ErbB配体的剪接变体、其组合物及其用途的制作方法

专利名称：：ErbB配体的剪接变体、其组合物及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及ErbB配体的核酸和氨基酸序列，此ErbB配体是先前已知的ErbB配体的剪接变体，还涉及包括这些序列的组合物，及其在诊断、治疗和预防ErbB受体介导疾病和受体介导紊乱中的用途。
背景技术：
：通常在由特定激活配体激活时，受体酪氨酸激酶在机体细胞间信号传导起重要作用。1-型酪氨酸激酶受体，也称为ErbB/HER蛋白，包括这样一个以表皮生长因子(EGFR;ErbB-l)为其代表的受体酪氨酸激酶家族。迄今为止哺乳动物/人类ErbB家族由4个已知受体(ErbB-l至ErbB-4)组成。在受体结合配体二聚时，信号由其内部细胞质酪氨酸激酶催化的自身磷酸化反应转导，并恢复下游的信号级联(由Yarden和Sliwkowski于2001综述)。ErbB配体ErbB受体由大量配体激活。人类的这个配体家族由至少ll个独立基因编码，它们的剪接变体包括神经调节蛋白(NRG-l、NRG-2、NRG-3&NRG-4)、表皮生长因子(EGF)、TGF-a、卩纤维素、双调蛋白(Amphiregulin)、肝素-EGF复合体(HB-EGF)、表皮调节素(Epiregulin)和Epigen(综述于Harari等人1999;Harris等人2003)。这些配体都具有一个它们优先结合的选择性受体镨系，各带有其自己的差异性结合亲和力的阵列。通常但并非仅仅是，神经调节蛋白优先结合ErbB3和/或ErbB4，而其余的配体优先结合ErbBl。配体一结合，受体的同型二聚体与异型二聚体得到特定的补充。与未知配体结合的ErbB2仍然可以作为异型二聚体依靠配体(ligand-dependent)的方式积极地得到补充。依赖于激活配体，大多数同型二聚体与异型二聚体ErbB的结合可以由其结合的配体决定，从而从这4种受体得到一个多元的下游信号网络。然而，对不同ErbB受体的二聚化配体的选择并非任意的。不同ErbB受体在体内的空间和时间表达通常不重叠，从而缩小了表达的配体对一个所给细胞类型可以激活的受体的结合范围(综述于Harari等人1999;Harari和Yarden2000)。通过依靠配体的方式对不同ErbB受体复合物的信号分级优选。其中，含有ErbB-2的结合通常是最有效的、由多个配体施加的延长信号，可能是由ErbB-2介导减速配体解离。与可能的ErbB4和ErbB-4同型二聚体形成相比，对没有已知直接配体的ErbB-2，和缺少内部酪氨酸激酶活性的ErbB-3，同型二聚体或者不能形成，或者是无活性的。异型二聚的ErbB复合体在体内的重要性是有争议的。例如，编码NRG-1基因的缺陷、编码受体ErbB-2基因的缺陷或编码受体ErbB-4基因的缺陷的小鼠，都导致胚胎心脏的小梁不能形成，这与小梁形成需要由NRG-1激活ErbB-2/ErbB-4异二聚体的观点一致(综述于Harari等人1999)。ErbB配体和受体的镨系在简单和更多的复杂有机体之间不同。在秀丽线虫(C.elegans)中，编码单个ErbB配体和受体(Moghal和Sternberg2003)。在黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)中同样的编码单个ErbB受体基因，但具有4个激动物的扩大的配体家族(Vein、Gurken、Spitz和Keren)和称为Argos的单个拮抗物(Shino2003;表1)。哺乳动物中，具有进一步扩大的编码至少U个配体和4个受体的基因。然而，迄今为止还没有发现哺乳动物抑制的Argos-类似ErbB配体。这些已知的ErbB配体列在表1中。表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>调节ErbB配体家族的EGF域的基序(motif)的受体随着有机体进化的分离选择，ErbB配体都隐含一个保守基序，称为EGF域。EGF域(包括来自无脊推动物衍生的拮抗配体Argos)对受体结合和调节是关键性的。大多数配体有共同的一般特性，即隐含单个EGF域和单个跨膜域。研究发现，EGF域邻接跨膜区并且在其氨基末端侧，这样组成配体细胞外域的一部分。对大量配体，已经证明EGF域对受体结合和活化是既必需又充分的。例外地，表皮生长因子包括9个细胞外的EGF域，其中只有第9个EGF域即最接近跨膜区的，已经表现出促成受体结合(Carpenter和Cohen1990)。跨膜域把配体束繂在细胞表面。细胞外域的翻译后的蛋白质水解裂解的复杂过程需要释放束缚的EGF域，其在很多情况下对配体活化是关键性的(Harris等人2003)。然而，确实存在缺乏跨膜域的天然配体，例如NRG-1的一些剪接变体的情况。此外，已经描述了带有截短的EGF域的NRG-1的变体(heregulin-Y;NRGl-y)，尽管有报导说其可能不具有生物活性(Falls2003)。ErbB-受体-结合EGF域包含6个不变的半胱氨酸残基，其负责形成3个二硫键(认为形成键Cysl-Cys3、Cys2-Cys4和Cys5-Cys6),表示为环A、B和C(图1来自Harari和Yarden2000)。除了保守的半胱氨酸以外，这些配体的受体-结合的EGF域编码许多保守和半保守的残基，包括靠近Cys6的甘氨酸和精氨酸残基(如其它文章定义的，图1中的对应于Gly-40&Arg-42或Gly-39&Arg-41合成多肽的框内残基用于分别编码TGF-a和表皮生长因子的配体结合EGF域(Jorissen等人2003))。这些甘氨酸与精氨酸的保守性并不是一致的。这些残基的替代式突变严重地危害了配体结合或功能(Campion和Niyogi1994;Groenen等人1994;Su腿erfield等人1996)。昆虫Argos来自苍蝇的遗传证据证明Argos在EGFR信号传导中作为负调控因子(Howes等人1998)。黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)配体Argos含有包含B-环的EGF域，此环比用于活化配体的环大(图1)。尽管这不同于ErbB配体家族的其它成员，但是已经说明了ArgosEGF域直接与果蝇EGF受体结合(Jin等人2000;Vinos和Freeman2000)。据报道ArgosEGF域不仅在受体结合也在配体的拮抗功能上起重要作用。ArgosEGF域交换到激动物配体Vein中，把这个活性配体转变为抑制剂(Schnepp等人1998)。而且，Argos阻滞分泌的Spitz与果蝇EGF受体结合，暗示抑制配体竟争性地取代拮抗配体结合(Jin等人2000)。当发现Argos没有直接结合EGF受体而是以高亲和力结合到活性配体Spitz时，Argos结合果蝇EGFR并抑制受体功能的假设近来已经被争论。这提出了一种完全不同的机制，其中Argos以此机制通过螯合配体，而不是通过直接Argos-EGF受体结合而抑制EGF受体信号(MarkLemmon;TheFourthDubrovnikSignalingConference,FEBS，2004年5月)。总之，尽管遗传证据证明Argos作为EGF受体通路的抑制配体，它发挥其抑制功能的一般机制还在争论中。在C-环中，黑腹杲蝇Argos含有通常存在于这个配体家族的典型的甘氨酸和精氨酸残基(加框区域；图1;等价于EGF的Gly39和Arg41(Groenen等人1994))。然而，在从另一个昆虫种一家蝇(Muscadomestica)测序的Argos中，这个典型的精氨酸残基由组氨酸取代，这证明这个残基上的绝对保守性对于Argos功能是不需要的(Howes等人1998)。这个发现再次表示于图2,作为3个昆虫种的多重比对。家蝇Argos中His取代Arg的重要性不应该被低估，尤其是如果考虑到Argos结合于EGF受体的模式。EGFArg41(或TGF-a对应的Arg42)的取代突变的嵌合表示，配体-受体结合的亲和力的降低超过100倍(Campion和Niyogi1994;Defeo-Jones等人1989;Engler等人1992)。以刺激性果蝇配体Spitz取代Argos的C-环，导致形成保持适度抑制活性的融合蛋白(Howes等人1998)。这些发现不提供对Argos作用的机制的理解。然而，它们提供了证据以支持Argos的C-环不可以被认为是负责(或至少完全负责)Argos的抑制功能的假定。ErbB配体已经表现出对细胞增殖的诱导和繁殖是重要的，也广泛涉及多种生理和病理状况下的许多其它细胞信号通路中。因此，ErbB信号通路的拮抗物和激动物都有巨大的治疗潜力(由Mendelsohn和Baselga评论，2003)。上述ErbB配体和其使用方法说明不同ErbB配体可以有不同结构和功能。ErbB配体的新的剪接变体很可能具有系统或组织特异性的生理作用。因此，人们已经意识到分离和鉴定ErbB配体剪接变体是一项有意义的工作，这些变体包括截短、缺失、可选外显子剪接或可翻译的内含子序列，其改变调节EGF域的受体的构成、长度或功能。发明概要本发明提供了新的ErbB配体的剪接变体，包括截短变体、缺失变体、可选的外显子使用、和内含子序列，它们各包括至少一EGF域的改变部分，其影响配体介导的ErbB受体活化。为了不局限于特定的机制或作用机理，变异EGF域可以直接通过受体结合、或非直接地通过配体螫合、或通过改变ErbB受体活化的任何其它机制影响受体活化。本发明涉及编码这些ErbB配体新变体分离的多核苷酸，包括包含这些多核苦酸的重组DNA构建体、包含这些构建体的栽体、由它们转化的宿主细胞、和特异地识别这种剪接变体上存在的一个或多个表位的抗体。本发明的一个目标是提供载体，包括含有本发明多核苷酸的表达载体、含有本发明多核苷酸的工程化细胞、遗传工程改造过的表达本发明多核苷酸的细胞、以及使用这些载体以生产本发明的重组ErbB配体的剪接变体的方法。本发明另一个目的是提供包括本文所公开的新的氨基酸序列的合成肽。需要说明的是，本文公开的作为ErbB配体的新剪接变体，无论是来自保守基因组DNA序列、来自cDNA序列，或来自其它来源的，可以由任何涉及重组技术、合成肽化学方法或其任何组合的适合方法生产。本发明又一个目的是提供包含ErbB配体的新剪接变体或编码它的多核苷酸的药物组合物。本发明另一个目的是提供诊断和治疗ErbB受体相关疾病的方法，包括向需要的患者施用一种药物组合物，此组合物包括作为活性成分的新ErbB配体或编码它的多核苷酸。根据一个方面，本发明提供ErbB配体剪接变体多肽和编码它的多核苷酸。公开了已知ErbB配体的新类型和假定类型，其特征在于它们不包括EGF域的C-环。换言之，本发明的剪接变体的统一特征是它们缺少迄今已知ErbB配体的受体结合的不变6个半胱氨酸的半胱氨酸5和6,或受体调节EGF域。根据一个实施方式，本发明提供具有ErbB受体拮抗物或激动物活性的新的成熟多肽，及其片段、类似物和衍生物。一些实施实施方式，本发明的多肽来源于非哺乳动物的脊推动物。另一些实施方式，本发明的多肽来源于哺乳动物。其它实施方式，多肽来源于人类。根据一个实施方式，本发明提供一种多肽，其包括ErbB配体的剪接变体，此剪接变体是由不同的外显子编码的，此外显子包括一个截短的EGF域——^:少C-环的EGF域。根据某一优选实施方式，本发明提供ErbB配体剪接变体，其包括在SEQIDNOs:73至84中所列的任一序列。能够理解的是，本发明包括这些序列的活性片段、缺失、嵌入、延伸，附带条件为任何这种延伸都缺少相应已知EGF域的C-环。根据某一特定实施方式，本发明的包括截短EGF域的新剪接变体具有在SEQIDNOs:93、95-104、109-121中所列的任一序列。根据另一个实施方式，本发明提供编码ErbB配体的剪接变体的多核苷酸，其包括分离的多核普酸，此多核苷酸包括在SEQIDNOs:128-139和SEQIDNOs:148、150-159、164-176中所列的任一序列。将要理解的是，本发明包括本文所公开序列的所有活性片段、变体和类似物，他们保持所来源序列的生物活性，附带条件为所述变体和类似物缺少EGF域的C-环。本发明也提供一种多核苦酸序列，其在严格条件下与编码设定于SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121中所列任一氨基酸序列的多核苷酸或所述多核苷酸序列的片段杂交。本发明还提供一种多核苷酸序列，其包括编码了SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121所列的任一氨基酸序列的多核苦酸序列的补体，或所述多核苷酸序列的片段或变体。才艮据一些实施方式，本发明分离的多核苷酸包括一种多核苷酸，其包括SEQIDNOs:128-139和SEQIDNOs:148、150-159、164-176中所列任一核苷酸序列，或其片段、变体以及类似物。本发明还提供SEQIDNOs:128-139和SEQIDNOs:148、150-159、164-176中所列的任一多核香酸的互补序列，或其片段、变体和类似物。本发明的多核苷酸还包括在严格杂交条件下与SEQIDNOs:128-139和SEQIDNOs:148、150-159、164-176中所列任一核苷酸序列的补体相杂交的多核苷酸。根据另一个实施方式，本发明提供一种表达载体，其至少含有公开的任一多核苷酸序列的一个片段。在另一个实施方式中，含有此多核苷酸序列的表达载体包含在宿主细胞中。本发明还提供生产本发明多肽的方法，其包括a)在适于表达多肽的条件下，培养含有表达载体的宿主细胞，此载体至少含有编码ErbB配体剪接变体的多核苦酸序列的一个片段，此片段包括编码变体EGF域的序列；及b)从此宿主细胞培养物中分离的多肽。根据另一个方面，本发明也提供在生物样品中检测编码ErbB配体的剪接变体多核苷酸的方法，包括以下步骤a)把编码多肽的多核苦酸序列的补体与生物样品的核酸材料杂交，从而形成一个杂交复合体，此多肽具有SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121中所列的任一序列；和b)检测此杂交复合体，其中复合体的存在与生物样品中编码ErbB配体的变体的多核苷酸的存在相关联。根据一个实施方式，此生物样品的核酸材料在杂交前由聚合酶链式反应扩增。又一个方面，本发明提供一种药用混合物，其包括具有SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121中所列任一氨基酸序列的多肽，或编码其的多核苷酸，还包括一种制药学上可接受的稀释剂或载体。根据另一方面，本发明提供一种纯化的分子或化合物以阻止或抑制本发明的ErbB配体剪接变体的功能。抑制剂可以选自抗体、肽、模拟肽(peptidomimeric)和小的有机分子。抑制剂，优选具有多种应用的特异性抗体，这些应用包括鉴定、纯化和检测变体的ErbB配体，尤其是任何能够识别ErbB配体的剪接变体上存在的表位的抗体，此剪接变体缺少EGF域的C-环，即缺少包括EGF域的C-环已知对应物。根据一个实施方式，本发明提供一种纯化的抗体，其结合于包括SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121所列的任一氨基酸序列的多肽、或其特定片段、类似物和变体上的至少一个表位，附带条件为此表位应该不存在于与之对应的ErbB配体上。本发明的另一方面提供预防、治疗或改善ErbB受体相关疾病或紊乱的方法，包括向需要的患者施用一种药物组合物，其包括上文所公开的作为活性成分的ErbB配体剪接变体。根据一个实施方式，本发明提供预防、治疗或改善ErbB受体相关疾病或紊乱的方法，包括向需要的患者施用一种药物组合物，其包括作为活性成分的多肽，此多肽包括SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121中所列的任一序列。才艮据另一个实施方式，本发明提供预防、治疗或改善ErbB受体相关疾病或紊乱的方法，包括向需要的患者施用一种药物组合物，其包括作为活性成分的多核苷酸，此多核苷酸编码了包括SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121所列的任一序列的多肽。根据另一个实施方式，本发明提供预防、治疗或改善ErbB受体相关疾病或紊乱的方法，包括向需要的患者施用一种药物组合物，其包括作为活性成分的多核苷酸，此多核苷酸包括SEQIDNOs:128-139和SEQIDNOs:148、150-159、164-176所列的任一序列。根据另一个实施例，ErbB受体相关疾病或紊乱选自如下组成的组肿瘤疾病、过增殖紊乱、血管发生、再狭窄、创伤愈合、精神紊乱、神经学紊乱和神经损伤。由于期望至少一些具有缺少完整EGF域C-环的截短EGF域的新的ErbB剪接变体可以作为拮抗物而不是激动物，要理解的是这些变体对预防或减小配体激动物介导的任何病理学反应是有用的。这样，可以减少或甚至消除肿瘤、过增殖、血管生成或其它反应，通过暴露于或由根据本发明的一种拮抗物治疗。而且，如果激动物配体偏向于使干细胞增殖、存活、移动、进入或定向于特定语系，然后暴露于拮抗物或以拮抗物治疗将可能改变谱系定型(lineagecommitment)和分化才莫式(differentiation),或定向于给定细月包镨系之前加强增殖。根据另一些方面，本发明提供了选择性地调节表达ErbB受体的干细胞的存活、增殖、移动或分化的方法，包括把干细胞暴露于根据本发明的ErbB配体剪接变体。优选地，所述干细胞是神经的、心脏的或胰脏的语系，由于在本领域中已知ErbB配体涉及这些谱系的发展。根据一个实施方式，本发明提供一种选择性地调节表达ErbB受体的干细胞的存活、增殖、移动或分化的方法，包括把干细胞暴露于根据本发明的ErbB配体剪接变体，此剪接变体包括SEQIDNOs:73至84和SEQIDNOs:93、95-104、109-121所列任一氨基酸序列。更优选地，所述千细胞选自神经的、心脏的或胰脏的干细胞谦系。才艮据另一些方面，本发明提供抑制ErbB配体剪接变体表达的方法，通过使用反义杂交、小抑制物(siRNA)或微RNA(microRNA)抑制物和核酶靶向目标，靶向于这种剪接变体的表达的转录物。