2位点(Mustilli"fl/.1999;Levin"a/.2003)。通过以下的程序(对于*和/|/^突变的说明)可更加有效地实现及户-2位点的番茄红素增加^-2、/^-7'或rfg和定位于HP-1位点的两突变(/t"-J和r)中的任一个的并入1.将纯合rfg与纯合突变体杂交以产生双重杂合Fi植林+/+X+/+—-2~-7超/+/r/7-2/十2.将Fi双重杂合植林自交以产生F2种子。这些F2种子将分为9种基因型rfg/dgAi7-J//^-2，/ip-J/+，rfg/rfg+/+，/ip"//i/;-J，/^/7-7/+，+/+，+/+^p-J/A(/7-J，+/+/^-7/+，+/++/+。采用这里公开的用于突变的焦磷酸测序标记物系统和共有的待决申请PCT/IL03/00023公开的用于&突变的标记物，能容易地鉴定双重纯合植林*/*/|/^//|/7-2，并自交以产生对这两种突变纯合的繁殖品种。实施例8将两种遗传上不连锁的番茄红素增加突变并入单个番茄杂种显著增加番茄红素产量可行(working)实施例两种半等基因杂种，一种是突变纯合的和另一种是*突变纯合的*/<&,进行交叉杂交以产生F!植林(/^-7/+*/+)。这些Fn植林自交以产生F2幼苗。对这些F2幼苗进行基因定型和自交以产生双重突变体植林(/^^//^-i&力&)，如实施列7所述。两种园艺上可接受的植林被选择出来并自交以产生两种F4品种。这些F4品种交叉杂交以产生双重突变体杂种。该杂种与起始杂交使用的半等基因单突变体杂种(参见上文)一起在以色列北部的4个地点在春季开放田地条件下进行测试。示于表3(下文)的结果显示，令人意外地双重突变体杂种的番茄红素产量在统计学上高于它的等基因单突变体杂种。双重突变体杂种的番茄红素产量与仓/&和/|/7-7//^-7单突变体杂种相比分别增加了19和61%。表3.携带有过敏番茄红素增加突变的单个和双重突变体杂种栽培品种的番茄红素产量。不同的上标字母表示依Tukey-KramerHSD测试(Kramer1956)的均值间统计学显著差异(P〈0力5)。栽培品种基因型番茄红素产量(gr/dimam头)+/+hp-l/hp-l1136cdg/dg+/+1538Bdg/dghp國l/hp-l1824Adunam-1000平方米实施例9诊断工具用于对母本品种和杂种种子的后控(postcontrol)分析种子公司经常使用成组分子量标记物进行母本种子库和杂种种子的后控或质量控制。几种市售的富番茄红素番茄栽培品种携带有纯合或杂合状态的—-7和/^-r突变。到目前为止，在特定库中检测^;-J和—-尸性状只能通过使种子样品发芽、对母本栽培品种和后代进行复杂的表型分析这样漫长的程序来进行。品种中准确地检测A/7-7和/f/-^r等位基因，因此使生产后(post-production)质量控制在1-2天而不是几个星期或几个月的时间尺度上进行。实施例10其它功能上的活性突变在/)Z)忍/基因中的定位来自正常植林的种子可按照已知方法采用甲磺酸乙酯(EMS)或其它途径进行诱变以产生光形态发生突变体(Koornneef"fl/.1990)。这些突变体可在调节的光照条件如黄色塑料屏下选出。对获得的光形态发生突变体可进行增进健康代谢物的独特表达模式的筛选。这些突变体能通过相对/^-J和/或的等位基因测试进一步表征，其中的一些可能被表征为与这些突变等位。因此，可能发现也具有独特代谢物特征的与和/或Zi/7-广等位的诱变植株。对这些植林中Z)/XBJ基因的序列分析应揭示出使这种独特代谢结构突出的准确遗传改变。类似于以上概述的那些，这些遗传改变应4吏设计特定的分子标记物成为可能，以用于标记物辅助的选择。另外，这种损伤的定位可揭示/>/>必7基因内的区域，该区域作为目标用于有效的遗传操作以便获得在番茄果实内具有独特代谢特征的植林。实施例11在番茄果实和/或其它植物物种的果实和蔬菜中过量表达正常或改变的DDgJ基因以获得过量生成健康增进代谢物D"丑2基因在很多在进化上遥远的物种间高度保守(SchroederWfl/.2002)。它与过量生成健康增进代谢物的联系也已在上文进行过概述。这些结果提示D2)5J基因对健康增进化合物生成的影响在其它植物物种中也不应被忽视。从这种实际的观点来看，JWXBJ基因可从正常或A/-2和突变体番茄植林或任何其它植物物种以正义或反义(RNAi)方向在组成型或果实特异的启动子下克隆。在植物物种中这些构建物的过度表达可导致果实和蔬菜中功能性代谢物生成的增加。参考文献BargR，MeirE,LapushnerD，FranJcelR，SaltsY(1990)Differentialregulationoffruitspecific62kDaproteinindevelopingparthenocarpic(pat-2/pat-2)andseededtomatofruitsP/i;y"c/fcz"80:417-424'ChoryJ(1993)Outofdarkness:mutantsrevealpathwayscontrollinglight-regulateddeve〗opraen〖inpants.TrendsGenet9:167-172EshedY，Abu-AbiedM，SarangaY，ZaxnirD(1992)Lycopersiconesculentumlinesccmteini:ngsmdoverlappingintrogressionsfromL.pennellii.TheorAppGenet83:2027-034FuD，WakasugiM，IshigakiY，NikaidoO，MatsunagaT(2003)cDNAcloningofthechickenDDBlgeneencodingthep127subxmitofdamagedDNA-bindingprotein.GenesGenetSyst200378:169-77FultoriTM，ChunwongseJ，TansieySD(1995)MicroprepprotocolforextractionofDNAfromtomatoandotherherbaceousplants.PlantMolBiolRep13:207-209ffigginsDG，SharpPM(1988)CLUSTAL:apackageforperformingmultiplesequencealignmentonamicrocomputer.Gene73:237-244.IshibashiT，KimuraS，YamamotoT，FurukawaT，TakataK,UchiyamaY,HashimotoJ，SakaguchiK(2003)RiceUV-damagedDNAbindingproteinhomoogues肌mostabmzd如tinpro〗iferatiiigtissues.Gene308:79-87KonslerTR(1973)Threemutantsappearingin'Manapal'tomato.HortSci8:331-333KoornneefM,BosmaTDG，HanhartCJ,vanderVeenJH，ZeevaartJAD(1990)Theisolationandcharacterizationofgibberellin-deficientmutantintomato.The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