用于在改良安卡拉痘苗病毒中进行表达的启动子的制作方法

专利名称：用于在改良安卡拉痘苗病毒中进行表达的启动子的制作方法
专利说明用于在改良安卡拉痘苗病毒中进行表达的启动子 本发明涉及启动子，尤其是用于在改良安卡拉痘苗病毒(Modifiedvaccinia virus Ankara，MVA)之类的痘苗病毒中表达基因和/或编码序列的启动子。本发明还涉及包含该启动子的表达盒，含有所述表达盒的载体，以及药物组合物和疫苗。

背景技术：
重组痘病毒广泛用于在被感染的细胞中表达外来基因。目前还有人测试重组痘病毒是否可以作为非常有希望的疫苗用于诱导抗该痘病毒载体表达的外来抗原的免疫应答。最常见的痘病毒是禽痘病毒属的病毒(avipoxviruses)和痘苗病毒(vaccinia viruses)，后者尤其例如改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。MVA与痘苗病毒相关，是痘病毒科正粘病毒属的一员。MVA是通过将痘苗病毒的安卡拉毒株在鸡胚成纤维细胞上连续传516代(CVA)而得到的(综述可参见Mayr，A.，等Infection 3，6-14[1975])。如此长期传代得到一种MVA病毒，其基因组序列中缺失了大约31kb，因此它被描述为对宿主细胞具有高度选择性，仅限于鸟类细胞(Meyer，H.等，J.Gen.Virol.72，1031-1038[1991])。所得MVA在多种动物模型中明显缺乏毒力(Mayr，A.& Danner，K.[1978]Dev.Biol.Stand.41225-34)。此外，临床试验中还检验了该MVA毒株作为疫苗经免疫接种而对抗人类天花的效果(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390[1987]，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392[1974])。
US 5,736,368和US 6,051,410公开了表达HIV抗原和蛋白的重组痘苗病毒株Wyeth。US 5,747,324公开了表达慢病毒基因的重组痘苗病毒株NYCBH。EP 0 243 029公开了表达人逆转录病毒基因的重组痘苗病毒株Western Reserve。WO 02/42480公开了特别安全且减毒的MVA株。重组MVA可以参见，例如WO 98/13500和WO 03/048184。
本领域已知仅有一些启动子能在痘病毒中表达外来基因，如30K和40K启动子(参见，例如US 5,747,324)，人工合成的强效早/晚期启动子(参见，例如Sutter et al.，Vaccine(1994)12，1032-40)，P7.5启动子(参见，例如Endoet al.，J.Gen.Virol.(1991)72，699-703)以及衍生自牛痘病毒(cowpox virus)A型包涵体(ATI)基因的启动子(Li et al.，J.Gen.Virol.(1998)79，613)。所有这些启动子都已用在重组痘苗病毒中来表达外来基因，结果表明，它们都表达这些基因，从而产生由这些外来基因编码的蛋白。由于仅有一些启动子可以用于在痘苗病毒表达系统中表达基因，因此总体上需要另外的痘苗病毒启动子。此外，所有迄今已知的启动子都是强效晚期启动子，即可以用于在痘苗病毒载体发生复制之后来表达基因。而在一些应用中，希望有能在刚刚发生细胞感染后就表达基因的启动子，即需要痘苗病毒早期启动子。
不仅如此，如上所述，MVA由于其改进的安全性而在外来基因表达方面具有很好的前景。但迄今已知的所有用于在MVA中表达外来基因的启动子都来源于其它痘苗病毒或者是合成的、用于在其它痘苗病毒中进行表达的启动子。因此，还需要最适于在MVA中表达的启动子。
发明详述 本发明涉及衍生自改良安卡拉痘苗病毒(MVA)的启动子。MVA启动子至今尚未为本领域所知。
具体地，本发明涉及包含选自下列的核苷酸序列或由选自下列的核苷酸序列组成的启动子 (i)SEQ ID NO1-6任一所示核苷酸序列 5′TCTGCAATATTGTTATCGTAATTGGAAAAATAGTGTTCGAGTGAGTTGGATTATGTGAGTATTGGATTGTATATTTTATTTTATATTTTATATTTTGTAGTAAGAATAGAATGCTAATGTCAAGTTTATTCCAATAGATGTCTTATTAAAAAACATATATAATAAATAACA 3`(SEQ ID NO1) 5’GATAAAAATTTAAAGTGTAAATATAACTATTATTTTATAGTTGTAATAAAAAGGGAAATTTGATTGTATACTTTCGGTTCTTTAAAAGAAACTGACTTGATAAAA 3′(SEQ ID NO2) 5′GCATTTCATCTTTCTCCAATACTAATCAAATTGTTAAATAAATAATGGATAGTATAAATAGTTATTAGTGATAAAATAGTAAAAATAATTATTAGAATAAGAGTGTAGTATCATAGATAACTCTCTTCTATAAAA 3′(SEQ ID NO3) 5′GATCTATAAAGGTAGACCTAATCGTCTCGGATGACCATATATTTATTTTCAGTTTTATTATACGCATAAATAGTAAAAAATATGTTAGGTTTACAAAA 3′(SEQ ID NO4) 5′GGTAAACTTTAAGACATGTGTGTTATACTAAGATGGTTGGCTTATTCCATAGTAGCTTGTGGAATTTATAAACTTATGATAGTAAAACTAGTACCCAATATGTAAAGATGAAAAAGTAAATTACTATTAACGCCGTCGGTATTCGTTCATCCATTCAGTT 3′(SEQ ID NO5) 5′ATTTCTCGGTAGCACATCAAATGATGTTACCACTTTTCTTAGCATGCTTAACTTGACTAAATATTCATAACTAATTTTTATTAATGATACAAAAACGAAATAAAACTGCATATTATACACTGGTTAACGCCCTTATAGGCTCTAACCATTTTCAAG 3′(SEQ ID NO6) (ii)SEQ IDNo.1-6任一序列的亚序列 (iii)与序列(i)或(ii)相比具有一或多个核苷酸取代、缺失和/或插入的序列。
SEQ ID NO1-6都是MVA基因组的天然组成部分，分别位于阅读框A42R，J6R，F6R，I2R，C7L和B9R的上游。
本发明的启动子优选作为痘苗病毒启动子或者作为被痘苗病毒感染的细胞中的启动子来发挥作用。所述痘苗病毒优选MVA，尤其是下文中具体指出的MVA毒株之一。“作为痘苗病毒启动子来发挥作用”是指，在用痘苗病毒感染细胞后，该启动子能指导与该启动子可操作相连的基因在痘苗病毒中表达。所述细胞优选允许痘苗病毒的晚期和/或早期表达的细胞。“在被痘苗病毒感染的细胞中发挥作用的启动子”还包括以下情况启动子并非痘苗病毒基因组的一部分的情况，例如启动子是质粒的一部分或非-痘苗病毒的病毒基因组的一部分的情况；在这种情况中，本发明的启动子在含有该启动子的细胞同时也含有痘苗病毒基因组(例如，该细胞被痘苗病毒感染)时具有活性。在这些情况中，病毒RNA聚合酶识别本发明的启动子，活化与该启动子相连的基因/编码序列的表达。
根据本发明，可以使用SEQ ID NO1-6任一所示启动子。实际用于指导基因/编码序列表达的启动子可以由SEQ ID NO1-6任一组成，或者实际使用的启动子可以是包含SEQ ID NO1-6任一序列的更大的结构。或者，本发明的范围内包括使用这些启动子的衍生物，它们可以是SEQ.ID NO1-6任一的亚序列。“SEQ.ID NO1-6任一的亚序列”是指，比SEQ.ID NO1-6任一序列更短、但仍可以作为启动子(尤其是作为在痘苗病毒或被痘苗病毒感染的细胞中的启动子)来发挥作用的片段。同样地，痘苗病毒优选MVA，诸如下文中具体指明的那些毒株。SEQ ID NO1-6任一的典型亚序列具有SEQ ID NO1-6任一序列的至少15个核苷酸，更优选至少20个核苷酸，还更优选至少25个核苷酸，最优选至少30个核苷酸。