在以下的说明、图以及权利要求中更详尽地解释本发明。图l表示对于蠕虫(秀丽线虫)、昆虫(黑腹果蝇)和哺乳动物(人或鼠)的不同已知ErbB-配体鉴定，进化上保守的EGF域的多重序列比对。阴影灰色的序列表示了此比对中的不变残基。六个半胱氨酸残基被认为需要在所有这些已知配体的域内衔接形成三个二硫键。不变的甘氨酸和精氨酸残基被认为对高亲和力的配体-受体结合(框区)是重要的。此多重序列比对由带有更正的ClustalX(版本1.81)产生，使用以下方案哺乳动物序列是独立地由ClustalX比对的(缺省参数)。对无脊推动物配体重复此步骤。然后作为独立序型处理这些比对，其中哺乳动物序列的序型与无脊推动物序列的序型比对，再次使用ClustalX(序型模式)。所有计算都用缺省程序参数进行。图2对于3个独立昆虫种黑腹果蝇、黑果蝇(Drosophilavirilis)和家蝇的所公开的Argos主要蛋白序列的多序列比对。两个富含半胱氨酸的域定义为A1和A2，EGF域标以粗体和下划线。区别这些域的定义已经从其它地方借鉴(Howes等人，1999)。高度保守的残基区域表示，在Argos蛋白序列中存在关键的域。类似地，家蝇蛋白序列证明，在所有其它受体激动物(见图1)的EGF域中发现的不变Arg残基不是必要地保守在昆虫Argos(加框区域)中。*表示不变的残基；表示保守残基；.表示半保守残基。困3表示由不同哺乳动物ErbB-配体编码的受体-调节的EGF域的多序列比对。由不同哺乳动物ErbB-配体编码的受体-调节的EGF域的多序列比对用作输入物，从其产生为了序列序型以便使用Compugen(主机在EMBL)Bioccelerator对各数据库进行序型搜索。此比对由1.81版本的带有次要的手动更正的ClustalX产生。*=不变的残基；-保守残基；.-半-保守残基。图4表示对神经调节蛋白/EGF配体家族的EGF域的编码"外显子A"的基因组位点的检查。每个配体中编码外显子A的基因组序列从NCBI人类(或指出为鼠)基因组数据库提取出。然后翻译基因组序列，这包括延长序列进行到并超过5，外显子内含子剪接联结点，其通常区分外显子A的末端。这个"延展外显子A"可能地编码一个不变的框内终止密码子，其精确的位于对所有ErbB配体相对于EGF域的半胱氨酸4的同样的坐标系。全长EGF域的蛋白质序列在这个图中与延展外显子A的翻译序列比对。外显子A和外显子B是选择性地加阴影。终止密码子的存在由星号(*)表示。虚线(....)表示外显子-编码的序列延展超过这个比对。此图中存在的蛋白序列如所示的在本文列出(SEQIDNOS:14-26和73-84)。还提编码全长的鼠epigen的EGF域在这里给出，由于目前这种分析还不能得到人的序列。已经提供了对这两个种的源自基因组数据的"延展外显子A"序列。图5证明编码EGF域的基因而不是ErbB-配体在基因组水平表现出非均匀的内含子-外显子结构。图5A表示TGF-a、EGF和Notch-l的EGF域的示意图。蛋白质TGF-a、EGF和Notch-l在它们如所示的各自的序列中包含1个、9个和36个EGF域(示意图并非按比例的)。EGF域用框表示。EGF和TGF-a的跨膜域用垂直黑色条表示。其他无关区在此图中忽略。负责受体活化(对EGF和TGF-a)的EGF域用带星号(*)的阴影框表示。表皮生长因子包括另外八个EGF域，不认为它们直接活化受体。Notch-l不认为是ErbB配体，此处表示为也包含EGF域(未加阴影的框)的无关蛋白的例子。图5B提供了对人TGF-a、EGF和Notch-l的编码不同EGF域的基因组位点的检查。TGF-a(i)、EGF(ii)和Notch-l(iii)的蛋白序列以blasted人类基因组数据库(tblastn;NCBI)，以检查这些基因的外显子结构。这些蛋白序列的EGF域使用SMART数据库以手动调节鉴别，这里忽略了侧翼序列。比对这些域的序列(Clustalx版本1.81;标准参数)。黑色和轻的阴影表示在特定EGF域内区分外显子-内含子边界的基因组拓朴。每个EGF域的坐标在每种情况下提供。例如，跨越Notch-1的氨基酸24-57的第一EGF域表示为EGF—24—57。用于检查TGF-a、EGF和Notch-1的蛋白序列和基因组序列源自NCBI分别添加[P01135，NT—022184.9]、[NP—001954.1,NT—028147.9]和[AAG33848,NT—024000.13]。在比对的域，ErbB-受体-活化EGF域的例外的例子以粗体打印并以星号(*)区分。在四十四个不直接活化的ErbB受体的EGF域(三十六个区是Notch-1的，八个区是EGF的)中，其中只有两个(编号1和30的Notch-1EGF域)包含一个外显子-外显子分界，其分开半胱氨酸l-4与半胱氨酸5-6。Notch-l的第一EGF域不是完全阴影的，由于缺少在BLAST比对中发现的这个基因组序列的片段。图6表示mEGF(l-32)和hNRG2(l-32)与固定化的卩纤维素的Biocore结合变量曲线。如所示浓度的mEGF(l-32)与hNRG2(l-32)注射到带有固定化(3纤维素的Biacore芯片表面，所得到的传感器曲线减去空白对照以产生所示的特异反应。结果表示，所示的两种肽各自与卩纤维素以低亲和力相互作用(RU-共振单位)。发明详述本发明是指(i)认定为至少一种已知ErbB配体的剪接变体的新ErbB配体亚型；(ii)编码此新剪接变体的多核苷酸序列；(iii)来自所述多核苷酸序列的寡核苷酸和寡核苷酸类似物；(v)鉴定所述剪接变体的抗体；(vi)来自所述剪接变体的肽或肽似物；(vii)药用组合物；及(viii)采用所述多肽、肽或肽似物、所述寡核苷酸和寡核苷酸类似物、和/或所述多核苷酸序列调节至少一种ErbB受体介导的活性的方法。在构思本发明时，假定另外的、此前未知的ErbB配体可以存在。剪接变体，其在超过50%的人类基因中发生，在尝试认定差异表达的基因时其通常被忽略，而它们的独特序列特征包括供体-受体串联、可选择的外显子、外显子和保留的内含子，使它们的认定变得复杂。然而，剪接变体可以对理解疾病演变具有重要影响，并可以在各种病理学中作为有价值的标记。ErbB配体剪接变体可以组成ErbB-配体受体活化EGF域的边界的准确定义是有争论的事情。一种保守和局限的观点是，它恰好跨越半胱氨酸1至半胱氨酸6(Cl-C6)(例如，Howes等人1998)。这个区域的甚至更小的亚域报道为微弱地结合于受体并裔导低水平的生物活性(综述于Groenen等人1994)。一个可替换的定义是基于原配体(pro-ligand)的天然分裂方式，其中在最近的和末梢的分裂事件之后产生含有可变长度肽的EGF域(Harris等人2003)。而另一种定义依赖于具有可变长度的合成的和重组的肽的生物化学和生物活性分析，以重组"典型"配体功能。从这种分析，明显的是需要另外的羧基和氨基末端序列側翼C1-C6以重组配体功能。"典型"功能所需的准确长度可以在配体之间有所不同，如已经在研究中基于结合和生物活性试验的实验证明的(Barbacci等人1995;Groenen等人1994;Jones等人1999K即使这样，很明显，这种定义可以依赖于进行的生物试验而有所改变。例如，仅是基于对合成配体肽的受体-结合亲和力的说明的生物试验，可以证明限定长度的特定配体的结合很微弱。然而，已经描述了自然界中有效的促有丝分裂的低亲和力配体(例如Tzahar等人1998)。这样在这两种生物参数中存在差异。尽管每个神经调节蛋白基因只编码单个EGF域，NRG-1和NRG-2基因都包括剪接变体，其中EGF域的羧基-末端可以由两个可替换的外显子编码(所得到的变体称为a和卩)。这些选择性编码的配体具有与4种不同ErbB受体异型二聚化的不同的结合亲和力和能力(由Falls综述,2003)。产生对NRG-1和NRG-2的a和卩亚型的能力反映在基因组水平，这里EGF域的羧基末端由可选的外显子编码。更具体地，对NRG-1和NRG-2二者，单个外显子编码EGF域的氨基末端部分，其跨越Cl-C4并组成EGF域的A-环和B-环。可替换的选择外显子以编码此域的其余部分，此其余部分包含这个EGF域的C5-C6和C-环(Crovello等人1998)。有趣地，ErbB配体家族的所有其它成员也具有类似的分段的外显子域结构，其恰好编码相邻外显子上受体-活化EGF域的Cl-C4和C5-C6。然而，对于除了NRG-1和NRG-2之外的所有这些配体，还没有证据表明它们编码EGF域的a和(3可选择性亚型，因此在基因组水平保持这些保守的外显子-外显子拓朴的进化力量依然是个谜(Harris等人2003;D.Harari,BigRockSeminar,theWeizmannInstituteofScience,February5th,2001)。4呆持受体-活化EGF域的这种外显子-外显子结构的功能的重要性依然未解决，并且这是本发明的主要动力。目前，只认定了一个具有拮抗物活性的ErbB配体，称为来自昆虫的Argos配体。此ArgosEGF域对这个配体的抑制功能是必要的(Howes等人1998)。然而，Argos作用为抑制配体的机制是争论的主题。例如，一个模型暗示，Argos直接结合昆虫EGF受体，抑制激动物配体(诸如Spitz)的结合并抑制受体的二聚化(Jin等人2000)。然而一个替换的模型暗示，Argos直接结合激动物配体(诸如Spitz)，结合激动物不与活化受体结合(MarkLemmon;TheFourthDubrovnikSignalingConference,FEBS，2004年5月)。本发明的主要目的是鉴定具有抑制活性的另外的ErbB配体，尤其是天然存在的配体，优选地来自脊稚动物种，更优选地来自哺乳动物种，最优选地来自人类。除了EGF域的重要性，果蝇(Drosophila)Argo包括两个额外的富含半胱氨酸的区域，其已经定义为Al和A2(Howes等人1998)。来自这3个种的Argos的多序列比对证明，对于EGF域，域Al和A2以及相邻序列是高度保守的(图2),这支持了这些域在蛋白功能中的重要生理作用。这个多序列比对也证明了EGF域的序列和侧翼羧基-末端序列的保守性(图2)。在描述本蛋白、核苷酸序列、包括它们的组合物和它们使用方法之前，应当理解的是，本发明不限于所描述的特定的方法论、方案、细胞系、栽体和试剂，由于它们是可以改变的。还要理解的是，本文所使用的术语目的仅是描述特定实施方式，不意味着限制本发明的范围，本发明的范围仅由附带的权利要求限制。必须注意的是，本文和附带的权利要求中所使用的，单数形式"一"、"一"和"此"包括复数的含意，除非上下文明确地另外指出。因此，例如，提及的"一宿主细胞"包括多个这种宿主细胞，所提及的"抗体"是指一个或多个抗体以及对本领域技术人员已知的它们的等价物，等等。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语是本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。尽管在实践或测试本发明时可以使用类似于或等价于本文所描述的任何方法和材料，但是现在所描述的是优选的方法、装置和材料。本文所提到的所有出版物都在此引用作为参考，目的是描述和公开报道于出版物中的细胞系、载体和方法学，其可以与本发明结合使用。因为在先发明，在此的描述没有什么可解释为承认本发明无权早于此公开。定义本文使用的ErbB配体，是指从任何种，特别是高等脊推动物，尤其是从包括牛、羊、猪、鼠、马的哺乳动物，优选为人的，来自任何源头的，无论是天然的、合成的、半-合成的、或重组而得到的基本纯化的ErbB配体的氨基酸序列。如本文说明书中和此后的权利要求部分中使用的短语"互补多核苷酸序列"包括使用逆转录酶或任何其它依赖于RNA的DNA聚合酶从信使RNA反转录得到的序列。然后这种序列可以使用依赖DNA的DNA聚合酶在体内或体外扩增。如在本文说明书中和随其后的权利要求部分中使用的短语"基因组多核苷酸序列"包括来自染色体的序列，并反映染色体的邻近部分。如在本文的说明书中和随其后的权利要求部分中使用的短语"复合多核苷酸序列"包括至少部分互补的并至少部分是基因组的序列。复合序列可以包括编码多肽所需的一些外显子序列，以及介入其间的内含子序列。此内含序列可以是任何包括其它基因的源头的，通常将包括保守的剪接信号序列。这种内含序列还可以包括顺式作用表达的调节元件(regulatoryelement)。如在本文说明书中和权利要求中使用的短语"剪接变体"是指天然存在的核酸序列及其编码的蛋白，它们是选择性剪接(Alternativesplicing)的产物。选择性剪接是指内含子内含物、外显子排除、可选择的使用外显子或任何添加或缺失的末端序列，其导致在剪接变体序列和其它野生型序列之间的序列差异。尽管大多数选择性剪接变体来自选择性的使用外显子，一些来自在RNA转录过程的中间阶段未剪出的内含子的保留。本文使用的"等位基因"或"等位序列"是编码ErbB配体的基因的可替换形式。等位基因可以来自核酸序列中的至少一个突变，并导致改变的mRNAs或多肽，这些mRNAs或多肽的结构或功能是可以改变或可以不改变的。任何所给的天然或重组基因可以具有无等位形式、一个等位形式、或许多等位形式。通常引起等位基因的突变归因于核苷酸的天然缺失、附加或替代。这些类型的改变都可以单独的、或与其它改变组合的、在所给序列中一次或多次的发生。本文所使用的编码ErbB配体的"改变的"核酸序列包括那些带有不同核苷酸的缺失、插入或替代的核普酸序列，其得到编码相同的或功能上等价的ErbB配体的多核苷酸。包括在这个定义中的是多态性，其可以或不可以使用编码特定ErbB配体的多核苷酸的特定寡核苷酸探针容易地检测，并不适当或不期望地与等位基因杂交，其带有一个位点，其同于编码ErbB配体的多核苷酸序列的正常染色体位点。编码的蛋白质也可以是"改变的"并含有氨基酸残基的缺失、插入或替代，其产生沉默改变并导致功能上等价的ErbB配体。只要保留ErbB配体的生物学或免疫学活性，有意的氨基酸取代可以在类似的基础上制造，此类似性在于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两性特性。例如，带负电荷的氨基酸可以包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可以包括赖氨酸和精氨酸；带有具类似亲水性值的不带电极性头部基团的氨基酸可以包括亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸、甘氨酸和丙氨酸、天东酰胺和谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸，以及苯丙氨酸和酪氨酸。本文所使用的"氨基酸序列，，是指寡肽、肽、多肽或蛋白质的序列，以及它们的片段，以及指天然存在的或合成的分子。优选的ErbB配体的片段是大约二十至大约四十氨基酸的长度，并保持着完整配体的生物学活性或免疫活性。本文所述的"氨基酸序列"是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列、氨基酸序列、和类似术语，这些不意味着把氨基酸序列限制在所述蛋白质分子相关的完整、天然氨基酸序列。本文所使用的"扩增"是指产生核酸序列的另外拷贝，通常使用本领域中熟知的链式聚合酶反应(PCR)技术进行(Dieffenbach,C.W.andG.S.Dveksler(1995)PCRPrimer,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.)。本文所使用的术语"活化的配体"或"激动物，，是指一种配体，其一旦结合就以受体依赖的方式促进ErbB信号转导。不矛盾的是，在一定条件下，配体可以恰当的描述为既活化的又是抑制性的，依赖于描述它的背景的环境或实验。本文可互换使用的术语"抑制性配体"或"拮抗物"，是指一种减少ErbB受体的已知配体的生物或免疫活性的效果的量或持续时间的分子。拮抗物可以由直接或间接地与ErbB受体结合而起作用。然而拮抗物可以由另一种机制另外地或单独地起作用，其中拮抗物将直接或间接地结合一种活性ErbB配体，从而把它从受体-依赖的活化中螯合。术语"抑制物"是指一种分子或化合物，其对本发明的ErbB配体剪接变体的功能施加抑制作用。抑制物可以包括蛋白质、肽、核酸、抗体或任何其它降低变异ErbB配体效果的分子。本文所使用的术语"抗体"是指完整分子及其片段，诸如Fab、F(ab，)2、和Fv等，其能够结合表位决定子。结合ErbB配体多肽的抗体可以使用完整多肽或含有感兴趣的小肽的片段作为免疫抗原而制备。用于使动物免疫的多肽或寡肽可以来自RNA的翻译或化学合成，且如果需要可以接合于载体蛋白。通常使用的化学偶联于肽的载体包括牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白、匙孔血蓝蛋白。然后偶联的肽用于使动物(例如，小鼠、鼠、兔)免疫。本文所使用的术语"抗原决定子"，是指与特定抗体接触的分子(即表位)的片段。当蛋白质或蛋白质的片段用于使宿主动物免疫时，蛋白质的许多区域可以诱导抗体产生，这些抗体特异地结合蛋白质上的给定区域或三维结构；这些区域或结构是指抗原决定子。抗原决定子可以与完整抗原(即，引起免疫反应的免疫原)竟争结合抗体。本文所使用的术语"反义"，是指含有互补于特定DNA或RNA序列的核苷酸序列的任何组合物。术语"反义链"用于指与"有义"链互补的核酸链。反义分子包括肽、核酸，其可以由包括合成或转录的任何方法产生。一旦引入到细胞中，互补的核苷酸就与细胞产生的天然序列结合，以形成双螺旋并阻滞转录或翻译。命名"反向"有时用于指反义链，"正向，，有时用于指有义链。本文所使用的术语"生物活性，，，是指一种具有天然存在分子的结构的、调节的、或生物化学的功能蛋白质。类似地，"免疫活性"是指天然的、重组的、或合成的ErbB配体或其任何寡肽，在适合的动物或细胞中诱导特异性免疫反应并结合特异性抗体的能力。术语"活性片段，，是指作为最小的受体调节片段的具有缺少C-环的截短域的任何变体。