专利名称：促翻译反应dna片断和使用该片断的无细胞系蛋白质合成法的制作方法
技术领域：
本发明涉及促进翻译反应的DNA片断、具有该DNA片断的蛋白质表达载体以及模板DNA、从该模板DNA得到的mRNA、含有该模板DNA或mRNA的无细胞系蛋白质合成反应液、使用该模板DNA的无细胞系蛋白质合成方法、以及含有该表达载体的无细胞系蛋白质合成试剂盒。
背景技术：
近年来，以人基因组为代表，很多生物遗传信息正在被破解。这其中，作为后基因组研究，注意力被集中在对应这些遗传信息的蛋白质的功能分析或基因组创药。将对应这些遗传信息的蛋白质应用、利用于医药品等中，需要在短时间内简单地合成很多种蛋白质。
现在，在蛋白质的生产方法中，被广泛利用的是通过基因结合技术，使用酵母或昆虫细胞(昆虫培养细胞)等活细胞的表达系(下面有时称为“细胞系”)。但是，活细胞为了维持自身功能而有排除外来蛋白质的趋势，另外，活细胞如果表达细胞毒蛋白质，则由于细胞不能生育等，而有很多难以表达的蛋白质。
另一方面，作为不使用细胞系的蛋白质的生产方法，已知有如下所述的无细胞系的蛋白质合成系，即，进行向细胞裂解液或提取液中加入基质或酶等过程等，在试管内备齐生物的遗传信息翻译系或遗传信息转录/翻译系，作为翻译模板，使用具有编码目的蛋白的结构基因的DNA(转录模板)或mRNA(翻译模板)，重新构建可以按照希望的顺序使氨基酸结合必要的残基数的合成系。在这样的无细胞系蛋白质合成中，难以受到上述细胞系的蛋白质合成之类的限制，能够不切断生物的生命进行蛋白质的合成，另外，由于在蛋白质的生产中不伴随培养等操作，所以与细胞系相比，能够在短时间内进行蛋白质的合成。进而，在无细胞系蛋白质合成中，由生命体不利用的氨基酸序列构成的蛋白质的大量生产也成为可能，所以被认为是有希望的表达方法。作为提供到这样的无细胞系的蛋白质合成中的提取液(无细胞系蛋白质合成用提取液)，探讨使用各种生物来源的提取液，其研究在进展。
但是，已知真核生物的mRNA在从DNA转录之后，进行剪接(splicing)或多聚A尾(polyA tail)的添加、5’帽子结构的添加等各种修饰。利用多聚A尾以及5’帽子结构的添加，真核生物mRNA促进向核糖体的40s亚单位的结合。因而，以往，当使用真核生物来源的无细胞系蛋白质合成用提取液时，为了有效地进行翻译反应，向转录反应系添加市售的帽子类似物，进行mRNA的加帽。但是，帽子类似物价格高，转录效率显著降低，只能得到少量mRNA。进而，未反应的帽子类似物由于抑制翻译反应，所以转录反应结束后，有必要使用旋转柱(spin column)等完全除去该未反应的帽子类似物，以高生产量(high throughput)处理样品，因而存在大的问题。
在这样的背景的基础上，河原崎等清楚地了解到烟草蚀刻病毒(tobacco etch virus)来源的5’非翻译区(5’un translated region，下面简称为“5’UTR”)具有帽子非依赖性的(不具有帽子结构)的翻译促进活性(例如，参照河原崎等“Biotechnol.Prog”Vol.16，No.3，p517-521(2000).)。在河原崎等“Biotechnol.Prog”Vol.16，No.3，p517-521(2000).中报道了在使用了小麦胚芽提取液的无细胞系蛋白质合成中，由将烟草蚀刻病毒来源的5’UTR添加于编码需要的蛋白质的结构基因的5’上游侧的DNA转录得到的mRNA被作为翻译模板使用，得到与添加了帽子结构的mRNA相同的翻译效率。另外，报道有在使用了兔网织红细胞来源的提取液的无细胞系蛋白质合成中，野兔β球蛋白的5’UTR也具有相同的作用(例如，参照Annweiler等，“Nucleic acids Res”Vol.19，No.13，p3750(1991).)。
作为无细胞系蛋白质合成用提取液，一直以来已知有上述小麦胚芽、兔网织红细胞，除此以外，还已知有大肠杆菌、昆虫培养细胞等来源的提取液。我们迄今为止已经提出使用了蚕组织来源的提取液(蚕提取液)或昆虫培养细胞来源的提取液(昆虫培养细胞提取液)、哺乳动物培养细胞来源的提取液(下面称为哺乳动物培养细胞提取液)的无细胞系蛋白质合成方法(例如，参照日本特开2003-235598号公报，日本特开2004-215651号公报)。在我们提出的使用了蚕提取液或昆虫培养细胞提取液、哺乳动物培养细胞提取液的无细胞系蛋白质合成方法中，与以往的方法相比，提取液的调制特别容易，由于是真核生物来源，所以具有也可以进行糖蛋白的合成的优点，非常有用。因而即使在使用了这样的提取液的无细胞系蛋白质合成中，也发现能够更迅速而且高通量地进行无细胞系蛋白质合成的且不依赖于帽子结构的促翻译序列，进而构建能够简单地克隆需要的基因的表达载体是非常重要的课题。
发明内容
本发明正是为了解决上述课题而完成的发明，其目的在于，提供能够简便地克隆需要的基因进而可以提高翻译效率的DNA片断、具有该DNA片断的蛋白质表达载体以及模板DNA、从该模板DNA得到的mRNA、含有该模板DNA或mRNA的无细胞系蛋白质合成反应液、使用了该模板型DNA的无细胞系蛋白质合成方法，以及含有该表达载体的无细胞系蛋白质合成试剂盒。
本发明人等为了解决上述课题而进行潜心研究，结果完成本发明。即，本发明如下所述。
本发明之一提供一种DNA片断，是在无细胞系蛋白质合成中，为了促进翻译反应而使用的下面的(a)～(l)的任意的DNA片断。
(a)具有序列表的序列号1所示的碱基序列的DNA片断，(b)具有序列表的序列号2所示的碱基序列的DNA片断，(c)具有序列表的序列号3所示的碱基序列的DNA片断，(d)具有序列表的序列号4所示的碱基序列的DNA片断，(e)具有序列表的序列号5所示的碱基序列的DNA片断，(f)具有序列表的序列号6所示的碱基序列的DNA片断，(g)具有序列表的序列号7所示的碱基序列的DNA片断，(h)具有序列表的序列号8所示的碱基序列的DNA片断，(i)具有序列表的序列号9所示的碱基序列的DNA片断，
(j)具有序列表的序列号10所示的碱基序列的DNA片断，(k)具有序列表的序列号11所示的碱基序列的DNA片断，以及(l)具有在上述(a)～(k)的任意的碱基序列中1或多个碱基被缺失、置换、插入或添加的碱基序列，且具有促翻译反应活性的DNA片断。
本发明之二是含有从具有促翻译反应活性的下面的(a)～(l)中选择的至少一种DNA片断的表达载体。
(a)具有序列表的序列号1所示的碱基序列的DNA片断，(b)具有序列表的序列号2所示的碱基序列的DNA片断，(c)具有序列表的序列号3所示的碱基序列的DNA片断、(d)具有序列表的序列号4所示的碱基序列的DNA片断，(e)具有序列表的序列号5所示的碱基序列的DNA片断，(f)具有序列表的序列号6所示的碱基序列的DNA片断，(g)具有序列表的序列号7所示的碱基序列的DNA片断，(h)具有序列表的序列号8所示的碱基序列的DNA片断，(i)具有序列表的序列号9所示的碱基序列的DNA片断，(j)具有序列表的序列号10所示的碱基序列的DNA片断，(k)具有序列表的序列号11所示的碱基序列的DNA片断，以及(l)具有在上述(a)～(k)的任意的碱基序列中1或多个碱基被缺失、置换、插入或添加的碱基序列，而且具有促翻译反应活性的DNA片断。
本发明之三是具有编码蛋白质的结构基因和被结合(incorporated)到结构基因的5’上游侧的DNA片断的无细胞系蛋白质合成用的模板DNA，DNA片断是从下面的(a)～(l)中选择的至少一种。
(a)具有序列表的序列号1所示的碱基序列的DNA片断，(b)具有序列表的序列号2所示的碱基序列的DNA片断，(c)具有序列表的序列号3所示的碱基序列的DNA片断，(d)具有序列表的序列号4所示的碱基序列的DNA片断，(e)具有序列表的序列号5所示的碱基序列的DNA片断，(f)具有序列表的序列号6所示的碱基序列的DNA片断，
