专利名称：高纯度白术内酯的分离制备方法
技术领域：
本发明涉及一种白术内酯的分离制备方法，尤其涉及一种应用高速逆流色谱法(HSCCC)分离高纯度白术内酯III的制备方法。
背景技术：
中药白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根茎。主产浙江，安徽。神农本草列为上品，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎功效。近十年来的研究表明白术具有利尿、抗肿瘤、抗菌抗炎、抗糖尿病、抗衰老等作用，对神经系统、消化道、子宫平滑肌也有一定作用，还能调节免疫功能。
白术根茎中含挥发油、倍半萜内酯化合物、多炔醇类化合物等，其中白术内酯类成分(白术内酯I、白术内酯III)为白术的抗炎、抗癌有效成分，经药理实验表明，该类成分具有调节目肠道功能和促进营养物质吸收的作用。白术内酯的结构式如下 白术内酯I R＝H白术内酯III R＝OH高速逆流色谱技术(High Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)是20世纪90年代发展起来的一种新型液-液色谱分离方法。其原理是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固体相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固体相中分配比例大的后被洗脱。不同于传统液相色谱法，HSCCC分析方法不使用固相载体，因而避免了有效成分被固相载体的不可逆吸附和峰形拖尾等缺点；样品粗提物可直接进样分离，可以高效、快速和大制备量分离，分离纯化与制备可同步完成，有机溶剂消耗少，无损失、无污染。基于以上优点，HSCCC色谱仪无论是作为分析型仪器还是制备型仪器，在天然产物上具有广阔的开发前景和实际的应用意义，它可以从复杂的天然粗制品中提取不同特性的有效成分，为天然药物的发展提供了有利条件。目前，国内外学者利用HSCCC已经成功的分离提取天然药物中黄酮、生物碱、蒽醌类衍生物、皂甙等有效成分。因此，HSCCC是分离白术饮片中的有效成分-白术内酯III的较好手段。
在本发明之前，还没出现应用高速逆流色谱法(HSCCC)分离出高纯度白术内酯III的制备方法的公开报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高纯度白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现一种单体白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法，该方法包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系；使逆流色谱仪柱子中充满固定相，再使主机转动，然后将流动相泵入柱内；或用泵同时泵入固定相和流动相，再使主机转动；由进样阀进样；根据检测器谱图接收目标组分，所述的溶剂体系由烷烃，脂肪酯，脂肪醇或脂肪酮、水组成。
在所述的溶剂体系中，烷烃为正己烷等正构烷烃，脂肪酯为乙酸乙酯、乙酸甲酯等，脂肪醇为甲醇、乙醇等，脂肪酮为丙酮、丁酮等，优选正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系，且它们的用量体积比为(1-10)∶10∶(10-20)∶5，例如11∶15∶8∶5或8∶12∶16∶5等，优选体积比为11∶15∶8∶5，以上相为固定相，下相为流动相。
所述主机转动的速度控制在500-999r/min之间，流动相流速控制在0.5-3mL/min。主机转速优选为850r/min，流动相流速优选为1.2mL/min。
所述的逆流色谱仪柱子中充满固定相时，控制固定相保留值为0.5-0.7，优选固定相保留值为0.6。
所述的溶剂体系分离出的白术内酯经蒸干后，可用乙酸乙酯萃取。
实验条件适合温度15-30℃，在上述温度范围内，温度较低时，出峰时间略有提前，分离效率变化不大，对峰形无多大影响。
本发明由于应用高速逆流色谱法分离白术内酯，且采用优选的溶剂体系，调整主机转速和流速的工艺条件，使分离效率提高，获得高纯度的白术内酯III，同时使被分离物回收率高，理论达100％，本发明实际达到99％以上，并且本发明的分离制备方法适合于各种工艺途径制备的白术粗提物，能保证较高峰形分辨度，分离量大、分离环境缓和、节约溶剂、操作简便，最后得到白术内酯III的白色固体经HPLC检测，纯度均在95％以上。
图1是本发明的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(11∶15∶8∶5)体系分离白术内酯III的逆流色谱图；图2是本发明的白术内酯III的1HNMR图；图3是本发明的白术内酯III的EI-MS图；图4是本发明的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶10∶10∶5)体系分离白术内酯III的逆流色谱图；图5是本发明的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(10∶10∶20∶5)体系分离白术内酯III的逆流色谱图；图6是本发明的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶10∶20∶5)体系分离白术内酯III的逆流色谱图；图7是本发明的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(10∶10∶10∶5)体系分离白术内酯III的逆流色谱图。
具体实施例方式