活性片段可以定义为任何具有少于六个完整EGF域保守半胱氨酸的，并能够扰乱至少一个ErbB受体亚型活性的片段。优选地，术语活性片段是指任何具有少于六个完整EGF域保守半胱氨酸的，并能够扰乱至少一个ErbB受体亚型活性的片断，其还包括已知能增加受体结合和/或配体诱导的受体介导活性的侧翼氨基酸序列的片段。本文所使用的术语"互补的"或"互补性"，是指多核苷酸在许可的盐和温度的条件下通过碱基配对自然结合。例如，序歹'j"A-G-T"结合于互补序歹'j"A-C-T，，.两个单链分子之间的互补性可以是"部分的"，其中只有一些核酸结间的互补程度对核酸链之间杂交的效果和强度有重要影响。这在扩增反应中和在设计并使用肽核酸(PNA)分子时尤其重要，所述扩增反应依赖于核酸链之间的结合。本文所使用的"包括所给多核苷酸序列的组合物"，是宽泛地指任何含有所给多核苷酸序列的组合物。此组合物可以包括干燥制剂或含水溶液。可以采用包括编码本发明新的ErbB配体剪接变体的多核苷酸序列的組合物或此多核苷酸特定片段作为杂交探针。此探针可以以冻干形式保存，并与诸如碳水化合物等的稳定剂相关联。在杂交时，可以在水溶液中使用探针，此溶液含有盐(例如NaCl)、去污剂(例如SDS)和其它成分(例如，Denhardt，s溶液、奶粉、鲑鱼精子DNA等等)。本文所使用的"缺失"，是指在氨基酸或核苷酸序列中的改变，并导致一个或多个氨基酸残基或核苷酸的缺失。本文使用的术语"衍生物"，是指编码或互补于一种ErbB配体的核酸的化学修饰，或指所编码的ErbB配体的化学修饰。这种修饰包括，例如由烷基、酰基或氨基取代氢。核酸衍生物编码保留了天然分子的生物或免疫功能的多肽。多肽衍生物是由糖基化、聚乙二醇化(pegylation)或其它类似方法修饰的一种多肽，其保留了它所来源的多肽的生物或免疫功能。本文使用的术语"同源性"，是指基于所共享的氨基酸或核苷酸序列的序列相似性的程度。这里可以是部分同源性或完全同源性(即同一性)。对于氨基酸序列同源性，可以在不同生物信息学程序(如BLAST、FASTA、Sm他Waterman)中使用氨基酸相似性矩阵(如BLOSUM62、PAM79)。以不同矩阵或不同程序进行特定搜索时可以得到不同结果。如本领域所熟知的，核苷酸序列的同源性的程度依赖于带有制造用于最优化比对所需的缺口或插入的Ki的同一匹配。本文使用的术语"人源化抗体"，是指抗体分子，其中为了更加近似人类抗体，氨基酸在非抗原结合区域已经被替换，同时此抗体仍然保持原始的结合能力。本文使用的术语"杂交"是指任何通过碱基配对使一条核酸链与互补链结合的方法。本文使用的术语"插入"或"附加"，是指氨基酸或核苷酸序列的改变，与天然存在的分子相比，其分别导致添加一个或多个氨基酸残基或核苷酸。"微阵列，，是指不同多核苷酸或寡核苷酸在基质上合成的阵列，此基质诸如纸、尼龙或其它类型膜、过滤物、芯片、玻片、或任何其它适合的固体支撑物。本文使用的术语"调节"，是指至少一个ErbB受体调节活性的活性改变。例如，调节可以导致蛋白活性、受体结合特征、配体螯合、或ErbB配体的任何其它生物的、功能的或免疫的特性的增加或降低。本文使用的"核酸序列"是指寡核苦酸、核苷酸和多核苷酸以及其片段，还指基因组或合成来源的DNA或RNA,其可能是单链或双链的并代表有义或反义链。"片段，，是长度超过60核苷酸的核酸序列，最优选地包括长度至少为IOO核苷酸的片段。术语"寡核苷酸"是指至少大约6核苷酸至大约60核苷酸的核酸序列，优选地大约15至30核苷酸，更优选地大约20至25核苷酸，其可以用于PCR扩增或杂交试验、或樣i阵列。如本领域中通常定义的，本文所使用的寡核苷酸基本等价于术语"扩增引物"、"引物"、"寡聚物"、和"探针"。本文所使用的术语"肽核酸"(PNA)，是指核酸"模拟型"；分子的天然骨架由伪肽骨架(pseudopeptide)代替，只保留四个核普酸碱基。肽骨架终止于赖氨酸，其促进组合物的溶解度。PNAs可以被聚乙二醇化(pegylate)以延伸其在细胞中的寿命，在细胞中它们优先结合互补的单链DNA和RNA并终止转录伸长(Nielsen,P.E.等人(1993)AnticancerDrugDes.8:53-63)。本文使用的术语"部分"，对于一种蛋白质(即在"所给蛋白质的部分"中)是指此蛋白的片断。片段的尺寸可以在从5氨基酸残基到整个氨基酸序列减去1个氨基酸的范围内变动。因此，"包括氨基酸序列SEQIDN0:1的至少一个部分"的蛋白质包含全长的PNIN及其片段。本文使用的术语"样品"以其最宽泛的意义使用。怀疑含有编码ErbB配体的核酸、或其片段、或所编码的多肽本身的生物样品可以包括提取自细胞的体液、染色体、细胞器、或从细胞分离的膜、细胞、基因组DNA、RNA、或溶液中的或与固体支撑结合的cDNA、组织、组织印迹(print)、及类似物。本文使用的术语"特异结合，，或"特异性结合"，是指蛋白质或肽与激动物、抗体与拮抗物之间的相互作用。此相互作用依赖于由结合分子识别的蛋白质的特定结构(即，抗原决定子或表位)的存在。例如，如杲抗体是对表位"A"特异的，在含有标记的"A"和抗体的反应中，含有表位A(或自由的、未标记的A)的蛋白质的存在将减少标记的A与抗体结合的量。本文使用的术语"严格条件"或"严格性"，是指由核酸、盐、和温度限定的杂交的条件。这些条件是本领域中熟知的，且可以为了鉴别或检测同样的或相关的多核苷^列而改变。包括或低或高严格性的许多等价的条件依赖于一些因素，诸如序列(DNA、RNA、碱基组合物)的长度和性质、靶(DNA、RNA、碱基组合物)的性质、环境(在溶液中或是固定化到固体基质上)、盐和其它成分(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖和/或聚乙二醇)温度大约20至25度的范围之内)。可以改变一个或多个因素以产生或低或高严格性的条件，其不同于以上所列的条件，但等价于以上列出的条件。本文使用的术语"基本纯化的"，是指从它们的天然环境移去、分离或分开的核酸或氨基酸序列，至少60%、优选地75%、最优选地90%不含有其天然相关的其余部分。本文使用的术语"取代"，是指一个或多个氨基酸或核苷酸分别由不同的氨基酸或核苷酸代替。本文使用的术语"转化"，是指一个方法，外源DNA通过此方法进入受体细胞并改变受体细胞。这可以在天然条件下或者使用本领域中熟知的各种方法在人工条件下发生。转化可以依赖于任何已知的用于把外源核酸序列插入到原核或真核宿主细胞的方法。基于要转化的宿主细胞类型而选择方法，方法包括但不限于，病毒感染、电穿孔、热激、脂质转染、粒子轰击。这样的"转化"细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制的质粒或作为部分宿主染色体而复制。它们还包括用于限制细胞周期时间的瞬时表达所插入的DNA或RNA的细胞。本文使用的术语ErbB配体的"变体"，是指一种氨基酸序列，其由一个或多个氨基酸改变。变体可以具有"保守的，，改变，其中取代的氨基酸具有类似的结构或化学特征，如，以异亮氨酸代替亮氨酸。更罕见地，变体可以具有"非保守的，，改变，如，以色氨酸代替甘氨酸。相似的次要改变还可以包括氨基酸缺失或插入、或两者。用于确定哪个氨基酸残基可以被取代、插入、或缺失，而不取消生物或免疫活性的向导，可以使用本领域中熟知的计算机程序而发现，例如DNASTAR软件。本文和权利要求中使用的术语"剪接变体"，是指已知ErbB配体的任何变体，包括截短变体、缺失变体、可替换外显子使用、和内含子序列，其各包括影响配体介导的ErbB受体活化的EGF域的至少一个改变的部分。特别的，术语剪接变体包括缺少相应于已知EGF域的C5-C6环的所有这样的变体。由生物信息学方法鉴別的新的抑制配体使用序列比较的一种方法学，已经可能由生物信息学方法鉴别同源的ErbB配体激动物(如(Harari等人.1999))。然而，尽管出版了丰富的序列数据，到目前文献中还没有描述天然的已知哺乳动物的抑制性ErbB配体。事实上，一个初步的基于BLAST数据库的搜索未能认定哺乳动物基因，此基因带有的序列充分类似于易于鉴别的昆虫类似Argos蛋白质的序列(数据未示出)。因此决定进行序列的搜索，此序列可以隐藏类似EGF域，其序型是对已知的哺乳动物ErbB配体家族成员是有些典型的。需要注意的是，由于目前所有已知哺乳动物配体都是激动物，这个搜索偏向于鉴别配体激动物。然而，如果哺乳动物ErbB拮抗物配体的EGF域是充分类似于它们的激动物相对物的域，由序列相似性搜索鉴别它们是可能的。因此从NCBI服务器恢复对不同哺乳动物配体的蛋白序列(见表5和表6)。坐标的近似鉴别由SMART服务器定义，其中展现了每个配体的受体-调节EGF域。这些域被任意地延长以提供更大范围的氨基和羧基序列，其可以帮助鉴别新配体，并随后使用ClustalX进行比对。对这些序列比对的次要修正由手动进行(图3)。然后使用程序PROFILEWEIGHT(见材料与方法)进行多序列比对以产生序型。然后对EMBL站点(见材料与方法)上提供的EST数据库进行翻译后序型的搜索。在搜索时，EMBL站点上的EST数据库分成5个区，每个区独立地由TPROFILESEARH扫描。使用整体联配(globalalignment)进行这些搜索，空位开放罚值(gapopeningpenalty)和空位拓展罚值(gapextensionpenalty)的选择分别设在(10&1)或(12&1)，预设输出量为每次搜索比对500个序列。没有鉴别到具有类似于ErbB配体的EGF域典型序型的明显的编码的序列序型的新ESTs。由于已经观察到，在EGF域的位点编码所有哺乳动物ErbB配体的外显子构造是保寺的，决定探究编码了部分的、可替换的或截短的EGF域的可替换ErbB剪接变体可以表达的可能性。例如，已经报道了NRGl的截短形式，其编码部分EGF域直到半胱氨酸4，随后是终止密码子(Falls2003)。当变体在编码每个基因的基因组序列上下游中检查时，剪接亚型可以更好地定义。因此决定提取编码哺乳动物ErbB配体的共-目前(co-currently)基因组序列。为了方便，本文提供了命名以更好地描述外显子，其通常编码哺乳动物ErbB配体的受体-调节EGF域。编码ErbB配体(包括Cl-C4)的EGF调节域第一部分的第一个外显子本文描述为EGF域的"外显子A"。编码EGF域的第二部分(包括C5-C6)的第二个外显子称为EGF域的"外显子B"。对包含EGF域的可替换的(a和P)羧基亚型的NRG1和NRG2的情况，这些在这里认为是EGF域的外显子B(对a亚型)或外显子B，(对P亚型)。编码不同哺乳动物ErbB配体的基因组序列从NCBI数据库提取(见表5和表6)。对每个基因，被鉴别和翻译(使用Transeq)的编码外显子A的基因组区域包括侧翼序列。观察到令人惊讶的结果。不仅外显子A和外显子B的外显子-外显子接合点对所有哺乳动物ErbB配体是保守的，在恰好超过外显子A范围的通常认为是"内含子"的区域中，发现了不变的终止密码子，并在外显子A的框内并紧接挨其下游被编码(图4)。这提供了间接证据，以支持所有哺乳动物配体的可替换亚型可以存在于编码的包含截短EGF域的蛋白质中。特别地，这种剪接变体将编码EGF域至越过半胱氨酸4的一个氨基酸(图4)，作为EGF域的外显子A延伸长度的结果。类似的拓朴见于编码其它小鼠和其它可得脊堆动物种包括例如牛和鸡ErbB配体的基因，这说明对本文人类序列观察到的结果对哺乳动物、鸟类和其它高等脊堆动物是共享的(数据未示出)。扩展的外显子A核苷酸序列(SEQIDNOS:128-139)的4全查证明，对各配体，普通共有的方式导致翻译产物的终止。此序列包含共有的G,TXX，这里逗号表示密码子阅读框，TXX表示终止密码子。需要双核苷酸模式"GT"以保持进化上保守的外显子内含子剪接接合，其在此位点观察到(Darnell等人.1986)。因此，提供了初始的假定，即保持EGF域的进化上保守的基因组拓朴是为了允许在EGF域的半胱氨酸-4之后产生截短的ErbB配体剪接变体。这种观念的一个负向假定是，编码哺乳动物ErbB配体受体-调节EGF域的外显子-外显子结构与剪接变体的形成毫无关系，而是为EGF域序列发现的通常基因组拓朴的结果(其原因是可以是已知或未知的)。EGF域通常由多个蛋白质编码，其大多数部分的功能与ErbB-配体活化无关(CarpenterandCohen1990)。因此，如果ErbB配体的受体-调节EGF域发现的不变基因组结构，也保持在编码无关EGF域的样品的基因组序列中，将对其进行测试。为了测试这个假设，测试了蛋白质TGF-a(作为参照)、表皮生长因子和Notch-l。TGF-a包含单个负责受体结合和活化的EGF域。而相比较的表皮生长因子包括9个EGF域，其中只有第9个负责受体结合和活化。相反，Notch-l是另一个信号分子，包含36个EGF域，所有域都不负责ErbB-受体活化(图5A)。检查了编码这些基因的基因组序列，为了说明编码不同EGF域的基因组结构。对于表皮生长因子，只有ErbB-受体-结合的EGF域由一个分离密码子编码。相比之下，其余8个EGF域完全地在单个外显子编码(图5B)。相反，对于Notch-l，对46个编码的EGF域观察到异源的基因组结构(图5B)。其中，只有第1个和第30个EGF域在发现ErbB-受体结合域的位置包含分离外显子拓朴。从这些数据可以推论，编码EGF域的基因组DNA的一般拓朴通常不必分离的外显子-外显子结构，编码的终止密码子紧接外显子A之后，如哺乳动物的ErbB-受体-结合域证明的。编码ErbB配体的基因保持生物活性、此基因不包含编码EGF域的分离外显子-外显子结构。例如，自然界中存在的病毒编码的ErbB配体，尽管它们的基因组缺少分开EGF域编码区域的内含子序列(例如，VGF、NCBI检索号U18337、植入的蛋白序列弁AAA69306)。而且，在各种转录启动子控制下，表达缺少内含子的cDNA序列形式的基因在分子生物学中是普通的操作(Maniatis等人.1982)。人们已经以这种方式构建了编码缺少启动子的ErbB配体的重组基因，它们编码重组蛋白的功能和活性(Groenen等人.1994)。因此在编码不同哺乳动物ErbB-配体(图5)的基因中发现的进化上保守的外显子-外显子接合，对于在哺乳动物细胞中产生包含保守的6-半胱氨酸EGF域的功能配体是不需要的。带有在半胱氨酸4后结束的缩短的EGF域的ErbB配体的功能可替换剪接变体形成，将提供对这个区域序列保守性的功能解释。最好的证据，即这种截短的ErbB配体变体在自然界中存在，将证明确实表达了这种亚型。已经进行了饱和克隆的尝试，以分出较好地特征化了的NRG1基因的所有亚型。事实上存在截短的NRG1亚型，其与其它典型NRGla亚型相同，除了其序列终止于EGF域的第4个半胱氨酸之后的一个氨基酸(hereguliny-不要与yheregulin混淆(Falls2003))。对此蛋白的涉及NRG1基因组位点的编码序列(检索号NP—004486和NM—004495)的检查，更证明这个变体序列包含延展的外显子A，导致其中蛋白质的截短(数据未显示)。因此，对于NRG1，存在这种截短变体的原理的证据已经被证明。在诸如EST序列等的公众数据库中，随机产生的转录子提供了极少的ErbB配体序列的展示，尤其是由于这些基因通常发现的非常低的表达。然而，进行生物信息学搜索以搜寻基因的或基因片段的表达的转录子，在EGF域内寻找截短ErbB配体。为了达到此目的，不同哺乳动物ErbB配体的EGF域(图4)用于以TBLASTN方法查询NCBINR、EST和PATENT基因组数据库，为了搜寻带有截短同源序列的序列。提取这些DNA序列，并适当地翻译为6阅读框(EMBOSS-Transeq)。选择编码截短EGF域的相应阅读框。有趣地，发现了两类不同的预测蛋白序列。I类编码半胱氨酸-4之后截短的、期望在外显子A延展上的蛋白质序列。II类编码带有可替换剪接变体的部分EGF域(外显子A)的序列，其中不编码外显子B。由此类变体编码的蛋白倾向于是异源的、长度超过缩短的EGF域所表达的蛋白质，其依赖于在外显子A范围之外出现的可替换外显子序列。I类和II类蛋白序列的列表展示如下，包括它们编码的蛋白序列。除非蛋白序列是已知的，翻译此处所提供的序列，并选择编码截短EGF域的合适阅读框。需要注意的是，这些序列中的某些，尤其是EST序列是部分的序列，也倾向于通常的序列错误。因此，通常给出完整翻译后序列，不管起始甲硫氨酸是否在翻译后序列中标出。这些数据证明了存在两类ErbB配体的剪接变体，其编码缺少EGF域C-环的截短的EGF域，在不同范围的种中，包括人类和其它哺乳动物、鸟类和鱼类。表2:I类变体在EST、NR和专利(DNA)数据库中发现的序列，其具有编码包括延长的外显子A的ErbB配体的变体的序列，导致EGF域的保守的半胱氨酸-4后的截短的蛋白质序列。列表包括基因组片段和转录子数据。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>编码截短I类变体的DNA序列(图4)序列ID#128ACT—GGGACAAGCCATCTTGTAAAATGTGCGGAGAAGGAGAAAACTTTCTGTGTGAATGGAGGGGAGTGCTTCATCGTGAAAGACCTTTCMACCCCTCGAGA潔TTGTGCAAGTAA序列ID#129TCC—TGGTCGGGGCACGCCCGGAAGTGCAACGAGACAGCCAAGTCCTATTGCGTCAATGGAGGCGTCTGCTACTACATCGAGGGCATCAACOW5CTCTCCTGCAAGTAA序列ID#130GAGCC3ATCCGAGCACTTCAAACCCTGCCGAGACAAGGACCTTGCMACTGTCTCAATGATGGCGAOTGCTTTGTGATCGAAACCCTGACCGGATCCCATAAACACTGTCGGTAA序列ID#131GATCACGAAGAGCCCTGTGGTCCCAGTCACAAGTCGTTTTGCCTGAATGGGGGGCTTTGTTATGTGATACCTACTATTCCCAGCCCATTTTGTAGGTGA序列ID#132TCCGTAAGAAATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCAAGTAA序列D#133GCAGTGGTGTCCCATTTTAATGACTGCCCAGATTCCCACACTCACTTCTGCTTCCATGGAACCTGCAGGTTTTTGGTGCAGGAGGACAAGCCAGCATGTGTGTAA序列ID#134TCGTGGTGGCCGAGCAGACGCCCTCCTGTGTGTAA序列ID#135AGAAACAGAAAGAAGAAAAATCCATGTAATGCAGAATTTCAAAATTTCTGCATTCACGGAGAATGCAAATATATAGAGCACCTGGAAGCAGTAACATGCAAGTAA彭寸ID弁136GGGCTAGGGAAGAAGAGGGACCCATGTCTTCGGAAATACAAGGACTTCTGOVTCCATGGAGAATGCAAATATGTGAAGGAGCTCCGGGCTCCCTCCTGCATGTAA序列ID#137ATCTGGTGGACATGAGTCAAAACTACTGCAGGTAA序列ID#138GT^GCTCTGAAGTTCTCTCATCCTTGTCTGGAAGACCATAATAGTTACTGCATTAATGGAGCATGTGCATTCCACCATGAGCTGAAGCAAGCCATTTGCAGGTAA序列ID#139TCCACCATGAGCTAGAGAAAGCCATCTGCAGGTAA本申请中序列的概述序列l-72是指图3、4和5中描述的已知多肽序列，不包括权利要求中的新的ErbB剪接变体。