SEQ ID NO1的优选亚序列是SEQ ID NO7。SEQ ID NO2的优选亚序列是SEQ ID NO8。SEQ ID NO3的优选亚序列和/或衍生物是SEQ ID NO9和SEQ ID NO10。SEQ ID NO4的优选亚序列是SEQ ID NO11和SEQ IDNO12。序列SEQ ID NO6-12可参见实施例章节。
对于包含SEQ ID NO1-6任一所示核苷酸序列或其亚序列、或者由SEQID NO1-6任一所示核苷酸序列或其亚序列组成的启动子而言，其衍生物，尤其是SEQ ID NO7-12任一核苷酸序列的衍生物，可以是与SEQ ID NO1-6任一序列或其亚序列相比具有一或多个核苷酸取代、缺失、和/或插入的序列，尤其是与SEQ ID NO7-12任一核苷酸序列相比具有一或多个核苷酸取代、缺失、和/或插入的序列。本发明的衍生物仍然可以作为启动子(尤其是痘苗病毒启动子)而在痘苗病毒中或在被痘苗病毒感染的细胞中发挥作用，更优选作为MVA启动子而在MVA中或在被MVA感染的细胞中发挥作用。具有一或多个核苷酸取代的序列是指，与SEQ ID NO1-6任一所示核苷酸序列或其亚序列、尤其与SEQ ID NO7-12任一核苷酸序列相比，有一或多个核苷酸被不同核苷酸取代的序列。具有一或多个核苷酸插入的序列是指，与SEQ IDNO1-6任一所示核苷酸序列或其亚序列、尤其与SEQ ID NO7-12任一核苷酸序列相比，在一或多个位置插入了一或多个核苷酸的序列。具有一或多个核苷酸缺失的序列是指，与SEQ ID NO1-6任一所示核苷酸序列或其亚序列、尤其与SEQ ID NO7-12任一核苷酸序列相比，缺失了一或多个核苷酸的序列。在本发明的衍生物中，缺失、取代和插入可以出现在同一序列中。
本发明亚序列的衍生物的一个实例是SEQ ID NO10，它是SEQ ID NO3的亚序列，与SEQ ID NO3相比，它额外具有一个核苷酸改变。
优选所述衍生物与SEQ ID NO1-6任一序列或其亚序列、尤其与SEQ IDNO7-12任一序列相比，具有至少40％，更优选至少60％，还更优选至少80％，最优选至少90％的同源性。根据最优选的实施方案，SEQ ID NO7-12任一序列中有不超过10个核苷酸，还更优选不超过5个核苷酸被取代、缺失和/或插入。
有很多的现有技术文献可以使本领域技术人员预测，SEQ ID NO1-12任一序列的哪些衍生物或亚序列仍具有作为痘苗病毒启动子、尤其是作为在MVA中发挥作用的启动子的生物学活性。例如，可参见Chakrarbarti等，Biotechniques(1997)23，1094-1097和Davison and Moss，J.Mol.Biol.(1989)210，771-784。而且，一种片段是否仍具有作为痘苗病毒启动子、尤其是作为MVA启动子的活性，可以由本领域技术人员很容易地进行评估。具体地，序列衍生物可以克隆在质粒构建体中报告基因的上游。将该构建体转染到已被MVA感染的真核细胞或者CEF或BHK等细胞系中。测定所述报告基因的表达，并与SEQ ID NO1-6任一所示启动子控制的该报告基因的表达进行比较。本发明的衍生物是在该测试系统中具有SEQ ID NO1-6任一启动子序列的至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，还更优选至少70％，最优选至少90％启动子活性的衍生物。SEQ ID NO1-12任一的具有较高启动子活性的衍生物也包括本发明的范围内。
本发明的启动子特别适于在MVA中表达编码序列。
SEQ ID NO1所示启动子具有非常高的活性，尤其是作为晚期启动子，但它也可以作为早期启动子。相应的亚序列，例如SEQ ID NO7所示序列也具有这些特点，只不过它尤其适于作为晚期启动子。
SEQ ID NO2所示启动子也具有非常高的活性，尤其是作为晚期启动子时。它也可以用作早期启动子。相应的亚序列，例如SEQ ID NO8所示序列也具有这些特点，只不过它尤其适于作为晚期启动子。
SEQ ID NO3所示启动子尤其可用作早期启动子，并且它是所测试的所有启动子中早期启动子活性最高的。不过，它也可以用作晚期启动子。相应的亚序列，例如SEQ ID NO9和10所示序列也是如此。在这些亚序列中，SEQ ID NO9尤其可以用作早期启动子，SEQ ID NO10尤其可以用作晚期启动子。
SEQ ID NO4所示启动子尤其可用于早期和晚期表达与之相连的编码序列，因为该启动子在早期和晚期条件下具有非常高的活性。相应的亚序列，例如SEQ ID NO11和12所示序列也是如此。在这些亚序列中，SEQ ID NO11尤其可以用作早期启动子，SEQ ID NO12尤其可以用作晚期启动子。
SEQ ID NO5和6所示启动子尤其可用于极少量表达与之相连的编码序列。有些情况是需要极少量表达的，例如所连接的编码序列编码毒性基因产物和/或希望诱导较高亲合力免疫应答的情况。
术语“早期启动子”是指，在痘苗病毒或被痘苗病毒感染的细胞中，在病毒DNA复制之前发挥活性的启动子。本领域技术人员已知如何检查一种启动子是否早期启动子的方法。具体地，可将目标启动子插入报告基因上游。将含有该启动子和报告基因的构建体导入已被痘苗病毒感染的细胞中。为了评估早期启动子活性，将细胞与AraC等抑制DNA复制的物质一起保温。DNA复制是晚期启动子活性的必备条件。故，在该测试系统中测出的任何启动子活性归因于作为早期启动子来发挥作用的元件。因此，术语“晚期启动子”是指在DNA复制发生之后发挥作用的任何启动子。这种晚期活性也可以通过本领域已知的方法来测量。为简便目的，术语“晚期启动子”在本中请中用于指，在未添加阻断DNA复制的物质的情况下测定的启动子活性。
在另一实施方案中，本发明涉及含有编码序列和本发明启动子的表达盒，其中所述编码序列的表达受所述启动子控制。表达盒优选不是痘苗病毒基因组中天然存在的表达盒。故，当本发明启动子是痘苗病毒基因组中天然存在的启动子时，与该启动子相连的序列优选不同于痘苗病毒基因组中与该启动子天然相连的序列。换而言之，当本发明启动子与天然启动子相同时，受该启动子控制而表达的编码序列、和/或位于该启动子和该编码序列之间的序列不同于与该启动子天然相连的相应序列。术语“不同于”在此上下文中是指，在所述序列中有至少一个核苷酸不同的序列。优选它是有至少一个核苷酸不同的编码序列。在其它情况下，所述表达盒中编码序列与天然连接该启动子的序列之间的同源性不足90％，不足80％，不足70％，不足60％，不足50％，不足40％或甚至不足20％。最优选，受本发明启动子控制的编码序列编码的肽/蛋白与该编码序列编码的天然蛋白有至少一个氨基酸不同。例如，所述表达盒并不是含有在痘苗病毒中指导天然C7L基因表达的天然C7L启动子的表达盒，例如，所述表达盒并不是WO2004/015118中公开的含有C7L启动子和C7L编码序列的表达盒。
另一方面，当待表达的序列是痘苗病毒的天然序列时，用于表达该序列的启动子不同于在天然环境中指导该编码序列表达的启动子。根据这一方面，这种启动子的核苷酸序列与痘苗病毒天然启动子的序列有至少一个核苷酸不同。根据其它方面，本发明控制痘苗病毒序列表达的启动子与天然连接这种痘苗病毒序列的启动子之间的同源性不足90％，不足80％，不足70％，不足60％，不足50％或甚至不足40％。
优选编码序列编码至少一种抗原表位或抗原、治疗性肽或蛋白、反义RNA或核酶。当编码序列编码抗原表位或抗原时，可将表达盒导入生物(例如哺乳动物，包括人)的细胞中，用于表达所述抗原。所述抗原/表位的呈递可以在这种生物中激发免疫应答，使该生物对衍生该抗原/表位的物质致敏。更具体地，所述表位/抗原可以是较大的氨基酸序列(如多表位、肽或蛋白)的一部分。优选编码序列编码痘苗病毒基因组中并不编码的至少一种抗原表位或抗原、治疗性肽或蛋白、反义RNA或核酶。
所述多表位、肽或蛋白的实例可以是以下来源的多表位、肽或蛋白(i)病毒，尤其是除了痘苗病毒以外的病毒，如HIV，HTLV，疱疹病毒，登革热病毒，脊髓灰质炎病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒，肝炎病毒等，(ii)细菌，(iii)真菌，(iv)肿瘤相关多肽/蛋白，如肿瘤相关抗原。
或者，编码序列可以编码治疗性化合物，如白细胞介素，干扰素，核酶或酶。
