专利名称：一种重组人tPA的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组人tPA的制备方法，更具体涉及重组人tPA的发酵生产，以及发酵产品的变性、复性、纯化工艺技术。
tPA是目前最有效、最安全的溶栓药物，广泛用于治疗血栓引起的各种疾病，尤其急性心肌梗塞病人和脑血栓病人的抢救治疗。本发明提供的技术可应用于tPA的工业化生产。
背景技术：
组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator，tPA)是一种重要的溶栓剂，其主要功能是切割纤溶酶原蛋白使其激活成为纤溶酶而使纤维蛋白溶解，从而达到溶栓的目的。tPA优先激活与血栓或不溶性纤维蛋白结合的纤溶酶原发挥溶血栓和溶纤作用，因此对血栓部位具有特异性，不易造成其它部位出血，与其它溶栓药物如链激酶、尿激酶相比有巨大优势，是目前最有效、最安全的溶栓药物，广泛用于治疗血栓引起的各种疾病，尤其急性心肌梗塞病人和脑血栓病人的抢救治疗。1987年，基因工程技术生产的tPA在美国批准上市，商业名为阿克伐司(Activase)，在上世纪90年代中期的临床观察中被确认是治疗心肌梗塞最有效的药物。目前，美国、英国、德国等先进国家的tPA商品都已换代为tPA衍生物产品(即对天然tPA分子进行结构改造而得的tPA重组变异体)。
最先用于生产治疗用tPA的细胞系统是黑色素瘤细胞(Griffiths，JB.et al.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.1987，34147-166)。在随后一系列已经上市和即将上市的tPA衍生物产品中，大多也是采用动物细胞系统生产，如美国基因泰克(Genentech)公司开发的TNK酶(Tenecteplase)、美国布里斯托尔-迈尔斯普博(Bristol-MyersSpuibb)公司开发的nPA酶(Lanoteplase)，都是用中国仓鼠细胞(CHO)生产，日本卫材(Eisai)筑波研究所开发的孟替普酶(Monteplase)是用田鼠肾细胞生产。由于真核细胞培养系统存在细胞生长慢、生产产量低、培养基成分昂贵、培养条件要求高等特点，造成tPA成本很高，致使tPA产品价格居高不下，病人经济上难以承受。
大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统由于其操作简便、生产成本低廉，成为大多数蛋白质表达研究和生产的首选宿主细胞。采用大肠杆菌表达系统生产治疗用tPA在tPA药物研究的早期即受到研究人员关注并获得成功(Harris TJ et al.Mol.Biol.Med.1986，3279-292；Datar RV.et al.Biotechnology.1993，11349-357)，目前上市的tPA产品中，由德国宝丽曼(Boehringer Mannheim)公司开发的瑞替普酶(Reteplase，rPA)即是由大肠杆菌菌株K12生产。利用大肠杆菌表达系统表达tPA通常可以得到高表达量的重组蛋白，但随之而来的是表达蛋白质错误折叠，形成没有活性的蛋白。这种无活性的蛋白质常常聚集在一起，以包涵体的形式出现。包涵体的复性技术通常是用高浓度的变性剂，如尿素、盐酸胍等，将包涵体溶解，之后在去除变性剂得到复性蛋白。但是天然tPA以及有活性的重组tPA衍生物分子中含有大量的二硫键(天然tPA含17对二硫键)，造成tPA包涵体的复性困难和复性效率低下，纯化步骤增多，使得tPA包涵体的变性、复性和纯化等后处理工艺非常复杂，因此，采用大肠杆菌表达系统生产tPA的成本也很高，同样导致了tPA药品价格昂贵。
tPA作为具有显著疗效和巨大商业价值的重组基因工程药物，在我国始终没有产品生产，其发展瓶颈在于对tPA包涵体的变性、复性和纯化等后处理技术研究的匮乏。针对上述问题，本发明旨在提供一套高效生产重组tPA的生产工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组tPA的制备方法，本发明提供的tPA制备方法具有产量高、产品后处理工艺操作简便、成本低廉、效率高等优点，为克服目前tPA产品生产成本高，药品价格昂贵等问题提供了有效的解决途径。
