Hiv药物疫苗的制作方法

专利名称：Hiv药物疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含HIV抗原的多肽，尤其涉及包含突变的HIV序列的多肽，该突变序列保留了它们天然的CD8+表位。而且本发明涉及引入了附加的辅助T细胞表位的突变HIV序列。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种致病病毒，可以导致虚弱和致死的免疫缺陷，例如，艾滋病。尽管有一些可以延长预期寿命，增加感染个体的生命质量的疗法，例如对于艾滋病，但是此疾病通常是致命的。
消灭或者控制HIV感染病人体内的病毒是一个难题。
预防HIV感染是一个难题，迄今大部分仍无法为社会所解决，例如限制性行为和/或者加强皮下注射针的使用者采用灭菌操作。
药物预防HIV感染仍然是一个先进的研究领域。需要有效的HIV免疫对策被发现。
即使产生了针对HIV病毒粒子某些单元的免疫反应，但仍然存在一些可改善免疫反应的问题，包括优势免疫，病毒逃逸和病毒蛋白的递呈。显然，HIV病毒粒子应用于疫苗是非常危险的。此外，如果与天然蛋白相同的蛋白具有不良的效果，那么它们的应用本身也是有问题的。而且，这些蛋白本身具有免疫抑制性和/或者缺乏足够的CD8+T细胞表位，不能引起合适的强或广的免疫反应。
由CD8+T细胞的突变，尤其是优势免疫的CD8+T细胞表位的突变能引起病毒逃逸，病毒逃逸是病毒免疫中的一个重要难题。当前的疫苗不能够募集辅助T细胞，因此产生的免疫反应范围窄和/或者弱。天然的病毒序列受体内进化压力影响也许含相对较少的免疫显著表位。此外，优势免疫效应能够改变某些CD8+T细胞表位的临床价值，使免疫反应集中于这些表位。很明显地，这足以强调优势免疫的问题，例如导致在该表位突变的病毒系的亚选择，可以导致潜在的致死的病毒逃逸(例如，见Barouch et al.2002 Nature415 p.335)。
申请WO02/32943(Nabel and Huang)揭示HIV基因ENV，GAG和POL的修饰能够增强基因免疫的免疫原性。尤其是，这些修饰集中在ENV的糖基化，集中在编码delta CFI HIV ENV的核酸构建体。此外，ENV切割位点和融合区的特异性缺失，及7个重复基因1和2的间隔也被揭示。还描述了用编码GAG或编码GAG-POL的DNA质粒进行免疫，用GAG-POL质粒免疫的效果最好。申请WO02/32943的大部分内容是关于揭示列于表1和WO02/32943的权利要求的特定质粒。还要求保护这些质粒不同部分的类似物，及至少95％的序列一致性的片段。为了破坏Nef的功能，例如申请WO02/32943中限制I类主要组织相容性复合物(MHC)和/或CD4的表达，在HIV-1PV22的nef基因中引入点突变。PV22与HXB2参考序列(见实施例8)在突变位点上一致。因此可以看出申请WO02/32943中的突变破坏了天然表位。例如，在构建VRC4301中Nef多肽的氨基酸替代物为P69A、P72A、P75A、P78A、D174A和D175A。在这6个突变中每一个均位于实施例8中的一个特定表位，因此在修饰的Nef基因中没有保留天然表位。构建VRC4306、VRC4309、VRC4310、VRC4311、VRC4312和申请WO02/32943中的相似构建中，逆转录酶突变(D771H)存在于YMDD基序中(见表位图RT 183-186)，此基序含有许多记录表位。因此在现有技术中的构建体中没有保留这些表位。此外，通过如VRC 4312和相似构建体中所描述的截短融合，产生了申请WO02/32943中所揭示的合成的gag/pol/nef基因。参照VRC4312，合成的gag基因与编码合成nef基因的序列连接，其5’端51个氨基酸缺失；pol多聚蛋白5’端77个氨基酸缺失，然后与缺失tag终止密码子的nef的3’端连接。这些pol和nef的截短引起表位缺失，因此天然表位没有以全长gag/pol/nef基因的形式保留。
申请WO02/022080(Merckand Co.)揭示了HIV1-Gag、Pol和Nef的修饰。其中描述的主要修饰是gag基因、Pol和Nef的密码子优化。没有提到Gag多肽的突变，只是编码的核苷酸密码子进行了优化。申请WO02/022080中的实施例17提出了蛋白Pol的不同突变；提出了9个点突变，其中有3个突变分别位于此蛋白的逆转录酶、RNA酶和整合酶区。至少HIV-1 Pol的突变D112A，D187A，D188A，D445A和D500A位于人的表位中，因此没有保留天然表位。至少FHV-1和IRV-1中Nef的突变‘LLAA’(例如L164A，、L165A双突变)位于人的表位中，因此在突变的Nef多肽中没有保留天然表位。
申请WO03/025003揭示了不同改变的gag基因构建体，也提到了nef基因和pol的构建体。nef基因构建体是从nef的N端截短去除了表位。gag基因构建体没有被突变。
本发明找到了解决上述讨论的一些问题的方法。
发明概述本发明是基于HIV来源的CD8+T细胞表位的显著有效递呈的设计而完成。该方式能够产生最强和最广的免疫反应。
本发明通过改变含有表位的多肽序列来实现。这样可以破坏病毒多肽的天然生物学功能，而有利于使它们安全应用于疫苗，同时谨慎地保留了现有技术已知将被破坏的天然表位。
本发明中，将补充的(例如，非天然的)辅助T细胞表位也引入到抗原多肽中，从而更有利地增强和扩大免疫反应。
因此，一方面本发明提供了一种重组多肽，其包含的氨基酸序列来源于下面其中至少一种(i)HIV gag基因产物；(ii)HIV基因pol产物；或者(iii)HIVnef基因产物，其中氨基酸序列与上述基因产物的天然序列相比较被突变并且基本上保留了如详述于实施例8所示的p17和p24(gag)、RT(pol)的氨基酸1-440和nef的基因产物的相应部分的全部天然CD8+T细胞表位。
另一方面，本发明涉及一种如上面所述的重组多肽，其包含来源于(i)、(ii)和(iii)中至少两种的氨基酸序列。当多肽仅包含来源于(i)、(ii)和(iii)中两种的氨基酸序列时，优选地来源于(i)和(iii)，即gag和nef。
另一方面，本发明涉及一种如上面所述的重组多肽，其包含来源于(i)、(ii)和(iii)的氨基酸序列。
优选地，重组多肽包含的(i)、(ii)和(iii)来源的每个序列与该基因产物的天然序列相比较都产生了突变。优选每个序列基本上保留了全部天然CD8+T细胞表位，更优选的是保留了所有的所述表位。
另一方面，本发明涉及如上面所述的一种重组多肽，其中来源于(i)和/或(ii)和/或(iii)的氨基酸序列从多肽的N端到C端以(i)-(ii)-(iii)的顺序排列。
另一方面，本发明涉及一种重组多肽，其包含的氨基酸序列来源于(i)HIV gag基因的产物；(ii)HIV pol基因的产物；和(iii)HIV nef基因的产物，其中氨基酸序列与该基因产物的天然序列相比较被突变并且基本上保留了如详述于实施例8所示的p17和p24(gag)、RT(pol)的氨基酸1-440和nef的所述基因产物的全部天然CD8+T细胞表位，该多肽所含的氨基酸序列与SEQ ID NO9至少有75％的一致性。优选地，该多肽所含的氨基酸序列与SEQ ID NO9至少有95％的一致性。
另一方面，序列一致性是指表位间的序列的一致性。这就是说表位与天然序列或参考序列的表位具有100％的序列相同，而所引用的序列一致性是针对序列中其余的非表位区，也就是说它是针对表位间的区域而言。优选地，目前所有的表位间区域的一致性是可以计算的。优选地，“表位”是指表位已被作图的线性氨基酸序列，优选关于实施例8中已被作图的表位。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其包含SEQ ID NO9，或者与其至少有95％一致性的序列。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其进一步包含一个抗体识别标签。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其中所述标签是一个含SEQ ID NO8中所示序列的HA标签。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其进一步包含一个CD8+T细胞表位的标签。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其中所述标签是一个gp160来源的标签，其包含SEQ ID NO7所示的序列。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，该多肽所包含如SEQID NO1所示的序列。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，该多肽包含来源于HIVnef基因产物的氨基酸序列，所述重组多肽序列被突变以破坏nef序列的功能，所述nef序列进一步包含一个或多个天然nef基因中并不存在的辅助T细胞表位。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其包含一个或多个辅助T细胞表位，这些表位在天然nef序列中并不存在，所述表位在图3A显示。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其进一步包含如实施例8中的基本上全部的天然nefCD8+T细胞表位。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其进一步包含如详述于实施例8中的基本上全部的天然nef辅助T细胞表位。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO6所示的序列，或者与其至少有95％的一致性的序列。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，该多肽包含来源于HIVpol基因产物的氨基酸序列，该重组多肽序列被突变以破坏pol序列的逆转录酶活性，其中所述重组多肽中基本上保留了如详述于实施例8所示的RT(pol)的氨基酸1-440的天然pol序列的全部CD8+T细胞表位。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其中pol序列的逆转录酶活性通过天然pol基因核心区来源的内部序列的重复及所述pol序列的氨基端和羧基端的交换被突变。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其中该重复的内部序列包含TPDKKHQKEPPF(SEQ ID NO4)。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其中该多肽包含如SEQ ID NO12所示的序列，或者与其至少有95％的一致性的序列。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，该多肽包含来源于HIVgag基因产物的氨基酸序列，该重组多肽序列被突变以破坏gag基因产物的加工，该gag序列进一步包含一个被破坏的豆蔻酰化位点，其中在所述重组多肽中基本上保留了如详述于实施例8所示的p17和p24(gag)的天然gag序列的全部CD8+T细胞表位。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其中通过p17和p24功能域(domains)的交换来破坏gag的加工，通过将第二个甘氨酸突变成丙氨酸来破坏豆蔻酰化位点。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO13所示的序列，或者与其至少有95％的一致性的序列。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种重组多肽，其中HIV是HIV分化体B(clade B)。
另一方面，本发明涉及编码上述多肽的重组核酸。
另一方面，本发明涉及一种重组核酸序列，其包含SEQ ID NO11，或者与其遗传密码不同的仅在于沉默突变的序列，或者与其至少有95％的一致性的序列。
另一方面，本发明涉及编码上述多肽的一种病毒载体。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种病毒载体，其中所述病毒载体是MVA或来源于MVA的载体。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种病毒载体，其中所述载体是禽痘或来源于禽痘的载体。
另一方面，本发明涉及如上所述的一种病毒载体，其中所述载体是FP9禽痘载体。关于这个载体的详细说明可以从申请WO03/047617中获得，将其作为参考并入本文。
另一方面，本发明涉及上述多肽在药物中的应用。
另一方面，本发明涉及上述多肽在制备治疗或预防HIV感染的药物中的应用。
另一方面，本发明涉及上述多肽在制备抗HIV感染免疫药物中的应用。
另一方面，本发明涉及上述核酸在药物中的应用。
另一方面，本发明涉及上述核酸在制备治疗或预防HIV感染的药物中的应用。
另一方面，本发明涉及上述核酸在制备抗HIV感染免疫药物中的应用。
另一方面，本发明涉及一种免疫受试者获得抵抗HIV感染的方法，其包括给受试者施用上述多肽或核酸。
另一方面，本发明涉及上述多肽或核酸在基础-加强(prime-boost)免疫方案中作为引发剂(primingagent)或者加强剂(boostingagent)的应用。基础加强免疫是公知的技术，其详细说明可以从WO98/056919获得，同时将其作为参考合并入本文。
另一方面，本发明涉及上述多肽或核酸在诱导免疫反应中的应用。该免疫反应可以是例如细胞免疫反应如CD8+或CD4+反应，或者体液(抗体)反应。而且本发明提供了在受试者中引发免疫反应的方法，其包括给需要治疗的受试者施用本文所述的多肽、核酸或载体。
另一方面，本发明涉及一种核酸载体，其包含上述核酸序列或者编码上述多肽的核酸序列。
另一方面，本发明涉及腺病毒载体，其包含上述核酸序列或编码上述多肽的核酸序列。
另一方面，本发明涉及包含上述核酸序列或者编码上述多肽的核酸序列的载体，该载体是基于水泡性口炎病毒(VSV)，腺伴随病毒(AAV)，α病毒，仙台病毒或单纯疱疹病毒。
另一方面，本发明涉及包含上述核酸序列或者编码上述多肽的核酸序列的痘病毒载体。
另一方面，本发明涉及一种质粒，其选自p29D.gpn，pOPK6.gpn和pSG2.gpn。
发明详述定义本文使用的术语“腺病毒”包括腺病毒科(Adenoviridae)的多个成员。该科依次包含三个属哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，禽类腺病毒属(Aviadenovirus)和鸟类腺病毒属(ATadenovirus)。本发明尤其考虑采用绵羊的腺病毒(ovine adenovirus)(一种鸟类腺病毒属)。