在更广泛的意义上，本发明涉及包含本发明启动子和/或本发明表达盒的任何核酸序列。所述核酸可以是RNA，例如当所述启动子是逆转录病毒基因组的一部分时。更优选所述核酸是DNA。DNA可以是任何类型的DNA，如线性、环状、单链或双链DNA。
根据另一实施方案，本发明的启动子和/或表达盒可以是载体的一部分。术语“载体”是指本领域已知的任何载体。载体可以是质粒载体，如pBR322或pUC系列的载体。更优选载体是病毒载体。在本发明上下文中，术语“病毒载体”是指含有病毒基因组的感染性病毒。在这种情况下，本发明的DNA是相应病毒载体的病毒基因组的一部分。将重组病毒基因组包装后，所得的重组载体可以用于感染细胞和细胞系，尤其是感染活体动物，包括人。可用于本发明的典型的病毒载体有，腺病毒载体、逆转录病毒载体或基于腺伴随病毒2(AAV2)的载体。最优选痘病毒载体。痘病毒优选金丝雀痘病毒(canarypox virus)，禽痘病毒(fowlpoxvirus)或痘苗病毒。
更优选的是改良安卡拉痘苗病毒(MVA)(Sutter，G.et al.[1994]，Vaccine121032-40；Antoine，G.et al.[1998]，Virology 244365-396)。术语“MVA”用在本申请中是指现有技术已知的任何MVA病毒株。MVA病毒株的一个典型实例是VR-1508，它保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA20108，US。可用于本发明的MVA病毒株的其它实例有，MVA 572和575，它们保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of AnimalCell Cultures，ECACC)，Salisbury(UK)，保藏号为分别为ECACC V94012707和ECACC V00120707，另外还有MVA-BN，其保藏号为ECACC V00083008。
最优选的MVA病毒株是MVA-BN或其衍生物。MVA-BN的特点，能评价MVA病毒株是否MVA-BN或其衍生物的生物学试验以及获得MVA-BN或其衍生物的方法可以参见WO 02/42480。该申请的内容包括在本申请中作为参考。具体地，对本发明痘苗病毒特性的定义可以参考WO02/42480，诸如MVA的特性，以及MVA-BN衍生物的特性和定义。该文献还公开了如何繁殖MVA以及其它痘苗病毒。简言之，用这种病毒感染真核细胞。所述真核细胞是易被相应痘病毒感染、并允许感染性病毒复制增殖的细胞。对于MVA而言，这类细胞的实例有鸡胚成纤维细胞(CEF)和BHK细胞(Drexler I.，Heller K.，Wahren B.，Erfle V.and Sutter G.“Highly attenuatedrnodified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells，a potentialhost for virus propagation，but not in various human transformed and primarycells”J.Gen.Virol.(1998)，79，347-352)。CEF细胞可以在本领域已知的条件下培养。优选CEF细胞在静止的烧瓶或摇瓶中不含血清的培养基中培养。保温优选在37℃±2℃进行48-96小时。为了进行感染，优选MVA用量为0.05-1 TCID50的感染复数(MOI)，并且保温优选在37℃±2℃进行48-72小时。
本领域已知如何将本发明的表达盒或启动子插入病毒基因组，尤其是插入痘苗病毒基因组，最优选插入MVA基因组。例如，可以将本发明的表达盒或启动子或其衍生物通过同源重组插入MVA基因组。为此，将核酸转染到CEF或BHK细胞等容许细胞系中，在所述核酸中，本发明的表达盒或启动子或其衍生物的侧翼是与MVA基因组中希望插入本发明表达盒或启动子或其衍生物的区域同源的核苷酸链。用MVA感染所述细胞，在被感染的细胞中，所述核酸与病毒基因组之间发生同源重组。也可以首先用MVA感染细胞，然后将所述核酸转染到被感染的细胞中。同样在所述细胞中发生重组。然后用本领域已知的方法选出重组MVA。对重组MVA的构建不限于这种具体的方法。本领域已知的任何方法都可以用于此目的。
本发明的表达盒或启动子可以插入载体、尤其是病毒基因组的任何适当部分。在痘苗病毒的情况中，可以插入病毒基因组的非必需部分，或插入病毒基因组的基因间区域。术语“基因间区域”优选是病毒基因组中位于两个邻接基因之间的不含有编码序列的那些部分。当载体是MVA时，可以插入该病毒基因组的天然缺失位点。“天然缺失位点”是指病毒基因组中相对于痘苗病毒Copenhagen株的基因组而言已经缺失的那些部分。但插入位点不限于痘苗病毒基因组和MVA基因组中的这些优选插入位点，因为在本发明范围内，只要能获得在至少一种细胞培养系统如鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)中能够扩增和繁殖的重组体，可以将表达盒插入病毒基因组的任何位点。
本发明的启动子可以用于表达已经是载体(例如MVA基因组)的一部分的基因。这样的基因可以是病毒基因组的天然部分，或者是已经插入载体中的外来基因。在这些情况中，将本发明的启动子插入载体中这种基因的上游，使基因表达受该启动子控制。含有本发明表达盒的MVA载体也可以如下制备将A42R，J6R，F6R，I2R，C7L或B9R任一种开放读框替换为编码序列，而所述编码序列的表达受天然控制上述任一种开放读框表达的启动子的控制。例如，可以将A42R编码序列或其部分替换为待表达的编码序列。在所得构建体中，所述编码序列受本发明启动子控制，即受SEQ ID NO1和SEQID NO7所示启动子序列控制。这些表达盒也落在本发明范围内。
根据另一实施方案，本发明涉及作为疫苗或药物的本发明载体。在更广泛的意义上，本发明涉及含有本发明表达盒、DNA或载体的疫苗或药物组合物。本领域已知对动物或人体给药疫苗或药物组合物的方法。在DNA和质粒载体的情况中，所述DNA和载体可以简单地通过注射来给药。当载体是病毒载体，如痘苗病毒载体，尤其MVA载体时，可以按本领域技术人员所知对动物或人体给药，例如通过静脉内、肌肉内、鼻内、皮内或皮下方式给药。病毒给药量详见下文。
药物组合物或疫苗除了包括本发明的启动子、表达盒或载体以外，通常包括一或多种可药用和/或经核准的(approved)载体，添加剂，抗生素，保存剂，辅助剂，稀释剂和/或稳定剂。这类辅助物质可以是水，盐水，甘油，乙醇，增湿剂或乳化剂，pH缓冲物质，等等。适当的载体通常是分子量较大、代谢较慢的分子，如蛋白、多糖、多聚乳酸，多聚乙醇酸，多聚氨基酸，氨基酸共聚物，脂质聚集物，等等。
为了制备药物组合物或疫苗，可以将本发明的DNA、表达盒或载体(尤其是重组痘苗病毒如重组MVA)转变为生理可接受的形式。对于痘苗病毒，尤其是MVA而言，这可以依据制备天花预防性接种所用的痘病毒疫苗的经验来进行(参见Stickl，H.et al.[1974]Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。例如，将纯化的病毒以5×108TCID50/ml的滴度配制在约10mM Tris，140mMNaCl pH7.4中，-80℃保存。为了制备疫苗注射剂(vaccine shot)，例如将101-109的本发明重组病毒颗粒，在有2％蛋白胨和1％人白蛋白存在的情况下，冻干在安瓿(优选玻璃安瓿)内的磷酸盐缓冲液(PBS)中。或者，可通过将病毒在配制剂中逐步冻干的方式来制备疫苗注射剂。这种配制剂可包含适于体内给药的额外添加剂，如甘露醇，葡聚糖，糖，甘氨酸，乳糖，或聚乙烯吡硌烷酮，或其它添加剂，如抗氧化剂或惰性气体，稳定剂或重组蛋白(如人血清白蛋白)。适于冻干的含有病毒的典型配制剂包含10mM Tris-缓冲液，140mM NaCl，18.9g/l葡聚糖(MW 36000-40000)，45g/l蔗糖，0.108g/l L-谷氨酸单钾盐一水合物pH7.4。然后将玻璃安瓿密封，在介于4℃和室温之间的温度中保存数月。但是，只要不必使用，优选将安瓿保存在-20℃以下的温度中。
为了进行免疫接种或治疗，可将冻干品溶于0.1-0.5ml含水溶液(优选水、生理盐水或Tris缓冲液)中，经过系统途径或局部途径给药，即通过胃肠道外途径、肌肉途径或本领域已知的任何其它给药途径来给药。给药方式、给药剂量以及给药次数可由本领域技术人员通过已知的方式最优化。