本发明利用生产重组tPA的菌株是大肠杆菌菌株BL21/rtPAm-1(已交中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC M205112)。本发明提供的重组tPA制备方法，包括工程菌株的发酵生产、tPA包涵体的提取、复性、纯化、浓缩、tPA的冷冻干粉制备等技术工艺，叙述如下
1.工程菌株BL21/rtPAm-1的发酵生产包含以下步骤(1)斜面种子培养。用LB斜面固体培养基，含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml，从原始种子库中接种，37℃培养18-20小时。
(2)摇瓶种子培养。用2YT液体培养基，含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml。每个摇瓶用100ml培养基，接种一环生产种子，37℃振荡培养12-14小时。
(3)发酵培养。所用培养基为发酵培养基蛋白胨20g/L，酵母抽提物8g/L，NaCl 2g/L，MgSO40.2g/L，泡敌10μl/L，纯净水配制，至培养基体积10升。消毒前调节pH值至6.8-7.0。蒸汽消毒，缸压0.1MPa(120℃)20分钟。
发酵培养的控制条件和参数培养基体积10升，pH6.8-7.0接种量5％-10％搅拌机转速40Hz温度控制范围35-37℃罐压0.05-0.07MPa通气量3-5升/分钟(1∶0.3-1∶0.5)按上述条件和参数，培养至菌量6-8克/升、pH值上升到7.2-7.5、DO下降至20％以下时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，35-37℃继续培养，诱导蛋白质表达6-8小时。发酵全程为10-12小时，产生的重组tPA蛋白呈包涵体。
利用本发明的发酵方法可得到重组tPA包涵体，产量在1.0-1.3克tPA晶体(湿重)/升左右。发酵工艺的稳定性良好，用10升全自动发酵罐连续发酵生产10批次，菌体产量(湿重)稳定在8.0-10克/升，tPA晶体(纯化后，湿重)稳定在1.0-1.3克/升，平均产量达到1.1克/升。
2.tPA包涵体的提取和纯化。
离心收集发酵的BL21/rtPAm-1菌体，悬于纯净水中，超声波或高压匀质机破碎，离心去上清，沉淀用pH8.0的Tris-NaCl-吐温-20洗涤三次，离心收集沉淀，接着用纯净水洗涤三次，离心收集沉淀，沉淀经10％SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(10％SDS-PAGE)检查，tPA晶体含量在90％以上(图2、3)。沉淀可放-20℃冰箱保存。
3.包涵体的溶解和变性按5克tPA晶体(湿重)/升的量将tPA包涵体加到7-8M尿素中，用NaOH调节pH至9-10，加入还原剂β-巯基乙醇10-20mM，28-32℃搅拌溶解0.5-1小时，进行溶解和变性。
4.tPA复性，方法如下(1)加水将变性液稀释一倍，使尿素浓度降至4M以下，tPA开始复性。
(2)用G50Sephadex分子筛柱层析(购自安玛西亚公司)逐渐去除复性液中的尿素和还原剂β-巯基乙醇，使tPA逐步复性，同时又去除分子量30kD以下的杂蛋白。
(3)将收集的tPA溶液用pH8.0的10mM-20mM Tris-Cl进行稀释，至tPA浓度为1-2克湿重/升，在20-25℃及pH8.0的条件下，放置16-24小时，进行进一步复性。
tPA的复性方法是本发明中的一个关键步骤，经过多次试验优选而成。tPA包涵体的复性是在pH8.0的条件下，逐步降低尿素和还原剂β-巯基乙醇(β-ME)浓度进行的。尿素和还原剂的去除采用G50Sephadex分子筛层析柱进行，同时过G50 Sephadex柱对tPA起到初步纯化的作用。在G50 Sephadex柱层析之后，又用pH8.0的10mM-20mM Tris-Cl对tPA溶液进行大量稀释，进行进一步复性。经过本步骤处理，tPA纯度达95％以上(图3)，每毫升复性液中tPA活性达15000IU-20000IU，复性效率达10％左右。