(g)具有序列表的序列号7所示的碱基序列的DNA片断，(h)具有序列表的序列号8所示的碱基序列的DNA片断，(i)具有序列表的序列号9所示的碱基序列的DNA片断，(j)具有序列表的序列号10所示的碱基序列的DNA片断，(k)具有序列表的序列号11所示的碱基序列的DNA片断，以及(l)具有在上述(a)～(k)的任意的碱基序列中1或多个碱基被缺失、置换、插入或添加的碱基序列，而且具有促翻译反应活性的DNA片断。
本发明之三是转录本发明之三中记载的模板DNA而得到的mRNA，在无细胞系蛋白质合成中作为翻译模板使用。
本发明之五是含有本发明之三中记载的模板DNA或转录上述模板DNA得到的mRNA的无细胞系蛋白质合成用反应液。
还有，在本发明中，液体(solution)包括悬浊液(suspension)。
本发明之六是使用本发明之三中记载的模板DNA或转录上述模板DNA得到的mRNA的无细胞系蛋白质合成方法。
本发明之七涉及本发明之六中记载的无细胞系蛋白质合成方法，其中，使用了含有动物来源的提取物的无细胞系蛋白质合成反应液。
本发明之八涉及本发明之七中记载的无细胞系蛋白质合成方法，其中，动物来源的提取物是从蚕组织提取的。
本发明之九涉及本发明之七中记载的无细胞系蛋白质合成方法，其中，动物来源的提取物是从昆虫培养细胞提取的。
本发明之十涉及本发明之九中记载的无细胞系蛋白质合成方法，其中，昆虫培养细胞是粉丝夜蛾(Trichoplusia ni)的卵细胞来源和/或草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞来源的细胞。
本发明之十一涉及本发明之七中记载的无细胞系蛋白质合成方法，其中，动物来源的提取物是从哺乳动物细胞提取的。
本发明之十二涉及本发明之十一中记载的无细胞系蛋白质合成方法，其中，哺乳动物细胞是兔网织红细胞。
本发明之十三涉及本发明之十一中记载的无细胞系蛋白质合成方法，其中，哺乳动物细胞是哺乳动物培养细胞。
本发明之十四涉及本发明之十三中记载的无细胞系蛋白质合成方法，其中，哺乳动物培养细胞是中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary)细胞。
本发明之十五涉及本发明之六中记载的无细胞系蛋白质合成方法，其中，使用了含有小麦胚芽来源的提取物的无细胞系蛋白质合成反应液。
本发明之十六是包含本发明之二中记载的表达载体的无细胞系蛋白质合成用试剂盒。
通过本发明，可以简单地克隆需要的基因，进而可以提高翻译效率。
图1是表示实验例2的结果的图表。
图2是表示实验例3的结果的图表。
图3是表示实验例4的结果的图表。
图4是表示实验例5的结果的图表。
图5是表示实施例1的结果的图表。
图6是表示实施例2的结果的图表。
图7是表示通过参考例24制作的表达载体pTD1的载体图。
图8是表示通过参考例25制作的表达载体pTD2的载体图。
图9是表示实施例3的结果的图表。
图10是表示实施例4的结果的图表。
具体实施例方式
下面对本发明进行详细说明。
<DNA片断>
本发明的DNA片断是不依赖于帽子结构、在蛋白质表达系中具有促翻译反应活性的DNA片断。在这里，“具有促翻译反应活性”是指通过使用本发明的DNA片断进行无细胞系蛋白质合成反应，与不使用该DNA片断的情况相比，蛋白质合成量被提高(例如，1.2倍以上，优选2倍以上)。
作为简便地检测促进上述翻译反应的DNA片断的效果的机构，使用无细胞系蛋白质合成系，但本发明的表达载体不被限定于无细胞系，也可以用于以往公知的细胞系。
作为具有本发明的帽子非依赖性的促翻译反应活性的DNA片断，具体地说可以举出具有序列表的序列号1～11中的任意所示的碱基序列的双链DNA片断。在这些DNA片断中，也包括具有与它们均等的(从上述序列号1～11中的任意所示的碱基序列缺失、置换、插入或添加1或多个碱基)碱基序列，而且具有促翻译反应活性的双链DNA片断。
序列表的序列号1～11所示的碱基序列分别是作为蚕或杆状病毒(baculovirus)中的5’非翻译区(5’UTR)的公知的碱基序列。具体地说，分别作为如下所示的碱基序列而被公知，即(1-1)序列号1所示的碱基序列是蚕的丝蛋白L链基因的5’UTR的碱基序列，(1-2)序列号2所示的碱基序列是蚕的丝胶蛋白基因的5’UTR的碱基序列，(1-3)序列号3所示的碱基序列是AcNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列，(1-4)序列号4所示的碱基序列是BmCPV(家蚕胞质型多角体病毒Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列，(1-5)序列号5所示的碱基序列是EsCPV(Euxoa scandes胞质型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列，(1-6)序列号6所示的碱基序列是HcNPV(Hyphantria cunea核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列，(1-7)序列号7所示的碱基序列是CrNPV(Choristoneura rosaceana核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列，(1-8)序列号8所示的碱基序列是EoNPV(Ecotropis oblique核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列，(1-9)序列号9所示的碱基序列是MnNPV(Malacosma neustria核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列，(1-10)序列号10所示的碱基序列是SfNPV(草地夜蛾核型多角体病毒Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列，(1-11)序列号11所示的碱基序列是WsNPV(Wiseana signata核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR的碱基序列。
本发明发现，具有这些碱基序列的DNA片断或者在不损坏功能的范围内均等的DNA片断，在无细胞系蛋白质合成中发挥出特别有用的促翻译反应活性。还有，本发明中的DNA片断如果是源自蚕或杆状病毒的5’UTR，可以不必具有上述碱基序列。
本发明的DNA片断也可以利用以往公知的任何方法得到。例如，可以使用公知的DNA合成机合成。
<表达载体>
优选将一个或多个本发明的DNA片断结合到编码蛋白质的结构基因的5’上游侧，构建成表达载体。这种表达载体也被包括在本发明中。本发明的表达载体可以为环状或直链状。
还有，本发明的表达载体中，发挥出显著的促翻译反应活性、特别优选的表达载体如下所例示。
(2-1)按照顺向，将一个由序列号2所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体；(2-2)按照顺向，将一个由序列号3所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体；(2-3)按照顺向，将一个由序列号4所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体；(2-4)按照逆向，将具有彼此相同或不同的碱基序列的2个DNA片断结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体，其中，所述的2个DNA片断是从由序列号5所示的碱基序列构成的DNA片断、和具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断所形成的组中选择的2个DNA片断；