序列73-182包括表4中所概述的新的ErbB剪接变体。表4:包含或编码ErbB配体变体的序列概述，此序列不编码EGF域的外显子B<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>ErbB配体的新剪接变体目前，4艮据本发明优选的实施方式包括选自以下的分离的多核苷酸1.编码延展的EGF域的直接来自基因组数据(本文命名为I类)的多核苷酸即SEQIDNOS:128至139。2.编码来自EST和NR数据库的I类变体或变体片段的多核苷酸(表2排除heregulin(NRGl)y变体)即SEQIDNOS:148、150-159、164-165。3.编码来自EST和NR数据库的II类变体或变体片段的多核苷酸(表3):即SEQIDNOS:166至176。明确理解的是，所有已知序列都不包括在本发明范围中。然而，更要明确理解的是，之前公开为缺少这种实用性的序列的任何新用途都包括在本发明内。目前，根据本发明优选的实施方式包括包含如下的多肽1.包括截短的EGF域的直接来自基因组数据的多肽(此处命名为I类)即SEQIDNOS:73至84。2.来自EST、NR和专利数据库的I类变体或变体片段的(来自EST、NR数据库的表2序列的翻译，排除NRG1y变体的)即SEQIDNOS:93、95-104、109-110。3.来自EST和NR数据库的II类变体或变体片段(表3的翻译序列):即SEQIDNOS:166至176。明确理解的是，所有已知序列都不包括本发明范围中。因此，根据本发明的一个方面，提供了分离的核酸，其包括基因组的、互补的或复合的多核苷酸序列，此序列编码能够调节哺乳动物ErbB的多肽，此哺乳动物ErbB是至少70%、优选地至少80%、更优选地至少90%或更多、所述至少95%、或100%同源(类似+等同酸)于SEQIDNOS:73-84和SEQIDNOS:93、95-104、109-121。同源性是由例如使用带有优选矩阵BLOSUM62(基于蛋白质的搜索)的基于空位的BLAST的搜索(Altsclml等人.1997)而确定的，以下的缺省参数如由NCBIBLAST网页定义-G开放空位的损失值(cost)[Integer]缺省=5对核苷酸ll蛋白质-E拓展空位的损失值[Integer]缺省=2核普酸1蛋白质-q核苷酸不匹配的处罚值[Integer]缺省=3-r核苷酸匹配的收益值[Integer]缺省=1-e期望值[Real]缺省=10-W字大小(wordsize)[Integer]缺省=11核苷酸3蛋白质-y在比特(bits)中对blast延伸的遗失值(X)(如果缺省为零)缺省=20对blato7对其它程序-X对空位比对(比特中)的X遗失值缺省=15对所有除了blastn以外的程序，它不适用于blastn-Z对空位比对(比特中)的最终X遗失值50对blastn25对其它程序因此，编码ErbB配体的氨基酸序列的任何核酸序列可以用于产生表达此配体的重组分子。在特定实施方式中，才艮据本发明另一方面的多核普35酸编码SEQIDNOS:73-84和SEQIDNOS:93、95-104、109-121中所列的多肽，或此多肽的一部分，其调节至少一个ErbB受体的已知配体的至少一种生物的、免疫的或其它功能的特征或活性。本文公开的EGF-编码的变体域包括共有序列，其可表示如下(X-8)-C-(X-7)-C-(X2至3)-G-X-C-(X-10至13)-C-X,其中X是任何氨基酸。这是图4中表示的共有序列图案。较短或较长的氨基-末端序列(上述X-8)可以提供或限制生物活性。通常，源自新配体的合成肽可以具有包括氨基酸的氨基末端的尾巴的延伸。将要理解的是，本发明包括含有种氨基末端延伸的所有片段或变体，附带条件为EGF域的C环在这些衍生物中不存在。用于DNA测序的方法是本领域中熟知并通常可得的，并且可以用于搡作本发明的任何实施方式。此方法可以采用诸如DNA聚合酶I的Klenow片段、Sequenase⑧(U.S.BiochemicalCorp,Cleveland,Ohio)、Taq聚合酶(PerkinElmer)、热稳定的T7聚合酶(Amersham，Chicago,111.)等的酶、或聚合酶的组合，以及校正核酸外切酶诸如见于Gibco/BRL(Ga池ersburg，Md.)出售的ELONGASE扩增系统中的。优选地，此方法由机器自动化，沖几器i者如HamiltonMicroLab2200(Hamiiton，Reno,Nev,)、PeltierThermalCycler(PTC2000;MJRearch，Watertown，Mass.)和ABICatalyst和373与377DNASequencers(PerkinElmer)。本领域中技术人员将认识到的是，作为简并遗传密码的结果，可以产生编码ErbB配体亚型的多个核苷酸序列，它们一些与任何已知和天然存在基因的核香酸序列具有最小同源性的序列。因此，通过基于可能密码选择的组合，本发明设想可以制造核苷酸序列的每个可能变异。这种组合根据标准三联遗传密码制造，应用于天然存在的ErbB配体亚型的核苷酸序列，所有这种变异都认为是明确公开的。在适合的所选严格性条件下，尽管编码ErbB配体亚型以及其变体的核苷酸序列优选地能够杂交于天然存在的ErbB配体亚型,它可以有利的是生产编码ErbB配体亚型或其^f汙生物的核苷酸序列，它们具有大致不同的密码子使用。可以选择密码子以增加肽在特定原核或真核宿主中发生表达的比率，这个比率与此宿主中采用的特定密码子的频率相同。基本改变编码ErbB配体亚型以及其衍生物的核苦酸序列、而不改变所编码的氨基酸序列的其它原因包括RNA转录子的产生，此转录子比产自天然存在序列的转录子具有更多的所期望的特性，诸如更长的寿命。本发明也包括完全由合成化学产生的DNA序列或其片段，此DNA序列或其片段编码了ErbB配体亚型以及其衍生物。在产生后，此合成序列可以使用本领域熟知的试剂插入到任何的可得的表达载体和细胞系统中。而且，可以使用合成化学将突变插入编码ErbB配体亚型或其任意片段的序列中。本发明还包括能够与才艮据本发明的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。根据一个实施方式，此多核苷酸优选地与SEQIDNOS:73-84和SEQIDNOS:93、95-104、109-121杂交。根据本发明的优选实施方式，长核酸(例如，长度为大约200bp)的杂交作用由严格或中度杂交作用影响，其中严格杂交，在65t:由含有10%硫酸葡聚糖、1MNaCl、P/。SDS和5xl06rpm32p标记的探针的杂交液影响，在，最终洗涤液为0.2xSSC和0.P/。SDS并在65。C最终洗涤；而中度杂交由在65。C的含有10%疏酸葡聚糖、1MNaCl、1%SDS和5xl06cpm32P标记的探针的杂交液影响，最终洗涤液为lxSSC和0.1。/。SDS并在5(TC洗涤。根据优选实施方式，根据本发明这个方面的如SEQIDNOS:73-84和SEQIDNOS:93、95-104、109-121中所列的多核香酸或其一部分，所述部分优选地编码包括氨基酸段的多肽，此段为至少80%、优选地至少85%、更优选地至少90%或更多，最优选地95%或更多地等同于多核苷酸序列编码截短的缺少C-环的ErbB受体-调节EGF域的位置。根据本发明的另一个实施方式，提供了一种至少17、至少18、至少19、至少20、至少22、至少25、至少30或至少40个碱基的寡核苷酸，此碱基特异地可与本文描述的分离的核酸杂交。较短的核酸(长度低于200bp，如长度为17-40bp)的杂交由严格、中度或轻度杂交影响，其中严格杂交由含有6xSSC、l。/。SDS或3MTMACI、O.OIM磷酸钠(pH6.8)、lmMEDTA(pH7.6)、0.5%SDS、100pg/ml变性鲑鱼精子DNA和4.1%脱脂干奶粉的杂交溶液影响，杂交温度低于Tml-1.5°C,最终洗涤液为3MTMACI、0.01M磷酸钠(pH6.8)、lmEDTA(pH7.6)、0.5%SDS、在低于Tml-1.5°C最终洗涤。中度杂交由含有6xSSC、0.1%SDS或3MTMACI、0.01M磷酸钠(pH6.8)、lmMEDTA(pH7.6)、0.6%SDS、lOOpg/ml变性鲑鱼精子DNA和0.1%脱脂千奶粉的杂交溶液影响，杂交温度低于Tn^-2.5。C，最终洗涤液为3MTMACI、O.OIM磷酸钠(pH6.8)、lmMEDTA(pH7.6)、0.5%SDS、在低于Tml-1.5°C最终洗涤，最终洗涤液为6xSSC，此最终洗涤在22。C;而轻度杂交由含有6xSSC、1%SDS或3MTMACI、0.01M磷酸钠(pH6.8)、lmMEDTA(pH7.6)、0.5%SDS、100pg/ml变性鮭鱼精子DNA和0.1%脱脂千奶粉的杂交溶液影响，杂交温度为37。C,最终洗涤液为6xSSC，最终洗涤在22。C。根据本发明的一个另外方面，提供了一对(成对)寡核苷酸，各独立地为至少17-40碱基、特异地以相反方向与本文描述的分离核酸杂交，从而引导其一部分的指数式扩增，所述为核酸扩增反应中50-2000bp,诸如聚合酶链式反应。聚合酶链式反应和其它核酸扩增反应是本领域中熟知的，不需要在这里进一步介绍。根据本发明此方面的这对寡核苷酸是优选地选择以具有可比的熔化温度(Tm),例如，熔化温度差别少于7。C、优选地少于5。C、更优选地少于4。C、最优选地少于3。C,理想地在3""C和0。C之间。因此，根据本发明另一方面，提供了使用本文描述的引物得到核酸扩增产物。这种核酸扩增产物可以由凝胶电泳或任何其它基尺寸的分离技术来分离。可替换地，这样的核酸扩增产物可以用亲和分离来分离，链亲和力或序列亲和力。此外，一旦分离了，这种产物可以由限制酶、连接酶或类似物进一步地进行遗传操作，以用于关于调节ErbB活性的多种应用的任何之一，如本文进一步详述的。编码ErbB配体亚型的核酸序列可以使用部分核苷酸序列并采用本领域中已知的各种方法来延伸，以检测诸如启动子和调节元件等上游序列。例如，一种可以使用的方法"限制-位点"PCR，使用通用引物以找回靠近一个已知位点的未知序列(Sarkar，G.(1993)PCRmethodsApplic.2:318-322)。特别地，在连接区序列的引物和对已知区域特异性的引物存在时，首先扩增基因组DNA。然后扩增的序列进行第二轮PCR,用同样的连接区引物和另一个第一个引物中的特异性引物。每轮PCR的产物以合适的RNA聚合酶转录，并4吏用逆转录酶测序。也可以用基于已知区域的反向引物使用反向PCR来扩增或延伸序列(Triglia,T.等人.(1998)NucleicAcidsRes.16:8186)。可以使用市场上提供的專欠4牛i者4口OLIGO4.06PrimerAnalysisl欠件(NationalBiosciencesInc.,Plymouth,Minn.)或其它合适的程序来设计引物，引物长度为22-30核苷酸，GC含量为优选但并不排它地在40。/。至600/。，在大约68。C至72。C的温度退火靶序列。此方法使用多个限制酶以在基因的已知区域产生合适的片段。然后由分子内连接使此片段成环，并用作PCR模板。另一种可以采用的方法是捕获PCR，它涉及靠近人类和酵母人工染色体DNA中已知序列的DNA片段的PCR扩增(Lagerstrom,M.等人.(1991)PCRMethodsApplic.1:111-119)。在此方法中，也可以使用多个限制酶消化和连接，以在进行PCR之前，把构建的双链序列放置到DNA分子的未知片段中。另一种可以使用以找回未知序列的方法是Parker,J.D.等人的(1991;NucleicAcidsRes.19:3055-3060)。此外，可以使用PCR、嵌套引物、和PromoterFinder文库来运转基因组DNA(Clontech，PaloAlto，Calif.)。此方法不需要筛选文库，并对寻找内含子/外显子接合是有用的。在筛选全长cDNAs时，优选的是使用已经尺寸选择的文库以包括更大的cDNAs。随机-引物文库也是优选的，在这些文库中它们将含有更多包含基因的5，区的序列。对于寡d(T)文库不产生全长cDNA的情况，使用随^L引物文库将是尤其优选的。基因组文库可以用于把序列延伸到5'非转录调节区。在解释了例如引物延伸的用于产生新转录子的基因组DNA新的片方法、平板接种并分离cDNA黏粒/质粒克隆后，可以采用RT-PCR,此PCR使用通过阅读基因组DNA序列的外显子预测程序猜测的人工引物，如本领域中熟知的。可以使用市售的毛细管电泳系统以分析测序产物或PCR产物的核苷酸序列的大小或证实此序列。尤其是，毛细管测序中可以采用用于电泳分离的可流动聚合物、4种激光激活的不同荧光染料(每种对应一种核苷酸)、并由电荷偶联的设计相机检测发射的波长。输出/光密度可以使用合适的软件(例如Genotyper和SequenceNavigator,PerkinElmer)转化为电信号，从栽入样品到计算机分析和展示电子数据的整个过程可以是计算机控制的。毛细管电泳尤其优选用于对小片DNA测序，此小片DNA可能在特定样品中存在有限量。因此，本发明的这个方面包括(i)如SEQIDNOs:DNA序列IDs所主张的(排除已知的y亚型)128-139、148、150-159中所列的多核苷酸;(ii)此多核苷酸的片段；(iii)与其可杂交的序列；(iv)与其同源的序列；(v)编码带有不同密码子用法的类似的多肽的序列；(vi)可变的序列，特征为突变，诸如一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代，天然存在的或人工诱导的、随机的或以耙向的方式的。包括新变体的构建体根据本发明的另一方面，提供了核酸构建体，其包括本文描述的分离的核酸。根据一个优选实施方式，根据本发明这个方面的核酸构建体还包括启动子用于调节在有义或反义方向的所分离核酸的表达。已知的这种启动子是转录所需的顺式-作用的序列元件，由于它们用于结合依赖DNA的RNA聚合酶，此聚合酶转录存在于其下游的序列。这种下游的序列可以两个个可能方向的任一个，以导致有义RNA或反义RNA的转录，有义RNA由核糖体机制是可翻译的，反义RNA通常不包含可翻译的序列，却能够与内源序列形成双链体或三链体并阻碍基因表达，此内源序列或是mRNA或是染色体DNA，如在下文将进一步详述的。本文描述的分离的核酸是本发明中的必要部分，它是模块式的，并可以用于不同上下文中。与本发明结合使用的选择的启动子是次级重要性，其将包括任何合适的启动子序列。然而，本领域中技术人员将认识到是，确保转录起始位点将位于开放阅读框的上游是必要的。在本发明的优选实施方式中，所选择的启动子包括在所需的特定宿主细胞中有活性的元件。这些元件可以选自转录调解子，此调节子激活对细胞在胁迫或饥饿条件下存活是必要的基因的转录的，这些元件包括热激蛋白。载体和宿主细胞为了表达生物活性的ErbB配体亚型，编码根据本发明的ErbB配体亚型或功能等价物的核苷酸序列可以插入合适的表达栽体，即含有用于转录和翻译插入的编码序列的必需元件的栽体。可以由本领域中多种已知方法中任意一种把载体导入细胞或组织，这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、和体内遗传重组。这种方法大致的描述于Sambrook等人.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork1989，1992;Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,MD.1989;Chang等人，SomaticGeneTherapy,CRCPress,AnnArbor,Mich.1995;Vega等人，GeneTargeting,CRCPress,AnnArborMich.1995;Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Butterworths,BostonMass.1988;和Gilboa等人.(1986)Biotechnique4(6):504-512，且例如，包括稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔和以重组病毒栽体感染。此外，见于美国专利No.4,866，042对涉及中枢神经系统的载体和美国专利No.5,464，764和5,487,992对于正-负选择性方法。多种表达载体/宿主系统可用于包含和表达编码ErbB配体亚型的序列。