5.tPA复性后的纯化和浓缩，包括步骤；(1)用Q-Sepharose 4FF柱(购自安玛西亚公司)分离复性正确和复性不正确的tPA蛋白。柱子先经0.5M HCl进行预处理，再用水洗至pH5.0-6.0，然后用2倍体积的pH8.0-8.5的20mM Tris-Cl进行平衡，复性液经过滤后，加入pH8.0的Tris-Cl至20mM，上柱，用pH7.5的10mM Tris-Cl，0.1-0.5M NaCl进行梯度洗脱，收集有活性的tPA洗脱峰，或用pH7.5的10mM Tris-Cl，0.15-0.2M NaCl洗脱杂蛋白，再用pH7.5的10mM Tris-Cl，0.25-0.35M NaCl洗脱有活性的tPA。
(2)进一步用疏水层析柱Phenyl-Sepharose 6FF(购自安玛西亚公司)对tPA进行纯化，柱子用pH6.5-7.5的5mM Tris-Cl，0.4-0.6M NaCl进行平衡，在Q-Sepharose 4 FF柱洗脱的tPA液中加入NaCl至0.4-0.6M，用HCl调节pH至7.0-7.5，上柱，用pH8.0-9.0的2.5-5mMTris进行洗脱，收集有活性的tPA。
(3)用膜滤器(天津膜天膜工程技术有限公司，型号UEIP905)对tPA洗脱液进行浓缩，至tPA浓度3×105IU/ml。
tPA复性后的纯化工艺是本发明中的另一个关键步骤，经过复性的tPA纯度达95％，但仍需把复性正确的与复性不正确的蛋白分开。本步骤关键之处在于使用Q-Sepharose 4FF柱分离复性正确和不正确的蛋白，然后用疏水层析柱Phenyl-Sepharose 6FF对tPA进行进一步的纯化。本步骤之优选条件亦是经由多次试验探索而成。在实施本步骤中，无活性的(未正确复性的)蛋白在上Q-Sepharose 4 FF柱时直接流出，因而不必在上柱前预先酸化过滤去除未正确复性的蛋白。经过本步骤的处理，获得的重组tPA纯度99％以上(图3，图4)，比活性为5-6×105IU/mg。
6.tPA冷冻干粉针剂制备制剂成分PVP-K30(1.5％)、甘露醇(0.5％)、精氨酸(0.2％)、吐温-80(0.2％)、磷酸盐(10mM)和纯化浓缩的tPA溶液，各成分搅拌溶解后，0.22μm滤膜过滤除菌，分装到冻干瓶中。产品冻结程序产品预冷温度-30℃，冷阱温度-45℃，压力大于100hpa，冻结时间4小时；升华干燥程序产品温度-20℃，冷阱温度-50℃，真空度0.1-0.3hpa，干燥时间40小时；升温至25-30℃，继续真空干燥3小时。
总之，本发明提供了从菌种培养开始，到tPA包涵体的获得，到tPA的复性和纯化，直到获得tPA冷冻干粉针剂的一整套生产工艺流程(图1)，其中重点解决了tPA包涵体的复性、tPA纯化等关键工艺和技术。本发明提供的重组tPA的制备方法是在中试水平上进行，所获得的生产工艺可很快转化为工业化生产工艺。利用本发明所提供的制备方法，从10L发酵体积中可生产tPA晶体湿重10克以上，折合干重5克，变性、复性后总活性可高达3-4×108IU，总的复性效率＞10％，复性后有活性tPA的回收率达到60％，经浓缩后可获得总活性1.5-2×108IU，比活性达5-6×105IU/mg，可制造150万IU的针剂40支。经过复性和纯化的tPA用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10％SDS-PAGE)和高效液相色谱分析，纯度达到99％-100％。
利用本发明之方法制备的重组tPA，热原试验和异常毒性试验都达到《中国生物制品规程》(2000年版)的要求。宿主细胞DNA残留量检测为10-100pg/剂量(按tPA每剂量150万IU算)，符合《中国生物制品规程》(2000年版)的要求。宿主蛋白的含量低于0.01％，符合国家对大肠杆菌产品要求宿主蛋白不大于0.1％的标准。本发明制备的tPA，经由冷冻干燥制备成粉状针剂，具有良好的稳定性，在37℃保存30天、在4℃保存半年，活性均未下降。