故根据相关实施方案，本发明涉及在包括人在内的活动物体中影响(优选诱导)免疫应答的方法，该方法包括对待处理的动物或人给予本发明的表达盒、DNA、载体、药物组合物或疫苗。当疫苗是痘苗病毒、尤其是MVA时，人用疫苗注射剂的通常用量包含至少102，优选至少104，更优选至少106，还更优选107或108TCID50(组织培养感染剂量)的所述病毒。
当疫苗是重组MVA，尤其重组MVA-BN及其衍生物时，所述病毒可以用于初次-加强式给药。因此，本发明还涉及一种方法，其中载体是MVA、尤其MVA-BN及其衍生物，且所述载体或包含该载体的组合物或疫苗在第一次接种(“初次接种”)和在第二次接种(“加强接种”)中以治疗有效量对有需要的动物(包括人)给药。
本发明还涉及将编码序列导入靶细胞的方法，包括将本发明的载体、表达盒或DNA导入靶细胞。当载体是痘苗病毒、尤其是MVA如MVA-BN时，靶细胞可以是能使所述病毒在其中复制的细胞如CEF或BHK细胞，或者是被MVA感染、但不能使该病毒在其中复制的那些细胞(对MVA-BN而言，例如是所有类型的人细胞)。
本发明还涉及制备肽、蛋白和/或病毒的方法，包括用本发明病毒载体感染宿主细胞，接着在适当条件下培养已感染的宿主细胞，然后分离和/或富集由所述宿主细胞产生的肽和/或蛋白和/或病毒。当希望产生、即扩增本发明的病毒时，所述细胞必需是能使病毒在其中复制的细胞。适于痘苗病毒，尤其MVA的细胞是CEF或BHK细胞。当希望产生由本发明病毒载体编码的肽/蛋白时，所述细胞可以是被该病毒载体感染、并允许该病毒编码的蛋白/肽表达的任何细胞。
本发明还涉及制备肽、蛋白和/或病毒的方法，包括用本发明的表达盒、DNA或质粒载体转染宿主细胞，接着用痘苗病毒感染所述宿主细胞。已感染的宿主细胞在适当条件下培养。此后的步骤包括分离和/或富集由所述宿主细胞产生的肽和/或蛋白和/或病毒。用痘苗病毒感染细胞的步骤可以在转染细胞的步骤之前或之后进行。
本发明还涉及包含本发明启动子、DNA、表达盒或载体的细胞。尤其是，本发明涉及被本发明病毒载体感染的细胞。



图1由不同启动子表达后的GUS活性 细胞用MVA-BN感染，并用合适的质粒转染。48小时后，对细胞进行抽提，经酶反应产生黄色，在415nm测定消光(extinction)，从而确定GUS活性。Zex＝阴性对照(被MVA-BN感染的细胞)。
图2早期以及早期/晚期表达后的GUS活性 细胞用MVA-BN感染，并用合适的质粒转染。24小时后，对细胞进行抽提，经酶反应产生黄色，在415nm测定消光，从而确定GUS活性。Zex＝阴性对照(被MVA-BN感染的细胞)。在所述酶反应中，不具有AraC(早期+晚期)表达的样品必需保温5小时，有AraC(早期表达)的样品必需保温过夜以便出现颜色反应。
图3由不同启动子表达后的GUS活性 细胞用MVA-BN感染，并用合适的质粒转染。24小时后，对细胞进行抽提，经酶反应产生黄色，在415nm测定消光，从而确定GUS活性。对照＝阴性对照(被MVA-BN感染的细胞)。
实施例 以下实施例将进一步举例说明本发明。本领域技术人员应理解，所提供的实施例无意限制本发明技术的应用。
实施例1分析启动子对MVA-BN基因组中编码序列的表达 1.1试验目的 本试验的目的是鉴定适于在MVA基因组中表达编码序列的启动子，所述编码序列优选是与天然MVA基因组异源的序列。尤其是在将两个或更多个基因插入单个插入位点的情况中，使用不同启动子表达各个基因较有利，这样可以减少重组事件的发生，从而避免其中一种外来基因的缺失。而且，启动子最好长度不一，以便有可能根据启动子的长度，在重组MVA-BN中表达不同量的外来基因。一共分离了11种假定的启动子。将这些假定的启动子序列克隆至质粒骨架(pBSKS+)中。为了分析这些启动子的潜在活性，将它们与GUS(大肠杆菌β-葡糖醛酸酶)报告基因融合。BHK(幼年仓鼠肾)细胞用MVA-BN感染，并用含有与GUS基因融合的假定启动子的质粒转染。如果该启动子是有功能的，则GUS被表达，可以通过GUS酶反应定量。将已知特性的痘苗病毒启动子p7.5和Ps与GUS融合进行平行分析，以此作为阳性对照和参考。通过测量GUS表达，筛选这些假定启动子的活性、强度和早期/晚期表达。早期/晚期表达通过向培养基中添加AraC(阿糖胞苷)进行检测。显示出功能的启动子Ps和p7.5，本领域已知的7.5L和ATI启动子，以及新近鉴定的天然参与MVA ORF A42L，B9R，C7L，F6R，I2R，J6R的表达控制的启动子序列，都优选可以用于在重组MVA构建体(recMVA-BN)中表达外来基因。
1.2材料 细胞BHK细胞 病毒MVA-BN标准粗制原液(7.5×107TCID50) DNApAB-GUS(Ps启动子+GUS) pBNX71(pBluescript+痘苗病毒pr7.5+GUS) pBNX73(pBluescript+牛痘病毒(Cowpox virus)ATI启动子+GUS) pBN81(pBluescript+修饰的H5R启动子+GUS1) pBN61(pBluescript+MVA B1R启动子+GUS) pBN62(pBluescript+MVA B2R启动子+GUS) pBN63(pBluescript+MVA B3R启动子+GUS) pBN60(pBluescript+MVA A30R启动子+GUS) pBN82(pBluescript+痘苗病毒7.5L启动子+GUS) pBN83(pBluescript+MVA C7L启动子(SEQ ID NO5+GUS) pBNX49(pBluescript+MVA A42R启动子(SEQ ID NO1)+GUS) pBNX69(pBluescript+MVA I2R启动子(SEQ ID NO4)+GUS) pBNX72(pBluescript+MVA K5L启动子+GUS) pBNX83(pBluescript+MVA F6R启动子(SEQ ID NO3)+GUS) pBNX84(pBluescript+MVA B9R启动子(SEQ ID NO6+GUS) pBNX85(pBluescript+MVA J6R启动子(SEQ ID NO2)+GUS) 转染试剂盒Effectene transfection kit(Qiagen) 培养基和添加剂DMEM(Gibco BRL)，含10％FCS(Gibco BRL) 化学品和缓冲液裂解缓冲液(PBS+0.1％Triton+1mM蛋白酶抑制剂) AraC(Sigma，目录号C1768) GUS底物1mM(对硝基苯-β-(D)-葡糖苷酸；Sigma，目录号N1627) 终止液2.5M(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇；Sigma，目录号A 9754) 1.3方法 接种细胞 在6孔板的每一孔中接种5×105BHK细胞的转染液，细胞在DMEM/10％FCS、37℃和5％CO2中维持过夜。
感染/转染 细胞用MVA-BN(moi 0.1)-0.5ml DMEM/10％FCS/孔感染，在摇床上室温保温1h。按照厂家方案进行转染。将2μg质粒稀释在缓冲液EB中(100μl总体积)。添加3.2μl增强液，混合，室温保温5min。接着添加10μl Effectene试剂，将悬浮液混合，室温保温10min。将病毒-悬浮液从细胞中取出，添加1.6ml DMEM/10％FCS。向DNA Effectene混合物中添加0.6mlDMEM/10％FCS，再滴加在细胞上，同时旋转培养板。然后根据试验将细胞保温7，24或48小时。为了分析早期/晚期表达，在感染和转染期间向培养基中添加AraC(40μg/ml)。
收获细胞 除去培养基，给细胞添加0.5ml裂解液。室温(RT)摇动15min后，将细胞刮到裂解液中，转移到1.5ml反应管中，猛烈涡旋。将已裂解的细胞4℃ 500rcf离心1min。将澄清的上清转移到新鲜小瓶中，-20℃贮存备用。
测定GUS活性 10μl细胞提取液(＝从2×104细胞获得的蛋白)添加到1ml预保温的底物溶液(37℃)中，37℃保温直至出现黄色。接着迅速将样品至于冰上，添加0.4ml终止液。测定415nm的消光，按照GUS活性与0.05-2.0区间的消光值的线性关系换算为GUS活性。用底物溶液作参考，用已被MVA-BN感染的细胞的提取液作阴性对照。