“CD8+T细胞表位”是指一段氨基酸序列，它是可以被通常与I类主要组织相容性复合物相结合的CD8+T细胞所识别的肽。尤其是，所述的“所有”CD8+T细胞表位和/或“所有已知的”CD8+T细胞表位是指目前已知的表位，如在例8、HIV分子免疫2002通过蛋白绘制细胞毒性T淋巴细胞的表位位置图；理论生物学和生物物理学，Los Alamos国家实验室，2003年8月7日(HIV Molecular Immunology 2002Maps of CTL Epitope LocationsPlotted by Protein；Theoretical Biology & Biophysics，Los Alamos NationalLaboratory，Agust 7，2003)中详细说明的表位。根据本发明，在修饰的多肽中保留了基本上所有的人的CD8+T细胞表位；然而，其它哺乳动物种相关的CD8+T细胞表位，例如鼠的CD8+T细胞表位则可能被缺失。CD8+T细胞与CTLs(细胞毒性T淋巴细胞)同义。
同样，“辅助T细胞表位”也是指一种可被通常与II类主要组织相容性复合物相结合的辅助T细胞所识别的肽；“所有的”和/或“所有已知的”辅助T细胞表位如在实施例8、HIV分子免疫2002通过蛋白绘制细胞毒性T淋巴细胞的表位位置图；理论生物学和生物物理学，LosAlamos国家实验室，2003年8月7日(HIV Molecular Immunology 2002Maps of CTL EpitopeLocations Plotted by Protein；Theoretical Biology & Biophysics，Los AlamosNational Laboratory，Agust 7，2003)中详细说明的表位。根据本发明，在修饰的多肽中保留了基本上所有的人的辅助T细胞表位；然而，其它哺乳动物种相关的辅助T细胞表位，例如鼠的辅助T细胞表位则可能被缺失。辅助T细胞与T辅助细胞同义。“基本上所有”是指至少99％；优选地，它是指至少98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％或者85％。在一个选择性的实施方案中，“基本上所有”是指除一个以外的全部，除两个以外的全部，除三个以外的全部，除四个以外的全部，除五个以外的全部，除六个以外的全部，除七个以外的全部，除八个以外的全部，除九个以外的全部，除十个以外的全部，除十一个以外的全部，除十二个以外的全部，除十三个以外的全部，除十四个以外的全部，除十五个以外的全部。
如果被作图的肽序列发生突变，例如参考实施例8，那么表位被认为“缺失”或者“破坏”或者“没有保留”。优选地，保留所有的表位，参见实施例8所示。
本文所用的“天然”序列或“参考”序列是指原始序列，要求保护的多肽或核酸序列是根据此原始序列所设计或来源于此原始序列。无论何处此术语都应当采用其通常的意思，就是指自然界存在的病毒中的相应基因的序列。然而，在自然界没有发现单一的HIV病毒，而是存在着许多不同的分化体和在这些分化体中的许多不同的分离群或克隆体，这对本领域专业人员是显而易见的。因此，当本发明的特定序列是根据特定的克隆体或分离群而设计或衍生时，那么“天然”或“参考”序列是指该特定克隆体或分离群本身的序列。然而，在本领域已经形成了许多已知的共有序列，共有序列实际上通过许多不同的分离或克隆的序列的比较或累积有时被更新，这些分离或克隆的序列可能在一个或多个核酸或氨基酸序列位点上是趋异进化的。当本发明的构建体是根据这样的共有序列来设计或衍生时，则这些共有序列将被认为是天然或者参考序列。
优选地，本文所述的“全长”g/p/n基因产物的所有表位都被保留下来。优选地，即使包含于基因产物中的非表位区域被截短或缺失，所有所述表位仍保留下来。
天然或参考序列应该优选在逐个基因的基础上进行考虑。例如本发明的构建体应包含gag基因、nef基因和pol基因。这些基因每个均含天然或参考序列。每个基因有同样的来源，例如，同样的全部共有序列，或者每个基因的天然或参考序列有不同的来源，例如，gag和pol参考序列来源于2001分化体B(clade B)共有序列，而nef参考序列则来源于2000分化体B共有序列，反之亦然。参考序列(共有的和克隆的)可以从本文所讨论的Los Alamos数据库中找到(HIV分子免疫2002通过蛋白绘制细胞毒性T淋巴细胞的表位位置图；理论生物学和生物物理学，Los Alamos国家实验室，2003年8月7日(HIV Molecular Immunology 2002Maps of CTL Epitope Locations Plotted byProtein；Theoretical Biology & Biophysics，Los Alamos National Laboratory，August 7，2003))。2001分化体B共有序列可以在http:www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/ALIGN 02/ALIGN-INDEX.html上找到，而2000分化体B共有序列可以在http:www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/ALIGN_01/ALIGN-INDEX.html上找到。
“HIV”是人类免疫缺陷病毒，它通过侵犯体内CD4+细胞来引起免疫缺陷。本文使用的术语“HIV”包括任何人类免疫缺陷病毒，其包括HIV-1和HIV-2的全部类别和亚型(分化体)，例如HIV-1M和HIV-1 O类；本发明包括每个已知的分化体；优选的是HIV-1分化体B。Gag，pol和nef基因产物是本领域公知的并且也详述于实施例8。
对本发明的不同分化体的应用指导也可在下述文献中找到HIV序列概要，2002，Kuiken C，Foley B，Freed E，HahnB，Marx P，McCutchan F，Mellors J，Wolinsky S，and Korber B，编辑，由理论生物学和生物物理学组，Los Alamos国家实验室出版，LA-UR号03-3564.(HIV Sequence Compendium 2002 KuikenC，Foley B，Freed E，HahnB，Marx P，McCutchan F，Mellors J，Wolinsky S，andKorber B，editors.Published by the Theoretical Biology and Biophysics Group，Los Alamos National Laboratory，LA-UR number 03-3564)，将其作为参考合并于此。尤其是HIV-1分化体A，B，C和D及许多分离体的共有序列资料可以在此书的第490-550页中找到；HIV-2分化体A，B，C和D及许多分离体的共有序列数据可以此书的在第554-578页中找到。优选地，HIV是HIV-1或HIV-2，最优选的是HIV-1。优选地，HIV是分化体A，B，C和D，优选的是分化体B或D，更优选的是分化体B。HIV序列可以与HXB2参考序列(实施例8)比对，因此，不论采用哪个分化体，都可以识别g/p/n基因并且绘制其相应的表位。这项工作可以通过手工来进行，但优选采用Los Alamos数据库的“HXB2 Numbering Engine”(http:www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/NUM-HXB2/HXB2.MAIN.html)实现此目的。
本文提到的“突变”包括在多肽的氨基酸或核酸中进行的任何添加，缺失或替代。通常突变改变所述多肽的氨基酸序列以使其与原序列或天然多肽序列不同。
在本发明中，经常引入突变来去除或改善病毒蛋白已知的生物学活性。因此，优选地，当上述序列相对于天然序列发生突变时，这意味着突变使病毒多肽减少了、优选去除了一个或多个生物学活性。本文描述了使病毒特有的生物学活性减少或去除的特定突变的例子。而且与病毒功能相关的基序或功能域在本领域是公知的。然而，如本文所述，本发明的重要之处在于，当用于减少或去除生物学活性的突变发生时，天然表位被保留了下来。
本文所述的“重组多肽”是与天然等价多肽序列不同的肽，它可以通过包括DNA合成和处理的基因重组技术而制得。重组多肽也包括不通过重组方式产生的多肽，而是包括通过已经设计并正在使用的重组DNA技术产生的多肽或者，优选地包括通过这种技术设计的与多肽相同的序列。
本文提到的“免疫反应”是针对抗原序列的细胞反应(包括但不限于CD4+和CD8+)或者体液反应，或者是两者的组合。
本文用于定义核酸片段和/或多肽序列的基因名，例如‘gag’、‘pol’、‘nef’等优选具有其通常的意思。通常大部分术语用来描述多肽序列，或编码该多肽序列的相应的核酸序列。
本文所述的“保护性免疫反应”是指有预防和/或者治疗效应的抗原特异性免疫反应。
病毒逃逸突变可以发生在任何表位并且能够导致病毒逃逸。通过提供更多的表位，很有可能有一些表位保持未突变。此外，本发明通过有利地提供额外的辅助T细胞表位，使免疫反应扩大和/或者加强。
因此，在一个实施方案中，本发明有利地克服了了能够影响传统疫苗的优势免疫效应。
已证明，本发明的GPN序列(SEQ ID NO1)中存在着HIV分子免疫学数据库中所有已鉴定出的nef人表位(包括CD8+T细胞和辅助T细胞表位)。
正如上面所提到的，WO02/32943(Nabel and Huang)公开了很多HIV疫苗领域内的内容。从其说明书中可以明显地看出，本发明与其所公开的显著不同。在优选实施方案中，本发明涉及包含和/或编码来源于HIV的蛋白的物质，它明显排除了WO02/32943中所揭示的任何物质，优选排除了任何与WO02/32943中所揭示的有95％或更高一致性的物质。
正如上面所提到的，WO02/022080(Merck and Co.)在HIV疫苗领域中公开了很多内容。从其说明书中可以明显地看出，本发明与其所公开的显著不同。在优选实施方案中，本发明涉及包含和/或编码来源于HIV的蛋白的物质，它明显排除了WO02/022080中所揭示的任何物质，优选排除了任何与WO02/022080中所揭示的有95％或更高一致性的物质。
正如上面所提到的，WO03/025003在HIV领域公开了很多内容。从说明书中可以明显地看出，本发明与其所公开的显著不同。在优选实施方案中，本发明涉及包含和/或编码来源于HIV的蛋白的物质，它明显排除了WO03/025003中所揭示的任何物质，优选排除了任何与WO03/025003中所揭示的有95％或更高一致性的物质。
CD8+T细胞表位
CD8+T细胞表位可以通过实验来鉴定，也可以通过对所关注的序列进行分析而预测。优选地可以应用ProPred程序(表位预测程序，采用基于矩阵的预测算法，此算法在Sturniolo et al.Nat.Biotechnol.17.555-561(1999)和Singh and Raghava(2001)Bioinformatics，17(12)，1236-37中公开，例如可以从(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)找到)来预测/识别。
本发明的一个有益之处是在所关注的多肽或编码它们的核酸中保留了天然表位。
在突变和基因构建过程中可以添加或者引入新的CD8+T细胞表位。
辅助T细胞表位辅助T细胞表位可以通过实验来鉴定，也可以通过对所关注的序列进行分析而预测。优选地可以应用ProPred程序(表位预测程序，采用基于矩阵的预测算法，此算法在Sturniolo et al.Nat.Biotechnol.17.555-561(1999)和SinghandRaghava(2001)Bioinformatics，17(12)，1236-37中公开，例如可以从(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)找到)来预测/识别。
优选地，本发明所关注的多肽或编码它们的核酸中保留了天然辅助T细胞表位。
而且，本发明的有利之处在于提出了新的辅助T细胞表位，这些表位对含所述表位的抗原的免疫反应具有明显加强和/或者扩大的作用。在本发明的一个优选实施方案中，增加了辅助T细胞表位数量的提供。
在本发明的另一个优选实施方案中，创建了新的辅助T细胞表位和/或将新的辅助T细胞表位引入到本发明的多肽中，因而增强了免疫反应。
在一些实施方案中，本发明包含重组禽痘株FP9和/或重组修饰的Ankara痘苗病毒(vaccinia virus)，(MVA)，每个均表达包含抗原肽序列的一个新的融合蛋白，此抗原肽序列可以在I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)，优选分化体B的gag、pol和nef基因的翻译产物中找到。
本发明也涉及这些载体在例如基础-加强免疫(包括单次基础-多次加强的基础-加强免疫策略)的免疫方法中的用途，。正如下面所讨论的，这两个重组病毒中任一个或两者加强DNA质粒介导的基础免疫(引发)的用途已经显示了在哺乳动物例如啮齿动物中诱导产生了强的免疫反应，并且也发现在灵长目动物例如人中的这种应用。本发明也涉及HIV-1感染的人的治疗性免疫疗法，例如使用本发明的抗原基因与HAATR联合进行，和/或HIV-1感染的高危人群的预防性免疫治疗。
有益地，本发明的载体采用了合适的密码子选择来优化蛋白在哺乳动物细胞中的表达。有利的是采用了人的密码子选择。
在一个优选实施方案中，本发明的治疗性抗原包括基于HIV-1(优选分化体B)产物、gag、pol和nef的基因产物的一种融合蛋白。优选地，所述抗原通过本文所述的两个重组痘病毒(pox viruses)中的一个或两个来传递。
本发明一方面提供包含抗原肽序列的新的融合蛋白，此抗原肽序列来源于I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)，优选分化体B的gag、pol和nef基因的翻译产物。
优选的融合蛋白的氨基酸序列如图1所示。优选的编码该氨基酸序列的核酸序列如图6所示。由于遗传密码的简并性，本领域技术人员能理解可能存在很多可能的核酸序列，而所述核酸序列只是其中一个优选的例子。
基因产物在融合蛋白中的顺序优选是GAG-POL-NEF。这也是它们在HIV基因组中的排列方式。其它顺序也同样有效。本领域技术人员有能力改变此顺序来满足特定应用的需要，或者甚至只是为了更容易构建和/或试剂的处理。
在一个优选实施方案中，本发明的构建体对优势免疫具有有益的效果。优势免疫阻碍了现有技术的疫苗，尤其是对于gag表位。这在上面已经讨论过。本发明在实例部分研究了优选的GPN构建中GAG的3个表位，每个均能产生免疫反应。在优选实施方案中将进一步揭示如何来监测整个融合蛋白的免疫反应(详细描述如下)。
很明显地，一些GPN蛋白是可以缺失的，例如通过缺失可以减少构建体的大小。实际上，某些个别基因是有其独特应用的。优选地在此揭示的gpn构建体没有被截短。没有结合任何理论，作为一个比公开的基因内实体更小的单一蛋白如果单独应用会有较低的免疫原性。因此在一个优选实施方案中，本文所揭示的gpn基因没有截短/缺失。优选地，g/p/n基因中的每个均使用其全长。
本发明的免疫原性成分通常是多肽，这对本专业读者来说是显而易见的。然而，本发明涉及的是这些多肽和编码多肽的核酸，无论它们采用的是DNA、质粒、病毒载体或其它实体形式。依据本发明提出的特定应用，本领域技术人员生产抗原多肽的实际方式可以有所不同。多肽可以是在体外生产，或者优选在体内生产，或者在细胞内或细胞外生产。本文描述了所采用的特定方式。