图1本发明提供的重组tPA制备方法的工艺流程，包括1.工程菌株BL21/rtPAm-1的发酵生产图1中步骤1-步骤52.tPA包涵体的提取和纯化图1中步骤6-步骤93.包涵体的溶解和变性图1中步骤104.tPA复性图1中步骤11-步骤125.tPA复性后的纯化和浓缩图1中步骤13-步骤156.tPA冷冻干粉针剂制备图1中步骤16-18图2重组tPA包涵体的产生和提取。
泳道1显示异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导前的菌体蛋白，没有重组tPA出现。泳道2是在IPTG诱导后，破碎细胞之上清中的蛋白，没有重组tPA。泳道3显示在IPTG诱导后，破碎细胞之沉淀中的蛋白，在38kD处可以观察到有大量重组tPA蛋白出现。泳道4显示经过提取和初步纯化(Tris-NaCl-吐温-20和纯净水分别洗涤三次)的tPA包涵体，大小约为38kD。M代表蛋白质分子量标识(Marker)。蛋白质电泳是在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10％SDS-PAGE)上进行。
图3重组tPA的复性和纯化泳道M.蛋白质分子量标识(Marker)。泳道1显示在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后，超声波破碎细胞沉淀中的蛋白，得到的tPA蛋白大小在38kD左右。泳道2显示经过Tris-NaCl-吐温-20和纯净水洗涤的tPA包涵体，纯度达到90％以上。泳道3显示经G50Sephadex柱层析纯化后的tPA蛋白，纯度在95％左右。泳道4显示经过Q-Sepharose 4 FF和Phenyl-Sepharose 6 FF柱层析纯化后的tPA蛋白，纯度在99％以上。蛋白质电泳是在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10％SDS-PAGE)上进行。蛋白质含量是将电泳结果进行扫描，用KODAKID 3.5软件分析得到。
图4高压液相色谱分析经过复性与纯化的重组tPA由武汉大学测试中心进行。经过复性、纯化后的重组tPA纯度达到100％。
图5溶纤圈法检测经过复性和纯化的tPA的活性结果表明本发明制备的重组tPA具有激活纤溶酶原成为纤溶酶的活性。点样顺序为1.阴性对照，2μl生理氯化钠溶液；2.经过复性、纯化和浓缩的tPA溶液2μl；3.tPA标准品20IU(2μl)；4.tPA标准品5IU(0.5μl)。
图6tPA冷冻干粉制剂的稳定性A 1.阴性对照，生理氯化钠溶液1μl2.tPA标准品10IU(1μl)3.新鲜制备的tPA(1μl)B 1.37℃放置10天的tPA(1μl)2.4℃放置10天的tPA(1μl)3.tPA标准品10IU(1μl)C 1.37℃放置20天的tPA(1μl)2.4℃放置20天的tPA(1μl)3.tPA标准品10IU(1μl)D 1.37℃放置30天的tPA(1μl)2.4℃放置30天的tPA(1μl)3.tPA标准品10IU(1μl)结果表明tPA冷冻干粉制剂稳定性良好，在37℃放置30天，tPA活性无明显下降。
图7固相斑点杂交法检测外源DNA残留量1-4.阳性对照。大肠杆菌染色体DNA，点样量为10ng，1000pg、100pg、10pg。
5、6.阴性对照，不含DNA的10mM Tris-Cl，点样1μl。
7、8.tPA样品，点样量按150万IU的tPA量计。
结果表明每剂量的tPA样品含外源DNA在10-100pg间。
具体实施例方式
实施例1、重组tPA的发酵生产工艺本发明生产重组tPA的菌株是大肠杆菌菌株BL21/rtPAm-1(交由中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC M205112)，发酵生产工艺步骤如图1中步骤1-步骤5所示，其作用是将保存的原始种子经过斜面培养、摇瓶培养、发酵培养逐步扩增发酵生产水平，然后进行诱导产生重组tPA蛋白。具体叙述如下1.斜面种子制备(1)培养基LB培养基蛋白胨10g/L，酵母提取5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素(Amp)100mg/LLB固体培养基蛋白胨10/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉2g/L，氨苄青霉素(Amp)100mg/L(2)从大肠杆菌菌株BL21/rtPAm-1冷冻干粉种子中挑取少许干粉，加入到200μlLB培养基中，悬浮均匀，每支斜面LB固体培养基上接种一环，37℃培养18-20小时，获得斜面种子。斜面种子于2-4℃保存，可使用2星期。