1.4试验和结果 试验1测定假定的启动子的功能 在第一个试验中，分析所有包含与GUS基因融合的假定的MVA启动子或已知特性的启动子的质粒。细胞用MVA-BN(moi 0.1)感染，并用相应质粒转染。48小时后收获细胞，裂解细胞，并测定GUS活性。该试验目的是确定启动子是否有功能。结果见图1。
阴性对照(被MVA-BN感染的细胞的提取物)明显显示无GUS活性(Zex；消光值0.001)。已知特性的合成性强效Ps启动子显示非常有效(Ps；消光值0.87)，48小时的表达后可以检测到高水平的GUS。已知的痘苗病毒天然pr7.5启动子也显示很高的活性(p7.5；消光值0.41)。pr7.5的晚期部分(7.5L；消光值0.25)显示明显可以检测到的活性。牛痘病毒ATI启动子明显显示对于由MVA-BN表达外来基因非常有效(ATI；消光值0.76)。至于MVA-BN基因组的假定启动子区域，结果显示，A42R(A42；消光值0.48)，B9R(B9；消光值0.06)，C7L(C7；消光值0.055)，F6R(F6；消光值0.208)，I2R(I2；消光值0.130)和J6R(J6；消光值0.290)都是有功能的启动子。在这项初步试验中明显显示有活性的那些启动子(消光值＞0.05)将进一步进行详细鉴定(试验2)。
试验2定性启动子的表达 鉴定在试验1中显示活性的那些启动子的表达模式。为此，将已被MVA-BN感染并被相应质粒转染的细胞与AraC一起保温。AraC抑制DNA复制，而DNA复制是MVA复制周期中晚期基因表达所必需的先决条件。平行进行相同试验，但不添加AraC。24小时后收获被感染并被转染的细胞，一式三份地测定GUS活性。图2显示了每份样品的平均消光值。
在不含AraC(-AraC)的情况下保温24小时后，所有启动子都可以明显检测到总体GUS表达(早期+晚期)(图2右栏)。新鉴定的启动子的强度按照降序排列为 I2R(I2)＞A42R(A42)＞F6R(F6)＞J6R(J6)＞B9R(B9)＝C7L(C7)。
结果表明，启动子B9、C7和J6在MVA的生命周期中主要参与晚期表达，在与抑制晚期表达的AraC一起保温的条件下(+AraC)，其GUS表达水平与阴性对照(Zex)的相当。尽管C7L启动子看起来较弱，但数个迹象表明，它在早期表达期间发挥重要作用。
结果还清楚表明，启动子A42R、I2R和F6R有非常有效的早期表达。测定早期表达时，样品必需保温过夜，以便出现可以检测到的颜色反应。这些结果不能与早期+晚期表达的值(图2-AraC)进行直接比较，因为它们仅保温5小时。对于显示早期表达的那些启动子，在表达7小时后，再进行分析，24小时后的结果可以确认(数据未显示)。
1.5结论 上述结果清楚表明，可以获得不同长度的启动子，并且现已有一组不同的启动子，它们因保温时间长短不同以及MVA-BN复制可能性不同而显示不同的表达模式。当优选早期+晚期表达时，优选使用启动子A42R、I2R和F6R。当必需避免早期表达时(例如外来基因包含早期表达的终止信号TTTTTNT时)，优选使用B9R、J6R或C7L。
实施例2分析衍生自SEQ ID NO1-4的最小启动子元件 在实施例1中，鉴定出数种特别适于在MVA基因组中表达外来基因的序列。为了检查更短的片段是否也能实现相同目的，进行另外的试验。经PCR分离SEQ ID NO 1-4的更短片段，将它们克隆到质粒骨架(pBSKS+)中。一共测试了6种假定的最小启动子。为了分析这些启动子的潜在活性，将它们与GUS报告基因融合。BHK细胞用MVA-BN感染，并用含有与GUS基因融合的假定启动子的质粒转染。通过测量GUS表达，筛选这些假定启动子的活性和表达强度(见实施例1)。将已知特性的痘苗病毒启动子Ps与GUS融合进行平行分析，以此作为阳性对照和参考。约30bp的最小启动子元件可以用于在重组MVA构建体(recMVA-BN)中表达外来基因、且无起始同源序列与另外克隆的启动子之间同源重组的危险。
2.1材料和方法 如无另外说明，实施例2中使用的材料和方法与实施例1的相同。PCR按照标准技术进行。
2.2试验和结果 通过PCR将启动子与GUS基因融合 通过PCR反应使以下最小启动子序列与GUS基因融合 SEQ ID NO7(“A42短晚期(short late)”) TCTTATTAAAAAACATATATAATAAATAACA SEQ ID NO8(“J6R短晚期”) GATAAAAATTTAAAGTGTAAATTAACTAT SEQ ID NO9(“F6R短早期(short early)) AGAGTGTAGTATCATAGATAACTCTCTTCTATAAAAT SEQ ID NO10(“F6R短晚期”) ATTGTTAAATAAATAATGGATAGTATAAAT SEQ ID NO11(“I2R短早期”) AGTAAAAAATATGTTAGGTTTACAAAA SEQ ID NO12(“I2R短晚期”) ATTTATTTTCAGTTTTATTATACGCATAAAT 将所有与GUS基因融合的最小假定启动子克隆到pBSKS+中并测序。
测定假定的最小启动子的功能 为了分析假定的最小启动子元件的功能，BHK细胞用MVA-BN(moi1.0)感染，并用相应质粒转染。24小时后收获细胞，将细胞裂解，测定GUS活性(图3)。
阴性对照(来自已被MVA-BN感染的细胞的提取物)明显显示无GUS活性(对照；平均消光值0.00167)。已知特性的合成性强效Ps启动子显示非常有效(Ps；平均消光值2.05267)，24小时的表达后可以检测到高水平的GUS。至于假定的MVA-BN基因组最小启动子元件，结果显示，F6R短早期、F6R短晚期、I2R短早期、I2R短晚期、A42R短晚期和J6R短晚期都是有功能的启动子。
一共分离了6种功能性最小启动子元件。其中，2种适于较弱的早期转录(I2R短早期平均消光值0.06933；F6R短早期平均消光值0.189)，4种适于不同水平的晚期表达(F6R短晚期平均消光值0.09833；I2R短晚期平均消光值0.391；J6R短晚期平均消光值0.80167 and A42R短晚期平均消光值2.07)。
2.3结论 上述结果清楚表明，可以分离到不同长度的启动子，并且现已有一组不同的启动子。当优选早期表达时，优选使用最小启动子F6R短早期或I2R短早期。当优选晚期表达且必需避免早期表达时(例如外来基因包含早期表达的终止信号TTTTTNT时)，优选使用最小启动子元件F6R短晚期、I2R短晚期、J6R短晚期和A42R短晚期。
关于微生物保藏的说明 (细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 关于微生物保藏的说明 (细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 关于微生物保藏的说明 (细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 关于微生物保藏的说明 (细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 公共健康实验室服务部 应用微生物学和研究中心 本文件在此证明，根据1977年的布达佩斯条约，病毒株(保藏号V94012707)已于1994年01月27日被欧洲动物细胞培养物保藏中心接受为专利保藏。Dr.Alan Doyle，Curator. 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏 国际局表格 收件人 Prof Dr Dr h.c.mult保藏证明 Anton Mayr由本页底部所指明的国际保藏 Bockmeyrstrasse 9单位根据细则7.1对初始保藏 80992Munchen 物出具 Germany 保藏人的姓名和地址
1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
BP/4表(只此一页)布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏 国际局表格 收件人 存活证明 ProfDr Dr h.c.mult Anton Mayr 由下一页所指明的国际保藏单 Bockmeyrstrasse 9 位根据细则10.2出具 80992Munchen Germany 应接到此存活证明的单位的名称和地址