(2-5)按照逆向，将一个由序列号6所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体；(2-6)按照逆向，将具有彼此相同或不同的碱基序列的2个DNA片断结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体，其中，所述的2个DNA片断是从由序列号6所示的碱基序列构成的DNA片断、和具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断所形成的组中选择的2个DNA片断；(2-7)按照顺向，将一个由序列号7所示的碱基序列构成的DNA片断或具有与其均等的碱基序列而且具有促翻译反应活性的DNA片断结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体；(2-8)按照逆向，将一个由序列号7所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体；(2-9)按照逆向，将一个由序列号8所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体；(2-10)按照顺向，将具有彼此相同或不同的碱基序列的2个DNA片断结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体，其中，所述的2个DNA片断是从由序列号9所示的碱基序列构成的DNA片断、和具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断所形成的组中选择的1个DNA片断，或者从上述组中选择的2个DNA片断；(2-11)按照逆向，将一个由序列号9所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体；(2-12)按照顺向，将一个由序列号10所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体；(2-13)按照顺向，将一个由序列号11所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在启动子序列的3’下游侧的表达载体；本发明的表达载体在上述DNA片断的5’上游侧通常至少具有一个启动子序列。作为启动子序列，例如可以举出以往公知的T7启动子序列、SP6启动子序列、T3启动子序列等。
本发明的表达载体包括一个或多个上述DNA片断。上述DNA片断在启动子序列的3’下游侧可以按顺向(5’→3’)结合，也可以按逆向结合。在包括多个上述DNA片断的情况下，上述DNA片断可以相同也可以彼此不同。另外，当结合两个以上的DNA片断时，即使全部DNA片断未按相同方向结合也可以。
另外，本发明的表达载体具有用于插入对表达的蛋白质进行编码的结构基因的序列。作为用于插入的序列，可以举出以往公知的多克隆位点或引起同源结合(homologous recombination)反应的序列等。用于插入对这种蛋白质进行编码的结构基因的序列被结合到具有上述促翻译反应活性的DNA片断的3’下游侧。从使表达的蛋白质的纯化变得容易的观点出发，在用于插入这种结构基因的序列中可以添加编码以往公知的His(组氨酸)标签或GST标签的碱基序列等。
另外，从已合成的mRNA的稳定性等观点出发，本发明的表达载体优选在用于插入对上述蛋白质进行编码的结构基因的序列的3’下游侧，具有3’非翻译区(3’UTR)以及polyA序列。
另外，本发明的表达载体优选在上述polyA的3’下游侧具有起到使转录终止的功能的终止子(terminator)序列。作为上述终止子序列，例如可以举出以往公知的T7终止子序列、SP6终止子序列、T3终止子序列等。
另外，本发明的表达载体为了在宿主内保持稳定而具有抗药标记。作为抗药标记，例如可以举出以往公知的抗氨苄霉素基因、抗卡那霉素基因等。
另外，本发明的表达载体为了在宿主内进行自主复制而具有复制起点。作为复制起点，例如可以举出以往公知的pBR322 Ori、pUC、Ori、SV40 Ori等。另外，为了可以作为穿梭载体使用，也可以具有在不同宿主间发挥功能的复制起点。
上述表达载体可以使用以往公知的基因重组技术制作。
向上面已述的本发明的表达载体中插入对在无细胞系中合成的目的蛋白质(包括肽)进行编码的结构基因。对结构基因所编码的蛋白质(包括肽)没有特别限定，可以是具有对在活细胞中成为细胞毒的蛋白质进行编码的碱基序列的结构基因，也可以是具有编码糖蛋白的碱基序列，还可以是编码融合蛋白质的碱基序列。另外，从使表达的蛋白质的纯化变得容易的观点出发，也可以添加编码以往公知的His标签或GST标签的碱基序列等。这些标签序列通常被添加于目的蛋白质的N末端或C末端。
还有，结构基因对其碱基数没有特别限制，只要是可以合成作为目的的蛋白质，即使碱基数全不相同也可以。另外，只要在可以合成目的蛋白质的程度下是相同的序列，各结构基因也可以缺失、置换、插入或添加多个碱基。
<模板DNA>
在上述本发明的表达载体中，已插入编码目的蛋白质(包括肽)的结构基因的载体(下面称为模板DNA)，可以在细胞系和无细胞系中使用。即，本发明的DNA片断优选被一个或多个结合到编码蛋白质的结构基因的5’上游侧，构建为模板DNA。这种模板DNA也被包括在本发明中。本发明的模板DNA可以为环状或直链状。在本发明的模板DNA中，上述DNA片断在结构基因的5’上游侧可以被按照顺向(5’→3’)结合，也可以按逆向结合。另外，在本发明的模板DNA中，也可以结合两个以上的DNA片断，在这种情况下，结合的DNA片断可以相同也可以彼此不同。另外，当结合两个以上的DNA片断时，即使全部的DNA片断未在结合在相同的方向也可以。DNA片断在结构基因的5’上游侧可以被结合为与结构基因相邻，也可以在一个以上的碱基序列介于其和结构基因之间的状态下被结合。这种模板DNA可以通过使用公知的基因操作技术适当构建。
本发明的模板DNA中的结构基因，是编码在无细胞系中合成的目的蛋白质的区域。对结构基因编码的蛋白质(包括肽)没有特别限定，可以是具有对在活细胞中成为细胞毒的蛋白质进行编码的碱基序列的结构基因，另外也可以是具有编码糖蛋白的碱基序列的结构基因，也可以为编码融合蛋白质的碱基序列。
本发明的模板DNA在DNA片断的5’上游侧，通常至少具有一个启动子序列。作为启动子序列，例如可以举出以往公知的T7启动子序列、SP6启动子序列、T3启动子序列等。
另外，本发明的模板DNA优选在上述结构基因的3’下游侧具有起到使转录终止的功能的终止子序列、和/或从已合成的mRNA的稳定性等观点出发具有polyA序列。作为上述终止子序列，例如可以举出以往公知的T7终止子序列、SP6终止子序列、T3终止子序列等。
还有，本发明的模板DNA中发挥出显著的促翻译反应活性、特别优选的模板DNA如下所例示。
(3-1)按照顺向，将一个由序列号2所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA；(3-2)按照顺向，将一个由序列号3所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA；(3-3)按照顺向，将一个由序列号4所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA；(3-4)按照逆向，将具有彼此相同或不同的碱基序列的2个DNA片断结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA，其中，所述的2个DNA片断是从由序列号5所示的碱基序列构成的DNA片断、和具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断所形成的组中选择的2个DNA片断；(3-5)按照逆向，将一个由序列号6所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA；(3-6)按照逆向，将具有彼此相同或不同的碱基序列的2个DNA片断结