2.摇瓶种子制备(1)培养基2YT培养基蛋白胨16g/L，酵母提取物8g/L，NaCl 5g/L，自来水配制，用5M NaOH调节pH至7.0。1.034×105Pa高压蒸汽灭菌20分钟。
(2)从斜面种子中接一环到100ml摇瓶中，同时加入氨苄青霉素(Amp)至终浓度100μg/ml，37℃，200rmp培养12-14小时，获得摇瓶种子。
3.发酵培养(1)发酵培养基蛋白胨20g/L，酵母抽提物8g/L，NaCl 2g/L，MgSO40.2g/L，泡敌20μl/L，纯净水配制，至培养基体积10升。消毒前调节pH值至6.8-7.0。蒸汽消毒，缸压0.1Mpa，120℃，20分钟。
(2)发酵培养的控制条件和参数培养基体积10升(消毒后)，pH6.8-7.0接种量5％-10％搅拌机转速40Hz温度控制范围35-37℃罐压0.05-0.07MPa通气量3-5升/min(0.3-1∶0.5)按上述条件和参数，培养至菌量6-8克/升、pH值上升到7.2、DO下降至20％以下时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，35-37℃继续培养，诱导蛋白质表达6-8小时。发酵全程为10-12小时，产生的tPA蛋白为包涵体，全部出现在破细胞的沉淀中(图2)。
实施例2.tPA包涵体的提取和纯化见图1中步骤6-步骤9，其作用是收集发酵生产的重组tPA蛋白，并进行初步的纯化。
具体实施方式
如下1.离心收集发酵培养的菌体，悬于纯净水中(200克湿重/升)。
2.超声波破碎菌体，12000rmp离心8分钟，去上清。
3.沉淀用Tris-NaCl(pH8.0)-吐温-20洗涤三次，每次按克沉淀/15ml洗涤缓冲液的量进行洗涤，每次离心6分钟，离心收集沉淀。
4.纯净水洗涤三次，每次离心6分钟，收集沉淀。
5.10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检查rtPAm-1蛋白，可见其纯度在90％以上(图2，图3)。沉淀放-20℃冰箱保存。
实施例3包涵体的变性和溶解见图1中的步骤10。按5克tPA晶体(湿重)/升的比例将离心收集的包涵体溶于7-8M尿素，用NaOH将pH调节至9-10，加入还原剂β-巯基乙醇(β-ME)10-20mM，30℃，搅拌0.5-1小时，进行变性溶解。
实施例4tPA的复性见图1中的步骤11和步骤12，其作用是将变性溶解的重组tPA进行复性，得到有活性的、可溶的重组tPA蛋白，同时可以对重组tPA蛋白进行纯化。方法如下1.加水将变性液稀释一倍，使尿素浓度降至4M以下，tPA开始复性。
2.用G50Sephadex分子筛层析柱去除尿素和还原剂β-巯基乙醇(β-ME)。柱子用10mM的Tris-Cl(pH8.0)平衡，上柱量为柱床体积20％。
3.用10mM Tris-Cl(pH8.0)洗涤柱子，用核酸蛋白质检测仪(波长280nm)检测收集含tPA的溶液。重组tPA最先直接从柱中流出(带红茶色)，随后为分子量30KD以下的蛋白(无色)，最后流出的是尿素和β-ME(无色)。
4.将收集的tPA溶液按2克tPA(湿重)/升的量用10mM Tris-Cl(pH8.0)调节到指定体积，20-25℃放置16-24小时，进一步进行复性。
经过本步骤处理，重组tPA的复性效率达10％左右，tPA蛋白纯度可达95％左右(10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，图3)。
实施例5.tPA复性后的纯化和浓缩见图1中步骤13-步骤15，重组tPA蛋白在经过复性后，需将复性正确和不正确的蛋白分离，同时还需进一步纯化。
具体实施方式
