专利名称：一种从1,3－丙二醇发酵液中去除菌体及蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及微生物发酵产品分离过程中去除微生物细胞及蛋白的方法，特别涉及到从1，3-丙二醇发酵液中分离去除微生物细胞及蛋白的方法。
背景技术：
1，3-丙二醇(1，3-PD)是一种重要的化工原料，在制造聚酯纤维、聚氨酯、热熔胶、粉末涂料、抗冻剂、包装材料以及有机合成中间体等方面都有着广泛的应用，其中制造高性能的聚酯纤维PTT是目前主要的用途。1，3-丙二醇可通过化学法路线和生物法路线生产，采用生物技术生产1，3-丙二醇，以其绿色化学为特征，具有反应条件温和、操作简便、副产物少、环境污染小、可利用再生资源等特点，成为新世纪生物化工研究的热点之一。
1，3-丙二醇的发酵液是一个成分非常复杂的混合体系，主要成分包括产物1，3-丙二醇、微生物菌体细胞、有机酸盐、无机盐、甘油、水、蛋白质及其它中间代谢产物等，由于产物1，3-丙二醇分子含有两个羟基，它的亲水性较乙醇更强，目前发酵液中产物的浓度为30～70g/L，要从稀发酵液中分离回收产品就变得极为困难，产品回收率低，而且分离成本很高。
1，3-丙二醇属胞外产物，在提取纯化之前需要经过预处理，除去发酵液中的菌体细胞和蛋白，得到澄清发酵液。由于菌体颗粒细小，发酵液外观呈乳状液形式，除含有颗粒细小的细菌细胞和细胞碎片外，还含有水溶性蛋白质和其它胶状物。这些细菌细胞和细胞碎片以及水溶性蛋白质大分子的存在，会给后续工艺带来极大的困难，直接影响脱盐蒸发工序，产生堵塞、阻碍蒸发，导致产品收率的降低。目前细胞及碎片的分离方法主要有过滤方法和离心方法。用传统的过滤除菌法，效率低、劳动强度大，过滤所形成的黏胶状滤饼会堵塞滤布，使操作无法顺利进行。一种新的过滤方法是利用微滤膜或超滤膜进行错流过滤，存在的问题是分离能力小、分离时间长，不能将固液相分离完全，易出现膜污染堵塞等。而用离心的方法除去菌体与蛋白，需要高速的离心设备，投资大能耗高，固相中液体滞留量大，产品损失大。
为了能更有效地对1，3-丙二醇发酵液进行预处理，国内外科技工作者为此做出了不懈的努力，提出了许多工艺方法。清华大学李凡锋等人公开了一种絮凝预处理方法(微生物学通报，2004.31(3)30～35)，该方法使用天然澄清剂II型B组份作为絮凝剂，对1，3-丙二醇的发酵液进行预处理，对菌体的絮凝率为95％，但对蛋白的絮凝效果较差，而且絮凝要在pH为5～6的条件下才有好的结果，发酵液的pH为7左右，则需用酸来调节pH值，这样就人为增加了发酵液中的盐浓度，为后续的脱盐工序增加了更大的麻烦。
发明内容
为克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种从1，3-丙二醇发酵液去除微生物细胞及蛋白的方法。该方法简单易行，能有效地去除1，3-丙二醇发酵液中的菌体和蛋白。
本发明方法是采用絮凝的方法除去1，3-丙二醇发酵液中的菌体和蛋白，包括加絮凝剂、搅拌、静置沉降和分离，其中所用的絮凝剂有主絮凝剂和助絮凝剂；主絮凝剂为有机高分子絮凝剂，具有如下的结构式 其中R1是胺基或带有羟烷基取代的胺基；R2、R4分别是亚烷基；R3是羰基氧或羟基烷基氧；m＝5～15，n＝10～20。
所述的主絮凝剂可按照中国专利ZL 98121074.0公开的方法制备。
本发明方法中所用的助絮凝剂为无机-有机复合絮凝剂(PAC-PDMDAAC)，其中PAC为聚氯化铝，PDMDAAC为二甲基二烯丙基氯化铵均聚物(分子量为30～35万)，PAC-PDMDAAC为PAC与PDMDAAC的共聚物，铝的有效浓度为2.1wt％～3.0wt％，最好为2.3wt％～2.7wt％。
在本发明方法中，主絮凝剂的加入量为0.5～5.0g/L发酵液，最好为1.0～3.5g/L发酵液；助絮凝剂的加入量为0.1～1.0g/L发酵液，最好为0.3～0.6g/L发酵液。
本发明方法中，所述絮凝剂的加入方法可采用下述方式之一(1)先将主絮凝剂加入到1，3-丙二发酵液中，搅拌后，再加入助絮凝剂；(2)先将主絮凝剂加入到1，3-丙二醇发酵液中，搅拌、静置沉降和分离后，再加入助絮凝剂；(3)先将主絮凝剂加入到1，3-丙二醇发酵液中，搅拌和静置沉降后，再加入助絮凝剂。(4)将主絮凝剂和助絮凝剂按比例进行复配后再加入到1，3-丙二醇发酵液中，搅拌、静置沉降，过滤或离心分离。
上述絮凝剂加入方式(4)中，主絮凝剂和助絮凝剂复配的重量比例为0.5∶1～50∶1，最好为2∶1～20∶1。
本发明所处理的1，3-丙二醇发酵液中1，3-丙二醇的含量为30～80g/L，通常终止发酵液的pH值为6.5～7.5。在这一范围菌体及蛋白都能够产生絮凝作用。