1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
BP/4表(第1页) 4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
关于微生物保藏的说明 (细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 应用微生物学和研究中心 以及 欧洲细胞培养物保藏中心 本文件在此证明，根据1977年的布达佩斯条约，病毒株(保藏号V00120707)已于2000年12月7日被欧洲细胞培养物保藏中心接受为专利保藏。Dr.P J Packer质量经理，ECACC 附录3 第14页 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格 收件人 BAVARIAN NORDIC RESEARCH INSTITUTE GMBH FRAUNHOFERSTRASSE 18B D-82152 MARTINSRIED GERMANY 保藏人的姓名和地址
1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
BP/4表(只此一页)附录3第24页 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏 国际局表格 收件人存活证明 BAVARIA NNORDIC RESEARCH由下一页所指明的国际保藏单 INSTITUTE GMBH 位根据细则10.2出具 FRAUNHOFERSTRASSE 18B D-82152 MARTINSRIED GERMANY 应接到此存活证明的单位的名称和地址
1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
BP/4表(第1页) 附录3 第25页 4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。分析试验的证书 产物描述 MVA-575 保藏号00120707 试验描述确定病毒的致细胞病变滴度TCID50。(SOP ECACC/055)细胞 接受标准/说明/标准阴性对照应显示没有致细胞病变效应的迹象。将检验样品进行系列稀释，然后添加到含有指示细胞系的孔中，每一稀释度有4个孔。致细胞病变效应指示病毒的存在。病毒滴度用下式计算，其中x是从标准TCID50表得到的值，它是每一稀释度展示少于4个阳性孔的那些孔的分布结果，y是4个孔都为阳性的最高稀释度。
日期 19/01/01 结果 指示细胞系 BHK 21克隆13 阴性对照 无CPE 检验样品 CPE 少于4个阳性孔的分布 4，4，0 X0.50 Y10-5 总体结果存在病毒 试验描述对在支原体猪血清琼脂和支原体马血清肉汤中分离的支原体进行检测。
SOP QC/MYCO/01/02 接受标准/说明所有阳性对照(肺炎支原体(M.pneumoniae)和口腔支原体(M.orale))必须显示支原体迹象，为在琼脂板上形成典型的集落。将培养物在支原体猪血清琼脂板上进一步培养，以便评估由典型集落的形成指示的支原体迹象。所有阴性对照必须无微生物生长迹象。
阳性检验结果的标准是，在琼脂板上形成典型集落所指示的支原体迹象。阴性结果将显示无此迹象。
试验号21702 日期12/02/01 结果阳性对照阳性 阴性对照阴性 检验结果阴性 总体结果通过 批准人＿＿＿＿＿ECACC质量主管 日期＿＿＿＿＿ 分析试验的证书 产物描述 MVA-575 保藏号00120707 试验描述使用Vero指示细胞系和Hoechst 33258荧光检测系统检测支原体SOP QC/MYCO/07/05 接受标准/说明阴性对照中，Vero细胞可以清楚地观察到荧光核而细胞质无荧光。阳性对照(口腔支原体(M.orale))中必须显示支原体的迹象，即荧光核以及额外的支原体DNA的核荧光。阳性检验结果表现为额外的支原体DNA核荧光。阴性结果显示无细胞质荧光。
试验号21702 日期12/02/01 结果 阳性对照阳性 阴性对照阴性 检验结果阴性 总体结果通过 试验描述对在Tryptone Soya Broth(TSB)上和在流质巯基乙酸培养基(FTGM)中分离的细菌和真菌进行检测。SOP QC/BF/01/02 接受标准/说明所有阳性对照(枯草牙孢杆菌(Bacillis subtilus)，生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)和白色念珠菌(Candida albicans))显示微生物生长迹象(混浊)，而阴性对照不显示微生物生长迹象(清亮)。
阳性检验的标准是，在任一种试验培养基中混浊。阴性检验结果必须是在所有培养基中清亮。
试验号21702 日期12/02/01 结果 阳性对照阳性 阴性对照阴性 检验结果阴性 总体结果通过 批准人＿＿＿＿＿ECACC质量主管 日期＿＿＿＿＿＿ 仅供ECACC填写 ECACC 保藏号 保藏人编码 专利保藏登录表格—病毒 保藏人信息 保藏人/公司/机构名称 Bavarian Nordic Research Institute GmbH (这将是证明书上出现的名称) 联系人名称 Dr.Paul M.Howley，Dr.Petre Pielken 保藏人地址 Fraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany 电话++49 89 8565 0030 传真++49 89 8565 1333 必须附带的生物危害声明 该保藏根据1977年布达佩斯条约的条款进行。我同意遵守关于向ECACC保藏细胞系的条件和规则。

寄送发票的地址(如果与上述不同) Accounts Department Bavarian Nordic Research Institute GmbH Fraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany 病毒信息 全称 改良安卡拉痘苗病毒 简称 MVA 安瓿瓶标识＿＿＿＿＿＿＿＿ 菌株 第575号 血清型＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 正常宿主 无 保藏的病毒的滴度＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 病毒增殖 宿主细胞(首选)鸡胚成纤维细胞(CEF) 可选宿主细胞＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 宿主细胞生长的详细资料(例如培养基、温度、接种密度、生长因子等) 鸡胚成纤维细胞于37℃、5％CO2在添加了10％FCS的RPMI培养基中进行培养。不需生长因子。
病毒生长的详细资料(例如宿主细胞汇合、共培养、moi、效应、耗时) 在接近细胞汇合(约90％)时以MOI0，1 TCID50/细胞汇合感染CEF细胞在37℃、5％CO2中的感染时间平均为3天 病毒储藏 储藏的材料(例如上清液、被感染的细胞的提取物、被感染的活细胞等) 温度和条件被感染的细胞的提取物，-80℃ 病毒分析 方法(如果需要可写明)不形成噬菌斑。在CEF单层上形成CPE灶。用TCID50法滴定。
参考文献(如果有) Ingo Drexler et al.2000，Methods in Molecular Medicine vol 35Gene Therapy，Methods and Protocol.s Ed.W.Walther andU.Stein.Human Press 其他相关信息 在低pH时病毒释放活力。用无菌IMM Tris-HCl pH9缓冲液稀释病毒。
CAMR 欧洲细胞培养物保藏中心，应用微生物学和研究中心 Salisbury，Wiltshir SP4 OJG，UK 电话+44 1980 612512 传真+44 1980 611315 Emailecacc@camr.org.uk网址ecacc.camr.org.uk 仅供ECACC填写 ECACC保藏号 保藏人编码 生物危害声明 (所有保藏物都需包含在本声明) 保藏物类别 细胞培养物□ 植物培养物□ 病毒重组DNA□ DNA探针□ 细菌□ 上述保藏物是否表现感染性、毒性或过敏性危害？ 是□ 否