如下1.用Q-Sepharose 4FF层析柱分离复性正确和复性不正确的tPA蛋白。柱子先经0.5M HCl预处理，再用水洗至pH5.0-6.0，然后用2倍体积的20mM Tris-Cl(pH8.0)平衡。
2.复性液经过滤后，加入Tris-Cl(pH8.0)至20mM，上柱至接近饱和。
3.用10mM Tris-Cl(pH7.5)，0.1-0.5M NaCl梯度洗脱，用核酸蛋白质检测仪(波长280nm)检测收集有活性的tPA洗脱峰，或用10mM Tris-Cl(pH7.5)，0.15-0.2M NaCl，3倍柱床体积洗脱杂蛋白，再用10mM Tris-Cl(pH7.5)，0.25-0.35M NaCl洗脱有活性的tPA。
4.进一步用疏水层析柱Phenyl-Sepharose 6FF对tPA进行纯化。柱子用5mMTris，0.5M NaCl(pH6.5-7.5)平衡。
5.在Q-Sepharose 4FF柱洗脱的tPA液中加入NaCl至0.5M，用HCl调节pH至7.0-7.5，上柱。
6.用5mMTris(pH8.5)进行洗脱，用核酸蛋白质检测仪(波长280nm)检测收集有活性的tPA洗脱峰。
7.用膜滤器对tPA洗脱液进行浓缩，至tPA浓度3×105IU/ml。
用10％SDS-PAGE和高效液相色谱检测经过纯化和浓缩的重组tPA的纯度，用溶纤圈法测定tPA活性(见实施例6)。结果表明获得的重组tPA纯度达99-100％(10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，图3；高效液相色谱，图4)，比活性约为5-6×105IU/mg，复性效率在10％以上，活性回收率60％左右。
实施例6重组tPA活性检测采用溶圈法进行，步骤如下1.tPA标准品购自卫生部北京药品生物制品检定所，每瓶含tPA30000IU，用3ml生理氯化钠溶液溶解，使tPA浓度为10IU/μl。
2.人凝血酶用生理氯化钠溶液配成100IU/ml，于-20℃保存。
3.纤溶酶原购自北京药品生物制品检定所，用生理氯化钠溶液配成0.5mg/ml。
4.人纤维蛋白原30mg/支，中国药品生物制品检定所制备标准试剂。实验前配置，配置前先在37℃水浴预热15min，生理氯化钠溶液也同时预热，然后每支加5ml生理氯化钠溶液，37℃水浴静置保温30min使其完全溶解，配置成6mg/ml溶液。
5.纤维蛋白平板制备称取125mg琼脂糖，加入23ml生理氯化钠溶液，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加入280ul纤维蛋白(0.5mg/ml)，加入14μl凝血酶(100IU/ml)，摇匀，混浊后倒平板，水平放置，室温凝固。
6.活性检测用打孔器在纤维蛋白平板上打孔，直径2mm，将tPA样品和标准品点入孔中，37℃8小时，测量透明圈直径。根据标准tPA和rtPAm-1样品的透明圈直径大小，计算出样品活性。
结果见图5，经过变性、复性及纯化后的rtPAm-1能够激活纤溶酶原产生溶纤圈，经过与标准tPA的换算，活性达到5-6×105IU/mg，达到国际同类产品的水平(5×105IU/mg)。
实施例7tPA冷冻干粉针剂的制备及其稳定性检测见图1中步骤16-步骤18，其目的是将重组tPA蛋白制成干粉针剂，利于保存。具体实施方法如下1.制剂成分和配方PVP-K30(1.5％)、甘露醇(0.5％)、精氨酸(0.2％)、吐温-80(0.2％)、磷酸盐(10mM)和纯化浓缩的tPA溶液，搅拌溶解后，0.22μm滤膜过滤除菌，分装到20ml冻干瓶中，每瓶装5ml。
2.制剂冷冻干燥工艺。产品冻结程序产品预冷温度-30℃，冷阱温度-45℃，压力大于100hpa，冻结时间4小时。升华干燥程序产品温度-20℃，冷阱温度-50℃，真空度0.1-0.3hpa，升华干燥时间40小时；升温至30℃，继续真空干燥3小时。获得的冻干产品为白色，内部均匀蓬松、表面平整。
3.tPA冷冻干粉制剂的稳定性tPA冷冻干粉置于37℃，每隔10天取一瓶用生理氯化钠溶液溶解，用溶圈法测活性，与4℃保存的同批产品以及tPA标准品相比较，计算每瓶总活性下降。