本发明方法中，絮凝温度对絮凝效果具有较大的影响，过高的温度会导致絮凝体细小，不易沉降，并使絮凝体的水合作用增加，所以絮凝应在较低温度下进行，以5～35℃为好，最好为10～30℃。
搅拌速度对絮凝效果也具有一定的影响，速度太慢不利于混合传质，剧烈搅拌会破环微粒间的架桥作用，不能形成絮团，难以沉降分离。搅拌速度选择为60～180r/min为好，最好为80～150r/min。无论以何种方式加入絮凝剂，每次加入絮凝剂后，搅拌时间均以5～30min为宜，最好8～20min。
本发明方法中所用的主絮凝剂具有较高的阳离子电荷密度，所含电荷能有效地中和菌体和蛋白微粒表面的负电荷，降低Z电位值，使之趋于零，达到脱稳、微粒凝聚的目的，所以絮凝剂的使用存在着较佳用量，过低过高都达不到理想的絮凝效果。在本发明方法中，主絮凝剂的加入量为0.5～5.0g/L发酵液，最好为1.0～3.5 g/L发酵液。
本发明方法中所用的助絮凝剂在一次絮凝除去菌体后，助絮凝剂将对残余的菌体及蛋白做进一步的絮凝，以达到后续工序的要求。
本发明方法采用双絮凝剂，在发酵pH值条件下对发酵液进行处理，主絮凝剂的作用主要是絮凝去除微生物菌体，助絮凝剂的作用主要絮凝去除大分子蛋白包括水溶性蛋白。
本发明与现有技术相比具有以下优点(1)、本发明所采用的双絮凝剂絮凝不仅能使发酵液中的菌体絮凝、又能使大分子蛋白产生絮凝，与过滤或离心相结合，使1，3-丙二醇发酵液中菌体和蛋白的去除更为有效彻底；(2)、本发明方法可直接处理发酵液，无需另行调节pH值，为后续的脱盐工序及蒸馏过程创造了良好的条件。(3)过程简单，便于实施。
具体实施例方式
本发明优选的实施方案具体如下(1)先将主絮凝剂加入到1，3-丙二醇发酵液中，搅拌一定时间后，再将助絮凝剂加入继续搅拌一定时间，静置沉降，上层为澄清的清液，下层为菌体絮凝物，上下两层采用分批过滤或离心方法即可得到澄清的发酵液。
(2)先将主絮凝剂加入到1，3-丙二醇发酵液中，搅拌一定时间后，静置沉降，上层为澄清的清液，下层为菌体絮凝物，上下两层分批过滤或离心得到一次絮凝发酵液；再将助絮凝剂加入继续搅拌一定时间，静置沉降，分批过滤或离心上下两层，可得到澄清发酵液。
(3)先将主絮凝剂加入到1，3-丙二醇发酵液中，搅拌一定时间后，静置沉降后；再将助絮凝剂加入发酵液中继续搅拌一定时间，静置沉降，上层为澄清的清液，下层为菌体絮凝物，分批过滤或离心上下两层，可得到澄清发酵液。
(4)将主絮凝剂和助絮凝剂按比例加入到1，3-丙二醇发酵液中，搅拌一定时间后，静置沉降后；上层为澄清的清液，下层为菌体絮凝物，分批过滤或离心上下两层，可得到澄清发酵液。
下面通过实施例对本发明作进一步的详述。
本发明实施例所处理的发酵液是以甘油为底物，采用克雷伯氏菌发酵而得到的1，3-丙二醇发酵液。
实施例1本实施例中所用的1，3-丙二醇发酵液中，1，3-丙二醇的含量为68.5g/L，发酵终止pH值为6.8。
取500ml上述发酵液装入1000ml三口烧瓶或烧杯中，在80r/min的速度搅拌下，于20℃加入主絮凝剂(中国专利ZL98121074.0实施例中絮凝剂3)0.35g，搅拌10min后静置沉降。待絮凝完全沉降后分别过滤上层清液和沉降层，得到发酵清液。搅拌下在上述清液中加入助絮凝剂0.4g(铝的有效浓度为2.45wt％，PDMDAAC的分子量为32万)，继续搅拌10min后静置沉降，分别过滤清液层和沉降层，得到澄清的1，3-丙二醇发酵液。相对原发酵液菌体去除率为96.1wt％，蛋白去除率为89.2wt％。
实施例2本实施例中所用的1，3-丙二醇发酵液中，1，3-丙二醇含量为51.2g/L，发酵终止pH值为7.1。
取500ml上述发酵液，装入1000ml三口烧瓶或烧杯中，在150r/min的速度搅拌下，于25℃加入主絮凝剂((中国专利ZL98121074.0实施例中絮凝剂4))2.2g，搅拌20min后，再将0.1g助絮凝剂(性质同实施例1)加入继续搅拌20min，静置沉降，上层为澄清的清液，下层为菌体蛋白絮凝物，分别离心分离清液层和絮凝物，合并离心液即得到澄清的发酵液。相对原发酵液菌体去除率为95.3wt％，蛋白去除率为85.5wt％。
实施例3
本实施例中所用的1，3-丙二醇发酵液中，1，3-丙二醇含量为67.3g/L，发酵终止pH值为7.3。
取500ml上述发酵液，装入1000ml三口烧瓶或烧杯中，在100r/min的速度搅拌下，于25℃加入主絮凝剂(中国专利ZL98121074.0实施例中絮凝剂3)0.8g，搅拌15min后静置沉降。待絮凝完全沉降后分出上层清液，搅拌下在上述清液中加入助絮凝剂0.3g(性质同实施例1)，继续搅拌15min后静置沉降，分别过滤清液层和沉降层(包括一次絮凝的沉降层)，得到澄清的1，3-丙二醇发酵液。相对原发酵液菌体去除率为95.5wt％，蛋白去除率为86.7wt％。