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA，其中，所述的2个DNA片断是从由序列号6所示的碱基序列构成的DNA片断、和具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断所形成的组中选择的2个DNA片断；(3-7)按照顺向，将一个由序列号7所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA；(3-8)按照逆向，将一个由序列号7所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA；(3-9)按照逆向，将一个由序列号8所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA；(3-10)按照顺向，将具有彼此相同或不同的碱基序列的2个DNA片断结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA，其中，所述的2个DNA片断是从由序列号9所示的碱基序列构成的DNA片断、和具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断所形成的组中选择的2个DNA片断；将两个由序列号9所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，；(3-11)按照逆向，将一个由序列号9所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA；(3-12)按照顺向，将一个由序列号10所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA；(3-13)按照顺向，将一个由序列号11所示的碱基序列构成的DNA片断、或具有与其均等的碱基序列且具有促翻译反应活性的DNA片断，结合在结构基因的5’上游侧的模板DNA。
上述已述的本发明的模板DNA，可以在无细胞系蛋白质合成中适合作为转录模板使用。
<mRNA>
另外，转录本发明的模板DNA得到的mRNA，可以在翻译系的无细胞系蛋白质合成中适合作为翻译模板使用。转录这样的上述模板DNA得到的mRNA，也被包括在本发明的范围内。本发明的mRNA可以利用以往公知的适当的方法转录上述模板DNA而调制，但优选通过自身公知的体外(in vitro)转录来转录上述模板DNA并调制。体外转录例如可以利用RiboMax大规模RNA生产系统-T7(RiboMaxLarge Scale RNAproduction System-T7)(Promega公司制)等进行。mRNA可以在转录后，通过自身公知的方法纯化分离，如后所述，作为无细胞系蛋白质合成用的翻译模板，可以用于翻译系用反应液。
当在细胞系中使用模板DNA时，采用以往公知的方法向作为宿主的生物中导入模板DNA，得到转化体。此时使用的宿主可以使用任何生物种。其中，具有本表达载体中包括的促翻译反应作用的DNA片断由于来自于蚕或杆状病毒，所以特别适合在使用了杆状病毒表达系或蚕的细胞系中使用。
<无细胞系蛋白质合成反应液和无细胞系蛋白质合成方法>
无细胞系蛋白质合成通常大致可分为只通过读取mRNA信息合成蛋白质的无细胞系翻译系的蛋白质合成(翻译系)，以及包括通过DNA转录mRNA的转录工序和读取在该转录工序中得到的mRNA的信息合成蛋白质的翻译工序的蛋白质合成(转录/翻译系)，上述模板DNA可以适合在任意系中使用。即，将上述模板DNA或对其进行转录得到的mRNA作为反应模板使用。在本发明中，包括使用了上述模板DNA或对其进行转录得到的mRNA的无细胞系蛋白质合成方法。
在本发明中，也包括将上述模板DNA或对其进行转录得到的mRNA作为反应模板使用的无细胞系蛋白质合成用反应液。该无细胞系蛋白质合成用反应液，适合用于本发明的无细胞系蛋白质合成中。本发明的无细胞系蛋白质合成用反应液可以是用于进行上述翻译系的合成反应的反应液(下面称为“翻译系用反应液”)、用于进行上述转录/翻译系的合成反应的反应液(下面称为“转录/翻译系用反应液”)的任意形态。即，可以是含有上述模板DNA作为转录模板的转录/翻译系用反应液，也可以是含有从上述模板DNA转录得到的mRNA作为翻译模板的翻译系用反应液。
在无细胞系蛋白质合成用反应液中，通常包括含有作为翻译装置的核糖体等的生物体来源提取物。另外，本发明的无细胞系蛋白质合成用反应液中含有的提取物，只要是能够生成按照模板DNA编码的蛋白质的提取物，就可以是任何物质，可以没有特别限制地使用以往公知的从大肠杆菌、小麦、大麦、稻子、玉米等稻子科的植物以及菠菜等植物种子的胚芽、兔网织红细胞等提取的提取物、提取液。它们也可以使用市售的提取液，也可以按照自身已知的方法，具体地说，在是大肠杆菌提取液的情况下，可以按照Zubay G“Ann Rev Genet”Vol.7，p267-287(1973)等中记载的方法等进行调制。作为市售的蛋白质合成用细胞提取液，大肠杆菌来源可以举出用于线性模板的大肠杆菌提取物(E.coli S30 extract for lineartemplates)(Promega公司制)等，兔网织红细胞来源可以举出兔网织红细胞溶解产物系统(rabbit reticulocyte lysate systems)(Promega公司制)等，小麦胚芽来源可以举出小麦胚芽提取物(wheat germ extract)(Promega公司制)、PROTEIOS(东洋纺织公司制)等。
在无细胞系蛋白质合成用反应液中，也可以含有如上所述的公知的提取物、提取液，但优选含有本发明人等提出的动物来源的提取物的反应液。作为动物来源的提取物，可以举出节肢动物来源的提取物、哺乳动物培养细胞来源的提取物等。
作为上述节肢动物来源的提取液，可以是从无论节肢动物的成长阶段的任何阶段的任何组织提取的提取液，另外，也可以是从节肢动物的任意组织来源的培养细胞提取的提取液。其中，优选从蚕组织或昆虫培养细胞提取的提取液。当将蚕组织作为提取对象时，如果含有从5龄期的3天～7天的蚕幼虫的后部丝腺的提取物，可以得到在短时间内能合成大量的蛋白质的无细胞系蛋白质合成用反应液，所以特别优选(参照特开2003-235598说明书)。另外，当将昆虫培养细胞作为提取对象时，例示蛋白质合成能力高且可以在无血清培养基中培养的粉丝夜蛾的卵细胞来源的细胞High Five(Invitrogen公司制)以及草地夜蛾卵巢细胞来源的细胞Sf21(Invitrogen公司制)作为适合的昆虫培养细胞(参照特开2004-215651说明书)。
另外，作为上述哺乳动物培养细胞来源的提取液，没有特别限制，例如，可以使用人、大鼠、小鼠、猴等以往公知的适当的哺乳动物来源的培养细胞。
另外，作为哺乳动物培养细胞，可以是任何组织来源的细胞，例如，可以没有特别限制地使用血细胞、生殖巢来源细胞、淋巴瘤(lymphoma)来源细胞、其它肿瘤细胞、干细胞等。其中，由于悬浮培养是可能的，所以培养和传代容易，因而优选使用淋巴瘤来源细胞。另外，中国仓鼠卵巢(CHO)k1-SFM细胞不只可以悬浮培养，还可以在无血清培养基中培养，培养和传代更加容易。进而，在细胞系中被广泛利用，具有高的蛋白质合成能力，在无细胞系中也可以期待产生相同的效果，所以优选使用CHO K1-SFM细胞。
另外，不限于单一种类的哺乳动物中的单一的组织来源的哺乳动物培养细胞，可以从单一种类的哺乳动物中的多种组织来源的哺乳动物培养细胞中进行提取，也可以从多种哺乳动物中的单一的组织来源的哺乳动物培养细胞中进行提取，当然也可以从多种哺乳动物中的多种组织来源的哺乳动物培养细胞中进行提取。