GAGGAG蛋白有两个功能域，p17间质蛋白和p24核衣壳蛋白，两者对HIV病毒样颗粒的组装的是必要和充分的。本发明的gag基因中，根据国际艾滋病疫苗倡议(International Aids VaccinationInitiative)(WO01/47955)，p17和p24的功能域已有利地被交换以破坏GAG蛋白的加工。只要保留天然CD8+T细胞表位，其它的破坏性重排也是可能的，例如将拼接(scrambling)应用到nef中(如下)。
p17功能域的豆蔻酰化位点被突变以利于阻碍GAG蛋白与细胞膜的结合，以及随后的组装和出芽。这种突变优选通过缺失或将此功能域中的第二个甘氨酸残基用另一个氨基酸替代进行。更优选地，用惰性的非极性氨基酸替代该甘氨酸残基，最优选采用丙氨酸来替代该第二个甘氨酸残基。这会阻碍GAG与细胞膜结合的功能，还阻碍在病毒组装和出芽中的功能。
有利地，在本发明的重组基因中，gag的免疫原性没有得到不利的改变。
优选地，本发明的“全长”gag意味着包含p17和p24的功能域的全部序列。优选地，全长gag仅包含p17和p24的功能域的全部序列。
POLpol基因编码一些蛋白，包括蛋白酶，(p10)，逆转录酶，(p51)，RNA酶H，(p15)和整合酶，(p31)。
对于逆转录酶活性的功能性氨基酸残基在YMDD基序(见表位图RT183-186)的中部，YMDD基序是一个包含许多记录表位的区域。有利地，以下将详细描述通过功能域交换突变使逆转录酶失活而没有使表位缺失。因此，在本发明中，优选地，存在于p51亚单位的逆转录酶活性被破坏。这是优选通过编码序列的重排来实现的，这样得到了RT活性被破坏的改变了的p51多肽。最优选地，序列TPDKKHQKEPPF(邻近于p51多肽的中部)被复制，编码p51多肽的氨基端部分和羧基端部分的序列在复制序列之间发生了交换。
该新技术破坏了POL的活性位点，从而改进了逆转录酶活性。而且，有利的是，本发明的实施还保留了该基因产物的免疫原性。如果活性位点通过例如插入、缺失或其它已知的替代型突变进行突变，则T细胞表位将受到破坏，而本发明则保留了这些表位。
优选地，本发明的“全长”pol意味着包含pol的全部p51功能域(即氨基酸1-440)，pol通常被称为逆转录酶(RT)。在实施例8中，逆转录酶和RNA酶在称为RT CTL图谱的部分被组合；当读到这个例子的时候，应当引起适当的关注。有时也将其称为“RT的1-440”。有时pol的氨基酸1-440是指截短的pol(p51)以表示全部病毒pol ORF的其它部分被省略，例如RNA酶单位。然而，所指的“pol”、“截短的pol”(p51)和“全长pol”优选意味着pol p51氨基酸1-440，正如本文所采用的，这也是上下文中所显而易见的。
NEFnef基因编码一种多功能蛋白，该蛋白可以促进病毒的生长及调节免疫逃脱。在本发明中，此基因所编码的NEF蛋白已失活(就是其功能被破坏)。在一个优选实施方案中，通过把编码区分割成8个亚区然后对这8个亚区进行排序而使其失活。优选地，这8个区包括26个氨基酸的6个区和25个氨基酸的2个区。更优选的拼接(scrambled)NEF序列如下所示(见图2)。通过与天然nef序列(也如下所示)比较，很容易辨别出该序列中准确的结合界线。
本发明的拼接的目的在于破坏nef的功能，而保留其T细胞表位。
本发明在拼接的nef中，应当注意破坏nef的功能同时产生最少数量的无用的CD8+T细胞表位。
本文公开的8个亚区的优先选择显示了在保持CD8+T细胞表位和不产生过多新的接合的CD8+T细胞表位之间的一个有益平衡。在一个优选实施方案中，将新产生的接合的CD8+T细胞表位的数量减到最少。上下文所述的“新的”CD8+T细胞表位在天然nef序列中是不存在的表位。CD8+T细胞表位的平均长度是9个氨基酸。
根据本发明，所绘制的优选GPN融合蛋白的图显示了保留了哪些表位及产生了哪些新的接合的表位。这会在下面进一步讨论。
根据本发明，当制备拼接基因时，优选引入接合连接体来保留跨越(span)所选接合点的任意表位。这项工作通过应用ProPred工具浏览序列并且根据需要进行相关修饰可很容易实现。
在一个优选实施方案中，跨越这些亚区接合点的12个残基连接体被插入到重排序的亚区之间从而恢复位于原始NEF蛋白序列中8个亚区的接合点的T细胞表位。
优选地，本发明的“全长”nef意味着包括nef基因的全部氨基酸序列，优选包括nef多肽N端部分(即nef氨基酸1-65)，nef多肽包含现有技术nef构建体中缺失的表位。
序列特定的序列列于序列表中。简言之，SEQ ID NO1包含代表性的全部gpn基因序列，包括标签。在一个优选实施方案中，去除了标签，例如用于人类，和一个代表性核GPN序列示于SEQ ID NO9。
SEQ ID NO2是p24gag片段，SEQ ID NO3是p17 gag片段。尽管天然或参考的p24序列不包含MA，但GAG p24的构建始于MAPIV。这是由于用于翻译的优选的Kozak序列(GCC GCC ACC ATG G；SEQ ID NO14)。ATG是起始密码子，它翻译成甲硫氨酸(M)。脯氨酸(P)的DNA密码子以C开始，因此插入一个具有始于G的DNA密码子的附加氨基酸(丙氨酸)。
在一个实施方案中，根据本发明，SEQ ID NO2和SEQ ID NO3被连接起来(SEQ ID NO2的最后一个残基与SEQ ID NO3的第一个残基连接)产生优选的gag基因。
SEQ ID NO4表示短的pol p51序列，根据本发明，该序列在优选的pol构建体中被有利地复制。SEQ ID NO5是pol序列的N端和C端。在一个实施方案中，以SEQ ID NO4-SEQ ID NO5-SEQ ID NO4的顺序构建了一个较大的序列，导致SEQ ID NO4的重复，SEQ ID NO5的每一端各重复一个(即一个在SEQ ID NO5的N端，一个在C端)，这样制备了本发明的一个优选的pol基因。
根据本发明，SEQ ID NO6是一个拼接nef。
SEQ ID NO7是一个被鼠CD8+T细胞所识别的标签，SEQ ID NO8是一个HA标签。这些标签的任一个或两者都可以有利地整合到本发明的基因序列中，例如可以通过该蛋白的N-或C-端(优选通过C端)来监测该蛋白的表达和/或免疫反应和/或该蛋白的稳定性/加工。然而，对于涉及人类受试者的实施方案，这些标签优选不被整合到本发明的基因序列中，或者从所述基因序列中去除，或者不为该基因序列所表达。
SEQ ID NO10是HIV分化体B共有序列蛋白的天然HIV nef序列。
SEQ ID NO11是编码GPN的代表性核酸序列。本领域技术人员当然会了解由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸序列可能同样编码本发明的GPN。尤其是与SEQ ID NO11相关并且只是在核酸序列中通过翻译沉默差异而不同。
本文的术语“来源于”HIV基因产物的序列在本领域有其固定的意思。“来源于”只是表示基于HIV序列，例如作为起始点，不论其是利用计算机(in silico)还是例如通过克隆、PCR等实验来源的。例如，该术语可以包括从HIV ORF预测的氨基酸序列，而不仅限于实验来源的序列。如果技术人员能够识别序列来自HIV，那么不管它怎样重排或突变，都将被认为来源于HIV。在一个优选实施方案中，来源于另一个序列的序列应具有一些与其来源的序列相同的连续残基(氨基酸或核酸)。优选至少有5个这样的残基，优选至少有8个这样的残基，优选至少有10个这样的残基，优选至少有14个这样的残基，优选至少有18个这样的残基，优选至少有20个这样的残基，优选至少有22个这样的残基，优选至少有25个这样的残基。例如，本文给出的gag，pol和nef序列每个均源于HIV。
术语“突变”有其通常的意思，其包括缺失、插入、点突变、截短、替换以及本文所描述的定点突变和拼接。
应当理解，本发明也包括公开的核苷酸序列的核酸片段。优选地，核酸片段包含至少40个核苷酸，优选至少50个核苷酸，优选至少100个核苷酸，优选至少200个核苷酸，优选至少400个核苷酸，优选至少600个核苷酸，优选至少800个核苷酸，优选至少1000个核苷酸，优选至少1500个核苷酸，优选至少2000个核苷酸，优选至少2500个核苷酸，优选至少3000个核苷酸，优选至少3400个核苷酸，优选至少3410个核苷酸。
应当理解，本发明也涉及仅因为遗传密码简并性而与所呈现的核酸不同的核酸。当鉴别与遗传密码简并性有关的变异时，重要的开放读码框是编码本发明多肽的核酸，尤其是编码核心GPN(SEQ ID NO9和编码它的核酸)的核酸。
非天然的核苷酸残基或类似物或衍生部分在本发明的核酸中起到重要作用。
应该理解，本发明也包括公开的氨基酸序列的多肽片段。优选地，这些片段是基于逐个基因进行考虑的。优选的多肽片段包含至少8个氨基酸，优选至少9个氨基酸，优选至少10个氨基酸，优选至少12个氨基酸，优选至少15个氨基酸，优选至少20个氨基酸，优选至少25个氨基酸，优选至少26个氨基酸，优选至少30个氨基酸，优选至少40个氨基酸，优选至少60个氨基酸，优选至少80个氨基酸，优选至少100个氨基酸，优选至少150个氨基酸，优选至少200个氨基酸，优选至少300个氨基酸，优选至少400个氨基酸，优选至少600个氨基酸，优选至少800个氨基酸，优选至少1000个氨基酸，优选至少1108个氨基酸，优选至少1125个氨基酸。
应该理解，当考虑本发明的多肽和核酸片段时，同样重要的在于保留表位。这就是说，如果本发明在构建体中只含有基因的一部分(例如，逆转录酶(pol)的氨基酸1-440)，那么必需保留那部分基因产物的相应天然表位。这个同样适用于适当的CD8+T细胞表位和辅助T细胞表位。通常，如上所示，优选的是单个基因的较长片段，最优选的是本文所描述的全长多肽和如序列表中所列出的序列。很明显，同样的原则扩大到考虑序列的一致性，这就是说，当评价本发明片段的序列一致性时，首先选择片段的长度，然后通过天然或参考序列的相应片段长度部分进行序列比较。本发明要求保留片段长度上的所有表位。优先考虑的是本文描述的全长g/p/n基因。
在一个实施方案中，本发明涉及gag/pol/nef多肽，其包含成串的天然表位，并含有最少的连接序列。
非天然氨基酸或其类似物或其衍生部分在本发明多肽中可以起到重要作用。
通过计算机程序来测量序列的相对一致性，该程序采用确定一致性的适当算法例如采用默认参数来计算两个或多个序列间的一致性的百分率。这种计算机程序的典型例子是CLUSTAL(见Thompson et al.，1994(NAR224673-80)或http://www.psc.edu/general/software/packages/clustal/clustal.html)。或者，可采用BLAST算法，其参数设置成默认值。BLAST算法在http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast help.html中详细描述，将其作为参考合并入本文。
其它计算机程序也被用于确定序列间的一致性和/或者相似性，其包括但不限于GCG程序包(Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12387)、FASTA(Atschul et al 1990 J Mol Biol 403-410)和比对工具的GENEWORKS程序组。
FASTA采用Pearson和Lipman的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85；2444-2448(1988))来搜索一个序列(查询序列)与任何序列组间的相似性。FASTA采用以下搜索参数其可以有利地设定为规定的默认参数矩阵关于BLAST(没有通过FASTA用于核苷酸比对)。字长-连续的残基或碱基数目，其在初始比对时即被考虑；对于核苷酸序列默认值是6，对于氨基酸序列默认值是2。间隙罚分这是一个当新的间隙产生时从相似性得分中扣除的数值；对于核苷酸序列默认值是16，对于氨基酸序列默认值是12。间隙扩展罚分这是一个当现有间隙扩大时从相似性得分中扣除的数值；对于核苷酸序列默认值是4，对于氨基酸序列默认值是2。期望值根据统计学显著性，其限定序列返回的数目，默认值是2。表其限定了被报告的的同源序列的数目；默认值是40。对比其限定了对比显示的同源序列的数目；默认值是10。
FASTA可以通过University of Illinois的生物学工作平台(http://biology.ncsa.uiuc.edu/)获得，或由Genetics Computer Group(GCG)获得。
BLAST(基本局部序列对比搜索工具)是程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所采用的启发式搜索算法；这些程序把显著性归于采用Karlin和Altschul的增强的统计学方法(见http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast help.html)的发现。BLAST程序特定地用于序列相似性的搜索，例如鉴定查询序列的同系物。序列数据库的相似性搜索中基本问题的讨论见Altschul et al(1994Nature Genetics 6119-29)。
BLAST采用以下搜索参数其可以有利地被设定为规定的默认参数条形图(HISTOGRAM)-显示每个搜索的得分的条形图；默认值是yes。说明(DESCRIPTIONS)-限定报告的同源序列的描述数目；默认值是100。期望值(EXPECT)-根据Karlin和Altschul的随机模型(1990PNAS872264-8)，用于序列比对的统计学显著性阈值；默认值是10。对比(ALIGNMENTS)-限定了对比显示的序列数；默认值是50。矩阵(MAATRIX)-指定BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX的一个得分矩阵。默认矩阵是BLOSUM62(Henikoff & Henikoff 1992PNAS8910915-9)。链(STRAND)-限定序列的一条或另一条链的搜索，(如果是一个核苷酸序列)；默认值是双链。过滤(FILTER)-屏蔽低复杂性的查询序列的片段，它由Wootton & Federhen的SEG程序(1993Computers inChemistry 17149-163)确定；或组成短周期性内部重复的片段，它由Claverie& States的XNU程序(1993Computers and Chemistry 17191-201)或通过Tatusov和Lipman的DUST程序(见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定；BLASTN的过滤默认值是DUST，其它程序的默认值是SEG。
最优选地，采用FASTA对比工具进行序列比对。
尽管通常在此提到的序列比对技术是本领域公知的，当然也可特别参考Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology(1999)4thEd，John Wiley & Sons，Inc。
本发明包括与本文公开的示例性序列有显著一致性的序列。优选的序列至少与所公开的序列有40％的一致性，优选至少有45％的一致性，优选至少有50％的一致性，优选至少有55％的一致性，优选至少有60％的一致性，优选至少有65％的一致性，优选至少有70％的一致性，优选至少有75％的一致性，优选至少有76％的一致性，优选至少有78％的一致性，优选至少有80％的一致性，优选至少有85％的一致性，优选至少有90％的一致性，优选至少有91％的一致性，优选至少有92％的一致性，优选至少有93％的一致性，优选至少有94％的一致性，优选至少有95％的一致性，更优选至少有96％的一致性，优选至少有97％的一致性，优选至少有98％的一致性，优选至少有99％的一致性，或者更多。