实施例11.粗提物的制备将白术粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 95％乙醇，回流提取3h后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏备用。
2.高速逆流色谱分离制备白术内酯III首先，从体系中选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备白术内酯III。按11∶15∶8∶5按体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。
设定实验温度为25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，还运用HX-1050恒温循环器。
称取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。进样前，先用AKTA purifier把固定相充满整个逆流色谱仪柱子，控制固定相保留值为0.6，调整主机转速850r/min，流动相以1.2mL/min的流速泵入柱内，待系统稳定后，由进样阀进样。然后根据UV-900紫外检测器检测图谱，接收目标成分。HSCCC图谱如图1所示，6号峰即为白术内酯III。目标成分收集后经蒸干，乙酸乙酯萃取两次，可得白术内酯的白色固体，经HPLC检测纯度为95％，并经过1HNRM，MS测试鉴定结构，其中，核磁共振1HNRM图谱如图2所示，质谱(EI-MS)图谱如图3所示，它们的分析数据如下1HNMR(CD3OD)4.90(1H，s)，4.63(1H，s)，2.65(1H，m)，2.46(2H，m)，2.2(1H，m)，2.0(1H，m)，1.90(1H，d)，1.84(3H，s)，1.65(2H，m)，1.57(1H，J＝4.5Hz，d)，1.48(1H，d)，1.25(1H，J＝12.3Hz，m)，1.0(3H，s)。
EI-MSM/Z＝248(M+)，230(M-H2O)，220，191，159，147，与白术内酯III的分子量一致。
1HNRM、MS的结构分析数据与文献报道的白术内酯III的数据一致，推定其为白术内酯III。
实施例2
1.粗提物的制备将白术粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 95％乙醇，回流提取3h后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏备用。
2.高速逆流色谱分离制备白术内酯III首先，从体系中选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备白术内酯III。按1∶10∶10∶5按体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。
设定实验温度为15℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，还运用HX-1050恒温循环器。
称取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。进样前，先用AKTA purifier把固定相充满整个逆流色谱仪柱子，控制固定相保留值为0.6，调整主机转速500r/min，流动相以0.5mL/min的流速泵入柱内，待系统稳定后，由进样阀进样。然后根据UV-900紫外检测器检测图谱，接收目标成分。HSCCC图谱如图4所示，4号峰即为白术内酯III。目标成分收集后经蒸干，乙酸乙酯萃取两次，可得白术内酯的白色固体，经HPLC检测纯度为93％，并经过1HNRM，MS测试鉴定了结构。
实施例31.粗提物的制备将白术粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 95％乙醇，回流提取3h后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏备用。
2.高速逆流色谱分离制备白术内酯III
首先，从体系中选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备白术内酯III。按10∶10∶20∶5按体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。
设定实验温度为30℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，还运用HX-1050恒温循环器。
称取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。进样前，先用AKTA purifier把固定相充满整个逆流色谱仪柱子，控制固定相保留值为0.6，调整主机转速999r/min，流动相以3mL/min的流速泵入柱内，待系统稳定后，由进样阀进样。然后根据UV-900紫外检测器检测图谱，接收目标成分。HSCCC图谱如图5所示，4号峰即为白术内酯III。目标成分收集后经蒸干，乙酸乙酯萃取两次，可得白术内酯的白色固体，经HPLC检测纯度分别为91％，并经过1HNRM，MS测试鉴定了结构。
实施例41.粗提物的制备将白术粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 95％乙醇，回流提取3h后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏备用。
2.高速逆流色谱分离制备白术内酯III首先，从体系中选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备白术内酯III。按1∶10∶20∶5按体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。