作为在从上述动物来源的组织或培养细胞中的提取操作中使用的提取用液，没有特别限制，但优选至少含有蛋白酶抑制剂。如果使用含有蛋白酶抑制剂的提取用液，提取物中含有的蛋白酶的活性被抑制，可以防止该蛋白酶引起的提取物中的活性蛋白的不希望的分解，可以有效地引导出提取物具有的蛋白质合成能力。作为上述蛋白酶抑制剂，只要可以抑制蛋白酶的活性，就没有特别限制，例如可以使用甲苯磺酰氟(phenylmethanesulphonyl fluorid，下面有时称为“PMSF”)、抑肽酶(aprotinin)、贝他定(bestatin)、亮肽素(leupeptin)、抑胃肽(pepstatin)A、E-64(L-转环氧琥珀酰亮氨酰酰胺-4-胍基丁烷L-trans-epoxysuccinylleucylamide-4-guanidinobutane)、乙二胺四乙酸、磷酸阿米酮等，但由于提取物中大多含有丝氨酸蛋白酶，所以优选使用在上述中作为相对于丝氨酸蛋白酶具有高特异性的抑制剂发挥作用的PMSF。另外，不只一种蛋白酶抑制剂，也可以使用多种的混合物(蛋白酶抑制剂混合物)。
对在该提取用液中的蛋白酶抑制剂的含量没有特别限制，但从可以很好地发挥无细胞系蛋白质合成所必需的酶类的分解抑制能力的观点出发，优选含有1μM～50mM，更优选含有0.01mM～5mM。这是因为，如果蛋白酶抑制剂不到1μM，有不能充分抑制蛋白酶的分解活性的趋势，另外，如果蛋白酶抑制剂超过50mM，有抑制蛋白质合成反应的趋势。
另外，用于上述动物来源的组织或培养细胞的提取用液，除了上述蛋白酶抑制剂之外，优选至少含有钾盐、镁盐、二硫苏糖醇(下面称为DTT)以及缓冲剂。
作为上述钾盐，例如可以以醋酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二钾、硫酸钾、磷酸二氢钾、碘化钾、苯二甲酸钾等一般的形态进行使用，其中，优选使用醋酸钾。钾盐作为蛋白质合成反应中的辅助因子发挥作用。
对该提取用液中的钾盐的含量没有特别限制，但从保存稳定性的观点来看，当是例如醋酸钾等一价钾盐时，优选含有10mM～500mM，更优选含有20mM～300mM。这是因为，钾盐如果不到10mM或超过500mM，在蛋白质合成中所必需的成分有变得不稳定的趋势。
作为上述镁盐，例如可以以醋酸镁、硫酸镁、氯化镁、柠檬酸镁、磷酸氢镁、碘化镁、乳酸镁、硝酸镁、草酸镁等一般的形态进行使用，其中优选使用醋酸镁。镁盐也可以作为蛋白质合成反应中的辅助因子发挥作用。
对该提取用液中的镁盐的含量没有特别限制，从保存稳定性的观点来看，当是例如醋酸镁等二价盐时，优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mM。这是因为，镁盐如果不到0.1mM或超过10mM，在蛋白质合成中所必需的成分有变得不稳定的趋势。
上述DTT是为了防止氧化而配合的物质，在该提取用液中优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mM。这是因为，DTT如果不到0.1mM或超过10mM，在蛋白质合成中所必需的成分有变得不稳定的趋势。
上述缓冲剂是为了向提取用液赋予缓冲能力、例如防止由酸性或碱性物质的添加等引起的提取液的pH的急剧变化所导致的提取物的变性而配合的。对这样的缓冲剂没有特别限制，例如可以使用HEPES-KOH、Tris-HCL、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸、硼酸、MES、PIPES等。
缓冲剂优选使用将得到的提取液的pH保持在4～10的缓冲剂，更优选使用pH被保持在6.0～8.5的缓冲剂。这是因为，如果提取液的pH不到4或pH超过10，本发明的反应中所必需的成分可能会变性。从这样的观点出发，在上述中特别优选使用HEPES-KOH(pH6.0～8.5)对该提取用液中的缓冲剂的含量没有特别限制，从保持适当的缓冲能力的观点出发，优选含有5mM～200mM，更优选含有10mM～100mM。这是因为，缓冲剂如果不到5mM，酸性或碱性物质的添加引起的pH的急剧变动，由导致提取物变性的趋势，另外还因为，缓冲剂如果超过200mM，盐浓度变得过高，在蛋白质合成中所必需的成分有变得不稳定的趋势。
进而，当提取对象是节肢动物或哺乳动物来源的培养细胞时，为了提高得到的提取液的蛋白质合成能力，优选进一步添加钙盐以及甘油。对钙盐没有特别限制，例如可以以氯化钙、醋酸钙、硫酸钙、柠檬酸钙、碘化钙、乳酸钙、硝酸钙、草酸钙等一般的形态进行使用，其中优选使用氯化钙。在这种情况下，对氯化钙的含量没有特别限制，但从可以有效地发挥提高蛋白质合成能力的效果的观点出发，优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mM。另外，对甘油的添加量没有特别限制，从可以有效地发挥提高蛋白质合成能力的效果的观点出发，优选添加成为5(v/v)％～80(v/v)％，更优选添加成为10(v/v)％～50(v/v)％。
上述节肢动物来源的提取液可以通过进行以往公知的适当的提取操作得到，而其中为了使提取操作简便并得到高的蛋白质合成活性，蚕组织来源的提取液优选通过2003-235598说明书记载的方法制作，培养细胞来源的提取液优选通过特开2004-215651说明书记载的方法制作。
另外，对在制作哺乳动物培养细胞来源提取液时得细胞裂解方法没有特别限制，可以通过以往公知的适当的方法进行。其中，优选通过冻结、解冻来裂解细胞的方法。上述方法与以往的方法相比，由于能够以更温和的状态进行细胞的裂解，所以与以往相比，能够更容易地调制在无细胞系中蛋白质的合成量高的哺乳动物培养细胞提取液。
在上述哺乳动物培养细胞的细胞裂解方法中，需要急剧地使在提取用液中悬浮的哺乳动物培养细胞冻结。在该裂解方法中，“急剧地冻结”是指在10秒以下、优选在2秒以下使哺乳动物培养细胞冻结。这是因为，在没有急剧地使哺乳动物培养细胞冻结的情况下，在蛋白质合成中所必需的成分有可能失活，所以不能达到该提取方法的上述效果。
作为如上所述使哺乳动物培养细胞急剧地冻结的温度，通常为-80℃以下，优选为-150℃以下。这是因为，如果在超过-80℃的温度下急剧地使其冻结，会有蛋白质合成中必需的成分失活，蛋白质合成能力有降低的趋势。
上述哺乳动物培养细胞的急剧的冻结，例如可以通过使用液氮或液体氦等惰性气体等实现，而优选使用得到容易、成本低的液氮进行。
将上述已急剧冻结的哺乳动物培养细胞解冻之后进行离心分离时，解冻例如可以通过在-10℃～20℃的水浴或冰浴中解冻、在室温(25℃)下放置等实现，因为防止蛋白质合成中必需的成分的失活，确实可靠地防止蛋白质合成能力得降低，所以优选在0℃～20℃(特别是4℃～10℃)的水浴或冰水浴中进行解冻。
已解冻的哺乳动物培养细胞的离心分离，可以在该领域通常进行的条件(10000×g～50000×g、0℃～10℃、10分钟～60分钟)下进行。
在哺乳动物培养细胞提取液的调制方法中，对从细胞裂解后直至得到无细胞系蛋白质合成用的哺乳动物培养细胞提取液为止的步骤等，没有特别限制。
例如，当使已在提取用液中悬浮的哺乳动物培养细胞急剧地冻结的工序之后解冻、离心分离时，也可以将该离心分离后的上清(上清1)直接作为哺乳动物培养细胞提取液。另外，也可以进一步离心分离上清1，将得到的上清(上清2)作为哺乳动物培养细胞提取液。作为上述上清1的离心分离的条件，可以在与上述相同的条件(10000×g～50000×g、0℃～10℃、10分钟～60分钟)下进行。
还有，如上所述分别进行调制之后，也可以实施凝胶过滤，从凝胶过滤后的滤液分出280nm处的吸光度为10以上的组分，调制成为提取液。
还有，提供到调制方法中的哺乳动物培养细胞，为了避免培养中使用的培养基被带入到翻译反应液中，优选在进行上述急剧的冻结之前，预先用清洗液进行清洗。作为清洗液的组成，可以是组成与上述的提取用液相同的物质。用清洗液的清洗通过向哺乳动物培养细胞中添加清洗液并将其离心分离(例如，700×g、10分钟、4℃的条件)来进行。
从完全冲洗培养基的原因出发，清洗中使用的清洗液的量相对于湿重1g的哺乳动物培养细胞优选5mL～100mL，更优选为10mL～50mL。
清洗次数优选进行1次～5次，更优选进行2次～4次。