如果是，请给出详细说明及相关的危害类别(例如ACDP类别)并向ECACC PRIOR发传真以便航运细胞。
MVA被ZKBS归类为生物安全1级(S1) 档案号6790-10-14 日期1997年5月 上述保藏物是否包含可遗传操作的物质？ 是□ 否
如果是，请写出普通的描述并回答下列问题 a.该物质是 DNA□ RNA□ b.该物质是否存在于宿主生物中？ 是□ 否□ c.该遗传物质是否容易转移给环境生物？ 是□ 否□ d.该遗传物质是否易被表达为蛋白质？ 是□ 否□ e.这一物质按照ACGM规定属于什么类别？ 即，i防范级别＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ ii.GMO类型＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 对于问题b-d为肯定回答时请给出详细说明 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 对于将在ECACC进行保藏的物质，请提供与评估其安全操作条件有关的进一步详细说明 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
姓名打印 Dr.Petra Pielken 请注意，本身是动物病原体或包含动物病原体的保藏物需要EC的入境许可。请留出8周时间，以便尽快递交ECACC许可证申请所要求的信息。
CAMR 欧洲细胞培养物保藏中心，应用微生物学和研究中心 Salisbury，Wiltshir SP4 OJG，UK 电话+44 1980 612512 传真+44 1980 611315 Emailecacc@camr.org.uk 网址ecacc.camr.org.uk 关于微生物保藏的说明 (细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月) 应用微生物学和研究中心 以及 欧洲细胞培养物保藏中心 本文件在此证明，根据1977年的布达佩斯条约，病毒株(保藏号V00083008)已于2000年8月30日被欧洲细胞培养物保藏中心接受为专利保藏。Dr.P J Packer质量经理，ECACC BP/4表格(第1页)附录3第25页 4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。 附录3 第24页 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏 国际局表格 收件人存活证明 BAVARIAN NORDIC RESEARCH由下一页所指明的国际保 INSTITUTE GMBH 藏单位根据细则10.2出具 FRAUNHOFERSTRASSE 18B D-82152 MARTINSRIED Germany 应接到此存活证明的 单位的名称和地址
1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
附录3 第14页 布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏 国际局表格 收件人 BAVARIAN NORDIC RESEARCH INSTITUTE GMBH FRAUNHOFERSTRASSE 18B D-82152 MARTINSRIED GERMANY 保藏人的姓名和地址
1当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
BP/4表(只此一页) 分析试验的证书 产物描述 MVA-BN 保藏号00083008 试验描述对在支原体猪血清琼脂和支原体马血清肉汤中分离的支原体进行检测。 SOP QC/MYCO/01/02 接受标准/说明所有阳性对照(肺炎支原体(M.pneumoniae)和口腔支原体(M.orale))必须显示支原体迹象，为在琼脂板上形成典型的集落。将培养物在支原体猪血清琼脂板上进一步培养，以便评估由典型集落的形成指示的支原体迹象。所有阴性对照必须无微生物生长迹象。
阳性检验结果的标准是，在琼脂板上形成典型集落所指示的支原体迹象。阴性结果将显示无此迹象。
试验号21487 日期27/11/00 结果阳性对照阳性 阴性对照阴性 检验结果阴性 总体结果通过 试验描述使用Vero指示细胞系和Hoechst 33258荧光检测系统检测支原体 SOP QC/MYCO/07/05 接受标准/说明阴性对照中，Vero细胞可以清楚地观察到荧光核而细胞质无荧光。阳性对照(口腔支原体(M.orale))中必须显示支原体的迹象，即荧光核以及外加的支原体DNA的核荧光。阳性检验结果表现为外加的支原体DNA核荧光。阴性结果显示无细胞质荧光。
试验号21487 日期27/11/00 结果 阳性对照阳性 阴性对照阴性 检验结果阴性 总体结果通过 批准人＿＿＿＿ECACC质量主管 日期＿＿＿＿＿ 分析试验的证书 产物描述 MVA-BN 保藏号00083008 试验描述对在Tryptone Soya Broth(TSB)上和在流质巯基乙酸培养基(FTGM)中分离的细菌和真菌进行检测。SOP QC/BF/01/02 接受标准/说明所有阳性对照(枯草牙孢杆菌(Bacillis subtilus)，生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)和白色念珠菌(Candida albicans))显示微生物生长迹象(混浊)，而阴性对照不显示微生物生长迹象(清亮)。
阳性检验的标准是，在任一种试验培养基中混浊。阴性检验结果必须是在所有培养基中清亮。
试验号21487 日期27/11/00 结果 阳性对照阳性 阴性对照阴性 检验结果阴性 总体结果通过 试验描述确定病毒的致细胞病变滴度TCID50。(SOP ECACC/055)细胞 接受标准/说明/标准阴性对照应显示没有致细胞病变效应的迹象。将检验样品进行系列稀释，然后添加到含有指示细胞系的孔中，每一稀释度有4个孔。致细胞病变效应指示病毒的存在。病毒滴度用下式计算，其中x是从标准TCID50表得到的值，它是每一稀释度展示少于4个阳性孔的那些孔的分布结果，y是4个孔都为阳性的最高稀释度。
日期 01/12/00 结果 指示细胞系BHK 21(克隆13) 阴性对照 无CPE 检验样品 CPE 少于4个阳性孔的分布 4，4，4，3，0 X 1.25 Y 10-3 总体结果存在病毒 批准人＿＿＿＿ECACC质量主管 日期＿＿＿＿仅供ECACC填写 ECACC 保藏号保藏人编码 专利保藏登录表格—病毒 保藏人信息 保藏人/公司/机构名称 Bavarian Nordic Research Institute GmbH (这将是证明书上出现的名称) 联系人名称 Dr.Paul M.Howley，Dr.Petre Pielken 保藏人地址 Fraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany 电话 ++49 89 8565 0030 传真++49 89 8565 1333 必须附带的生物危害声明 该保藏根据1977年布达佩斯条约的条款进行。我同意遵守关于向ECACC保藏细胞系的条件和规则。

寄送发票的地址(如果与上述不同) Accounts Department，Bavarian Nordic Research Institute GmbH Fraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany 病毒信息 全称 改良安卡拉痘苗病毒 简称 MVA-BN安瓿瓶标识Lot 010500 菌株 vral#3；32；51；76；82；85；84；88；98；99；106；109 正常宿主 无 保藏的病毒的滴度＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 病毒增殖 宿主细胞(首选) 鸡胚成纤维细胞(CEF) 可选宿主细胞＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 宿主细胞生长的详细资料(例如培养基、温度、接种密度、生长因子等) 鸡胚成纤维细胞干37℃、5％CO2在添加了10％FCS的RPMI培养基中进行培养。不需生长因子。