对于本发明的多肽的氨基酸序列，要求保留表位是指序列一致性可以集中在已知表位的区域，其中实际表位序列中的序列一致性优选是100％。因此，表位之间的氨基酸序列区比实际的表位区有更大的变化，其优选与参考序列保持一致。优选地，通过比较相关序列的全部相应长度，包括表位和表位之间的区域，来判断一致性的百分率数值。在另一个实施方案中，一致性数值仅涉及可变区，即仅涉及表位之间的区域，在该实施方案中，表位被100％地保留。
基因构建体的优化在一个优选实施方案中，一个“Kozak”共有序列GCC GCC ACC ATG G被安排到基因构建体的上游。
在一个优选实施方案中，可修改序列密码子使用来优化人细胞中gag-pol-nef转录物的翻译效率。
在一个优选实施方案中，Apa I和Asc I限制性核酸内切酶识别位点被分别引入到gag-pol-nef(gpn)基因的5-prime端和3-prime端。这将有利地促进基因序列盒的亚克隆。在此实施方案中，限制性位点存在于重组病毒中而有利地处于GAG-POL-NEF融合蛋白的开放读码框之外。因而它们对融合蛋白的氨基酸序列没有影响，对此蛋白产生的免疫反应也没有影响。Apa I和AscI也被选择允许直接克隆到pOPK6重组质粒中。更有利的是它们对基因功能产生了未知的影响。
在一个优选实施例中，将可以被gp160蛋白特异的鼠CD8-阳性T细胞识别的编码报道子CD8+T细胞表位的序列PGPGRAFVTI(SEQ ID NO7)整合到本发明的重组基因中。这有利于监测含GPN的疫苗免疫之后的CD8+T细胞的诱导作用。有利的是表位的存在已知不会融合基因的功能。在一个更优选的实施例中，此报道子表位在用于灵长类动物免疫，如人类免疫的构建体/重组基因中不存在。
在一个优选实施例中，流感病毒血细胞凝集素蛋白特异抗体所识别的附加的抗体标签YPYDVPDYA(SEQ ID NO8)被加到本发明的基因中(或者编码其的核酸中)。优选地，添加到蛋白的羧基端以允许基于例如蛋白印迹分析的免疫测定的抗体的表达检测。在更优选的实施例中，此标签被整合到重组gag-pol-nef基因中的羧基端，例如在包含重组gag-pol-nef基因的重组载体中的羧基端。在更优选的实施例中，此抗体标签在用于灵长类动物免疫，如人类免疫的构建体/重组基因中不存在。
药物组合物本发明也提供一个包含施用有效治疗剂量的本发明试剂(例如本文所述的重组gpn基因的重组HIV基因)和一个药物可接受的载体、稀释剂或者赋形剂(包括它们的组合)的药物组合物。
药物组合物包含两种成分-其中第一种成分包括核酸载体，第二种成分包括它的病毒载体。第一和第二种成分可以相继递送，也可以同时或一起递送，甚至可通过不同的给药途径递送。
药物组合物可以作为人或兽药应用于人类或动物，它典型地包含任何一种或多种合适的药物可接受的稀释剂、载体或者赋形剂。治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是公知的，并且也描述在例如Remingtong’sPharmacetical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中。药物可接受的载体、赋形剂或稀释剂可以根据预期的给药途径和标准制药规范来选择。药物组合物可以包含如载体、赋形剂或稀释剂，另外还包括合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂或助溶剂。
药物组合物中也可以包含防腐剂、稳定剂、染料、甚至是调味剂。防腐剂包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的多种酯。也可以使用抗氧化剂和助悬剂。
不同的递药系统要求有不同的药物组成/配方。例如，本发明的按配方制造可以通过袖珍泵递药或者通过粘膜途径给药，如鼻腔喷雾或气雾剂吸入或可吸收的溶液，或者药物组合物按注射形式制造经注射途径给药，如通过静脉、肌肉或皮下途径。替代性的，药物组合物可以设计经多个途径给药。
不论药物通过胃肠粘膜传递到何处，试剂经过胃肠道期间都应当能够保持稳定；例如，它应当能抵抗蛋白水解的降解，在酸性pH条件下稳定而且能抵抗胆汁的洗涤作用。
在适当的地方，药物组合物可以通过吸入施用，以栓剂或阴道栓剂的形式施用，以洗液、溶液、乳膏、油膏或撒粉形式外用(topically)，通过皮肤贴的形式施用，口服用药形式为含赋形剂如淀粉或乳糖的片剂形式，或可单独也可与赋形剂混合使用的胶囊或胚珠(ovule)形式，或者含调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液形式，或者可以经注射途径，如通过静脉、肌肉或皮下途径给药。对于注射途径给药，药物组合物最好采用无菌水溶液的形式，可以包含其它物质，如足量的盐或单糖使溶液与血液等渗。对于含服或舌下服用，药物组合物可以采用片剂或锭剂，它们可以通过常规方法制造。
药物的联合本发明的试剂可以与一个或多个其它药物活性物质施用。例如，本发明采用了本发明的试剂和一个或多个类固醇、镇痛药、抗病毒药物或其它药用活性成分进行同时或相继的治疗。
本发明也发现了对HIV例如HIV-1感染人的治疗性免疫疗法的应用。对HIV如HIV-1感染危险人群，本发明与HAART联合使用，和/或与预防性免疫疗法联合使用。
可以理解这些方式包括药物相继、同时或一起施用。
现在通过具体实施例来描述本发明，这些实施例并没有限制权利要求的保护范围的含义，其中需要参照以下附图


图1显示了优选的gpn基因构建体。序列是连续的，只是为了清楚而分开。粗体表示GPN序列与HIV分子免疫学序列的差异(NB.没有显示所有的序列差异)。
图2显示了用于MHC II类表位比较的拼接的和天然的nef基因序列。
图3显示了拼接nef(图3A)和天然nef(图3B)的辅助T细胞表位。
图4显示了用于构建表达gag-pol-nef的重组禽痘菌株FP9的重组质粒p29D.gpn结构示意图。
图5显示了用于构建表达gag-pol-nef的重组MVA的重组质粒pOPK6.gpn结构示意图。
图6显示了GPN的序列。GPN序列以正常文本形式显示。上游区用斜体字表示。5-prime Apa I和3-prime Asc I位点加下划线表示。起始密码子ATG和终止密码子TGA用粗体表示。
图7显示了实施例3所描述的IFN-γELISpot的条形图。
图8显示了实施例5所描述的IFN-γELISpot的条形图。
图9显示了用于IFN-γELISpot分析的重叠的20mer肽。氨基酸长度显示于括号中。
图10显示了实施例4的组4中的动物的GAG特异反应的条形图。
图11显示了实施例4的组4中的动物的POL特异反应的条形图。
图12显示了实施例4的组4中的动物的NEF特异反应的条形图。
图13显示了IFN-γ反应的条形图。
图14显示了gpn序列来源的选择性多肽引发的IFN-γ反应的条形图。
实施例实施例1GPN序列中CD8+T细胞表位和辅助T细胞表位的分析。
我们采用ProPred来比较天然NEF相对于拼接NEF的辅助T细胞表位差异。基于本发明，该程序预测在拼接NEF中存在更多的辅助T细胞表位。这证明拼接NEF至少与天然NEF一样能有效引发辅助T细胞和CD8+T细胞反应。
CD8+T细胞表位CD8+T细胞能够识别和消除病毒感染的T细胞，与控制人HIV感染和猴SIV感染的病毒血症有关。
GPN序列(图1)和HXB2参考序列的比较发表在HIV分子免疫学数据库(“HIV分子免疫学2002通过蛋白绘制CD8+T细胞表位位置图”理论生物学和生物物理学，Los Alamos国家实验室，2003年8月7日(”HIV MolecularImmunology 2002Maps of CTL Epitope Locations Plotted by Protein”；Theoretical Biology & Biophysics，Los Alamos National Laboratory，August7，2003.)；http://hiv-web.lanl.gov/content/immunology/maps/ctl/ctl.pdf)中。
上述比较揭示了天然gag(p17，p24)、截短的pol(p51)和nef中鉴定的所有已知鼠和人CD8+T细胞表位序列在GPN多肽序列中都存在。在GPN序列和HXB2参考序列间存在单个氨基酸差异。表位序列在HXB2蛋白序列中标明，而且提供了该表位的相对定位，尽管相对于限定的蛋白序列有所不同(参照HIV分子免疫学数据库2002II-A-2部分-HIV蛋白表位图，p56；http://hiv-web.lanl.gov/content/immunology/pdf/2002/immuno2002.pdf)。
因此，GPN序列的洗牌(shuffling)和重排不会改变该分子本身针对存在于HIV中的天然gag(p17，p24)、截短pol(p51)和nef序列的诱导CD8+T细胞反应的能力。
构成GPN蛋白的天然多肽的拼接和重排可以产生新的该分子特有的CD8+T细胞表位。由于这些表位不可能存在于HIV病毒中的天然gag、pol或nef序列中，因此它们不可能是与HIV疫苗中新的抗原有生物学相关性的表位。因而，这些表位在这个例子中还没有被进一步研究过。
辅助T细胞表位辅助T细胞免疫反应可以增强CD8+T细胞效应子反应的大小和幅度，因此也可以增强抗HIV感染的CD8+T细胞反应。
GPN序列和HXB2参考序列的比较发表在HIV分子数据库(“HIV分子免疫学2002通过蛋白绘制辅助T细胞表位位置图”理论生物学和生物物理学，Los Alamos国家实验室，2003年8月7日；http://hiv-web.lanl.gov/content/immunology/maps/helper/helper.pdf)中，该比较揭示了天然gag(p17，p24)、截短的pol(p51)和nef中鉴定的所有人辅助T细胞表位序列在GPN多肽序列中都存在。因此，GPN序列的洗牌和重排不会减少该分子本身针对人类病毒分化体B中天然gag(p17，p24)、截短pol(p51)和nef序列的诱导辅助T细胞反应的能力。
由于辅助T细胞表位通常大于15个氨基酸，所以GPN中gag、截短的pol和nef序列的融合很可能会有益地产生新的表位来连接这些基因或基因部分融合的位点。而且，nef基因的洗牌可能会产生许多新的表位来连接产生多肽的改动部分。当GPN用作疫苗时这些新的辅助T细胞表位可以引发免疫反应，因而相对于天然GAG、截短的POL和NEF蛋白增强了本发明多肽引发的生物学相关的CD8+T细胞表位反应的幅度和强度。
为了证明洗牌产生了潜在的新的辅助T细胞表位，采用ProPred MHC II类预测程序比较天然NEF和拼接NEF多肽序列(图2)，该程序采用基于Sturniolo et al.Nat.Biotechnol.17.555-561(1999)和Singh和Raghava(2001)Bioinformatics，17(12)，1236-37所述的预测算法，例如可以从(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)中获得。
这些分子的比较揭示了预测的在人类MHC II类限制的辅助T细胞表位中的重要改变，与天然NEF序列(图3A和3B)相比，在拼接NEF序列中存在更多的被预测的表位。
因而，nef序列的拼接导致了对本发明多肽的CD8+T细胞反应增强的附加的辅助T细胞表位的增加。这些有益的新的辅助T细胞表位包括图3A中所含而在图3B不存在的表位。
在包括GPN多肽的蛋白间的融合位点上产生相似的新的辅助T细胞表位。上述的比较可以用来进一步说明和研究这些。
实施例2DNA、MVA和禽痘中的重组GPN基因构建了重组gag-pol-nef(gpn)基因用来表达GPN融合蛋白。此基因构建于核酸载体中，例如DNA载体(例如质粒载体)、以及用于MVA和禽痘载体和用于这些构建的材料。
重组病毒载体例如MVA和/或禽痘载体用于加强DNA质粒介导的基础免疫的应用显示了在啮齿动物中诱导了很强的免疫反应。
本质的相同的构建也被发现在灵长类动物如人类中得到应用。
在这个实施例中，重组禽痘病毒携带的治疗性抗原包括基于HIV-1分化体B的gag、pol和nef基因产物的融合蛋白。
重组gag-pol-nef基因被合成为一系列的重叠寡核苷酸并运用聚合酶链式反应扩增并且克隆入商品化质粒pUC19，产生pUC19.gpn(或02-213)，并且测定核酸序列。
gag-pol-nef基因被亚克隆到3个质粒载体以制备i)一个表达质粒pSG2.gpn，用作体内引发剂，例如含gpn的重组痘病毒载体的临床前实验；ii)一个重组质粒pOPK6.gpn，用于构建表达gag-pol-nef的重组MVA；iii)一个重组质粒p29D.gpn，用于构建表达gag-pol-nef的重组禽痘菌株FP9。
表达质粒pSG2.Mel3(Palmowski，MJ.et al 2002 J Immunol 168 p4391-4398)包含基于人巨细胞病毒即时早期启动子和与牛生长激素基因多腺苷酸化信号结合的内含子的表达盒，用于表达包含黑素瘤抗原的合成表位簇。用Apa I和Asc I、酶切pUC19.gpn，平端钝化，然后亚克隆到经Pst I消化平端钝化后的pSG2.Mel3中，产生表达质粒pSG2.gpn。
MVA重组质粒pOPK6构建如下。该质粒基于商品化克隆质粒pSP72(Promega Inc.)；标准多克隆位点用一个含特定限制性酶切位点和牛痘病毒P7.5后期-早期启动子及后期P11启动子的合成接头置换，它们在合成接头中头到头朝向排列。此接头也包含大肠杆菌LacZ(β-半乳糖苷酶)前20个核苷酸，该基因在牛痘病毒重组质粒pSC11(Chakrabarti et al 1985 Mol CellBiol 5 p3403-3409)中发现。合成接头被合成为一系列的重叠寡核苷酸，运用聚合酶链式反应扩增并且克隆入商品化克隆质粒pcDNA3.1中，产生pLink(或02-363)。300个碱基对的接头序列如下agatctttaattaatgcctaggcaattgagacggcgcgcccgggcactagtaagggcccgtgcaataaattagaatatattttctacttttaccagaaattaattgtacaatttattatttatgggtgaaaaacttactataaaaagcgggtgggtttggaattagtggtaccatgcatcttagaatatatgtatgtaaaaatatagtagaatttcattttgtttttttctatgctataaatgaattcctcaagggatccgtctcctgcaggcatgctaagctagcggccggccctcgagpSC11来源的部分LacZ基因亚克隆到pLINK中构建pLinkLacZ。然后该接头和LacZ被亚克隆到pSP72的Xho I-Bgl II之间，这样在P11晚期启动子3-prime形成完整编码β-半乳糖苷酶的开放读码框来构建pSP72LinkLacZ。