对哺乳动物培养细胞的量没有特别限制，而为了将提取效率保持在最佳，相对于提取用液1mL优选为0.1g～5g，更优选为0.5～2g。
对哺乳动物培养细胞来源的提取液中的提取物的含量没有特别限制，以蛋白质浓度计优选为1mg/mL～200mg/mL，其中更优选为10mg/mL～100mg/mL。这是因为，该提取物的含量如果以蛋白质浓度计不到1mg/mL，在无细胞系蛋白质合成中必需的成分的浓度则变低，有可能无法充分地进行合成反应，另外还因为，该提取物的含量如果以蛋白质浓度计超过200mg/mL，则提取液自身具有高粘性，有可能难以操作。
还有，含有上述范围的量的提取物的提取液，可以利用提取液的蛋白质浓度测量来调制。如同在该领域通常进行的那样，该蛋白质浓度测量按照如下步骤进行，即使用BCA蛋白质检测试剂盒(BCA Protein assay Kit)(PIERCE公司制)，相对反应试剂2mL加入样品0.1mL，37℃下反应30分钟，测量562nm处的吸光度。使用分光光度计(Ultrospec330pro、Amersham Biosciences公司制)，测量562nm处的吸光度。作为对照，通常使用牛血清白蛋白(BSA)。
哺乳动物培养细胞来源的提取液，优选含有提取物以蛋白质浓度计为10mg/mL～100mg/mL，同时含有20mM～300mM的醋酸钾、0.5mM～5mM的醋酸镁、0.5mM～5mM的DTT、0.01mM～5mM的PMSF、10mM～100mM的HEPES-KOH(pH6～8.5)，从而得到实现。另外，除了上述之外，进一步优选含有0.5mM～5mM的氯化钙盐和10(v/v)％～50(v/v)％的甘油。
在无细胞系蛋白质合成反应液中，例如使用如上所述调制的节肢动物来源或哺乳动物培养细胞提取液进行调制。上述反应液优选调制成含有上述提取液10(v/v)％～80(v/v)％、特别是30(v/v)％～60(v/v)％。即，在反应液整体中，上述节肢动物来源或哺乳动物培养细胞来源的提取物的含量，优选调制成以蛋白质浓度计为0.1mg/mL～160mg/mL，更优选为3mg/mL～60mg/mL。这是因为，该提取物的含量如果以蛋白质浓度计不到0.1mg/mL或者超过160mg/mL，蛋白质得合成速度有降低的趋势。
另外，如果该提取物的含量在上述范围内，可以单独使用上述节肢动物来源或哺乳动物细胞来源的提取液，也可以混合不同的提取液。另外，当混合不同的提取液时，可以为任意比例。
在使用含有上述节肢动物来源的提取物的提取液时的翻译系用反应液、转录/翻译系用反应液中，没有特别限制，可以含有以往公知的适当的成分。其中，从在短时间内可以合成大量的蛋白质的观点出发，在翻译系用反应液中，在是蚕组织来源的翻译系用反应液的情况下，优选含有特开2003-235598说明书记载的成分；在是培养细胞来源提取液的情况下，优选含有特开2004-215651说明书中记载的成分。另外，在是转录/翻译系用反应液的情况下，例如含有特开2003-245094说明书中记载的成分。
使用了含有上述哺乳动物培养细胞来源的提取物的提取液的无细胞系蛋白质合成反应液，作为除了上述记载的哺乳动物培养细胞提取液之外的成分，优选至少含有外来mRNA、钾盐、镁盐、DTT、三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、磷酸肌酸、肌酸激酶、氨基酸成分、缓冲剂。通过使用该反应液进行翻译反应，可以在短时间内合成大量的蛋白质。
用于上述反应液的外来mRNA，是指按照模板DNA(在本发明的表达载体中插入编码目的蛋白质的结构基因而成的模板DNA)转录的mRNA，对编码的蛋白质(包括肽)没有特别限制，可以编码具有毒性的蛋白质，也可以编码糖蛋白，也可以是编码融合蛋白的碱基序列，另外从容易纯化表达的蛋白质的观点出发，也可以添加编码以往公知的His标签或GST标签的碱基序列等。这些的标签序列通常被添加在目的蛋白质的N末端或C末端。
还有，用于反应液中的外来mRNA在其碱基数方面没有特别限制，只要可以合成目的蛋白质，即使mRNA的碱基数不全部相同也可以。另外，如果是在可以合成目的蛋白质的程度下的相同的序列，各mRNA也可以缺失、置换、插入或添加多个碱基。
在反应液中，从蛋白质合成的速度的观点出发，外来mRNA优选含有1μg/mL～1000μg/mL，更优选含有10μg/mL～500μg/mL。这是因为，外来mRNA如果不到1μg/mL或超过1000μg/mL，蛋白质合成的速度有降低的趋势。
作为该反应液中的钾盐，作为提取用液的成分，可以优选使用上述的各种钾盐，最好是醋酸钾。从与上述的提取用液中的钾盐的情况相同的观点出发，在该反应液中，钾盐优选含有10mM～500mM，更优选含有20mM～300mM。
作为该反应液中的镁盐，作为提取用液的成分，可以优选使用上述的各种镁盐，最好是醋酸镁。从与上述的提取液中的镁盐的情况相同的观点出发，在该反应液中，镁盐优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mM。
从与上述的提取用液中的DTT的情况相同的观点出发，该反应液中的DTT优选含有0.1mM～10mM，更优选含有0.5mM～5mM。
从蛋白质合成的速度的观点出发，该反应液中的三磷酸腺苷(下面有时称为“ATP”)在该反应液中优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.1mM～5mM。这是因为，ATP如果不到0.01mM或超过10mM，蛋白质合成的速度有降低的趋势。
从蛋白质合成的速度的观点出发，该反应液中的三磷酸鸟苷(下面有时称为“GTP”)在该反应液中优选含有0.01mM～10mM，更优选含有0.05mM～5mM。这是因为，GTP如果不到0.01mM或超过10mM，蛋白质合成的速度有降低的趋势。
该反应液中的磷酸肌酸是用于持续合成蛋白质的成分，配合目的是再生ATP和GTP。从蛋白质合成的速度的观点出发，磷酸肌酸在该反应液中优选含有1mM～200mM，更优选含有10mM～100mM。这是因为，磷酸肌酸如果不到1mM，则难以再生充分量的ATP和GTP，其结果是蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外，磷酸肌酸如果超过200mM，则成为抑制物质，蛋白质的合成速度有降低的趋势。
该反应液中的肌酸激酶是用于持续合成蛋白质的成分，配合目的是连同磷酸肌酸一起再生ATP和GTP。从蛋白质合成的速度的观点出发，肌酸激酶在该反应液中优选含有1μg/mL～1000μg/mL，更优选含有10μg/mL～500μg/mL。这是因为，肌酸激酶如果不到1μg/mL，则难以再生充分量的ATP和GTP，其结果是蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外，肌酸激酶如果超过1000μg/mL，则成为抑制物质，蛋白质的合成速度有降低的趋势。
该反应液中的氨基酸成分至少含有20种氨基酸，即缬氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、胱氨酸、精氨酸的20种氨基酸。该氨基酸中也含有放射性同元素标记的氨基酸。进而，根据需要，也可以含有修饰氨基酸。该氨基酸成分通常以大致等量含有各种氨基酸而成。
从蛋白质合成的速度的观点出发，该反应液中优选含有上述的氨基酸成分1μM～1000μM，更优选含有10μM～200μM。这是因为，氨基酸成分如果不到1μM或超过1000μM，蛋白质的合成速度有降低的趋势。
作为反应液中含有的缓冲剂，可以适合使用与上述的提取液相同的缓冲剂，从相同的理由出发，优选使用HEPES-KOH(pH6～8.5)。另外，从与上述的提取液中的缓冲剂的情况相同的观点出发，缓冲剂优选含有5mM～200mM，更优选含有10mM～100mM。