这些包括但不限于，诸如用重组噬菌体、质粒、或黏粒DNA表达载体等转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；感染了病毒表达栽体(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV;烟草花叶病毒TMV)或细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。所采用的宿主细胞不能限制本发明。才艮据本发明的构建体在宿主细胞内的表达可以是瞬时的或可以是稳定地整合于此宿主细胞基因组。可以采用本发明的多核苦酸以由重组技术产生多肽。因此，例如，多核苷酸可以包括在用于表达多肽的多种表达载体中的任一种。这种载体包括染色体的、非染色体的以及合成的DNA序列，如SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、来自质粒与噬菌体DNA组合的载体、病毒DNA诸如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、和伪狂犬病(pseudorabies)。然而，可以使用任何其它载体，只要它在宿主中可复制并可存活。"控制元件"或"调节序列，，是栽体的非-翻译区-增强子、启动子、5'和3，非翻译区，它们与宿主细胞内蛋白相互作用以实现转录和翻译。这种元件的长度和特异性是可变的。依赖于采用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适转录和翻译元件，其包括组成型和诱导型还有启动子。例如当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子诸如Bluescriptphagemid(Stratagene，Lajolla,Calif.)的杂合lacZ启动子或pSportlTM质粒(GibcoBRL)和类似物。在昆虫细胞中可以使用杆状病毒多角体蛋白启动子。来自植物细胞的基因组(如热激蛋白基因、RUBISCO和贮存蛋白基因)或来自植物病毒(病毒启动子或引导序列)的启动子或增强子可以克隆到载体中。在哺乳动物细胞系统中，优选的是来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果必需产生含有多个编码变异ErbB-配体的多拷贝序列的细胞系，可以使用带有合适的可选择标记的基于SV40或EBV的载体。在细菌系统中，可以根据用于变异ErbB-配体表达的期望用途而选择许多表达载体。例如，当需要大量变异ErbB-配体以诱导抗体时，可以使用引导易于纯化的融合蛋白质高水平表达的载体。这种栽体包括但不限于，多功能的诸如Bluescript(Stratagene)等的大肠杆菌(E.coli)克隆和表达载体，其中编码变异ErbB-配体的序列可以绰于载体，与用于氨基-末端的Met和随后的7个p-半乳糖香酶的序列在同一阅读框中，从而产生杂合蛋白；pIN载体(VanHeeke，G.和S.M.Schuster(1989)J，Biol.Chem.264:5503-5509);和类似物。pGEX栽体(Promega，Madison,Wis.)作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白可用于表达外源多肽。通常，这种融合蛋白是可溶的并能通过吸收到谷胱甘肽-琼脂糖珠易于从溶解细胞纯化，然后在游离谷胱甘肽存在时洗脱。这种系统中制造的蛋白可以设计为包括肝素、凝血酶、或因子XA蛋白酶切割位点，从而克隆的感兴趣的多肽可以从GST部分如期望地释放。在酵母即酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中,可以使用许多含有组成型或诱导型启动子诸如a因子、乙醇脱氢酶、和PGH等的栽体。综述见于Ausubel等人.(supra)和Grant等人.(198"MethodsEnzymol.153:516-544。对于使用植物表达栽体的情况，编码变异ErbB-配体的序列的表达可以由许多启动子中的任何一种驱动。例如，诸如CaMV的35S和19S启动子等的病毒启动子可以单独使用，或者与来自TMV的Q引导序列组合使用(Takamatsu,N.(1987)EMBOJ,6:307-311)。可替换地，可以使用诸如RUBISCO的小亚基或热激启动子等的植物启动子(Coruzzi，G.等人.(1984)EMBOJ.3:1671-1680;Broglie，R.等人.(1984)Science224:838-843;以及Winter,J,等人.(1991)ResultsProbl.CellDiffer.17:85-105)。可以通过直接DNA转化或病原体介导的转染将这些构建体插入植物细胞。这种技术描述在许多通常可得的综述中(见于，如Hobbs，S.或Murry，L.E.inMcGrawHillYearbookofScienceandTechnology(1992)McGrawHill,NewYork,N.Y.;pp.191-196.)。也可以使用昆虫系统以表达变异ErbB-配体。例如，在一个这种系统中，使用苜蓿丫紋夜蛾(awtogra;/wca/i/brm'c^(细胞)核的多角体病毒(AcNPV)作为栽体以在草地夜蛾f^oJo/tera/rwgz;^W^)细胞或在粉紋夜蛾^n'c/w;/^W幼虫中表达外源基因。编码变异ErbB-配体的序列可以克隆到病毒的非-必需区域，诸如多角体蛋白的基因，并置于多角体蛋白启动子的控制下。变异ErbB-配体的成功插入将使多角体蛋白基因失活并产生缺少外壳蛋白质的重组病毒。然后重组病毒可以用于感染例如草地夜蛾(S./rwg^7eW"j细胞或粉紋夜蛾(m'c/w//i^a)幼虫，变异的ErbB-配体可以在其中表达(Engelhard,E.K.等人(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.91:3224-3227)。在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基病毒的表达系统。对于使用腺病毒作为表达载体的情况，编码变异ErbB-配体的序列可以缚到由晚期的腺病毒的转录子/翻译复合物。在病毒基因组的非必需El或E3区域插入可以用于得到能够在感染的宿主细胞中表达变异ErbB-酉己体的能生存的病毒(Logan,J.andShenk,T.(1984)Proc.NatLAcad.Sci.81:3655-3659)。此外，可以使用诸如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子等的转录增强子，以增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。可以采用人类人工染色体(HACs)以运送较大片段的DNA,这种片段比可以在质粒中包含和表达的片断大。用于治疗目的，构建6至10M的HACs并由常规运送方法(脂质体、聚阳离子氨基聚合物、或小泡)运送。也可以使用特定起始信号以达到对编码变异ErbB-配体的序列更有效的翻译。这种信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。对于编码变异ErbB-配体的序列、它的起始密码子和上游序列插入到合适的表达栽体中的情况，不需要另外的转录或翻译控制信号。然而，对于只有编码序列或其片段插入的情况，应该提供包括ATG起始密码子的外源的翻译控制信号。而且,起始信号应该位于正确的阅读框中,以确保整个插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是不同来源的、天然和合成的。表达的效率可以由包含的增强子而增强，此增强子适合于其所使用的特定细胞系统，诸如在那些文献中描述的(Scharf，D.等人.(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:125-162)。多肽纯化用编码变异ErbB配体亚型的序列转化的宿主细胞，可以在适合蛋白表达和从细胞培养物回收蛋白的条件下培养。依赖于所使用的序列和/或载体，转化了的细胞产生的蛋白质可以是分泌的或细胞中内含的。编码变异ErbB配体亚型的多核苷酸可以包括信号肽，它引导ErbB配体亚型的分泌物穿过原核细胞或真核细胞的膜。可以使用其它构建物以把编码ErbB配体亚型的序列连接到编码多肽域的核苷酸序列，此多肽域将促进可溶蛋白质的纯化。这种促进纯化的域包括但不限于，金属螯合肽诸如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸组件(module)、允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A域、和用于FLAG延伸/亲和力纯化系统中的域(Immunex44Corp.,Seattle,Wash.)。可切开的连接区序列的内含物，诸如那些对因子XA或肠激酶(Invitrogen,SanDiego,Calif.)特异的内含物，在纯化域和ErbB配体亚型编码的序列之间可以采用此内含物以促进纯化。提供一种这样的表达栽体用于融合蛋白的表达，此融合蛋白包含ErbB配体亚型和编码在疏氧还蛋白和肠激酶切割位点之前的6个组氨酸残基的核酸。组氨酸残基促进在固定化金属离子亲和层析(IMIAC)的纯化。(见于，如Porath，J等人.(1992)ProtE印.Purif.3:263-281.)肠激酶切割位点提供了从融合蛋白纯化ErbB配体亚型的方法。(见于，如Kroll，D.J.等人.(1993)DNACellBiol.12:441-453.)ErbB配体亚型的片段不仅可以由重组产物产生，还可以由使用固相技术引导肽的合成而产生。(见于，如Creighton，T.E.(1984)Protein:StructuresandMolecularProperties,pp.55-60,W.H.FreemanandCo.NewYork,N.Y.)可以由手动技术或由自动装置进行蛋白合成。可以实现自动合成，侈'j力口《吏用AppliedBiosystems431Apeptidesynthesizer(PerkinElmer)。ErbB配体亚型的各个片段可以单独合成，然后组合以产生全长分子。转基因动物或细胞系本发明具有提供转基因的基因和多态基因动物和细胞的(细胞系)模型以及用于导入和敲除的模型的潜力。这些模型可以使用本领域中已知的标准方法构建，并如同美国专利No.5，487，992、5,464,764、5,387,742、5,360,735、5,347,075、5,298,422、5,288,846、5,221,778、5，175，385、5,175,384、5，175，383、4，736，866中所陈述的，以及BurkeandOlson(1991)MethodsinEnzymology,194:251-270;Capecchi(1989)Science244:1288-1292;Davies等人.(1992)NucleicAcidsResearch,20(11)2693-2698;Dickinson等人.(1993)HumanMolecularGenetics,2(8):1299-1302;DuffandLincoln,"InsertionofapathogenicmutationintoayeastartificialchromosomecontainingthehumanAPPgeneandexpressioninEScells",ResearchAdvancesinAlzheimer'sDiseaseandRelatedDisorders,1995;Huxley等人.(1991)Genomics,9:74147501991;Jakobovits等人.(1993)Nature,362:255-261;Lamb等人.(1993)NatureGenetics,5:22-29;PearsonandChoi,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10578-82;Rothstein,(1991)MethodsinEnzymology,194:281-301;Schedl等人.(1993)Nature,362:258-261;Strauss等人.(1993)Science,259:1904-1907。而且，专利申请WO94/23049、WO93/14200、WO94/06408、W094/28123也提供了信息。所有来自本发明所声明的实施方式的这种转基因的基因和多态基因动物和细胞(细胞系)的模型以及导入或敲除的模型，组成了本发明的优选实施方式。基因治疗本文使用的基因治疗是指感兴趣的遗传物质(例如DNA或RNA)转移进入宿主，以治疗或预防遗传的或获得的疾病或病况或表型。感兴趣的遗传物质编码产物(例如蛋白质、多肽、肽、功能性RNA、反义)，这些产物需要在体内产生。例如，感兴趣的遗传物质可以编码有治疗价值的配体、激素、受体、酶、多肽或肽。评论通常见于文本"基因治疗"(AdvancedinPharmacology40，AcademicPress,1997)。基因治疗的两种基本方法包括(i)体外和(ii)体内基因治疗。在体外基因治疗中，从患者移去细胞，并在培养中体外治疗。通常，通过合适的基因运输载体/方法(转染、转导、同源重组等等)把功能上替换基因引入细胞中，以及所需要的表达系统，然后修饰的细胞在培养中膨胀并回到宿主/患者。这些遗传上移植的细胞已经表现为在原位表达转染的遗传物质。在体内基因治疗中，靶细胞不从患者移去。而是把将要转移的遗传物质导入到受体有机体的细胞的原位中，原位即在受体中。在一个可替换的实施例方式，如果宿主基因是有缺陷的，就在原位修复基因(Culver,1998.(Abstract)AntisenseDNA&RNAbasedtherapeutics,February1998，Coronada,Calif.)。这些遗传上改变的细胞已经表现为在原位表达转染的遗传物质。基因表达栽体能够运输/转移异源核酸进入宿主细胞。表达载体可以包括以细胞选择方式控制核酸靶向、表达和转录的元件，如在本领域中已知的。需要注意的是，基因的5'UTR和/或3'UTR经常可以由表达载体的5，UTR和/或3，UTR代替。因此，根据需要的，本文所使用的表达载体可以不包括将要转移的现存基因的5'UTR和/或3'UTR,且只包括特定氨基酸编码区域。表达载体可以包括用于控制异源物质转录的启动子，并可以或是组成型或是诱导型的启动子以允许选择性转录。可以非必要的包括增强子，可需要此增强子以得到必要的转录水平。增强子通常是靠近编码序列(顺式)作用的任何非翻译DNA序列，以改变由启动子指示的基础转录水平。表达载体也可以包括下文所述的选择基因。用于基因治疗的栽体如上文所述，载体可以由本领域中已知的许多方法中任意一种引入宿主细力包或纟且织。由感染而引入核酸提供了超越所列出的其它方法许多优点。由于它们的感染性的本质可以得到更高的效率。而且，病毒在特定细胞类型中是非常专门的和典型地感染和繁殖。因此，可以使用它们的天然特异性以在体内或在组织中或细胞混合培养物中把载体輩巴向于特定细胞类型。也可以用以特定受体或配体修饰的病毒栽体通过受体介导事件改变乾向特异性。引导并表达重组序列的DNA病毒载体的一个特殊例子是腺病毒衍生的栽体Adenop53TK。此载体表达一个疱渗病毒胸苷激酶(TK)基因用于正向或负向选择，和用于所需的重组序列的表达盒。此载体可以用于感染具有腺病毒受体的细胞，此受体包括大多数上皮来源的癌以及其它。此载体以及其它表现类似期望功能的可以用于治疗混合种群的细胞，并且可以包括例如细胞、组织或人类患者的体内或体外培养物。还可以包括对特定细胞类型限制表达的特征。这种特征包括，例如对期望的细胞类型特异的启动子和调节元件。此外，重组的病毒载体对期望核酸的体内表达是有用的，由于它们提供了诸如横向感染和靶向特异性等优点。横向感染是生命周期中固有的，例如逆转录病毒，且此橫向感染是一种方法，通过这个方法单个感染的细胞产生许多后代病毒体，它们出芽并感染相邻的细胞。这导致大片区域迅速被感染，其中大部分区域不是由最初的病毒颗粒起始感染的。这与垂直型感染相反，垂直型感染中感染因素只沿着子代后代传播。也可以产生不能够横向传播的病毒载体。这个特征是有用的，如果期望的目的是引导特定基因只进入有限数量的靶细胞。如以上所述，病毒是非常特异性的感染介质，在许多情况下，其已经进化以躲避宿主的防御机制。通常，病毒在特定细胞类型中感染和繁殖。使用病毒载体的天然特异性以特异性地靶向预设的细胞类型，并从而引导重组基因进入感染的细胞。用于本发明的方法中的载体将依赖于期望的将要靶定的细胞类型，并对本领域中技术人员是已知的。例如，如果将要治疗乳癌，那么就使用对这种上皮细胞特异性的载体。类似地，如果将要治疗造血系统的疾病或病理状态，那么将使用对血细胞和其前体特异性的、优选地使用对特定造血细胞类型特异性的病毒载体。可以构建逆转录病毒载体，作用为感染颗粒或只经历感染的单个起始周期。对前一种情况，调节病毒的基因组从而使它保持必需基因、调节序列和包装信号，以合成新的病毒蛋白和RNA。一旦和成了这些分子，宿主细胞就把RNA包装为新的病毒颗粒，其能够经历感染的更多的周期。也构建栽体的基因组以编码和表达期望的重组基因。对非感染性病毒栽体的情况，载体基因组通常变异以破坏病毒包装信号，此信号对把RNA封装为病毒颗粒是必须的。如果没有这样的信号，形成的任何颗粒将不包含基因组，从而不能进行到感染的随后的周期。栽体的特定类型将依赖于打算的应用。实际的载体在本领域中也是已知的并易于得到，或者可以由本领域中技术人员使用熟知的方法学构建。重组的载体可以以多种方式施用。例如，如果使用病毒载体，此步骤可以利用它们靶向特异性，因此不需要局部地施用在疾病的位置上。然而，如果局部施用可以提供更快和更有效的治疗，还可以例如由静脉注射或皮下注射而施用于患者。也可以使用把病毒载体向脊髓液注射作为一种施用方式。注射后，病毒载体将流通直到识别带有对于感染合适的靶向特异性的细胞。48因此，根据一个可替换实施方式，根据本发明的核酸构建体还可以包括正向和负向的选择标记，并因此可以用于选择同源重组事件，包括但不限于，用于导入和敲除步骤中的同源重组。