实施例4本实施例中所用的1，3-丙二醇发酵液中，1，3-丙二醇含量为51.2g/L，发酵终止pH值为7.1。
取500ml上述发酵液，装入1000ml三口烧瓶或烧杯中，在160r/min的速度搅拌下，于25℃加入复配絮凝剂(性质同实施例1)1.8g，主絮凝剂与助絮凝剂的复配重量比例为10∶1，搅拌20min后静置沉降，上层为澄清的清液，下层为菌体蛋白絮凝物，分别离心分离清液层和絮凝物，合并离心液即得到澄清的发酵液。相对原发酵液菌体去除率为96.3wt％，蛋白去除率为82.5wt％。
权利要求
1.一种从1，3-丙二醇发酵液中除去菌体和蛋白的方法，该方法包括加絮凝剂、搅拌、静置沉降和分离，其中所用的絮凝剂有主絮凝剂和助絮凝剂；所用的主絮凝剂的结构如下 其中R1是胺基或带有羟烷基取代的胺基；R2、R4分别是亚烷基；R3是羰基氧或羟基烷基氧；m＝5～15，n＝10～20；所用的助絮凝剂为PAC-PDMDAAC的共聚物。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述助絮凝剂中铝的有效浓度为2.1wt％～3.0wt％，PDMDAAC的分子量为30～35万。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述助絮凝剂中铝的有效浓度为2.3wt％～2.7wt％。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述主絮凝剂的加入量为0.5～5.0g/L发酵液；助絮凝剂的加入量为0.1～1.0g/L发酵液。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述主絮凝剂的加入量为1.0～3.5g/L发酵液；助絮凝剂的加入量为0.3～0.6g/L发酵液。
6.按照权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于所述絮凝剂的加入方法可采用下述方式之一(1)先将主絮凝剂加入到1，3-丙二发酵液中，搅拌后，再加入助絮凝剂；(2)先将主絮凝剂加入到1，3-丙二醇发酵液中，搅拌、静置沉降和分离后，再加入助絮凝剂；(3)先将主絮凝剂加入到1，3-丙二醇发酵液中，搅拌和静置沉降后，再加入助絮凝剂；(4)将主絮凝剂和助絮凝剂一同加入到1，3-丙二醇发酵液中，搅拌、静置沉降和分离。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于主絮凝剂和助絮凝剂的重量比例为0.5∶1～50∶1。
8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于主絮凝剂和助絮凝剂的重量比例为2∶1～20∶1。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的1，3-丙二醇发酵液中1，3-丙二醇的含量为30～80g/L，终止发酵液的pH值为6.5～7.5。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的絮凝温度为5～35℃。
11.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的絮凝温度10～30℃。
12.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的搅拌速度为60～180r/min，搅拌时间5～30min。
13.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的搅拌速度为80～150r/min，搅拌时间8～20min。
14.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的分离采用上下两层分批过滤或离心的方法。
全文摘要
本发明公开了一种从1，3－丙二醇发酵液中去除菌体及蛋白的方法。该方法包括加絮凝剂、搅拌、静置沉降和分离，其中所用的絮凝剂有主絮凝剂和助絮凝剂；所用的主絮凝剂的结构如下，其中R
文档编号C07C31/20GK1951889SQ200510047500
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月19日 优先权日2005年10月19日
发明者王崇辉 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院