设定实验温度为20℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，还运用HX-1050恒温循环器。
称取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。进样前，先用AKTA purifier把固定相充满整个逆流色谱仪柱子，控制固定相保留值为0.6，调整主机转速700r/min，流动相以2mL/min的流速泵入柱内，待系统稳定后，由进样阀进样。然后根据UV-900紫外检测器检测图谱，接收目标成分。HSCCC图谱如图6所示，6号峰即为白术内酯III。目标成分收集后经蒸干，乙酸乙酯萃取两次，可得白术内酯的白色固体，经HPLC检测纯度分别为94％，并经过1HNRM，MS测试鉴定了结构。
实施例51.粗提物的制备将白术粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 95％乙醇，回流提取3h后，过滤，旋转蒸干，得棕黄色浸膏备用。
2.高速逆流色谱分离制备白术内酯III首先，从体系中选取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备白术内酯III。按10∶10∶10∶5按体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。
设定实验温度为26℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，还运用HX-1050恒温循环器。
称取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。进样前，先用AKTA purifier把固定相充满整个逆流色谱仪柱子，控制固定相保留值为0.6，调整主机转速600r/min，流动相以1.8mL/min的流速泵入柱内，待系统稳定后，由进样阀进样。然后根据UV-900紫外检测器检测图谱，接收目标成分。HSCCC图谱如图7所示，3号峰即为白术内酯III。目标成分收集后经蒸干，乙酸乙酯萃取两次，可得白术内酯的白色固体，经HPLC检测纯度分别为92％，并经过1HNRM，MS测试鉴定了结构。
权利要求
1.一种单体白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法，该方法包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系；使逆流色谱仪柱子中充满固定相，再使主机转动，然后将流动相泵入柱内；或用泵同时泵入固定相和流动相，再使主机转动；由进样阀进样；根据检测器谱图接收目标组分，其特征在于，所述的溶剂体系由烷烃，脂肪酯，脂肪醇或脂肪酮、水组成。
2.如权利要求1所述的单体白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于，所述的烷烃为正己烷，所述的脂肪酯为乙酸乙酯，所述的脂肪醇为甲醇，所述的脂肪酮为丙酮，在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系中，它们的用量体积比为(1-10)∶10∶(10-20)∶5，以上相为固定相，下相为流动相。
3.如权利要求2所述的单体白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于，所述的溶剂体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的体积比为11∶15∶8∶5
4.如权利要求1所述的单体白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于，所述主机转动的速度控制在500-999r/min之间，流动相流速控制在0.5-3mL/min。
5.如权利要求4所述的单体白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于，所述的主机转速为850r/min，流动相流速为1.2mL/min。
6.如权利要求1所述的单体白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于，所述的逆流色谱仪柱子中充满固定相时，控制固定相保留值为0.5-0.7。
7.如权利要求6所述的单体白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于，所述的固定相保留值为0.6。
8.如权利要求1至3中任一项所述的单体白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法，其特征在于，所述的溶剂体系分离出的白术内酯经蒸干后，可用乙酸乙酯萃取。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度单体白术内酯的高速逆流色谱分离制备方法，该方法包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系；使逆流色谱仪柱子中充满固定相；再使主机转动，然后将流动相泵入柱内；由进样阀进样；根据检测器谱图接收目标组分，所用溶剂体系由烷烃，脂肪酯，脂肪醇或脂肪酮、水组成，以上相为固定相，下相为流动相。本方法可获得高纯度单体白术内酯III，纯度可达95％，且该方法能保证较高峰形分辨度，分离量大、分离环境缓和、操作简便，被分离物回收率高，易于推广使用。
文档编号C07D307/00GK1982302SQ20051011154
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者张继全, 沈平孃, 刘志远, 刘峻, 徐超 申请人:上海中药制药技术有限公司, 国家中药制药工程技术研究中心