进而，优选在反应液中进一步添加RNase抑制剂。配合RNase抑制剂的目的在于，防止通过提取液中混在的哺乳动物培养细胞来源的RNase，在无细胞系蛋白质合成时使外来mRNA或tRNA被不希望地消化而妨碍蛋白质的合成，在该反应液中，RNase优选含有0.1U/μL～100U/μL，更优选含有0.5U/μL～10U/μL进而，优选在反应液中进一步添加tRNA。tRNA各大致等量地含有对应上述20种氨基酸的种类的tRNA而成。从蛋白质合成的速度的观点出发，在该反应液中，优选含有1μg/mL～1000μg/mL，更优选含有10μg/mL～500μg/mL。
进而，优选在反应液中进一步添加钙盐。作为钙盐，作为提取用液的成分可以优选使用上述的各种钙盐、最好是氯化钙。从与上述的提取用液中的钙盐的情况相同的观点出发，在该反应液中，钙盐优选含有0.05mM～10mM，更优选含有0.1mM～5mM。
即，作为使用了哺乳动物培养细胞来源的提取液的反应液，优选含有该提取液为30(v/v)％～60(v/v)％，同时含有20mM～300mM的醋酸钾、0.5mM～5mM的醋酸镁、0.5mM～5mM的DTT、0.1mM～5mM的ATP、0.05mM～5mM的GTP、10mM～100mM的磷酸肌酸、10μg/mL～500μg/mL的肌酸激酶、10μM～200μM的氨基酸成分、10μg/mL～500μg/mL的外来mRNA、10mM～100mM的HEPES-KOH(pH6～8.5)，从而得到实现。另外，除了上述之外，更优选进一步含有0.5U/μL～10U/μL的RNase抑制剂、10μg/mL～500μg/mL的tRNA、0.1mM～5mM的氯化钙而得到实现。
使用了含有上述节肢动物来源的提取液或哺乳动物培养细胞提取液的反应液的无细胞系蛋白质合成反应，在以往公知的例如低温恒温槽中进行。反应温度通常为10℃～40℃、优选为20℃～30℃的范围内。这是因为，如果反应温度不到10℃，蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外如果反应温度超过40℃，必需成分有变性的趋势。反应时间通常为1小时～72小时，优选为3小时～24小时。
另外，在是使用了含有哺乳动物培养细胞提取液的反应液的无细胞系蛋白质合成的情况下，在进行合成反应之前，在向提取液中加入mRNA以外的反应液组成的成分的状态下，优选进行一定时间地保温。保温在以往公知的例如低温恒温槽中进行。保温温度通常为0℃～50℃、优选为15℃～37℃的范围。这是因为，如果保温温度不到0℃，难以得到保温的效果，另外如果保温温度超过50℃，必需成分有变性的趋势。保温时间通常为1分钟～120分钟，优选为10分钟～60分钟。
另外，对于使用了上述转录/翻译系用反应液的无细胞系蛋白质合成反应(转录/翻译系合成反应)，也与上述翻译系合成反应的情况相同，可以在以往公知的例如低温恒温槽中进行。转录工序的反应温度通常为10℃～60℃、优选为20℃～50℃的范围内。这是因为，如果转录工序的反应温度不到10℃，转录速度有降低的趋势，另外如果转录工序的反应温度超过60℃，反应中必需的成分有变性的趋势。另外，翻译工序的温度通常为10℃～40℃、优选为20℃～30℃的范围内。这是因为，如果翻译工序的反应温度不到10℃，蛋白质的合成速度有降低的趋势，另外如果翻译工序的反应温度超过40℃，反应中必需的成分有变性的趋势。
从可以连续实施转录、翻译工序的观点出发，在转录/翻译系合成反应中，特别优选在两个序中在适合的20℃～30℃的范围下进行反应。反应的时间与整个工序相一致，通常为1小时～72小时，优选为3小时～24小时。
对可以使用上述翻译系用反应液、转录/翻译系用反应液进行合成的蛋白质没有特别限制。已合成的蛋白质的量可以通过酶的活性的测量、SDS-PAGE、免疫检测法等进行测量。
<无细胞系蛋白质合成试剂盒>
另外，本发明也提供包括上述的本发明的表达载体的无细胞系合成用试剂盒。在该无细胞系蛋白质合成用试剂盒中，含有无细胞系蛋白质合成反应液。对于该无细胞系蛋白质合成用试剂盒中的适合的表达载体、无细胞系蛋白质合成反应液的组成、浓度、其他适当的组成，如上所述。这种无细胞系蛋白质合成用试剂盒，可以是由收容了表达载体、无细胞系蛋白质合成反应液的适当的容器和其它适当的要素构成，不被特别限制。另外，从保存的观点出发，用于无细胞系蛋白质合成中的提取物也可以与无细胞系蛋白质合成用反应液分开收容。
实施例下面，利用实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不被这些实施例所限定。
将具有编码荧光素酶的结构基因pGEM-Luc载体(Promega公司制)5ng作为模板，使用具有序列表序列号12所示的碱基序列的引物(Luc T7-F3-Kpn)、具有序列表序列号13所示的碱基序列的引物(Luc T7-R4-Kpn)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，在96℃下用2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃120秒、30个循环的PCR，扩增结构基因的开放读码框(ORF)。通过乙醇沉淀纯化PCR产物之后，用Kpn I进行消化。另外，还用Kpn I消化pTNT载体(Promega公司制)。用琼脂糖凝胶电泳分离这些反应液之后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒(Gen Elute Gel Purification Kit)(Sigma公司制)纯化。使用Ligation High(东洋纺织公司制)，连接(ligation)它们之后，转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织公司制)。从转化后的大肠杆菌利用碱-SDS法调制的质粒，使用具有序列表序列号14所示的碱基序列的引物(T7启动子T7 Promoter)和大染料终止子循环测序法(Big Dye Terminator Cycle Sequencing)FS(Applied biosystems公司制)，对上述质粒进行测序反应(96℃10秒、50℃5秒、60℃4分钟、25个循环)。将该反应液提供到ABI PRISM 310遗传分析器(Genetic Analyzer)(Applied biosystems公司制)，进行碱基序列分析。将荧光素酶基因的起始密码子被插入到pTNT载体来源的5’-β球蛋白前导(globin leader)序列的下游的质粒命名为pTNT-Luc。
将在上述参考例1中作成的质粒载体pTNT-Luc作为模板，使用具有序列表序列号15所示的碱基序列的引物(T7p Rv)和具有序列表序列号16所示的碱基序列的引物(Luc-ATG)，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃5分钟、30个循环的PCR。反应结束后，用电泳分离PCR产物，然后使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒(Sigma公司制)纯化，将其用于连接反应。这样，为了确认5’UTR的插入效果，得到从质粒载体pTNT-Luc缺失掉SP6启动子序列、5’-β球蛋白前导序列以及编码荧光素酶的结构基因的5’上游侧多克隆位点的质粒载体。