结果见图6，在37℃放置30天，tPA活性无明显下降。冻干粉在4℃保存半年，也未发现tPA活性下降。表明制备的tPA冷冻干粉具有良好的稳定性。
实施例8重组tPA动物试验1.热原试验每个tPA样品按3万单位/公斤体重耳静脉注射家兔3只，另设对照组三只耳静脉注射无菌生理盐水，注射后测量体温变化，每隔30分钟测量体温1次，连续测6次以上，试验组3只兔体温上升均在0.6℃以内，且3只兔的升温总和不超过1.40℃，达到《中国生物制品规程》(2000年版)的要求。
2.异常毒性试验按尾静脉注射和腹腔注射两个试验组进行，按每公斤体重5万单位tPA剂量注射，每个样品注射20只，另用20只注射无菌生理盐水为对照租，连续观察7天。结果两个试验组的小鼠在7天内全部健存，无异常反应，体重增长，活动和进食正常，达到《中国生物制品规程》(2000年版)的要求。
实施例9外源DNA残留量检测用固相斑点杂交法。
1.提取大肠杆菌BL21(DE3)的染色体DNA。按萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第二版，1992年，科学出版社)的方法进行。
2.细菌染色体DNA经酶切消化后作为制备DNA探针的模板，地高辛标记的探针是用DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I试剂盒(购自Roche公司)制备，方法参照试剂盒说明书。
3.对大肠杆菌染色体DNA作一系列稀释，作为斑点杂交的阳性对照和DNA含量标准，阳性对照DNA点样量为10ng，1000pg、100pg、10pg。
4.制备的tPA样品按150万IU每针剂量计算(tPA药品通常的剂量)，先经蛋白酶K处理降解tPA蛋白，然后100℃水浴10分钟，冰浴冷却，离心5分钟，用抽滤加样器点膜。
5.120℃交联半小时。
6.探针杂交、显色等步骤按试剂盒说明书进行。
结果表明本发明制备tPA样品的外源DNA含量在10-100pg/剂量(图7)，低于《中国生物制品规程》(2000年版)规定的100pg/剂量(我国现行规程已做了调整，宿主细胞DNA残留量标准为小于10ng/人用剂量)。
实施例10宿主细胞蛋白含量测定采用双抗体夹心酶联免疫法。
1.用包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释兔抗大肠杆菌菌体至10μg/ml，以100μl/孔加至96孔酶标板内，4℃放置，16-18小时。
2.洗板3次。用洗涤液(磷酸缓冲液-0.05％土温20，pH7.4)配1％牛血清白蛋白，以200μl/孔加至孔内，置37℃2小时。
3.用稀释液(0.5％牛血清白蛋白-磷酸缓冲液-0.05％土温20，pH7.4)将标准菌体蛋白从500ng/ml开始做对半稀释，一直到最低浓度7.8125ng/ml，得到一系列标准菌体蛋白浓度梯度。
4.用稀释液将tPA原液稀释至250μg/ml左右。
5.将封闭好的酶标板洗涤3次，将标准品和样品均以100μl加入孔内，置37℃2小时。
6.洗板3次，用稀释液1∶1000稀释辣根过氧化酶(HRP)兔抗大肠杆菌蛋白抗体，以100μl/孔加至板内，置37℃2小时。
7.洗板10次。以100μl/孔加入临时配置的底物液(邻苯二酚8mg溶入柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH5.0，加30％过氧化氢30μl)，37℃40分钟。
8.以50μl/孔加入1M硫酸终止反应。
9.在酶标仪中选择492nm波长测光吸收值(A)，以标准蛋白的A值与浓度梯度做标准曲线，根据待测样品的A值计算tPA样品中的宿主蛋白含量。
按上述步骤测定了5批次tPA样品中的宿主蛋白含量。结果分别为0.0087％，0.0092％，0.0039％，0.0055％，0.0074％，0.0032％，全部低于0.01％，符合国家对大肠杆菌产品要求宿主蛋白不大于0.1％的标准。
权利要求