采用下述引物对通过PCR从MVA中分离了MVA胸苷激酶(tk)基因中表示EcoR I酶切位点5-prime和3prime的1500个碱基对的MVA侧翼区。
(5-prime)tk的左侧翼正向引物CAATTACAGATTTCTCCGTGATAGGT反向引物CGTGCATGCGGCCGCAACAATGTCTGGAAAGAACTG(3-prime)tk的右侧翼正向引物CAGGAATTCGCGGCCGCTGTGAGCGTATGGCAAACG反向引物TCATTTGCACTTTCTGGTTCGTA1500bp的PCR产物亚克隆到商品化克隆载体pTOPO-TA(Invitrogen)，并进行测序。
右侧翼序列亚克隆到pSP72LinkLacZ的EcoR I-Mfe I之间，形成p72LacZR。然后左侧翼插入片段亚克隆到p72LinkLacZR的Nhe I-Sph I之间，形成pOPK6。
随后该质粒的序列分析表明由于Nhe I酶的非特异酶切，从含左侧翼序列的pTOPO-TA载体中引入的pOPK6质粒主链序列中识别到了附加的174个碱基对。
pUC19.gpn来源的gag-pol-nef开放读码框亚克隆到pOPK6的Apa I-AscI间，形成pOPK.gpn，gpn插入序列经测序表明在亚克隆步骤中没有发生序列的改变。
质粒作为媒介在p7.5后-早期启动子的控制下可以将gpn开放读码框引入到MVA的tk基因座。
FP9载体FP9禽痘菌株重组质粒pEFL29来自the Institute for Animal Health，Compton，UK的Mike Skinner博士发表的论文Qingzhong，Y.et al 1994，Vaccine 12(6)p569-573。
pUC19.gpn来源的gpn开放读码框作为平端Kpn I-Sac I片段亚克隆到pEFL29的SmaI位点形成pEFL29.gpn。该质粒测序表明在pEFL29构建过程中，LacY，部分LacA和LacZ标记基因被引入。因而，合成一个接头，其通过pEFL29的BsrG I-Blp I消化形成p29Delta，允许所有LacY和大部分保留的LacA开放读码框缺失，接头序列如下TGAGCGCCGGTAGATACCATTATCAGCTGGTGTGGTGTCAGAAGTAATGTA然后pEFL29.gpn的Aat II-Sph I片段间来源的gpn表达盒被亚克隆到AatII-Sph I切割的p29Delta中形成p29D.gpn。gpn插入序列然后经测序确定在亚克隆步骤中没有发生序列的改变。
重组质粒pOPK6.gpn和p29D.gpn被用来将p7.5-gpn表达盒分别引入到MVA和FP9中。
通过病毒基因组与相关的鸡胚成纤维细胞(CEF)的重组质粒的同源重组形成重组痘病毒，CEF采用标准分子生物学技术培养，见Current Protocols inMolecular Biology，Ed.F.M.Ausubel，John Wiley & Sons；或根据供应商或制造商的说明书培养。
通过用非重组MVA(stock 575FHE-K)感染CEF细胞的融合培养物，感染复数为0.1的情况下感染1小时来形成MVA.gpn，非重组MVA来源于MVA传代数575(Mayr et al.，(1978)Zentralbl Bakteriol[b].167(5-6)375-90)。然后根据制造商的规程，用混合有脂质体(Invitrogen)和0.5-2.0μg的pOPK6.gpn质粒DNA转染感染细胞。在收集细胞之前，培养物孵育3天。收集的细胞冻融3次，10倍稀释测定滴度，在含CMC的培养液中培养3天。然后去除培养液，用含X-Gal的CMC培养液替换，在此培养液中培养20小时。
通过蓝色噬菌斑表型鉴定重组病毒，并用移液管转移到含100μl培养液的低温试管(cryotube)。挑取的病毒是可以确保其纯度的纯化5次以上的噬菌斑。当运用合适的引物筛选病毒DNA时，可以通过不含白色噬菌斑表型和WT PCR产物来确定非重组亲代病毒的纯度。
从2ml第五或第六轮MVA.gpn克隆感染的培养物中纯化病毒DNA，并进行PCR纯度筛查。
根据制造商规程，用Qiagen Blood and Cell Culture DNA min-kit(QiagenGmbH，Max Volmar str.4，40724 Hilden，Germany)纯化病毒DNA。用Klentaq高保真聚合酶(Sigma)在合适的孵育条件进行PCR反应。
用下面的引物来筛选亲代病毒，在野生型中产生471个碱基对的条带，而在MVA中不存在TKU CAATTACAGATTTCTCCGTGATAGGTTKL TCATTTGCACTTTCTGGTTCGTA用引物TKL和下面的引物从MVA.gpn构建体中筛选MVA.gpn，产生大约2000个碱基对的条带。
HIV-UATACCCCCGTGTTCGCCATTAAGA通过下面所描述的免疫印迹确定来源于MVA.gpn的GPN蛋白的表达。
用MVA.gpn或MVA.LacZ对照病毒感染CEF细胞，感染复数是1。在收集细胞前培养物孵育3天。细胞在SDS上样缓冲液中加热到100℃，在4-20％丙稀酰胺凝胶上进行电泳，并电转染到一个硝酸纤维素膜上。然后用血细胞凝集素标签(Abcam)特异抗体或者HIV GAG p24(Dako)特异抗体来检测转移蛋白，选择合适的过氧化物酶标记的第二抗体和色原使其可见。印迹分析表明感染MVA.gpn的细胞包含大约134kDa的含p24和HA表位的蛋白，134kDa蛋白在MVA.LacZ感染的细胞中不存在。GPN蛋白预测的分子量是128.5kDa，与MVA.gpn感染细胞产生的特异条带接近一致。
通过免疫印迹验证FP9.gpn来源的GPN蛋白的表达。用FP9.gpn或FP9.LacZ(“FP9.29D”)和对照病毒感染CEF细胞，感染复数是1。在收集细胞前培养物孵育5天。细胞在SDS上样缓冲液中加热到100℃，在4-20％丙稀酰胺凝胶上进行电泳，并电转染到一个硝酸纤维素膜上。然后用血细胞凝集素标签(Abcam)特异抗体或者HIV GAG p24(Dako)特异抗体来检测转移蛋白，选择合适的碱性磷酸酶标记的第二抗体和色原使其可见。印迹分析表明感染FP9.gpn的细胞包含大约134kDa的含p24和HA表位的蛋白，而134kDa蛋白在FP9.29D感染的细胞中不存在。GPN蛋白预测的分子量是128.5kDa，与FP9.gpn感染细胞产生的特异条带接近一致。
采用“基础-加强免疫”的免疫策略在BALB/c小鼠上测试MVA.gpn和FP9.gpn病毒的免疫原性。小鼠分组，每组4只。实验组和对照组如下pSG2.gpn(50μ)进行基础免疫，14天后用1×106p.f.u.的MVA.gpn加强免疫。
pSG2.gpn(50μ)进行基础免疫，14天后用1×106p.f.u.的FP9.gpn加强免疫。
1×106p.f.u.的MVA.gpn单独免疫。
1×106p.f.u.的FP9.gpn单独免疫。
病毒感染7天后，收集外周血淋巴细胞，用下列HIV T细胞表位(也见实施例3)通过ELISpot测定法确定GPN特异的γ干扰素分泌的淋巴细胞数。
H2-D CD8表位AMQMLKETITTSTLQEQGp 160 H2-D CD8表位RGPGRAFVTIH2-D CD4表位NPPIPVGEIYKRWIILGLNKMVA.gpn和FP9.gpn都能在小鼠中显示很强的诱导CD8+T细胞反应。
基础-加强免疫的免疫策略与病毒单独注射组相比能产生更强的免疫反应。
实施例3FP9.gpn和MVA.gpn免疫引发抗原特异的CD8+T细胞反应在此实施例中，证明了FP9.gpn和MVA.gpn单独施用或与pSG2.gpn联合用于基础-加强免疫均可以引发增强的抗原特异的CD8+T细胞反应。在此实施例中通过小鼠进行验证。
用50μg pSG2.gpn通过肌肉注射(im.)免疫雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)，2周后用1×106PFU的FP9.gpn或1×105PFU的MVA.gpn通过静脉注射(iv.)加强免疫。另外一组同龄的首次用于实验的雌性BALB/c小鼠，加强免疫同时用1×106PFU的FP9.gpn或1×105的MVA.gpn进行免疫。
加强免疫14天后，用颈脱位法处死所有小鼠，通过下面所描述的IFN-γELISpot测定法确定GPN多肽(表AAMQ，TTS，RGP)来源的3个H-2d限制性CD8+表位引发的T细胞反应。
鼠IFNγ ELISpot操作规程材料IFN-γELISpot ALP Kit Mabtech 3321-2A600μg抗IFN-γ纯化的单克隆抗体AN1850μg抗IFN-γ生物素化的单克隆抗体R46A250μl抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶α-MEM完全培养液500ml MEM α-修饰Sigma M-452650ml FCS[10％]Sigma F-24425ml青霉素/链霉素[100U青霉素100μg链霉素]Sigma P-078110ml L-谷氨酰胺[4mM]Sigma G-7513500μl 2-巯基乙醇[50μm]Gibco BRL 31350-010ACK缓冲液8.29g NH4Cl
(Sigma A-4514)1g KHCO3[1mM](Sigma P-9144)37.2mg Na2EDTA(Sigma ED2SS)800ml milli-Q水用HCl(Sigma S-7653)调pH到7.2-7.4加水至1000ml，高压灭菌显色缓冲液BioRad AP Conjugate Substrate kit(170-6432)。
一块平板5ml去离子水200μl的25倍缓冲液50μl试剂A50μl试剂B混匀并立即使用规程1.平板制备1.1包被平板用抗小鼠IFNγ(单克隆抗体AN18)的大鼠抗体包被MAIPmultiscreen平板(Millipore MAIPS4510)。用磷酸盐缓冲盐水(PBS；SigmaP-3813)稀释到10μg/ml，每孔加50μl。在湿盒中4℃过夜孵育。
1.2封闭平板甩出包被抗体，用多通道移液器每孔加150μl无菌PBS(SigmaP-3813)洗板1次。甩出PBS，每孔加100μl α-MEM完全培养液，室温孵育大约1小时。此步骤中保持平板无菌是很重要的。
2.脾细胞制备2.1.在2ml PBS中剪碎单个脾脏，在含70μm细胞滤器(Falcon 352350)的培养皿中用10ml注射器芯研磨，加5ml PBS，用移液器悬浮脾细胞，然后转到50ml试管中。然后进一步用10ml PBS冲洗细胞滤器和培养皿，并加到上述50ml试管中。1500rpm离心5分钟。
2.2.去除上清，轻拍试管重悬细胞，加入50ml ACK缓冲液，颠倒混匀。室温孵育不超过5分钟。加入25ml PBS，颠倒混匀，400Xg离心5分钟。
2.3.去除上清，轻拍试管重悬沉淀，加入10ml PBS，涡旋振荡混匀。用0.4％台盼蓝溶液(SigmaT-8154)以1∶10稀释，用改良的Neubauer血细胞计数器进行细胞计数。Elispot分析所需的等份量1500rpm离心5分钟，涡旋振荡重悬在适当体积的α-MEM完全培养液中，终浓度为10million细胞/ml。
3.平板设置
50μl 50μl 50μl←→→→ ←→→→←→→→1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

C C C注根据不同需要有不同的培养皿设置。该设置适合于本实施例。
3.1轻拍平板，去除封闭培养液，加入50μl完全αMEM培养基到3、4、7、8、11和12列。
3.2加入150μl脾细胞到2、6和10列双复孔中。(每个平板至多12个样品)3.3从2、6和10列中取50μl脾细胞，分别转移到1、5和9列作为阴性对照孔。
3.4系列稀释每个样品，从2、6和10列取50μl样品分别转移到3、7和11列，混匀，然后转移50μl到4、9和12列。最后一列稀释混匀后去除50μl。
3.5加入检验肽和对照肽到完全α-MEM培养基中的天然脾细胞中，2倍于目标终浓度，细胞浓度为10million/ml。加入50μl对照肽和靶T细胞到1、5和9列。加入50μl检验肽和靶T细胞到其余各列。
3.6将此板在37℃孵育18-20小时。
4.进行测定4.1用含0.05％Tween 20(Sigma P1379)的PBS洗平板两遍，用蒸馏水洗一遍，用PBST洗两遍。
4.2加入PBS稀释的1μg/ml的生物素化大鼠抗小鼠γ干扰素，50μl/孔。室温孵育2h。
4.3用PBST洗平板4遍，然后加入50μl PBS稀释的1μg/ml的抗生物素蛋白链菌素碱性磷酸酶(Mabtech)。室温孵育1h。
4.4用PBST洗平板4遍，加入显色缓冲液50μl/孔，室温孵育直至出现斑点(约10min)。用自来水清洗平板，将塑料底剥下放在纸巾上过夜晾干。
计算用表位特异的IFN-γ点形成细胞/百万个脾细胞(sfc/million)的量计算结果。组间差异用单向ANOVA和采用GraphPad Instat version 3.05对log10转换的数据的Tukey-Karamer多重比较测试来测量。
结果如图7所示，结果证明用FP9.gpn和MVA.gpn单独免疫或者用pSG2.gpn基础加强免疫能够在小鼠中引发抗原特异的CD8+T细胞反应。如上面所描述的，用pSG2.gpn(DNA)肌肉注射免疫雌性BALB/c小鼠或者用PBS免疫作为阴性对照(-)，14天后用FP9.gpn(FP9)或MVA.gpn(MVA)加强免疫。加强免疫14天后用IFN-γELISpot分析确定脾细胞的CD8+T细胞反应。列表示每组4只小鼠的CD8+反应性表位AMQ、TTS和RGP(见表A)引发的IFN-γ点形成的细胞/每百万脾细胞的平均数±标准差。
表A研究中使用的GPN表位(1ND＝不确定)

用FP9.gpn或MVA.gpn单独免疫或者基础-加强免疫，与阴性免疫对照(图7)相比较，能够引发针对每个CD8+T细胞表位的显著增强的抗原特异性T细胞反应(P＜0.01)。
另外用pSG2.gpn进行基础免疫，用FP9.gpn或MVA.gpn加强免疫，与每种病毒单独免疫相比较(图7)，能够引发针对每个CD8+T细胞表位的显著增强反应(P＜0.01)。
应当注意的是，在这个实验中病毒滴度是不相同的。因此没有比较病毒的相对免疫效应。当然用相同病毒滴度进行实验可以直接评价其相对免疫效应。
这样，针对本发明的重组HIV基因，例如gpn基因的特异的CD8+T细胞反应通过用FP9.gpn或MVA.gpn免疫而被引发。这表明这些构建体在引发针对GPN多肽的免疫反应中都是有效的。
而且，有效的免疫反应是针对GPN多肽N末端和C末端区域的表位，表明经FP9.gpn或MVA.gpn传递的整个多肽被表达、加工和递呈。
当将病毒注射到经pSG2.gpn进行基础免疫的动物时，针对每个表位病毒均能引发显著增强的免疫反应，表明在基础-加强免疫策略中两者均能作为加强剂。
实施例4FP9.gpn和MVA.gpn在灵长类动物中的免疫原性gpn免疫原在灵长类动物体内的免疫原性的证明描述如下。
在非人类的灵长类动物(猕猴)中测定含分化体B HIV-1的gag、pol和nef蛋白的GPN多肽的免疫原性。
多聚蛋白(采用人密码子)通过重组MVA、鸡痘病毒FP9、腺病毒和DNA疫苗载体表达。为了诱导高水平的抗原特异的CD8+和CD4+T细胞，多聚蛋白表达构建体采用异源免疫策略。
表B显示的是免疫原性的研究设计表B

此例中猕猴研究的设计见表B.