本领域中普通技术人员将易于设计既包括正向也包括负向选择基因敲除或导入构建体用于有效地选择转染的胚胎干细胞，此干细胞经历了与构建体的同源重组事件。可以把这种细胞引入发展中的胚胎以产生嵌合体，其后代可以用于测试以携带敲除或导入构建体。根据本发明的敲除和/或导入构建体可以用于进一步研究ErbB配体亚型的功能性。如此，构建体也可以用于体细胞和/或生殖细胞基因治疗以增加/降低ErbB信号的活性，从而调节ErbB相关的反应。关于构建和使用导入和敲除构建体的进一步详情可以见于Fukushige，S.andIkeda,J.E.(1996)DNARes3:73-50;Bedell，M.A.等人(1997)GenesandDevelopment11:1-11;Bermingham,J，J，等人.(19%)GenesDev10:1751-1762，其在此引入作为参考。反义根据本发明的又另一个方面，提供了包括多核苷酸或多核苷酸类似物的反义寡核脊酸，它们为至少10碱基、优选地在10与15之间，更优选地在5至20个碱基之间，最优选地在至少17-40个碱基，是在生理条件下，在体内与多核苷酸链的一个部分杂交，此多核苷酸编码一种多肽，此多肽是至少80%、优选地至少85%、更优选地至少90%或更多、最优选地至少95%或更多的同源(类似的+等同的酸)于由本发明公开的缺少C-环的ErbB受体-调节的EGF配体的序列。这种反义寡核苷酸可以用于减量调节表达，如下文进一步详述的。这种寡核苷酸是易于使用固相寡核苷酸合成的。化学合成具有选择的预设定序列的寡核苷酸及其类似物，提供了向下调节基因表达的方法。可以考虑3种类型的基因表达调节策略。在转录水平，通过链替换或形成三联螺旋结合于基因组DNA的反义或有义寡核苷酸或类似物，可以阻止转录。在转录水平，结合于靶mRNA分子的反义寡核苷酸或类似物，导致杂化物由胞内RNaseH酶切割。在这种情况下，通过与靶mRNA杂交，寡核苷酸或寡核苷酸类似物提供了一种双螺旋杂化物，RNaseH酶可以识别并破坏此杂化物。可替换地，这种杂化物的形成可以导致与正确剪接的干涉。作为一个结果，在这两种情况中，准备翻译的靶mRNA的完整转录物的数量减少或消除。在翻译水平，由必需翻译因子(核糖体)与靶mRNA的位阻结合，结合靶mRNA分子的反义寡核普酸或类似物阻止了一种本领域中称为为杂交扣留的现象，此现象使得这种mRNA分子不能翻译。因此，如上所述的反义序列可以扣留依赖于其特定序列的任何内源和/或外源基因的表达，这吸引了致力于把反义方法发展为一种新的药理学工具的科学家和药理学家的注意。例如，多个反义寡核苷酸已经显示为扣留造血细胞的增殖(Szczylik等人，1991)、生长(Calabretta等人.,1941)、进入细胞周期的S阶段(Heikhila等人，1987)、减少存活(Reed等人，1990)和阻止受体介导的反应(BurchandMahan,1991)。为了使用寡核苷酸或类似物在体内有效抑制基因表达，寡核苷酸或类似物必须实现以下要求(i)在结合于靶序列时足够的特异性；(ii)水中的溶解性；(iii)对胞内和胞外核酸酶的稳定性；(iv)穿过细胞膜的能力；和(v)当用于治疗有机体时的低毒性。通常，未修饰的寡核苷酸用作反义序列是不切实际的，因为在体内的半衰期短，在此期间它们迅速由核酸酶降解。而且，难于以超过毫克的量制备它们。此外，这种寡核苷酸是差的细胞膜穿透者。因此很明显，为了满足以上列出的要求，需要以合适的方式设计寡核苷酸类似物。因此，开始了对改进寡核苷酸的广泛搜索。例如，由三螺旋形成而引起的双链DNA(dsDNA)识别的问题，已经由聪明的"扳回(switchback)"化学键而减少，从而识别一条链上的多噪呤序列，并由"扳回，，而识别另一条链上的同型噪呤序列。由使用人工碱基也已经得到了好的螺旋形成，从而改善了关于离子强度和pH的结合条件。塞核苷酸类似物此外，为了提高半衰期和膜通透性，已经完成了在寡核苷酸骨架中的大量变异。可以在碱基、糖或磷酸部分中修改寡核苷酸。这些修饰包括例如使用甲基膦酸酯、单硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、桥式硫代磷酸酯、桥氨基磷酸酯、桥亚曱基膦酸酯、带有硅氧烷桥的去磷酸核苷酸间类似物、碳酸桥、羧甲基酯桥、碳酸酯桥、羧甲基酯桥；乙酰胺桥、碳酸桥、疏醚桥、砜桥、sulfono桥、各种"塑性"DNAs、a-异头桥和硼烷衍生物。国际专利申请WO89/12060公开了各种用于合成寡核苷酸类似物的建造单元，以及在定义的序列中由连接这种建造单元而形成的寡核苷酸类似物。建造单元可以是"刚性的"(即，含有环结构)或"柔性的"(即，缺少环结构)。对这两种情况，建造单元含有羟基和巯基，建造单元由其连接以形成寡核苷酸类似物。寡核苷酸类似物中的连接部分选自疏化物(-S-)、亚砜(-SO-)、和砜(-S02)组成的组。国际专利申请WO92/20702描述了一种无环寡核苷酸，其包括肽骨架，任意所选的化学核碱基(nucleobase)或类似物是严格的并用于编码特征的，如它们在天然DNA或RNA中的特征。这些新化合物，称为肽核酸(PNAs)，不仅在细胞中比它们天然对应物更稳定，还结合天然DNA和RNA，比天然核酸彼此之间的附着牢固50至100倍。可以从4个含有胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的受保护的单体，通过Merrifield固相肽的合成而合成PNA寡聚物。为了增加在水中溶解度并阻止聚集，在C-末端区放置赖氨酸酰胺基团。因此，在一个优选的方面，需要信使RNA配对的反义技术期望寡核苷酸形成抑制翻译的双螺旋。反义-介导的基因(gone)治疗的概念已经在1978为癌的治疗而引入。这个方法是基于某些在癌细胞的细胞分裂和生长中至关重要的基因。遗传物质DNA的片段的合成可以达到这个目标。这种分子结合肿瘤细胞的RNA中的靶向基因分子，从而抑制周期时限(gate)的翻译并导致这些细胞的功能紊乱生长。也提出了其它机制。已经使用了这些策略，一些成功地治疗癌症以及其它疾病，包括病毒或其它感染性疾病。反义寡核苷酸通常合成长度为13-30核苷酸。寡核苷酸分子在血液中的生命跨度是相当短的。这样，它们必须化学修饰以阻止被体内无所不在的核酸酶破坏。硫代磷酸酯在正在进行的临床试验中广泛用于反义寡核苷酸的修饰。新一代的反义分子由杂化物反义寡核苷酸与合成DNA的中心部分组成，而各末端的四种碱基已经用2，0-甲基核糖修饰以类似RNA。在实验室动物进行的基础研究中，已经证明这些化合物与第一代未修饰的疏代磷酸酯相比，在体组织中对新陈代谢具有更大的稳定性和改进的安全性序型(HybridonInc.news)。已经在反义技术中测试了许多其它核香酸类似物。RNA寡核苷酸策略也用于反义抑制，由于它们与靶形成稳定的RNA-RNA双螺旋，这暗示着有效的抑制。然而，由于它们低稳定性，RNA寡核苷酸典型地使用为此目的设计的载体在细胞内表达。当试图靶定编码丰富的和长寿命的蛋白质的mRNA时，这个方法是有利的。近来的科学出版物已经证实了反义化合物在肝炎、癌症、冠状动脉再狭窄和其它疾病的动物;溪型中的效力。第一个反义药物近来由FDA批准了。这种由Isis开发的药物福米韦生(Fomivirsen)，用于局部治疗AIDS患者的细胞巨化病毒(cytomegalovirus),对CMV视网膜炎的其它治疗不能耐受的或有禁忌征候的患者，或者是不能对之前的CMV视网膜炎的治疗有响应的患者(PharmacotherapyNewsNetwork)。许多反义化合物目前在美国进行临床试验。这些包括局部施用的抗病毒的、系统癌症疗法。反义疗法具有治疗许多威胁生命的疾病的潜力，具有超过传统药物的优点。传统药物在疾病-导致的蛋白形成之后干涉。然而，反义疗法在蛋白形成之前阻滞mRNA转录/翻译并千涉，并且由于反义疗法只靶定一个特异mRNA,它们应该比目前的蛋白-抑制疗法更有效、副作用更小。在转录水平干涉基因表达的第二个选择使用能够与双链DNA杂交的合成的寡核苷酸。形成三螺旋。这种寡核苷酸可以阻止转录因子结合基因的启动子并从而抑制转录。可替换地，它们可以阻止双螺旋展开，并从而阻止在三联螺旋结构内的基因的转录。因此，根据本发明的又一个方面，提供了药用组合物，它包括本文描述的反义寡核苷酸和药物上可接受的载体。药物上可接受的栽体可以是例如，装载了反义寡核苷酸的脂质体。用于局部施用的制剂可以包括但不限于，洗剂、药膏、凝胶、乳膏、栓剂、滴剂、流质、喷雾和散剂。常规的药物栽体、含水的、粉末的或含油的基质、增稠剂和类似物可以是必要或期望的。用于口服施用的组合物包括散剂或小粒、水或非-含水介质中的悬浮液或溶液、香嚢、胶囊或片剂。增稠剂、稀释剂、增香剂、分散助剂、乳化剂或粘结剂可以是期望的。用于非肠道施用的制剂可以包括但不限于，无菌水溶液，此水溶液也包含緩冲液、稀释剂和其它合适的添加物。根据本发明的另一方面，提供了一种核酶，它包括本文描述的反义寡核苷酸和与其融合的核酶序列。这种核酶是易于用固相寡核苦酸合成而合成的。通过裂解编码感兴趣蛋白的mRNAs，核酶正越来越多的用于序列特异的基因表达抑制。设计核酶以切割任何特异靶RNA的可能性已经使它们在基础研究和治疗应用中成为有价值的工具。在治疗领域，已经使用核酶来靶定感染性疾病中的病毒RNAs、癌症中的显性致癌基因、和遗传紊乱中的特定体细胞突变。最显著地，多个用于HIV患者的核酶基因治疗方法已经在阶段l试验中。最近，核酶已经用于转基因动物研究、基因靶定确认和通路阐明。多种核酶在临床试验的各个阶段中。ANGIOZYME是第一个化学合成的核酶，在人类临床口服中研究。ANGIOZYME特异性地抑制VEGF-r(血管内皮生长因子受体)的形成，后者是血管生成通路中的重要成分，RibozymePharmaceuticals,Inc.和其它公司已经证明抗血管生成治疗在动物模型中的重要性。HEPTAZYME是一种设计为选择性地破坏肝炎C病毒(HCV)RNA的核酶，发现它在细胞培养试验中有效减少肝炎C病毒RNA(RibozymePharmaceuticals,^>司网页主页)。根据本发明的另一方面，提供了重组或合成(即，使用固相肽合成作用制备)的蛋白质，它包括能够调节ErbB受体的多肽，这种多肽是至少80%、优选地至少85%、更优选地至少90%或更多、最优选地至少95%或更多、或100%地等同或同源(等同+类似)于一种新的剪接变体，这种变体包括ErbB配体的受体调节EGF域，附带条件为所述的配体缺少此受体调节EGF域的C-环。最优选地，此多肽包括本发明的ErbB配体剪接变体的至少一部分，此部分可以包括跨越半胱氨酸l至4的氨基酸，但没有受体调节EGF域的半胱氨酸5至6。此外或可替换地，根据本发明的这方面的多肽优选地由可以在上述用于长核酸的严格或中度杂交条件下，与序列SEQIDNOs:128至139、148、150-159和164-176或其一部分杂交的多核苷酸来编码。此外或可替换地，根据本发明的这方面的多肽优选地由一种多核苷酸编码，这种多核苷酸至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或100%等同于本发明公开的编码缺少受体调节EGF域C-环的剪接变体的序列。因此，本发明的这个方面包括(i)如SEQIDNOs:73至84和93、95-104、109-121中所列的多肽；(ii)此多肽的片段；(iii)与其同源多肽；及(iv)改变的多肽，其特征为突变，诸如一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代，天然发生或人工诱导的，随机或以靶定的方式，天然、非-天然或在合成时或合成后修饰的，附带条件为没有受体调节域的C-环。根据本发明的又另一个方面，提供了一种药用组合物，其包括本文描述的作为活性成分的重组蛋白，和以上描述的一种药物上可接受的载体。胜如使用在本文的说明书和以下的权利要求部分中的短语"衍生自多肽"是指从指定蛋白质或蛋白衍生的肽，还指从蛋白质的相等区域衍生的同源肽，此蛋白与相同种或其它种的特定蛋白同源。此术语还涉及基于特定蛋白质或它们的同源蛋白质的氨基酸的序列而设计的容许的氨基酸交替和模拟肽(peptidomimetics)。解为包括20种天然存在的氨基酸；那些氨基酸通常在体内翻译后修饰，包括例如羟脯氨酸、磷丝氨酸和磷苏氨酸；以及其它不常用的氨基酸包括但不限于，2-氨基脂肪酸羟赖氨酸异锁链素、正-撷氨酸、正-亮氨酸和鸟氨酸。而且，术语"氨基酸"包括D-和L-氨基酸。根据本发明可能使用的氨基酸的进一步说明和非天然氨基酸的例子在下文给出。亲水的脂肪族天然氨基酸可以由合成的氨基酸取代，优选地Nleu、Nval和/或a-氨基丁酸或由通式为HN(CH2)nCOOH的脂肪族氨基酸取代，其中n=3-5,以及由它们的支链衍生物取代，其中例如甲基、乙基或丙基等的烷基是位于n碳原子中任意之一或多个。氨基酸的每个或更多可以包括其D-异构体。带正电荷的脂肪族羧酸,诸如但不限于，H2N(CH2)nCOOH(n=2-4)、H2N-C(NH)-NH(CH2)nCOOH(n=2-3),以及还可以采用羟赖氨酸、N-甲基赖氨酸或鸟氨酸(Orn)。此外，也可以采用扩大的芳族残基，诸如但不限于，H2N-(C6H6)-CH2-COOH、对氨基苯丙氨酸、H2N-F(NH)-NH-(C6H6)-CHrCOOH、对胍基苯丙氨酸或吡啶丙氨酸(Pal)。氨基酸衍生物(如果是Ser、Tyr、Lys、Cys或Om)的支链可以保护-连接于烷基、芳基、烷酰基或芳酰基(aryloyl)的部分。也可以使用氨基酸的环状衍生物。可以通过酰胺键形成而得到环化，如通过在链(-CO-NH或-NH-CO键)的各位置上结合Glu、Asp、Lys、Om、二氨基丁(Dab)酸、二氨基丙(Dap)酸。也可以通过结合通式H-N((CH2)n-COOH)-C(R)H-COOH或H-N((CH2)n-COON)-C(R)H-NH2的经修饰的氨基酸而得到骨架与骨架环化，其中n-l-4，而且其中R是氨基酸的任何天然或非-天然的支链。通过合成两个Cys残基而形成S-S键而环化也是可能的。另外的支链与支链的环化，可以通过形成通式-(CH2-)n-S-CH2-C-的相互作用键而得到，其中n=l或2，例如通过合成Cys或homoCys并由它的游离SH基团与溴乙酰化的Lys、Om、Dab或Dap反应，肽内的肽键(-CO-NH-)可以由如下取代N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-CO誦O-C(R)-N-)、酮亚甲基(ketomethylene)键(-CO-CH2-)、a-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)(其中R例如曱基等的烷基)，carba键(-CHrNH-)、羟乙烯(hydroxyethylene)键(-CH(OH)-CH2-)、疏代酰胺键(-CS-NH-)、烯双键(-CH=CH-)、反(retro)酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)(其中R是天然存在于碳原子上的"普通"支链)。这些修饰可以在沿着肽链的任何键上发生，并甚至可以同时在几个(2-3)键发生。天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以由合成的port-天然酸取代，诸如TIC、萘基丙氨酸(naphthylelanine)(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或o-甲基Tyr。展示文库根据本发明的另一方面，提供了包括多个展示载体(诸如噬菌体、病毒或细菌)展示文库，各展示至少5-10或15-20连续的衍生来自一种多肽的氨基酸，此多肽至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+类似)于SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121。根据本发明此方面的一个优选实施方式，基本上每5-10或15-20连续的衍生来自一种多肽的氨基酸，此多肽至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+类似)于SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121,此连续的氨基酸由多个展示载体中的至少一种展示，从而提供高度代表性的文库。优选地，根据本发明这个方面的肽或肽类似物的连续的氨基酸或氨基酸类似物，是衍生来自SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121，附带条件为这些肽缺少EGF域的C-环。构建这些展示文库的方法是本领域中熟知的，这种方法描述于例如YoungAC,等人，JMolBiol1997;274(4):622-34;GiebelLB等人.Biochemistry1995;34(47):15430-5;DaviesEL等人，JImmunolMethods1995;186(l):125-35;JonesC等人.JChromatogrA1995;707(l):3-22;DengSJ等人.ProcNatlAcadSciUSA1995;92(11):4992-6;以及DengSJ等人.JBiolChem1994;269(13):9533-8,将它们以引用的方式并入本文。根据本发明此方面的展示文库可以用于鉴定和分离能够上调或下调ErbB活性的多肽和变体。抗体根据本发明的另一方面，提供了一种抗体，它包括特异性地识别和结合多肽的至少抗原结合部分，此多肽至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+类似)于SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121,附带条件为这些抗体不显著地结合完整EGF域的C-环。本发明可以使用血清免疫球蛋白、多克隆抗体或其片段(即抗体的免疫反应性衍生物)、或单克隆抗体或其片段。