1.一种重组人tPA的制备方法，它包括下列步骤A、利用工程菌株BL21/rtPAm-1，进行发酵生产重组tPA，工程菌株BL21(DE3)/rtPAm-1，CCTCC M205112，利用工程菌株BL21/rtPAm-1发酵生产重组人tPA包括步骤首先是斜面种子培养用LB培养基，37℃培养18-20小时；其次是瓶摇种子制备用2YT培养基，摇瓶培养，37℃培养12-14小时；第三是发酵培养用发酵培养基，37℃进行发酵培养和诱导蛋白质表达；B、tPA包涵体的提取和纯化离心收集菌体，超声波破碎菌体，离心去上清，沉淀用pH8.0的Tris-NaCl-吐温-20和纯净水各洗涤三次；C、包涵体的溶解和变性按5-10克tPA湿重/升的量将tPA包涵体加到7-8M尿素中，用NaOH调节pH至9-10，加入还原剂β-巯基乙醇至10-20mM，28-32℃搅拌溶解0.5-1小时，进行溶解和变性；D、tPA复性，其方法如下(a)加水将变性液稀释一倍，使尿素浓度降至4M以下，tPA开始复性；(b)用G50 Sephadex分子筛柱层析逐渐去除复性液中的尿素和还原剂β-巯基乙醇，使tPA逐步复性，同时又去除分子量30kD以下的杂蛋白；(c)将收集的tPA溶液用pH8.0的10mM-20mM Tris-Cl进行稀释，至tPA浓度为1-2克湿重/升，在20-25℃及pH8.0的条件下，放置16-24小时，进行进一步复性；E、柱层析纯化和浓缩(a)用Q-Sepharose 4 FF柱分离复性正确和复性不正确的tPA蛋白，柱子先用0.5M HCl进行预处理，再用水洗至pH5.0-6.0，然后用2倍体积的pH8.0-8.5的20mM Tris-Cl进行平衡，复性液经过滤后，加入pH8.0的Tris-Cl至20mM，上柱，用pH7.5的10mM Tris-Cl，0.1-0.5M NaCl进行梯度洗脱，收集有活性的tPA洗脱峰，或用pH7.5的10mM Tris-Cl，0.15-0.2M NaCl洗脱杂蛋白，再用pH7.5的10mM Tris-Cl，0.25-0.35MNaCl洗脱有活性的tPA；(b)进一步用疏水层析柱Phenyl-Sepharose 6 FF对tPA进行纯化，柱子用pH6.5-7.5的5mM Tris-Cl，0.4-0.6M NaCl进行平衡，在Q-Sepharose 4 FF柱洗脱的tPA液中加入NaCl至0.4-0.6M，用HCl调节pH至7.0-7.5，上柱，用pH8.0-9.0的2.5-5mMTris进行洗脱，收集有活性的tPA；(c)用膜滤器对tPA洗脱液进行浓缩，至tPA浓度3×105IU/ml；F、tPA冷冻干粉针剂制备采用冷冻干燥法将浓缩的tPA溶液制成冷冻干粉制剂。
2.根据权利要求1所述的一种重组人tPA的制备方法，其特征在于发酵培养所用培养基，其成分如下蛋白胨20g/L，酵母抽提物8g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 0.2g/L，泡敌10μl/L，纯净水配制，至培养基体积10升，消毒前调节pH至6.8-7.0，发酵培养基采用蒸汽消毒，缸压0.1mpa，120℃，20分钟。
3.根据权利要求1所述的一种重组人tPA的制备方法，其特征在于发酵培养的控制条件培养基体积10升，pH6.8-7.0；接种量5％-10％；搅拌机转速40Hz；温度控制范围35-37℃；罐压0.05-0.07Mpa；通气量3-5升/分钟；按上述条件，培养至菌量6-8克/升、pH值上升到7.2-7.5、DO下降至20％以下时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度1mM，35-37℃继续培养，诱导蛋白质表达6-8小时。
全文摘要
本发明公开了一种重组人tPA的制备方法，包括了从工程菌株发酵生产，tPA包涵体的提取、复性、纯化、浓缩，到tPA产品的冷冻干粉制备等的全套生产工艺，其中重点解决了tPA包涵体的复性、tPA纯化等关键技术。利用本发明所提供的制备方法，从10L发酵体积中可生产tPA晶体湿重10克以上，变性、复性后总活性可高达3－4×10
文档编号C07K1/14GK1786164SQ20051001970
公开日2006年6月14日 申请日期2005年11月1日 优先权日2005年11月1日
发明者叶林柏, 吴正辉, 佘应龙, 叶力, 郜金荣 申请人:武汉大学, 武汉陆地生物工程有限公司