免疫前、每次免疫后7天及最后一次免疫后4周采集血液样品。外周血单核细胞冷藏保存并用ELISpot测定及用重叠多肽库分析胞内细胞因子。
在研究中及研究结束时测定细胞免疫反应。通过IFN-γELISpot assay分析(使用的重叠多肽见图9)IFN-γ分泌的T细胞频率。
另外一组用于比较，分析用白细胞介素-2/Ig融合蛋白(Barouch，D.H.，A.Craiu，et al.(2000)Proc Natl Acad Sci USA97(8)4192-7)和重组腺病毒作为佐剂的DNA疫苗，研究设计见表B。
此研究中出现的一些参数(a)FP9和MVA的顺序。证明了痘病毒载体基础免疫和加强免疫的最有效组合。尤其集中在研究设计的组1和组2(见表B)。
(b)基础免疫和加强免疫的频率。证明了用单个痘病毒基础免疫，单个异源的痘病毒载体加强免疫的有效性(免疫原性)，尤其集中在免疫组3的动物。
读取此免疫策略的核心目的是诱导细胞免疫反应。因此下面的分析被用于监测细胞免疫反应用重叠多肽(如图9所示的10个氨基酸重叠的20mers)的IFN-γELISpot，CD8+和CD4+T细胞胞内细胞因子染色。在ELISpot分析中CD4/8缺失实验证实IFN-γ的分泌相应于CD4+和或CD8+T细胞多肽。
组4的资料如下。该资料表明了采用新的基础-加强免疫策略在猕猴HIV免疫治疗中的免疫原性。
表1免疫和取样时间表

结果GPN插入片段是免疫原性的并且在病毒载体免疫猕猴后能够诱导分泌γ干扰素的T细胞。
在FP9.加强免疫之后7天能够检测到组4中4/5的动物的gpn-特异的T细胞反应。MVA加强免疫后可以维持该反应。
该资料表明采用重组载体传递的gpn融合蛋白在灵长类动物中是免疫原性的。
gpn的GAG、POL和NEF在经免疫的猕猴中可以被识别到。
图10、11和12显示的是单个动物对gpn蛋白不同部分的反应，其表明来源于gag、pol和nef蛋白的T细胞表位在同样反应的动物中能够被识别。例如组4中的动物N93显示T细胞反应可以识别GPN蛋白的GAG、POL和NEF部分，表明运用GPN可以诱导T细胞反应。另外，不希望被理论所束缚，三个GPN多肽不同单元引发的免疫反应幅度表明本发明在避免优势免疫效应方面的优势，优势免疫效应是单个表位引发的免疫反应在多肽其它表位的免疫反应中占优势。相反，本发明所述的多肽能更有利地产生平衡的免疫反应。
灵长类动物免疫原性的单个施用实验GPN多肽(SEQ ID No.1)的免疫原性测试是采用10只猕猴，标记为A-J，单个施用(“单独射击”)实验。在此实验中，多肽通过MVA或FP9载体传递。
如上所述进行ELISpot分析。119个重叠的约20mer的多肽(如实施例7所描述)的免疫反应被测量，然后相加产生一个总的反应。
在注射前和注射后28天测量其反应。结果如下。GPN在所有研究动物中均能够引发免疫反应。


结果表明GPN多肽是能够产生免疫性的并且在病毒载体免疫灵长类动物如猕猴后能够诱导γ干扰素分泌的T细胞。
因此本发明中重组基因在灵长类动物体内的有效性被证明。
实施例5异源的具有FP9.gpn和MVA.gpn基础-加强免疫策略诱导了增强的T细胞反应此例证明在异源或同源的基础-加强免疫策略中将FP9.gpn和MVA.gpn施用到受试者能够诱导增强的抗原特异的CD4+和CD8+T细胞反应。在此例中，该效果在小鼠中被证实。
通过将1×105PFU的FP9.gpn或1×106的MVA.gpn静脉注射免疫雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)。两周后用病毒以与进行基础免疫相同的方式进行加强免疫。
加强免疫14天后，用颈脱位法处死所有小鼠，通过上面实施例所描述的IFN-γELISpot测定法确定3个CD8+表位(表AAMQ，TTS，RGP)和1个CD4+表位(表ANPP)引发的T细胞反应。
用表位特异的IFNγ点形成细胞/百万脾细胞(sfc/million)的总数来计算结果。组间差异用单向ANOVA和采用GraphPad Instat version 3.05对log10转换数据的Tukey-Karamer多重比较测试来确定。
结果证明在基础加强免疫中用FP9.gpn和MVA.gpn免疫能够在小鼠中引发针对GPN的增强的T细胞反应，结果见图8。雌性BALB/c小鼠用FP9.gpn(FP9)或MVA.gpn(MVA)静脉注射免疫，阴性对照用PBS(-)免疫，14天后用上述病毒加强免疫。加强免疫后14天用IFN-γELISpot测定法确定脾细胞的CD8+T细胞反应。列代表每组4只小鼠的AMQ、TTS、RGP和NPP(见表A)引发的IFN-γ点形成细胞/百万脾细胞的平均数±标准差的总和。
异源的FP9.gpn和MVA.gpn以任意顺序的基础加强免疫与任一病毒对受体进行的同源免疫(图8)相比较能够引发针对GPN来源的表位的显著增强的全部T细胞反应(P＜0.001)。
异源的FP9.gpn/MVA.gpn或MVA.gpn/FP9.gpn免疫，与用同源的FP9.gpn/FP9.gpn或MVA.gpn/MVA.gpn免疫相比较能够引发针对GPN的显著的更强的T细胞反应。
另外，有利的是，这些病毒可以在基础免疫和加强免疫中互相替换。
因此证明了重组HIV基因例如gpn基因的有效性，尤其是当通过病毒载体例如禽痘或基于MVA的载体传递时。
实施例6异源的FP9.gpn和MVA.gpn基础加强免疫引发针对gpn蛋白单个成分的增强的CD8+和CD4+T细胞反应证明异源的FP9.gpn和MVA.gpn或者FP9.gpn和MVA.gpn基础加强免疫能够引发针对GPN多肽构成部分的增强的抗原特异的CD4+和CD8+T细胞反应。此例是在小鼠中被证实。
用1×106PFU的FP9.gpn或1×106PFU的MVA.gpn静脉注射免疫雌性BALB/c和C57/BL6小鼠(6-8周龄)。两周后用病毒以与基础免疫相同的方式对它们进行加强免疫。
加强免疫14天后，用颈脱位法处死所有小鼠，通过上述实施例所描述的IFN-γELISpot测定法确定GPN序列来源的多肽库(20个氨基酸，重叠10个氨基酸)引发的T细胞反应。
用表位特异的IFNγ点形成细胞/百万脾细胞(sfc/million)的总数来计算每个多肽的结果。
结果异源的FP9.gpn和MVA.gpn(或相反顺序)基础加强免疫，与采用相同载体同源免疫(图8)相比较能够引发针对GPN序列的增强的T细胞反应。
另外，这些T细胞反应包括针对GPN多肽不同区域来源的表位的CD8+和CD4+反应。
因此，异源的基础加强免疫是本发明的重组基因的高度有效的应用。
实施例7GPN中小鼠的表位作图编码人类免疫缺陷病毒(HIV)的gag、pol和nef多聚蛋白(gpn；图1；SEQID NO11)的基因插入到痘病毒载体修饰的痘苗病毒Ankara(MVA.gpn)和减毒的鸡痘病毒(FP9.gpn)。评价在BALB/c小鼠中通过这些载体基础加强免疫引发的针对gpn的免疫反应。这些研究表明运用重叠多肽池可以检测针对多肽gag、pol和nef区域的T细胞反应。该研究的一个目的是要在反应的肽池中分离单个肽，并由此来确定在多肽gag、pol和nef区域的反应表位的位置。
此实施例中，从每个反应的肽池中识别免疫原性表位，描绘引发识别的多肽的特异的IFN-γ反应的T细胞亚型。识别表位的相应序列与其它研究相比较。
方法小鼠和免疫在全部实验中均采用雌性BALB/c小鼠(H2d；6-8周龄)，与1986年theU.K动物法(科学规程)要求一致，在单独的通风的笼子中饲养。1×106pfu的重组病毒静脉注射(尾静脉注射100μl)。
免疫分析如上面所描述的进行ELISPOT分析。阴性对照的3倍标准差作为截取值(反应＞60SFCs每百万)用于检测阳性反应。
CD4+和CD8+细胞的缺失在含1％胎牛血清的PBS中制备单个细胞悬液，根据制造商说明，与抗CD4或抗CD8的MACS磁珠(Miltenyi Biotech，Germany)一起4℃孵育15分钟。完全孵育后，洗细胞一遍(PBS，1％胎牛血清)，然后装到放置在MACS磁体的MACS柱上。通过双色流式细胞仪确定细胞亚型缺失前后的CD4和CD8细胞含量。CD4+缺失的脾细胞含＜1％的CD4+细胞，而＞6％的CD8+细胞仍然存在于CD8+缺失的脾细胞中。
多肽共合成119条跨越整个gpn序列的重叠的约20mer的多肽(表1)，它们由Natural and Medical Sciences Institute(NMI；Reutlingen，Germany)合成。多肽被分成6个肽池。
表1研究中所使用的多肽







结果从每个反应肽池中识别免疫原性表位通过IFN-γ进行反应肽池的单个表位作图。
运用每个肽池(见图13)来源的重叠多肽进行ELISPOT分析。图13显示的是肽池引发的IFN-γ反应及重叠多肽片段覆盖整个gpn序列(带标记)。雌性BALB/c小鼠(H2d；n＝4只小鼠)各组用1×106空斑形成单位(pfu)的MVA.gpn静脉注射(i.v.)免疫。14天后，用1×106pfu的FP9.gpn静脉注射加强免疫。加强免疫14天后，去除脾脏，收集(n＝4个脾脏)，通过IFN-γELISPOT确定每百万个脾细胞的IFN-γ点形成细胞(SFC)数。列代表SFC/million数。
这些结果表明下面的反应肽池中单个多肽被识别肽池gag 1中肽7NTVGGHQAAMQMLKETI肽8AAMQMLKETINEEAAEWDRL肽15GEIYKRWIILGLNKIVRMY肽池pol1中肽50LKEPVHGVYYDPSKDLIAEI肽池pol2中肽66KQWPLTEEKIKALVEICTEM肽85TKIEELRQHLLRWGFTTPDK肽池nef2中肽118EPARGPGRAFVTIYPYDVnef2中加下划线的序列相对应于报告表位，其被添加用于诱导IFN-γ反应的测量。倒数第二条多肽、序号118上的反应表明全部GPN多聚蛋白被表达。然而肽池nef2中检测到的IFN-γ反应不是天然nef来源的表位序列引起的，而是插入的报告表位。对于BALB/c小鼠(H-2d)，实施例8nef中包含非常少的CD8+T细胞表位，因此在nef中没有反应也不意外。
确定引发识别的多肽特异的IFN-γ反应的T细胞亚型图14显示的是从gpn序列中筛选的多肽引发的IFN-γ反应。雌性BALB/c小鼠(H2d；n＝4只小鼠)各组用1×106空斑形成单位(pfu)的MVA.gpn静脉注射(i.v.)免疫。14天后，用1×106pfu的FP9.gpn静脉注射加强免疫。加强免疫14天后，去除脾脏，收集(n＝4个脾脏)，如所示的不处理或者缺失CD4+细胞或缺失CD8+细胞。通过IFN-γELISPOT确定每百万个脾细胞的IFN-γ斑形成的细胞(SFC)数。列代表SFC数/百万(million)。
CD4+细胞缺失研究证明用多肽15和66活体外刺激后IFN-γ分泌显著减少，而多肽118刺激后观察到适量的减少。这些发现表明CD4+T细胞引发针对多肽15、66和118的IFN-γ反应(见图14)。
CD8+T细胞缺失观察到针对多肽7、50、85和118的IFN-γ反应部分减少。这些多肽的IFN-γ反应部分减少表明它们被CD8+T细胞调节(见图14)。
识别表位与其它描述的表位序列比较为了确定该研究中识别的多肽序列是否以前被定义过，它们与LosAlamos HIV序列数据库(小鼠；见实施例8(BALB/c；H2d))中的序列进行比较。
根据实施例8，相应于多肽7、8、15和118序列的表位以前在BALB/c小鼠中被识别，而相应于多肽50、66和85序列的表位以前没有被描述过。
相应于在此描述的全部7条多肽序列的表位被识别作为在HIV感染的人中的免疫原，如表2所示。
表2Los Alamos HIV数据库搜索结果

这些结果表明用异源的MVA.gpn和FP9.gpn基础-加强免疫能够在BALB/c小鼠中引发针对gpn分子的gag和pol区域的有效的CD4+和CD8+IFN-γ分泌的T细胞反应。与以前对BALB/c小鼠进行的研究一致，在nef分子中没有识别到免疫原性表位。
上述说明书中所公开的出版物作为参考并入本文。在不脱离本发明的精神和范围内的各种修改以及对本发明所描述的方法和系统的变化，对本领域技术人员是显而易见的。尽管本发明已结合详细的优选实施例进行了描述，但应当理解为，本发明所要求保护的范围不仅限于这些详细的实施例。实际上，对实现本发明所描述的方式的各种修改，对生物化学、生物工艺学或相关领域的技术人员来说均是显而易见的，可以认为是在本权利要求的范围内。
实施例8通过蛋白绘制细胞毒性T淋巴细胞的表位位置图此实施例提出优选的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，HIV分子免疫2002通过蛋白绘制细胞毒性T淋巴细胞的表位位置图；理论生物学和生物物理学，Los Alamos National Laboratory，2003年8月7日。显示了小于22个氨基酸的线性的细胞毒性T淋巴细胞表位。而且还显示了优选的辅助T细胞表位的表位图。
p17 CTL表位图1 p17 CTL表位图p17 CTL图aa 1-50 1/2
p17 CTL表位图p17 CTL图aa 1-50 2/2
p17 CTL表位图p17 CTL图aa 51-100 1/2
p17 CTL表位图p17 CTL图aa 51-100 2/2 图5p17 CTL图aa 101-132
p24 CTL表位图2 p24 CTL表位图p24 CTL图aa 1-50 1/2
p24 CTL表位图p24 CTL图aa 1-50 2/2
p24 CTL表位图p24 CTL图aa 51-100 1/2 图9p24CTL图aa 51-100 2/2
p24 CTL表位图p24 CTL图aa 101-150 1/2
p24 CTL表位图p24 CTL图aa 101-150 2/2
p24 CTL表位图p24 CTL图aa 151-200 1/2
p24 CTL表位图p24 CTL图aa 151-200 2/2 图14p24CTL图aa 201-231
RT CTL表位图5 RT CTL表位图RT CTL图aa 1-50 图21RTCTL图aa 51-100
RT CTL表位图RT CTL图aa 101-150
RT CTL表位图RT CTL图aa 101-150
RT CTL表位图RT CTL图aa 251-300
RT CTL表位图RT CTL图aa 301-350
RT CTL表位图RT CTL图aa 351-400 图28RT CTL图aa 401-450 图29RT CTL图aa 451-500
RT CTL表位图RT CTL图aa 501-550 图31RT CTL图aa 551-560LVSAGIRKVL|560
Nef CTL表位图13 Nef CTL表位图Nef CTL 图aa 1-50
Nef CTL表位图Nef CTL图aa 51-100 1/3
Nef CTL表位图Nef CTL图aa 51-100 2/3
Nef CTL表位图Nef CTL图aa 51-100 3/3
Nef CTL表位图Nef CTL图aa 101-150 1/2
Nef CTL表位图Nef CTL图aa 101-150 2/2 图78Nef CTL图aa 151-200
Nef CTL表位图Nef CTL图aa 201-206
p17 T-辅助细胞表位图1 p17 T-辅助细胞表位图p17 T-辅助细胞图aa 1-50 图2p17 T-辅助细胞图aa 51-100 图3p17 T-辅助细胞图aa 101-132
p24 T-辅助细胞表位图2 p24 T-辅助细胞表位图p24 T-辅助细胞图aa 1-50 Figure 5p24T-Helper Map aa 51-100 图6p24 T-辅助细胞图aa 101-150
p24 T-辅助细胞表位图p24 T-辅助细胞图aa 151-200 图8p24 T-辅助细胞图aa 201-231ILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL| | |210 220 230
RT T-辅助细胞表位图5 RT T-辅助细胞表位图RT T-辅助细胞图aa 1-50 图15RT T-辅助细胞图aa 51-100 图16RT T-辅助细胞图aa 101-150 图17RT T-辅助细胞图aa 151-200 图18RT T-辅助细胞图aa 201-250
RT T-辅助细胞表位图RT T-辅助细胞图aa 251-300 图20RT T-辅助细胞图aa 301-350 图21RT T-辅助细胞图aa 351-400 图22RT T-辅助细胞图aa 401-450 图23RT T-辅助细胞图aa 451-500KLGKAGYVTNRGRQKVVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQ| | | | |460 170 480 490 500图24RT T-辅助细胞图aa 501-550
RT T-辅助细胞表位图RT T-辅助细胞图aa 551-560LVSAGIRKVL|560
Nef T-辅助细胞表位图13 Nef T-辅助细胞表位图Nef T-辅助细胞图aa 1-50 图65Nef T-辅助细胞图aa 51-100 图66Nef T-辅助细胞图aa 101-150 图67Nef T-辅助细胞图aa 151-200 图68Nef T-辅助细胞图aa 201-206