可以由常规步骤制备单克隆抗体或单克隆抗体的纯化片段，其具有至少一部分抗原结合区域，包括诸如Fv、F(abl)2、Fab片段(HarlowandLane,1988Antibody,ColdSpringHarbor);单链抗体(美国专利No.4,946，778)、嵌合的或人工的抗体和56互补决定区(CDR)可以由常规的步骤制备。这些血清免疫球蛋白抗体或片段的纯化可以由本领域中多种已知方法达到，包括通过硫酸铵或疏酸钠沉淀、然后对盐水透析、离子交换色谱、亲和或免疫亲和色语法以及胶过滤、区带电〉永等(见GodinginMonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,2nded.，pp.104-126，1986，Orlando,Fla.，AcademicPress)。在正常生理条件下，发现抗体在血浆和其它体液中，还在某些细胞的膜中，并由称为B细胞的淋巴细胞类型或其功能等同物产生。IgG类的抗体由四个多肽链通过二硫键连接在一起而形成。完整IgG分子的4条链是两条称为H-链的相等的重链和两条称为L-链的相等的轻链。另外的类包括IgD、IgE、IgA、IgM和相关蛋白。单克隆抗体产生和选择单克隆抗体的方法是本领域中熟知的，概述于诸如TramontanoandSchloeder，MethodsinEnzymology178，551-568，1989的综述中。本发明的重组的或合成的ErbB配体或其部分可以用于在体外产生抗体。更优选地，本发明的重组的或合成的ErbB配体用于在体内诱导抗体。通常，用本发明的包括至少一个连续或不连续表位的重组的或合成的ErbB配体或其部分使合适的宿主动物免疫。有利地，使用的宿主动物是纯系小鼠。通常以一种混合物使动物免疫，这种混合物包括在药物上可接受的载体中的本发明的重组的或合成的ErbB配体或其部分的溶液，和任何合适的增强对免疫原的免疫应答的辅剂。以举例的方式，由本发明的重组的或合成的ErbB配体的溶液或其部分与Freund，s完全辅剂可以方便地完成初级免疫，所述混合物以油包水乳剂的形式制备。通常免疫可以肌肉内地、皮内地、皮下地、腹膜内地、至爪垫中、或由任意合适的施用途径而施用于动物。免疫原的免疫计划可以如所需地调整，^it常包括多个随后的或次级免疫，其使用柔和的辅剂诸如Freund，s不完全辅剂。抗体滴定量和结合特异性可以在免疫计划中通过任何适合的方法确定，这些方法包括例如放射性免疫测定、或称为ELISA测定的酶联免疫吸附测定法。当达到合适的抗体滴定量时，得到来自免疫动物的产生抗体的淋巴细胞，如本领域中已知的培养、选择并密集它们。通常，从免疫动物的脾得到大量淋巴细胞，但是也可以从循环、淋巴结或其它淋巴器官中重新得到它们。然后把淋巴细胞与任何适合的骨髓瘤细胞系融合，以产生杂交瘤，正如本领域中熟知的。可替换地，也可以刺激、淋巴细胞以在培养中生长；可以由本领域中已知的方法使其无限增殖，方法包括^ai些淋巴细胞暴露于病毒；根据已建立的方案的化学制品或诸如致癌基因的核酸。在融合后，在合适的培养条件下培养杂交瘤，例如在多孔盘中，筛选培养物的上清液以鉴别含有能识别所选半抗原的抗体的培养物。在合适的培养条件下，分泌能识别本发明的重组或合成的NRG-4的抗体的杂交瘤，由限制稀释和扩增而克隆。纯化单克隆抗体并且根据免疫球蛋白类型和结合亲和力描述其特征。用于调节ErbB受体活性的药用组合物根据本发明的另一方面，提供了一种药用组合物，它包括作为活性成分的在体内或体外调节ErbB受体介导活性的一种药剂。本发明的如下实施方式设计千涉ErbB配体活性并从而干涉ErbB受体信号。根据本发明的另一方面，提供了在体内或体外调节内源蛋白而影响ErbB受体活性的方法。根据本发明此方面的方法通过施用一种在体内调节内源蛋白活性的药剂而作用，此内源蛋白至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+类似)于SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121，附带条件为它缺少EGF域的C-环。根据本发明可以使用的用于上调内源蛋白活性的药剂可以包括，例如，可表达的有义多核苷酸，其至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100。/。等同于SEQIDNOs:128-139、148、150-159、164-176，附带条件为它不编码完整EGF域的C-环。根据本发明可以使用的用于下调内源蛋白活性的药剂可以包括，例如，可表达的反义多核苷酸，其至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100。/o等同于SEQIDNOs:128誦139、148、150-159、164-176，附带条件为它不编码完整EGF域的C-环。可替换地，根据本发明可以使用的一种用于下调内源蛋白活性的药剂可以包括，例如，反义寡核芬酸或核酶，其包括至少10碱基、优选地10-15、更优选地在15-20碱基之间、最优选地17-40碱基的多核苷酸或多核苷酸类似物，其在生理条件下可以在体内与一种编码多肽的多核苷酸链杂交，这种多肽，其至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+类似)于SEQIDNOs:128-139、148、150-159、164-176;还可替换地，根据本发明可以使用的用于下调内源蛋白活性的药剂可以包括，例如，一种肽或肽类似物，其表现至少6-10、10-15、或15-20连续的氨基酸或其类似物的片段，它们衍生自一种多肽，这种多肽至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%等同或同源(等同+类似)于SEQIDNOs:73-84和93、95-104、109-121。含有根据本发明的相互作用的EGF-类似域的肽或肽类似物将由蛋白质相互作用竟争而形成蛋白质与ErbB受体的复合物，抑制或加速涉及ErbB配体的通路。以下的生物化学的和分子的系统对鉴定和鉴别蛋白质-蛋白质相互作用是已知的，通过分析作为基质的肽，其系统可以用于鉴别抑制性肽序列。一个这种系统采用引导编码功能性蛋白质或蛋白质的突变形式的遗传物质进入细胞，突变形式包括氨基酸缺失和取代。通过在细胞中分析蛋白质活性和蛋白质的衍生突变体的活性，这个系统可以用于鉴别蛋白的功能域。另一个这种系统采用把基因的小的编码片段引入细胞，如通过展示文库的方法、或通过方向随机起始的cDNA文库，此文库包括基因的片段，并在它们存在时分析内源蛋白的活性(见于，如，Gudkov等人.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:3131-3236;GudkovandRobinson(1997)MethodsMolBiol69;221-240;andPestov等人.1999，BioTechniques26:102-106)。而另一个系统通过筛选带有肽域的表达文库而实现，例如，如Yamabhai等人.1998，JBiolChem273:31401-31407所例证的。在另一个这样的系统中，使用来自特异基因产物的交迭的合成肽以研究和影响体内和体外的蛋白质-蛋白质相互作用。例如，来自HIV-l基因的合成的交迭肽(20-30氨基酸)测定为不同病毒活性(Baraz等人.1998,FEBSLetters441:419-426),并发现它们抑制纯化的病毒蛋白酶活性；结合到病毒蛋白酶；抑制Gag-Pol聚蛋白裂解；并抑制成熟病毒在人类细胞中的产生。提供以下实施例的目的仅仅是说明本发明的原理，而并非以任何方式限制本发明的范围。包括新变体的合成肽使用所提供的标准的teW-叔丁氧羟基(f-Boc)化学方案(版本1.40;N-曱基吡咯酮/羟基苯并三唑)在AppliedBiosystems(ABI)430A肽合成器上合成肽。在每次活化酯偶联后采用乙酸酐加帽。在甲基苯乙酰胺(phenylacetamidomethyl)聚苯乙烯树脂上装配肽，除了使用"BocGlu(O-环己基)和PBocAsp(O-环己基)以外，使用标准的支链保护。使用Tam等人.(7.CAew.5bc川5:"W(79W"的"低-高"氢氟酸(HF)方法对肽脱保护。在每种情况中，粗制HF产物由反相HPLC(C-18Vydac,22*250mm)纯化，不经干燥稀释到折叠緩冲液(1M尿素、100mMTris、pH8.0、1.5mM氧化谷胱甘肽、0.75mM还原谷胱甘肽、10mMMet)中，并在4。C搅拌48h。折叠的、完全氧化的肽从折叠混合物中由反相HPLC纯化，并由电喷射质语学鉴定；由氨基酸分析定量。生物信息学对尤其是各种ErbB配体的EGF-类似域的同源物，由BLAST和基于Smith-Waterman的搜索，搜索了EST、基因组和非冗余数据库(Altschul等人，1997;SamuelandAltschul,1990;SmithandWaterman,1981)。使用国家生物学中心(NCBI)网点进行了基于BLASTN、BLASTP和TBLASTN的搜索，采用网页上提供的搜索引擎和数据库。使用ClustalX(对Windows的版本1.81)进行多序列比对(Chenna等人.2003)。使用软件包和欧洲分子生物学库(EuropeanMolecularBiologyLaboratory)上维护的CompugenBioccelerator(EMBL-界面)进行基于Smith-Waterman的搜索。也使用这个Bioccelerator进行基于序型的搜索；使用软件PROFILEWEIGHT从蛋白的ClustalX多序列比对得到序列序型，此软件作为EMBL-界面CompugenBioccderator的一个软件部分而提供。然后使用程序TPROFILESEARCH(EMBL的CompugenBioccelerator;程序版本1.9)对DNA数据库进行序型搜索。在本例中用于Bioccderator搜索的扫描的数据库保持在EMBL站点。使用NCBIEntrez序列找回工具(sequenceretrievaltools)直接找回定义名字或检索号的序列。使用程序Transeq进行DNA序列翻译，此程序是EMBOSS包的一部分并由EMBL-欧洲生物信息学研究院网点提供(Rice等人.；TrendsGenet.2000Jun;16(6):276-7)。域结构在阅读文献的帮助和使用SMART(简化模数结构搜索工具；EMBL)而界定(Letunic等人;NucleicAcidsRes，2002Jan1;30(l):242-4)。使用所j生物信息学工具时都使用缺省设置，除非在上下文中另外指出。在撰写本草稿时，上述程序和网页界面都可以从表5所示的站点访问得到。表5:用于生物信息学分析的源头/工具<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>ErbB配体家族的典型成员已经在别处描述(Harari等人，1999;Harris等人,2003;Strachan等人，2001)。这些配体的蛋白序列已经从NCBI服务器中提取出，通过使用Entrez序列找回工具以及由对NR蛋白数据库使用BLASTP搜索。随后得到相应的cDNA序列作为蛋白序列的参考连接，或由TBLASTN对NRDNA数据库搜索。最后，通过对NCBI人类和小鼠基因组数据库进行TBLASTN搜索而提取出编码至少部分ErbB配体的基因组叠连序列。代表序列的检索号提供于表6。需要注意的是，这些序列通常在数据库中冗余地表示，而且存在对一些配体的可供选择的剪接变体。因此此处给出的检索号码只是代表性的。对可替换检索号的参考可以结合到文本中。表6:关于编码不同ErbB配体的基因组、转录子和蛋白序列的检索号<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>承多个NRG1变体以此单次检索(singleaccession)提供。最初决定产生和分析合成的多肽，其编码了图4种描述的EGF的I类变体和NRG2的EGF域(序列IDNOS:77和74)。然而所产生的合成肽比所示的略小；从第1个半胱氨酸残基之前的5个氨基酸跨越到第4个半胱氨酸的一个氨基酸残基的羧基。产生缺少EGF域C环的变异ErbB配体。此前已经证明，来自不同活化ErbB配体的EGF域既必要又充分的使受体活化。例如，只包含NRG4EGF域的再折叠合成肽对引起ErbB4活化是充足的(Harari等人，1999)。因此决定合成地产生和再折叠的编码两个I类变异配体的EGF域。产生并由空气氧化再折叠了的截短人类EGF和截短人类NRG2(长度为32氨基酸)(本文描述为EGF(l-32)NRG2(l-32))。产生的肽是图4中列出的肽序列(序列ID弁77和#74)的亚序列(subsequence)。除了人类EGF以外，也以独立的方式由区域选择性二硫(regioselectivedisulphide)合成方法合成和再折叠了小鼠EGF(l-32)，小鼠EGF(l-32)的序列来自对小鼠基因组的翻译后blast搜索(对小鼠基因组的tblastn搜索，使用NCBIblast服务器)。合成和再折叠的细节如下提供人EGFfl-32)和人NRG2fl-32)的合成和再折叠人EGF(l-32)即hEGF(l-32):序列IDNO:183(来自序列IDNO:77)NSDSECPLSHDGYCLHDGVCNYIEALDKYACK-OH对hEGF(l-32)使用固相Fmoc技术从市售的预载Tentagel-Lys(Boc)-Fmoc树月旨(RappPolymere,Germany)开始的第一合成方法不成功。此合成中一个主要问题是肽序列的高聚集潜力，其导致不完全偶联和序列终止。在第二合成中由转换到Boc化学而绕过了这个问题。从而用固相Boc技术使用预载的1.5mmo1规模的Boc-Lys(2-Cl-Z)-Merrifield树脂合成还原的hEGF(l-32)肽。使用3个当量的氨基酸合成的肽序列用于DCCI偶联。在氨基酸#11(从N-末端)之后不需要再偶联和一乙酰化作用。为了减少aspartimide的形成，使用了Boc-Asp(OcHxl)-OH，由于同样的原因也使用了Boc-Glu(OcHxl)-OH。从带有含10%苯曱醚(v/v)的HF的树脂裂解，产生HPLC中等纯度的粗制肽，主要峰值为主产物(tR37.9mins,见HPLC#1)。此粗产物的MS分析表示肽的还原形式(数据未显示)。成批的粗制肽在pH8-9的水中通过空气氧化而再折叠，以产生折叠的肽此还原的肽溶解在水中，由加入稀释的水合NH3和固体NH4Ac而将搅拌溶液调节到pH8.0。在室温下持续搅拌，由HPLC监控反应。用于分析的HPLC的样品在注射前用醋酸酸化，且在不同时间点取样。HPLC分析表示，再折叠反应在18小时后完成(数据未显示)。在18小时后的反应样进行Ellman-Test表示没有游离的硫醇存在。人NRG2(l-32)即hNRG2(l-32):序列IDNO:184(来自序列IDNO:74)GHARKCNETAKSYCVNGGVCYYIEGINQLSCK-OH4吏用市售的预载Tentagel-Lys(Boc)-Fmoc树月旨(RappPolymere，Germany)以固相Fmoc技术合成还原的hNRG2肽。使用2或3个当量的氨基酸合成的肽序列用于与DIPCDI偶联，开始于偶联#14(Fmoc-Val-OH)HOBt另外地添加到每个偶联步骤。当需要时，使用TBTU/DIPEA与2个当量的氨基酸进行再偶联。氨基酸(从N-末端)#2、6、13、14、15、21、24、27、29、31被再偶联。从带有King's混合物(cocktail)的树脂裂解产生粗制的肽。此粗产物的MS分析表示存在WPPL185的还原形式(数据未显示)。二硫键寡聚物与DDT的还原反应减少不导致还原肽的纯度增力口。还原的肽样品溶解在水中，由加入稀释的水合NHb和固体NH4Ac而将搅拌溶液调节到pH8.5。在室温下持续搅拌，由HPLC监控反应。用于分析的HPLC的样品在注射前用醋酸酸化。在2.5小时后和21小时后反应样品的比较表明，反应在几小时内完成。在21小时后的反应样品进行Ellman-Test表示没有游离的硫醇存在。即使延长反应时间也对二硫键形成的效率和质量没有影响。在48小时后的样品表示存在一种副产物，在tR29.2分钟为第二个新峰。因此，对这个反应系统，大约12-16小时的反应时间是有利的。小鼠EGF(l-32):序列IDNO:185:(与人SEQIDNO:183同源的小鼠序列)NSYPGCPSSYDGYCLNGGVCMHIESLDSYTCK-OH使用区域选择性二硫合成方案来合成此肽由如上所述的连续流动Fmoc-固相合成作用在O.lmmol规模上装配(Dawson，等人，(1999)J.PeptideRes.53,542-547)。固体支撑是Fmoc-Lys(Boc)-PAC-PEG-PS(PerseptiveBiosystems,USA)，整个过程中使用4倍摩尔过量的HBTU-活化的Fmoc-氨基酸。Na-Fmoc脱保护是在带有20%哌啶的DMF中。氨基酸支链保护由以下提供Asn和Gln、Trt;Asp和Glu、But;His、Trt;Tyr、But;Lys、Boc;Ser和Thr、But;和Cys(6,20)、Trt;和Cys(14,31)、Acm。所64有衍生物都购自Auspep(Mdbourne，Australia)。不进行重复氨基酸偶联。在装配的末尾，从固体支撑和支链脱保护的分离由在存在苯酚、硫代苯曱醚(thioanisole)、乙基二石克醇(ethanedithiol)和Jc(82.5/5/5/2.5/5,v/v)时以三氟醋酸(TFA)处理肽树脂3.5h而得到。粗制S-硫醇(6,20)、S-Acm(14，31)肽的等分试样由RP-HPLC在VydacC18柱上使用含有0.1。/。TFA的乙腈的梯度而纯化。然后，以在pH8.5緩冲液中的2-二硫吡咬处理纯化的肽的等分试样(50mg)2小时，从而在Cys6和20之间形成二硫键。把它置于准备的反相高效液相层析(RP-HPLC)，在VydacC18柱(Hesperia,USA)上，使用在0.1%含水TFA中的1%/min梯度CH3CN,以得到7.2mgs。