病毒生长的详细资料(例如宿主细胞汇合、共培养、moi、效应、耗时) 在接近细胞汇合(约90％)时以MOI0，1TCID50/细胞汇合感染CEF细胞；在37℃、5％CO2中的感染时间平均为3天 病毒储藏 储藏的物质(例如上清液、被感染的细胞的提取物、被感染的活细胞等) 温度和条件 被感染的细胞的提取物，-80℃ 病毒分析 方法(如果需要可写明)不形成噬菌斑。在CEF单层上形成CPE灶。用TCID50法滴定。
参考文献(如果有) Ingo Drexler et al.2000，Methods in Molecular Me dicine vol 35Gene Therapy，Methods and Protocol.s Ed.W.Walther andU.Stein.Human Press 其他相关信息 在低pH时病毒释放活力。用无菌IMM Tris-HCl pH9缓冲液稀释病毒。
CAMR 欧洲细胞培养物保藏中心，应用微生物学和研究中心 Salisbury，Wiltshir SP4 OJG，UK 电话+44 1980 612512 传真+44 1980 611315 Emailecacc@camr.org.uk网址ecacc.camr.org.uk仅供ECACC填写ECACC 保藏号保藏人编码 生物危害声明 (所有保藏物都需包含在本声明) 保藏物类别 细胞培养物□ 植物培养物□ 病毒重组DNA□ DNA探针□细菌□ 上述保藏物是否表现感染性、毒性或过敏性危害？ 是□ 否
如果是，请给出详细说明及相关的危害类别(例如ACDP类别)并向ECACC PRIOR发传真以便航运细胞。
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 上述保藏物是否包含可遗传操作的物质？ 是□ 否
如果是，请写出普通的描述并回答下列问题 a.该物质是 DNA□ RNA□ b.该物质是否存在于宿主生物中？是□ 否□ c.该遗传物质是否容易转移给环境生物？ 是□ 否□ d.该遗传物质是否易被表达为蛋白质？是□ 否□ e.这一物质按照ACGM规定属于什么类别？ 即，i防范级别＿＿＿＿＿＿＿＿＿ ii.GMO类型＿＿＿＿＿＿＿＿ 对于问题b-d为肯定回答时请给出详细说明 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ ＿＿＿＿ 对于将在ECACC进行保藏的物质，请提供与评估其安全操作条件有关的进一步详细说明 在人体和动物体内高度减毒不能复制
姓名打印 Dr.Petra Pielken 请注意，本身是动物病原体或包含动物病原体的保藏物需要EC的入境许可。请留出8周时间，以便尽快递交ECACC许可证申请所要求的信息。
CAMR 欧洲细胞培养物保藏中心，应用微生物学和研究中心 Salisbury，Wiltshir SP4 OJG，UK 电话+44 1980 612512 传真+44 1980 611315 Emailecacc@camr.org.uk网址ecacc.camr.org.uk
序列表
<110>巴法里安诺迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)
<120>用于在改良安卡拉痘苗病毒中进行表达的启动子
<130>BN54PCT
<150>DK PA200301730
<151>2003-11-24
<150>EP04000943.3
<151>2004-01-17
<160>12
<170>Patent In version 3.3
<210>1
<211>171
<212>DNA
<213>改良安卡拉痘苗病毒
<400>1
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<212>DNA
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<213>改良安卡拉痘苗病毒
<400>12
atttattttc agttttatta tacgcataaa t 3权利要求
1.启动子，含有选自下组的核苷酸序列，或由所述序列组成
(i)核苷酸序列SEQ ID NO1-6之一，
(ii)SEQ IDNo.1-6之一的亚序列，和
(iii)相对于(i)或(ii)所述序列具有一或多个核苷酸取代、缺失和/或插入的序列，
其中所述启动子可以作为痘苗病毒启动子发挥作用和/或可以在被痘苗病毒感染的细胞中发挥作用。
2.权利要求1的启动子，其中所述亚序列选自SEQ ID7-12。
3.表达盒，包含编码序列和权利要求1或2的启动子，所述编码序列的表达受所述启动子控制，且所述表达盒并非痘苗病毒基因组中天然的表达盒。
4.权利要求3的表达盒，其中所述编码序列编码治疗性蛋白或肽，抗原，抗原表位，反义RNA或核酶。
5.DNA，含有权利要求1或2的启动子或者含有权利要求3或4的表达盒。
6.载体，含有权利要求1或2的启动子或者含有权利要求3或4的表达盒。
7.权利要求6的载体，选自质粒载体和病毒载体。
8.权利要求7的载体，所述病毒载体是痘苗病毒。
9.权利要求8的载体，所述痘苗病毒是改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，优选在欧州细胞培养物保藏中心(ECACC)以保藏号V00083008保藏的病毒株MVA-BN或其衍生物，以保藏号ECACC VA94012707保藏的病毒株MVA572，或以保藏号ECACC V00120707保藏的病毒株MVA 575。
10.权利要求9的载体，其中权利要求1或2的启动子或者权利要求3或4的表达盒插入在MVA基因组的天然缺失位点中。
11.权利要求9的载体，其中权利要求1或2的启动子或者权利要求3或4的表达盒插入在病毒基因组的非必需部分或者基因间区域中。
12.权利要求6-11之一的载体，作为疫苗或药物。
13.疫苗或药物组合物，含有权利要求3或4的表达盒，权利要求5的DNA，或权利要求6-11之一的载体。
14.权利要求13的疫苗或药物组合物，包含至少102TCID50(组织培养感染剂量)的权利要求8-11之一所述病毒载体。
15.权利要求14的疫苗或药物组合物，所述病毒载体在第一次接种(“初次接种”)和第二次接种(“加强接种”)中以治疗有效量施用。
16.权利要求3或4的表达盒，权利要求5的DNA，或权利要求6-11之一的载体在制备疫苗或药物中的用途。
17.将编码序列引入靶细胞的方法，包括将权利要求6-11之一的载体，权利要求3或4的表达盒，或权利要求5的DNA引入所述靶细胞。
18.制备肽、蛋白和/或病毒的方法，包括用权利要求7-11之一的病毒载体感染宿主细胞，在合适的条件下培养被感染的宿主细胞，以及分离和/或富集所述宿主细胞所产生的肽和/或蛋白和/或病毒。
19.制备肽、蛋白和/或病毒的方法，包括用权利要求3或4的表达盒、权利要求5的DNA、或权利要求7的质粒转染细胞，用痘苗病毒感染所述细胞，在合适的条件下培养被感染的宿主细胞，以及分离和/或富集由所述宿主细胞产生的肽和/或蛋白和/或病毒，其中用痘苗病毒感染细胞的步骤可以在细胞转染步骤之前或之后进行。
20.细胞，含有权利要求1或2的启动子，权利要求3或4的表达盒，权利要求5的DNA，或权利要求7-11之一的病毒载体。
21.权利要求1或2的启动子用于表达编码序列的用途，其中所述编码序列并非在痘苗病毒中与所述启动子天然连接的序列。
22.制备权利要求6-11之一的载体的方法，包括将权利要求3或4的表达盒插入该载体基因组中的步骤。
全文摘要
本发明涉及启动子，尤其是用于在痘苗病毒如改良安卡拉痘苗病毒(MVA)中表达基因和/或编码序列的启动子。本发明还涉及包含该启动子的表达盒，含有该表达盒的载体，以及药物组合物和疫苗。
文档编号C07K14/07GK1898390SQ200480034748
公开日2007年1月17日 申请日期2004年10月27日 优先权日2003年11月24日
发明者桑贾·莱勒 申请人:巴法里安诺迪克有限公司