序列表SEQ ID NO1人工序列-GPNM A P I V Q N L Q G Q M V H Q A I S P R T L N A W V K V V E E K A F SP E V I P M F S A L S E G A T P Q D L N T M L N T V G G H Q A A M Q ML K E T I N E E A A E W D R L H P V H A G P I A P G Q M R E P R G S DI A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G E I Y K R W I I L G LN K I V R M Y S P T S I L D I R Q G P K E P F R D Y V D R F Y K T L RA E Q A S Q E V K N W M T E T L L V Q N A N P D C K T I L K A L G P AA T L E E M M T A C Q G V G G P G H K A R V L M A A R A S V L S G G EL D R W E K I R L R P G G K K K Y K L K H I V W A S R E L E R F A V NP G L L E T S E G C R Q I L G Q L Q P S L Q T G S E E L R S L Y N T VA T L Y C V H Q R I E V K D T K E A L E K I E E E Q N K S K K K A Q QA A A D T G N S S Q V S Q N Y T P D K K H Q K E P P F L W M G Y E L HP D K W T V Q P I V L P E K D S W T V N D I Q K L V G K L N W A S Q IY A G I K V K Q L C K L L R G T K A L T E V I P L T E E A E L E L A EN R E I L K E P V H G V Y Y D P S K D L I A E I Q K Q G Q G Q W T Y QI Y Q E P F K N L K T G K Y A R M R G A H T N D V K Q L T E A V Q K IA T E S I V I W G K T P K F K L P I Q K E T W E A W W T E Y W Q A T WI P E W E F V N T P P L V K L W Y Q L E K E P I V G A E T F P I S P IE T V P V K L K P G M D G P K V K Q W P L T E E K I K A L V E I C T EM E K E G K I S K I G P E N P Y N T P V F A I K K K D S T K W R K L VD F R E L N K R T Q D F W E V Q L G I P H P A G L K K K K S V T V L DV G D A Y F S V P L D K D F R K Y T A F T I P S I N N E T P G I R Y QY N V L P Q G W K G S P A I F Q S S M T K I L E P F R K Q N P D I V IY Q Y M D D L Y V G S D L E I G Q H R T K I E E L R Q H L L R W G F TT P D K K H Q K E P P F L V W K F D S R L A F H H M A R E L H P E Y YK D C D P E K E V L V W K F D A N E G E N N S L L H P M S L H G M D DP E K E V P E K V E E A N E G E N G P G I R Y P L T F G W C F K L V PV E P E K V E E W Q N Y T P G P G I R Y Q K R Q D I L D L W V Y H T QG Y F P D W Q N Y T P E G L I Y S Q K R Q D I P M T Y K A A L D L S HF L K E K G G L E G L I Y S P Q V P L R P M T Y K A A D C A W L E A QE E E E V G F P V R P Q V P L R N T A A N N A D C A W L A D G V G A VS R D L E K H G A I T S S N T A A N N R R A E P A A D G V G A M G G KW S K R S V V G W P T V R E R M R R A E P A R G P G R A F V T I Y P YD V P D Y A
SEQ ID NO2人工序列-GAG P24M A P I V Q N L Q G Q M V H Q A I S P R T L N A W V K V V E E K A F SP E V I P M F S A L S E G A T P Q D L N T M L N T V G G H Q A A M Q ML K E T I N E E A A E W D R L H P V H A G P I A P G Q M R E P R G S DI A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G E I Y K R W I I L G LN K I V R M Y S P T S I L D I R Q G P K E P F R D Y V D R F Y K T L RA E Q A S Q E V K N W M T E T L L V Q N A N P D C K T I L K A L G P AA T L E E M M T A C Q G V G G P G H K A R V LSEQ ID NO3人工序列-GAG P17M A A R A S V L S G G E L D R W E K I R L R P G G K K K Y K L K H I VW A S R E L E R F A V N P G L L E T S E G C R Q I L G Q L Q P S L Q TG S E E L R S L Y N T V A T L Y C V H Q R I E V K D T K E A L E K I EE E Q N K S K K K A Q Q A A A D T G N S S Q V S Q N YSEQ ID NO4人工序列-POL P51重复序列T P D K K H Q K E P P FSEQ ID NO5人工序列-POL P51核心序列L W M G Y E L H P D K W T V Q P I V L P E K D S W T V N D I Q K L V GK L N W A S Q I Y A G I K V K Q L C K L L R G T K A L T E V I P L T EE A E L E L A E N R E I L K E P V H G V Y Y D P S K D L I A E I Q K QG Q G Q W T Y Q I Y Q E P F K N L K T G K Y A R M R G A H T N D V K QL T E A V Q K I A T E S I V I W G K T P K F K L P I Q K E T W E A W WT E Y W Q A T W I P E W E F V N T P P L V K L W Y Q L E K E P I V G AE T F P I S P I E T V P V K L K P G M D G P K V K Q W P L T E E K I KA L V E I C T E M E K E G K I S K I G P E N P Y N T P V F A I K K K DS T K W R K L V D F R E L N K R T Q D F W E V Q L G I P H P A G L K KK K S V T V L D V G D A Y F S V P L D K D F R K Y T A F T I P S I N NE T P G I R Y Q Y N V L P Q G W K G S P A I F Q S S M T K I L E P F RK Q N P D I V I Y Q Y M D D L Y V G S D L E I G Q H R T K I E E L R QH L L R W G F T
SEQ ID NO6人工序列-拼接的NEFL V W K F D S R L A F H H M A R E L H P E Y Y K D C D P E K E V L V WK F D A N E G E N N S L L H P M S L H G M D D P E K E V P E K V E E AN E G E N G P G I R Y P L T F G W C F K L V P V E P E K V E E W Q N YT P G P G I R Y Q K R Q D I L D L W V Y H T Q G Y F P D W Q N Y T P EG L I Y S Q K R Q D I P M T Y K A A L D L S H F L K E K G G L E G L IY S P Q V P L R P M T Y K A A D C A W L E A Q E E E E V G F P V R P QV P L R N T A A N N A D C A W L A D G V G A V S R D L E K H G A I T SS N T A A N N R R A E P A A D G V G A M G G K W S K R S V V G W P T VR E R M R R A E P ASEQ ID NO7人工序列-gp160鼠CD8标签R G P G R A F V T ISEQ ID NO8人工序列-HA标签Y P Y D V P D Y ASEQ ID NO9人工序列-GPN核心序列M A P I V Q N L Q G Q M V H Q A I S P R T L N A W V K V V E E K A F SP E V I P M F S A L S E G A T P Q D L N T M L N T V G G H Q A A M Q ML K E T I N E E A A E W D R L H P V H A G P I A P G Q M R E P R G S DI A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G E I Y K R W I I L G LN K I V R M Y S P T S I L D I R Q G P K E P F R D Y V D R F Y K T L RA E Q A S Q E V K N W M T E T L L V Q N A N P D C K T I L K A L G P AA T L E E M M T A C Q G V G G P G H K A R V L M A A R A S V L S G G EL D R W E K I R L R P G G K K K Y K L K H I V W A S R E L E R F A V NP G L L E T S E G C R Q I L G Q L Q P S L Q T G S E E L R S L Y N T VA T L Y C V H Q R I E V K D T K E A L E K I E E E Q N K S K K K A Q QA A A D T G N S S Q V S Q N Y T P D K K H Q K E P P F L W M G Y E L HP D K W T V Q P I V L P E K D S W T V N D I Q K L V G K L N W A S Q IY A G I K V K Q L C K L L R G T K A L T E V I P L T E E A E L E L A EN R E I L K E P V H G V Y Y D P S K D L I A E I Q K Q G Q G Q W T Y Q
I Y Q E P F K N L K T G K Y A R M R G A H T N D V K Q L T E A V Q K IA T E S I V I W G K T P K F K L P I Q K E T W E A W W T E Y W Q A T WI P E W E F V N T P P L V K L W Y Q L E K E P I V G A E T F P I S P IE T V P V K L K P G M D G P K V K Q W P L T E E K I K A L V E I C T EM E K E G K I S K I G P E N P Y N T P V F A I K K K D S T K W R K L VD F R E L N K R T Q D F W E V Q L G I P H P A G L K K K K S V T V L DV G D A Y F S V P L D K D F R K Y T A F T I P S I N N E T P G I R Y QY N V L P Q G W K G S P A I F Q S S M T K I L E P F R K Q N P D I V IY Q Y M D D L Y V G S D L E I G Q H R T K I E E L R Q H L L R W G F TT P D K K H Q K E P P F L V W K F D S R L A F H H M A R E L H P E Y YK D C D P E K E V L V W K F D A N E G E N N S L L H P M S L H G M D DP E K E V P E K V E E A N E G E N G P G I R Y P L T F G W C F K L V PV E P E K V E E W Q N Y T P G P G I R Y Q K R Q D I L D L W V Y H T QG Y F P D W Q N Y T P E G L I Y S Q K R Q D I P M T Y K A A L D L S HF L K E K G G L E G L I Y S P Q V P L R P M T Y K A A D C A W L E A QE E E E V G F P V R P Q V P L R N T A A N N A D C A W L A D G V G A VS R D L E K H G A I T S S N T A A N N R R A E P A A D G V G A M G G KW S K R S V V G W P T V R E R M R R A E P ASEQ ID NO10人类免疫缺陷病毒-天然NEFM G G K W S K R S V V G W P T V R E R M R R A E P A A D G V G A V S R D L E K H G A IT S S N T A A N N A D C A W L E A Q E E E E V G F P V R P Q V P L R P M T Y K A A L D LS H F L K E K G G L E G L I Y S Q K R Q D I L D L W V Y H T Q G Y F P D W Q N Y T P G PG I R Y P L T F G W C F K L V P V E P E K V E E A N E G E N N S L L H P M S L H G M D DP E K E V L V W K F D S R L A F H H M A R E L H P E Y Y K D C
SEQ ID NO11人工序列-gpn核苷酸序列C CG G G C C CG C C G C C A C C A T G G C C C C C A T C G T G C A GA A C C T G C A A G G C C A G A T G G T G C A C C A G G C C A T C A GC C C C A G A A C C C T G A A T G C C T G G G T G A A G G T G G T G GA G G A G A A G G C C T T C A G C C C T G A G G T G A T C C C T A T GT T C A G C G C C C T G A G C G A G G G C G C C A C C C C C C A G G AC C T G A A C A C C A T G C T G A A T A C C G T G G G C G G C C A T CA G G C C G C C A T G C A G A T G C T G A A G G A G A C C A T C A A CG A G G A G G C C G C C G A G T G G G A C A G A C T G C A C C C C G TG C A C G C C G G A C C T A T C G C C C C T G G C C A G A T G A G A GA G C C C A G A G G C A G C G A C A T C G C C G G C A C C A C C A G CA C C C T G C A A G A G C A G A T C G G C T G G A T G A C C A A C A AC C C C C C T A T C C C T G T G G G C G A G A T C T A C A A G A G A TG G A T C A T C C T G G G C C T G A A C A A G A T C G T G A G A A T GT A C A G C C C T A C C A G C A T C C T G G A C A T C A G A C A G G GA C C C A A G G A G C C C T T C A G A G A C T A C G T G G A C A G G TT C T A C A A G A C C C T G A G A G C C G A G C A G G C C A G C C A GG A A G T G A A G A A C T G G A T G A C C G A G A C C C T G C T G G TG C A G A A C G C C A A C C C C G A C T G C A A G A C C A T C C T G AA G G C C C T G G G A C C T G C C G C T A C C C T G G A G G A G A T GA T G A C C G C C T G C C A G G G C G T G G G C G G A C C T G G C C AC A A G G C C A G A G T G C T C A T G G C C G C C A G A G C C A G C GT G C T G A G C G G C G G A G A G C T G G A T A G A T G G G A G A A GA T C A G A C T G A G A C C T G G C G G C A A G A A G A A G T A C A AG C T G A A G C A C A T C G T G T G G G C C T C T A G G G A G C T G GA G A G A T T C G C C G T G A A T C C T G G C C T G C T G G A G A C CA G C G A G G G C T G T A G A C A G A T C C T G G G C C A G C T G C AA C C C A G C C T G C A A A C C G G C T C T G A G G A G C T G A G A TC C C T G T A C A A C A C C G T G G C C A C C C T G T A C T G C G T GC A C C A G A G A A T C G A G G T G A A G G A C A C A A A G G A G G CC C T G G A G A A G A T C G A G G A G G A G C A G A A C A A G T C C AA G A A G A A G G C C C A G C A G G C C G C T G C C G A C A C C G G CA A C A G C A G C C A G G T G A G C C A G A A C T A C A C C C C C G AC A A G A A G C A C C A G A A G G A G C C C C C T T T C C T G T G G AT G G G C T A C G A G C T G C A C C C C G A T A A G T G G A C C G T GC A G C C C A T C G T G C T G C C T G A G A A G G A T A G C T G G A CC G T G A A C G A C A T C C A G A A G C T G G T G G G C A A G C T G A
