专利名称：动物用重组干扰素的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种干扰素的生产方法，尤其是一种纯度高、活性强的动物用重组干扰素的生产方法。
背景技术：
干扰素是多种诱导剂(如病毒、细菌和其他大分子等)诱导细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的一类蛋白质。以往干扰素的生产方法是用动物血为原料制成，不但成本高，而且产品中还有潜在携带外源病毒及其他病原微生物的危险。为了克服传统生产方法所带来的弊病，人们已采用基因工程生产重组干扰素，尤其是将动物干扰素的基因克隆到表达载体pBV220中，并转化到大肠杆菌DH5α中，将筛选的阳性克隆用温度诱导表达生产菌种并制成重组干扰素的生产方法更为先进，其外源基因表达量可达到总蛋白的20％-30％。与血制品相比生产成本大大降低，可下降约1万倍，同时也完全避免了潜在携带外源病毒及其他病原微生物的危险。但是现有基因工程生产方法所生产的重组干扰素的活性成分均以包涵体的形式存在，降低了产品的活性作用，而且产品纯度不高，含有其它杂蛋白。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的活性低的技术问题，提供一种纯度高、活性强的动物用重组干扰素的生产方法。
本发明的技术解决方案是一种动物用重组干扰素的生产方法，将动物干扰素的基因克隆到表达载体pBV220中，并转化到大肠杆菌DH5α中，将筛选的阳性克隆用温度诱导表达生产菌种并制成粗制干扰素，其特征在于还包括如下步骤a.将粗制干扰素经截流量为10000相对分子量的中空纤维素超滤器浓缩；b.将浓缩的干扰素溶液经Sephadex G50分离，层系2cm*100cm，先用20mmol/l、pH7.0磷酸盐缓冲液平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，经SDS-PAGE检查，收集干扰素部分；c.将收集的干扰素再经DE-52柱纯化，上柱后用含0.05、0.1、0.15mol/LnaCl的20mM/L、pH7.0磷酸盐缓冲溶液分别洗涤，收集含干扰素的洗脱液，得半成品；d.将半成品用无热原生理盐水稀释使最终干扰素的含量为1％～2％，然后用0.22μm孔径滤膜除菌，分装。
本发明是在现有技术的基础上，对粗制重组干扰素浓缩、分离、提纯、配制及滤膜除菌。所生产的重组干扰素除具有生产成本低、避免潜在携带外源病毒及其他病原微生物的优点之外，同时全过程蛋白质回收率为25％，产品中不含杂蛋白，提高了产品的纯度且DNA及热源质含量合格；改变了活性成分的存在方式，增强了产品的活性，使产品的活性成分真正发挥了活性作用。
具体实施例方式实施例用现有技术制备粗制重组干扰素，具体做法如下1.根据Genbank上发表的各种动物干扰素基因序列，分别从ConA刺激的鸡脾淋巴细胞、从丝裂原刺激的鸭脾淋巴细胞中提取基因组RNA、从猪肝脏和犬血液中提取基因组DNA；2.根据Genbank上发表的干扰素序列，采用Oligo软件设计一对寡聚核苷酸引物，在上下游引物的5′端进行限制性内切酶的分子修饰；3.若提取的基因组为RNA则采用RT-PCR扩增干扰素基因，若提取的基因组为DNA则采用PCR扩增干扰素基因；4.RT-PCR或PCR扩增获得的目的基因经序列分析；5.将干扰素基因克隆到表达载体pBV220中，并转化到大肠杆菌DH5α中，将筛选的阳性克隆用温度诱导表达；6.SDS-PAGE、Western Blot鉴定表达产物；7.将稳定表达的干扰素留种低温保存于原始菌种库备用；8.从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库。
9.从制造用菌种库传出供生产用的菌种，经革兰氏染色、电镜检查、生化反应、质粒鉴定、表达量符合要求的菌种作为生产菌种。
10.从生产菌种选出供做发酵用的菌种(种子液)，种子液根据实际需要做扩充传代，作为罐培养的种子液；11.发酵培养；
12.用离心法收集菌体，菌体可在-20℃下保存1年；13.用盐酸胍或溶菌酶或高压匀浆泵等适宜方法裂解菌体；14.菌体裂解后经离心所得上清液即为粗制干扰素。
再按以下方法进行a.将粗制干扰素经截流量为10000相对分子量的中空纤维素超滤器浓缩；b.将浓缩的干扰素溶液经Sephadex G50分离，层系2cm*100cm，先用20mmol/l、pH7.0磷酸盐缓冲液平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，经SDS-PAGE检查，收集干扰素部分；c.将收集的干扰素再经DE-52柱纯化，上柱后用含0.05、0.1、0.15mol/LNaCl的20mM/L、pH7.0磷酸盐缓冲溶液分别洗涤，收集含干扰素的洗脱液，得半成品；d.将半成品用无热原生理盐水稀释使最终干扰素含量为1％～2％，然后用0.22μm孔径滤膜除菌，分装。
半成品检定每批半成品抽样进行效价测定、蛋白含量、比活性、高效液相色谱纯度、紫外光谱吸收、无菌试验、热原质试验等项检定，结果符合要求。
成品检定成品经外观、pH值、效价测定、鉴别试验、无菌试验、热原质试验、安全试验等检验。全过程蛋白质回收率为25％，产品不含杂蛋白，DNA及热源质含量合格，结果符合要求。
权利要求
1.一种动物用重组干扰素的生产方法，将动物干扰素的基因克隆到表达载体pBV220中，并转化到大肠杆菌DH5α中，将筛选的阳性克隆用温度诱导表达生产菌种并制成粗制干扰素，其特征在于还包括如下步骤a.将粗制干扰素经截流量为10000相对分子量的中空纤维素超滤器浓缩；b.将浓缩的干扰素溶液经Sephadex G50分离，层系2cm*100cm，先用20mmol/l、pH7.0磷酸盐缓冲液平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，经SDS-PAGE检查，收集干扰素部分；c.将收集的干扰素再经DE-52柱纯化，上柱后用含0.05、0.1、0.15mol/LNaCl的20mM/L、pH7.0磷酸盐缓冲溶液分别洗涤，收集含干扰素的洗脱液，得半成品；d.将半成品用无热原生理盐水稀释，使最终干扰素含量为1％～2％，然后用0.22μm孔径滤膜除菌，分装。
全文摘要
本发明公开一种动物用重组干扰素的生产方法，是在现有技术的基础上，对粗制重组干扰素浓缩、分离、提纯、配制及滤膜除菌。所生产的重组干扰素除具有生产成本低、避免潜在携带外源病毒及其他病原微生物的优点之外，同时全过程蛋白质回收率为25％，产品中不含杂蛋白，提高了产品的纯度且DNA及热源质含量合格；改变了活性成分的存在方式，增强了产品的活性，使产品的活性成分真正发挥了活性作用。
文档编号C07K14/435GK1737136SQ20051004720
公开日2006年2月22日 申请日期2005年9月12日 优先权日2005年9月12日
发明者江国托 申请人:大连三仪动物药品有限公司