然后，把产物在室温下以水冷醋酸中的多爽处理30分钟，从而在Cysl4和31之间形成第二个二硫键。双二硫mEGF(l-32)如前述的以HPLC纯化，以得到2.5mgs的高度同源的肽，它具有期望的分子量，如MALDI-TOFMS评定的(下迷)。^化和存浙f^炎的MiLD/提供合成肽mEGF(l-32)和hNRG2(l-32)的含水溶液(lmg/ml)用于分析。每种溶液的l.OpL样品滴到PerspectiveBiosystems10*10MALDI靶。lOmg/mLa-氰-4-幾基苯基-2-丙烯酸(a-cyano-4勿droxylcinnamicacid)(Sigma-AldrichPty.Ltd,Sydney,Australia)溶液，已经由从含水乙醇再结晶而纯化，在使用前制备于60%含水乙腈、0.1。/。TFA中，向点在靶上的各样品加入0.5pL此溶液。样品在室温下空气干燥。使用装有一个oMALDIII源的QSTARPulsari质镨仪(AppliedBiosystems，U.S.A)得到TOF-MS数据。使用337nm波长的氮激光以脉冲率29Hz和功率级14.8^J进行电离。使用来自[Glu!]-血纤肽B(AuspepPtyLtd,Melbourne,Australia)的数据用于TOF校准。在TOF-MS模式的质量精确度好于35ppm。肽的理论的单同位素分子量用亚洲-太平洋网站(http:〃jpsUudwig.edu.au/)的ProteinProspector(l)计算。再折叠的肽hEGF(l-32)的分子量独立地由不同装置确定，但通过使用类似的MALDI质谱方法。结果概述于表7。表7:对再折叠的合成的I类肽的质谱测量值<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>所有再折叠的肽产物表现为相当纯，只检测到除了报告的MH+以外的少量峰。观察到的质量对应于这些肽的完全氧化形式。检测到hNRG2(1-32)的一些次要缺失产物，但是它们的强度比报告的主要[M十1]低。观察到的质量对应于这些肽的完全氧化形式。确定合成肽中二硫健的形成最初假定的，从许多ErbB配体EGF域确定的结构，(对全长域)其编码的6个半胱氨酸以如下构造形成二硫键Cl-C3、C2-C4、C5-C6(Harari等人.2000)。因此期望变异的I类肽将形成Cl-C3、C2-C4构造。对mEGF(l-32)的情况，它是由区域选择性的二硫合成方案得到的，期望的二硫键顺序将由肽合成中的缺省值引导。然而，hEGF(l-32)和hNRG2(l-32)由氧化而再折叠，没有确定二硫键形成的顺序。进行了两种方法以确定这两种配体的二硫键序型；对肽的蛋白酶剪接，然后质镨法、和NMR确定。用蛋白酶V8剪接肽hEGF(l-32)和hNRG2(l-32)以lmg/ml悬浮在100mM重碳酸盐緩冲液中，然后在室温下以lpgV8蛋白酶(内蛋白酶(Endoproteinase)Glu-C;RocheDiagnosticsGmbH)过夜消化，目的是产生谷氨酸和天东氨酸残基的C-末端肽键的剪接。如果完全消化了，这种剪接方式将理想地导致在hEGF(l-32)的所有肽键之间形成肽片段。然后对hNRG2(l-32)的情况，以V8剪接产生较少的切口，导致产生包含C1、C4和Cys(2nd+3"组合)的独立片段。然后测量束縳片段的分子质量，目标是确定这些空气-氧化的肽的Cys-Cys结合分布。hEGF(1-32)以V8切割导致形成新的带，分子量[M+1]为1282.7Da和1522.72Da,其十分类似于Cl-C4和C2-C3的二硫键方式(表8)。也检测了3577.549Da的主要峰，其相当于全长的未切割的hEGF的期望分子质量+2Da,这表明在V8裂解緩冲液中培育期后有2个氢原子结合到此肽上。这些数据符合大多数肽在消化后保持未切割的可能性。以V8和10%乙腈重复对hEGF消化未能提高完全消化的片段的产量(数据未显示)。hNRG2(l-32)V8蛋白酶培育NRG2导致分子质量的形成与Cl-C4和C2-C3的二硫键形成相符(表8)。没有检测到对应于可替换的二硫键构造的形成的其它峰的迹象；也没有未裂解的肽的迹象。因此，对检测的结论，这个实验表明空气氧化的hNRG2(l-32)包含Cl-C4和C2-C3的同源结构，这并非最初可预见的结果。质谱结果的解释这里提供的数据表明在由上述方法空气氧化后，合成的肽hNRG2(l-32)和可能的hEGF(1-32)已经形成了如下的二硫键结构Cl-C4、C2-C3，这与期望的键形式Cl-C3、C2-C4相反。如果质谱数据的解释是正确的，那么基于二疏键的序型，I类变体可以折叠为不同的构造，这些构造是由已知EGF域结构(具有6个半胱氨酸)推断从而预期的结构。可替换地，这个种未割的片段表现一种可替换的折叠种类在技术上是可能的。需要注意的是，尽管假定在V8消化后hEGF(l-32)的大片段保持未切割，为了独立地证明这些发现，进行了对肽的NMR分析(见以下)。表8:再折叠的合成的I类肽的预测值与测量值。这些预测值和结果以单同位素质量測定[M+H给出。<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>注意ND-未抬r测。调整了预测质量以给出每个二硫键MW减少2Da。而且，所有肽保持理论的分子质量[M+1],不管由二硫键系留的片段数量。*作为hNRG2(l-32)以V8切割的方式的结果，C2和C3在切割后保持为单个片段。这将导致不能分离片断，此片断是在三种可能排列中的两种，其中如上述的形成两对Cys-Cys键。核磁共振(NMR)光谦分析合成的I类配体由NMR分析。所有1HNMR光语都记录在装有z-梯度单元的BrukerARX500分光计上。肽浓度范围在l-3mM之间。1HNMR实验包括混合时间为350ms的NOESY和混合时间为65ms的TOCSY。所有光谱都在303K记录。光语超过6024Hz,带有4K数据点、400-600FIDs、16(TOCSY)或64(NOESY),扫描和循环延迟为ls。促有丝分裂测定活性配体刺激有丝分裂在确定I类变异配体的抑制活性之前，重要的是首先测试这些配体是否显示活化有丝分裂的潜力。用EGFR转染的BaF/3细胞(BaF/3-EGFR;Walker等人，GrowthFactors16:53-67，1998)洗涤3次以除去残留的IL-3,并重悬浮于RPMI1640+10%FCS。然后在每200微升2x104细胞，使用Biomek2000(Beckman)把细胞接种于96孔板中，然后在37°C10%CO2中培养4h。为了确定带有阳性对照的这个系统的效力，细胞首先仅与滴定浓度的活化配体EGF生长，以确定对这些细胞达到最大或亚-最大受体-介导的有丝分裂所需配体的最小量。从小鼠唾液腺纯化的EGF(Burgess等人,ProcNatlAcadSciUSA.79:5753-7(1982))浓度为大约200pM,典型地在诱导这些细胞的亚-最大至最大促有丝分裂响应。ErbB变异配体的滴定浓度添加到这些细胞以测试它们促有丝分裂的潜力。以类似的方式，表达一个范围的ErbB受体的、能够对ErbB配体刺激提供促有丝分裂响应的BaF/3或不同的细胞，用于测试这些和其它变异配体的活性配体刺激有丝分裂(例子见Harari等人，1999)。初步结果表示，配体mEGF(l-32)和hNRG2(l-32)不加强BaF/3-EGFR细胞的有丝分裂(数据未显示)。抑制有丝分裂试验在连续稀释中，滴定浓度的变异ErbB配体添加到BaF/3-EGFR细胞中，这些细胞接种到带有复制的+-小鼠EGF的96孔板中(一般在200pM数量级内)。在一个系列的实验中，在加入小鼠EGF之前，变异配体与BaF/3-EGFR细胞预培养半小时。在的另一个系列的实验中，在把配体混合物加入细胞之前，变异配体与小鼠EGF或其它活性ErbB配体预培养半小时。在收获细胞之前，以3-H胸苷(1微Ci/孔)将板培养18小时(Filtermate,Packard),细胞收集到Unifilter96GF/C板(Packard)上。这些板干燥1小时，然后向各孔添加Microscint20(Packard)scintillationcocktai1(20微升)。使用TopCountNXT卩计数器(Packard)确定3H-胸苷结合。以类似的方式，表达某一范围的ErbB受体的、能够对ErbB配体刺激提供促有丝分裂响应的BaF/3或不同的细胞，用于测试这些和其它变异配体的抑制配体诱导有丝分裂的能力(例子见Harari等人，1999)。对hNRG2fl-32)&mEGFfl-32)的BIAcoreTM分析-受体结合测定使用BIAcoreTM3000进行生物传感器分析。CM-5(研究级)传感芯片与分别在流动室(flowcell)2、3和4上的可溶的EGFR(氨基酸1-501)、可溶的EGFR(氨基酸1-621)、和可溶的ErbB2(氨基酸1-509)固定化。使用胺偶联化学在pH4.2的10mM醋酸钠中进行固定化作用。不同浓度(1.25|iM、2.5pM、5hM和10mM)的肽以流动率为5pl/min注射(30pl)到HBS电泳緩冲液(10mMHEPES、3.4mMEDTA、0.15MNaCl、0.005%Tween20、pH7.4)中的传感器表面上。然后通过以流动率为20jil/min注射10^110mMNaOH而再生表面。所得到的传感器曲线减去空白通道(流动室1)以产生特异响应。对hNRG2a-32)&mEGRl-32)测量配体间相互作用的BIAcoreTM分析-使用BIAcoreTM3000进行生物传感器分析。CM-5(研究级)传感芯片与在流动室2、3和4上的重组的人或牛EGF、TGF-a和P纤维素分别固定化。使用胺偶联化学在pH4.2的lOmM醋酸钠中进行固定化作用。不同浓度(0.3拜、0.6pM、1.25pM、2.5pM、5(iM、10,[以及在一些情况中的50拜])的hNRG2(l-32)、mEGF(l-32)和hEGF(l-32)以流动率为5pl/min注射(30pl)到HBS电泳緩冲液(10mMHEPES、3.4mMEDTA、0.15MNaCl、0.005%Tween20、pH7.4)中的传感器表面上。然后通过以流动率为20jxl/min注射10^110mMNaOH而再生表面。所得到的传感器曲线减去空白通道(流动室1)以产生特异响应。Biacore结果I类ErbB配体变体-ErbB受体相互作用71肽hNRG2(l-32)和mEGF(l-32)，当添加到浓度达到lOpM时，未能证明具有可测量的结合于固定化的可溶的ErbBl、和ErbB2(数据未显示)。II类ErbB配体变体-ErbB受体相互作用在最初的实验中，hNRG2(l-32)、mEGF(l-32)和hEGF(l-32)单独地添加到固定化的激动物P纤维素中。对hNRG2(l-32)和mEGF(l-32)，被注意到微弱的结合于P纤维素(图6)。然而，没有检测到hEGF(l-32)肽结合固定化的P纤维素(数据未表示)。已经根据特定的优选实施方式和实施例描述了本发明。本领域中技术人员将认识到的是，在本发明范围内的许多可能替换将显而易见的，且本发明的范围不是由本文所列举的特定实施方式而限定，而是由随后的权利要求限定。参考文献Altschul，S.F"Madden,T.L"Schaffer,A.A"Zh旭g，J"Zhang,Z"固er，W.andLipmatuD.J.Gai^dBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograira.^ci必及&y25，3389-402，1997,Barbacci,E.G.;Guarino，B.C.;S加hjJ.G.;Singleton,D.H.;Rosnack,K丄；Moyer,J.D,;油dAndrews,G.C.Thestructuralbasisforthespecificityofepidermalgrowthfactorandheregulinbinding.J历o/CA柳，270(16):9585-9589,1995.C咖pioruS凡，andNiyogi，S.K.Interactionofepidermalgrowthfactorwithitsreceptor.尸rog油c/eic爿cirf及es她/胸/，49:353-383，1994.Carpenter,G.，andCohen,S.Epidermalgrowthfactor.J丑w/.CAe加.，265:7709-7712，l柳.Chenna^It,Sugawara^H"Koike,T"Lopez^R"Gibson,T.J"Higgins，D.G.andThomp幼n,J.D.Multiplesequ節cealignmentwiththeClustalseriesofprograms.Wwc/eicJc/ds及m31，3497-3500，2003.Crovello，C.S.;Lai，C.;Cantley，L,C.;andCaxraway,K丄.，3rd,DifferentialsignaUngbythe邻idennalgrowth&ctor-likegrowthActorsneuregulin-1and加uregulin-2,J所o/CAe附，273(41):26954-26961，1998.Darnell,J.;Lodish*H';andBaltimore,D"Mfec"/ayCg//fl!ofogy,ScientificAmericanBooks,USA(1986]iDefeo-Jones，D,;Tai，J.Y.;Vuocolo，G.A.;Wegrayn,R丄；Schofield,T丄.；Riem叫MW.;andOliff，A.Substitutionoflysineforarginineatposition42ofh咖幼transforminggrowthfactor-aeliminatesbioiogicalactivitywithoutchanginginternaldisulfidebonds.Mo/.Cefl.Sio/.，9:40834086，1989.Engler,D.A.;C咖pion，S.R.;Hanser，M.R.;Cook,J.S.;andNiyogi，S,K.Criticalfunctionalrequirementsfortheguanidiniumgroupofthearginine41sidechainofhumanepidex^algrowthfactorasrevealedbymutagenicinactivationandchemicalreactivation.JCZie附.，267:22742281，1992.Falls,D丄.Neuregulins:fiinctions,forms,andsignalingstrategies.￡xpCW/及ey.，284(l):14-30,2003.Groenen，LC,;Nice,E,C.;andBurgess,A.W.Stracture-fimctionrelationshipsfortheEGF/TGF-afemilyofmitogens.Grow沐Fa"附，11:235-257，1994.Harari，D.;Tzahar，E.;Romano,J.;Shelly,M.;Pierce,丄H.;Andrews,G.C.;andYarden,Y.Neuregulin4:anovelgrowflifactorthatactsthroughtheErbB4receptortyrosinekinase,O"cog幼e,18(17):2681-2689，1999.Harari,D,，andYarden，Y.MolecularmechanismsunderlyingErbB2/HER2actioninbreastcancer.19(53):6102-6114，2000.Harris!R.C.;ChungjE.;andCoffey,R丄EGFreceptorligaods.Ce//及咖orc/1,284:2-13,2003.Howes,R>;Wasserman,J.D.;姐dFreeman,M.InvivoanalysisofArgosstructure-fiinction.Sequoice呵uirementsforinhibitionoftheDrosophilaepidermalgrowthfactorreceptor.Jbur加/。/J3油gica/CA抓te"，273(7):42754281，1998.Jin，M.H.;Sawamoto,K.;Ito,M.;旭dOkano,H.TheinteractionbetweentheDrosophilasecretedproteinargosandtheepidermalgrowthfactorreceptorinhibitsdimerizationofther沈邻torandbindingofsecretedspitztothereceptor.A/o/Ce//B!'o/，20(6):2098-2107，2000.Jo加s，J.T.;Akita^ILW.;andSliwkowski，M.X.Bidingspec迅citiesandaffinitiesofegfdomainsforErbBreceptors.F五5S丄eff，447(2-3):227-231，1999.Jorissen^R.N.;Walker,F.;Poulio^N.;Garret^T.P.;Ward,C.W.;andBurgess,A.W.Epidormalgrowthfactorreceptor:mechanismsofactivationandsignalling.￡x/Ce//及es，284(l):31-53，2003.Kuneck,J.Antisensetechnologies.Improvementthroughnovelchemicalmodifications.五wJ所octe加，270(8):1628-1644,2003.Maniati^T.;Fri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