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T G C A C G G C A T G G A T G A T C C T G A G A A A G A A G T G C C CG A G A A G G T G G A A G A G G C C A A T G A G G G A G A A A A C G GC C C T G G C A T T A G A T A T C C C C T C A C C T T C G G C T G G TG C T T C A A G C T G G T G C C T G T G G A G C C T G A G A A A G T GG A G G A A T G G C A G A A T T A C A C A C C C G G C C C A G G C A TC C G G T A T C A G A A G A G A C A G G A C A T T C T G G A C C T G TG G G T G T A C C A C A C C C A G G G C T A C T T C C C C G A C T G GC A G A A C T A T A C T C C T G A G G G C C T C A T C T A C A G C C AG A A G C G G C A G G A T A T C C C C A T G A C C T A C A A G G C C GC C C T G G A T C T G A G C C A C T T T C T G A A A G A G A A G G G CG G C C T G G A G G G C T T G A T C T A C T C C C C A C A G G T G C CA C T G A G A C C T A T G A C A T A T A A G G C T G C C G A C T G C GC C T G G C T G G A G G C C C A G G A A G A G G A G G A A G T G G G CT T C C C T G T G A G A C C C C A G G T G C C C C T G C G G A A C A CC G C C G C C A A T A A T G C C G A T T G T G C T T G G C T C G C C GA C G G C G T G G G A G C C G T G A G C A G a G A C C T G G A A A A GC A C G G C G C C A T C A C C A G C A G C A A T A C A G C C G C C A AC A A C A G A A G A G C C G A G C C T G C C G C C G A T G G A G T G GG C G C C A T G G G C G G C A A G T G G A G C A A G A G A T C C G T GG T G G G C T G G C C C A C C G T G A G A G A A A G A A T G A G A A GG G C C G A A C C C G C C A G A G G A C C C G G C A G A G C C T T C GT G A C C A T C T A C C C C T A C G A C G T G C C C G A C T A C G C TT G A T G AG G C G C G C CC T5-prime ApaI和3-prime AscI位点用下划线标出。起始密码子ATG和终止密码子TGA用粗体标出。
SEQ ID NO12人工序列-破坏的polT P D K K H Q K E P P F L W M G Y E L H P D K W T V Q P I V L P E K DS W T V N D I Q K L V G K L N W A S Q I Y A G I K V K Q L C K L L R GT K A L T E V I P L T E E A E L E L A E N R E I L K E P V H G V Y Y DP S K D L I A E I Q K Q G Q G Q W T Y Q I Y Q E P F K N L K T G K Y AR M R G A H T N D V K Q L T E A V Q K I A T E S I V I W G K T P K F KL P I Q K E T W E A W W T E Y W Q A T W I P E W E F V N T P P L V K LW Y Q L E K E P I V G A E T F P I S P I E T V P V K L K P G M D G P KV K Q W P L T E E K I K A L V E I C T E M E K E G K I S K I G P E N PY N T P V F A I K K K D S T K W R K L V D F R E L N K R T Q D F W E VQ L G I P H P A G L K K K K S V T V L D V G D A Y F S V P L D K D F RK Y T A F T I P S I N N E T P G I R Y Q Y N V L P Q G W K G S P A I FQ S S M T K I L E P F R K Q N P D I V I Y Q Y M D D L Y V G S D L E IG Q H R T K I E E L R Q H L L R W G F T T P D K K H Q K E P P FSEQ ID NO13人工序列-破坏的gagM A P I V Q N L Q G Q M V H Q A I S P R T L N A W V K V V E E K A F SP E V I P M F S A L S E G A T P Q D L N T M L N T V G G H Q A A M Q ML K E T I N E E A A E W D R L H P V H A G P I A P G Q M R E P R G S DI A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G E I Y K R W I I L G LN K I V R M Y S P T S I L D I R Q G P K E P F R D Y V D R F Y K T L RA E Q A S Q E V K N W M T E T L L V Q N A N P D C K T I L K A L G P AA T L E E M M T A C Q G V G G P G H K A R V L M A A R A S V L S G G EL D R W E K I R L R P G G K K K Y K L K H I V W A S R E L E R F A V NP G L L E T S E G C R Q I L G Q L Q P S L Q T G S E E L R S L Y N T VA T L Y C V H Q R I E V K D T K E A L E K I E E E Q N K S K K K A Q QA A A D T G N S S Q V S Q N YSEQ ID NO14用于Gag p24的Kozak序列GCC GCC ACC ATG G
权利要求
1.一种重组多肽，其包含的氨基酸序列来源于(i)HIV gag基因产物；(ii)HIV pol基因产物；和(iii)HIV nef基因产物，其中氨基酸序列相对于所述基因产物的天然序列发生突变并且基本上保留了如详述于实施例8的p17和p24(gag)、RT(pol)的氨基酸1-440和nef的所述基因产物的全部天然CD8+T细胞表位，该多肽包含的氨基酸序列与SEQ IDNO9至少有75％的一致性。
2.根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述多肽包含与SEQ IDNO9至少有95％的一致性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述序列的一致性是指表位间序列的一致性。
4.根据权利要求3所述的重组多肽，其中所述多肽包含SEQ IDNO9。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的重组多肽，其基本上包含了如详述于实施例8中的p17和p24(gag)、RT(pol)的氨基酸1-440和nef的所述基因产物的全部天然T辅助表位。
6.一种包含来源于至少下面两个基因产物的氨基酸序列的重组多肽(i)HIV gag基因产物；(ii)HIV pol基因产物；或(iii)HIV nef基因产物，其中氨基酸序列相对于所述基因产物的天然序列产生突变并且基本上保留了如详述于实施例8的p17和p24(gag)、RT(pol)的氨基酸1-440和nef的所述基因产物的相应部分的全部天然CD8+T细胞表位。
7.根据权利要求6所述的重组多肽，其包含来源于(i)、(ii)和(iii)的氨基酸序列。
8.根据上述任一权利要求所述的重组多肽，所述多肽包含来源于HIV nef基因产物的氨基酸序列，所述重组多肽序列被突变以破坏所述nef序列的功能，所述nef序列进一步包含一个或多个天然nef基因中不存在的T辅助表位。
9.根据权利要求8所述的重组多肽，其包含一个或多个天然nef序列中不存在的并显示于图3A中的T辅助表位。
10.根据权利要求8或要求9所述的重组多肽，其包含一个或多个表3A显示的而表3B不存在的T辅助表位。
11.根据权利要求8至10任一所述的重组多肽，其进一步包含如实施例8中详述的nef基因产物的全部天然CD8+T细胞表位。
12.根据权利要求8至11任一所述的重组多肽，其进一步包含如实施例8中详述的全部天然nef人T辅助表位。
13.根据权利要求8至12任一所述的重组多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO6所示的序列，或者包含与其至少有95％一致性的序列。
14.根据上述任一权利要求所述的重组多肽，其中该多肽包含来源于HIVpol基因产物的氨基酸序列，该重组多肽序列被突变以破坏pol序列的逆转录酶活性，其中该重组多肽保留了如实施例8中所示的RT(pol)氨基酸1-440的天然pol序列的基本上全部的CD8+T细胞表位。
15.根据权利要求14所述的重组多肽，其中通过天然pol基因中央序列来源的内部序列的重复及该pol序列的氨基端和羧基端的交换使pol序列的逆转录酶活性突变。
16.根据权利要求15所述的重组多肽，其中所述重复的内部序列包含TPDKKHQKEPPF(SEQ ID NO4)。
17.根据权利要求15或要求16所述的重组多肽，其中该多肽包含SEQID NO12所示的序列，或者包含与其至少有95％一致性的序列。
18.根据上述任一权利要求所述的重组多肽，该多肽包含来源于HIV gag基因产物的氨基酸序列，该重组多肽序列被突变以破坏gag基因产物的加工，并且该gag序列进一步包含一个被破坏的豆蔻酰化位点，其中该重组多肽基本上保留了如实施例8详述的p17和p24(gag)的天然gag序列的全部CD8+T细胞表位。
19.根据权利要求18所述的重组多肽，其中通过p17和p24区域的交换来破坏gag的加工，通过将第二个甘氨酸突变成丙氨酸来破坏豆蔻酰化位点。
20.根据权利要求18或19所述的重组多肽，其中该多肽包含如SEQID NO13所示的序列，或者包含与其至少有95％一致性的序列。
21.根据上述任一权利要求所述的重组多肽，其进一步包含抗体识别标签，其中该标签是包含如SEQ ID NO8所示序列的HA标签。
22.根据上述任一权利要求所述的重组多肽，其进一步包含CD8+T细胞表位标签，其中该标签是gp160来源的包含如SEQ ID NO7所示序列的标签。23.根据上述任一权利要求所述的重组多肽，该多肽包含如SEQ ID NO1所示的序列。
24.根据上述任一权利要求所述的重组多肽，其中HIV是HIV分化体B。
25.一种编码根据上述任一权利要求所述的多肽的重组核酸编。
26.一种重组核酸序列，其包含SEQ ID NO11，或者与其仅区别在遗传密码的沉默突变的序列，或者与其至少有95％的一致性的序列。
27.一种编码根据权利要求1至24任一所述的多肽的病毒载体，该病毒载体选自痘病毒、腺病毒、AAV、α病毒、VSV、HSV和仙台病毒。
28.根据权利要求27所述的病毒载体，其中该载体是MVA或MVA来源的载体。
29.根据权利要求27所述的病毒载体，其中该载体是禽痘或禽痘来源的载体。
30.根据权利要求29所述的病毒载体，其中该载体是FP9禽痘病毒载体。
31.一种核酸载体，其包含根据权利要求25或26所述的核酸序列，或者编码根据权利要求1至24任一所述的多肽的核酸序列。
32.一种腺病毒载体，其包含根据权利要求25或26所述的核酸序列，或者编码根据权利要求1至24任一所述的多肽的核酸序列。
33.一种痘病毒载体，其包含根据权利要求25或26所述的核酸序列，或者编码根据权利要求1至24任一所述的多肽的核酸序列。
34.一种选自p29D.gpn、pOPK6.gpn和pSG2.gpn质粒。
35.根据权利要求1至24任一所述的多肽在药物中的应用。
36.根据权利要求1至24任一所述的多肽在制备治疗或预防HIV感染的药物中的用途。
37.根据权利要求1至24任一所述的多肽在制备抗HIV感染的免疫的药物中的用途。
38.根据权利要求25至34任一所述的核酸或载体应用于药物。
39.根据权利要求25至34任一所述的核酸或载体应用于制备治疗或预防HIV感染的药物。
40.根据权利要求25至34任一所述的核酸或载体在制备抗HIV感染的免疫用药物中的用途。
41.一种使受试者获得抗HIV感染的免疫的方法，其包含向受试者施用根据权利要求1至24任一所述的多肽，或者根据权利要求25至34任一所述的核酸或载体。
42.根据权利要求1至24任一所述的多肽，或者根据权利要求25至34任一所述的核酸或载体在基础-加强免疫策略中作为引发剂或免疫加强剂的用途。
43.根据权利要求1至24任一所述的多肽，或者根据权利要求25至34任一所述的核酸或载体在诱导免疫反应中的用途。
44.根据权利要求43所述的用途，其中免疫反应选自CD8+T细胞反应、CD4+T细胞反应和体液反应。
45.一种在受试者中诱导免疫反应的方法，其包含向受试者施用根据权利要求1至24任一所述的多肽，或者根据权利要求25至34任一所述的核酸或载体。
46.根据权利要求45所述的方法，其中免疫反应选自CD8+T细胞反应、CD4+T细胞反应和体液反应。
47.一种重组多肽，其包含与SEQ ID NO9所示氨基酸序列至少有95％一致性的氨基酸序列。
48.一种单纯疱疹病毒载体，其包含根据权利要求25或要求26所述的核酸序列，或者编码根据权利要求1至24任一所述的多肽的核酸序列。
49.一种参考附图且基本上如上文中所描述的重组多肽、重组多聚核酸或病毒载体。
全文摘要
本发明涉及一种重组多肽，其包含的氨基酸序列来源于HIV gag基因产物、HIV pol基因产物、或HIV nef基因产物中的至少一种，该氨基酸序列与上述基因产物的天然序列相比较被突变并且保留了如详述于实施例8所示的p17和p24(gag)、RT(pol)的氨基酸1－440和nef的基因产物的每个天然CD8+T细胞表位。本发明还涉及编码上述多肽的核酸和病毒载体及它们在药物、免疫和疫苗中的应用。
文档编号C07K14/16GK1886509SQ200480034684
公开日2006年12月27日 申请日期2004年9月23日 优先权日2003年9月24日
发明者约尔根·施奈德 申请人:奥克森治疗有限公司