用DNA合成机合成具有序列表序列号1所示的碱基序列的蚕的蚕丝蛋白L链基因的5’UTR的正义链、反义链，通过T4多核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase)(东洋纺织公司制)，进行其5’末端的磷酸化反应。反应结束后，混合正义链和反义链，95℃热处理5分钟。将其静置直至变成室温，退火正义链和反义链。通过乙醇沉淀纯化后，溶解于水中。利用SigmaSpin后反应纯化柱(SigmaSpin Post Reaction Purification Columns)(Sigma公司制)，去除过量的ATP之后，再次通过乙醇沉淀纯化。将得到的双链DNA片断作为插入片断，与上述缺失掉SP6启动子序列、β球蛋白前导序列以及结构基因的5’上游侧多克隆位点的pTNT-Luc来源的载体连接，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，进行碱基序列分析。这样，选择顺向(5’→3’)结合了1个蚕的蚕丝蛋白L链基因的5’UTR的载体。这样，制作在T7启动子序列与结构基因之间顺向结合了1个蚕的蚕丝蛋白L链基因的5’UTR的载体(模板DNA)。将得到的模板DNA命名为pFib-Luc。
除了使用具有序列表序列号2所示的碱基序列的蚕的蚕丝蛋白基因的5’UTR以外，与参考例2同样，制作在T7启动子序列与结构基因之间顺向(5’→3’)结合了1个具有序列表序列号2所示的碱基序列的蚕的蚕丝蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)。将得到的模板DNA命名为pSer-Luc。
除了使用具有序列表序列号3所示的碱基序列的AcNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)多角体蛋白基因的5’UTR以外，与参考例2同样，制作在T7启动子序列与结构基因之间顺向(5’→3’)结合了1个具有序列表序列号3所示的碱基序列的AcNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)。将得到的模板DNA命名为pAphd-Luc。
将由参考例2中蚕的蚕丝蛋白L链基因的5’UTR调制的双链DNA片断、和由参考例4中AcNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR调制的双链DNA片断一起作为插入片断使用，与缺失掉上述SP6启动子序列、β球蛋白前导序列以及结构基因的5’上游侧多克隆位点的pTNT-Luc来源的载体连接，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，进行碱基序列分析。这样，除了选择从5’侧按顺序分别顺向(5’→3’)结合了蚕的蚕丝蛋白L链基因的5’UTR和AcNPV的多角体蛋白基因的5’UTR各1个的载体(模板DNA)以外，与参考例2一样进行。将得到的模板DNA命名为pFAphd-Luc。
除了使用具有序列表序列号4所示的碱基序列的BmCPV(家蚕胞质型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR以外，与参考例2同样，制作在T7启动子序列与荧光素酶基因之间顺向(5’→3’)结合了1个具有序列表序列号4所示的碱基序列的BmCPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)。将得到的模板DNA命名为pBphd-Luc。
除了选择逆向(3’→5’)结合了1个BmCPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例6一样进行。将得到的模板DNA命名为pBphd-R-Luc。
除了使用具有序列表序列号5所示的碱基序列的EsCPV(Euxoascandes胞质型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR以外，与参考例2一样将制作的双链DNA片断作为插入片断，与缺失掉上述SP6启动子序列、β球蛋白前导序列以及结构基因的5’上游侧多克隆位点的pTNT-Luc来源的载体连接，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，进行碱基序列分析。这样，除了选择从5’侧按顺序分别顺向(5’→3’)结合了2个EsCPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例2一样进行。将得到的模板DNA命名为pEphd-FF-Luc。
除了选择从5’侧按顺序分别逆向(3’→5’)结合了2个EsCPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例8一样进行。将得到的模板DNA命名为pEphd-RR-Luc。
除了使用具有序列表序列号6所示的碱基序列的HcNPV(Hyphantriscunea核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR以外，与参考例2一样将制作的两条链DNA片断作为插入片断，与缺失掉上述SP6启动子序列、β球蛋白前导序列以及结构基因的5’上游侧多克隆位点的pTNT-Luc来源的载体连接，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，进行碱基序列分析。这样，除了选择顺向(5’→3’)结合1个HcNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例2一样进行。将得到的模板DNA命名为pHphd-Luc。
除了选择逆向(3’→5’)结合1个HcNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例10一样进行。将得到的模板DNA命名为pHphd-R-Luc。
除了选择从5’侧按顺序分别逆向(3’→5’)结合了2个HcNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例10一样进行。将得到的模板DNA命名为pHphd-RR-Luc。
除了使用具有序列表序列号7所示的碱基序列的CrNPV(Choristoneura rosaceana核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR以外，与参考例2同样，将制作的双链DNA片断作为插入片断，与缺失掉上述SP6启动子序列、β球蛋白前导序列以及结构基因的5’上游侧多克隆位点的pTNT-Luc来源的载体连接，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，进行碱基序列分析。这样，除了选择顺向(5’→3’)结合了1个CrNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例2一样进行。将得到的模板DNA命名为pCphd-Luc。
除了选择逆向(3’→5’)结合了1个CrNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例13一样进行。将得到的模板DNA命名为pCphd-R-Luc。
除了使用具有序列表序列号8所示的碱基序列的EoNPV(Ecotropisoblique核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR以外，与参考例2同样，将制作的双链DNA片断作为插入片断，与缺失掉上述SP6启动子序列、β球蛋白前导序列以及结构基因的5’上游侧多克隆位点的pTNT-Luc来源的载体连接，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，进行碱基序列分析。这样，除了选择逆向(3’→5’)结合了1个EoNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例2一样进行。将得到的模板DNA命名为pEophd-R-Luc。
除了使用具有序列表序列号9所示的碱基序列的MnNPV(Malacosmaneustria核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR以外，与参考例2同样，将制作的双链DNA片断作为插入片断，与缺失掉上述SP6启动子序列、β球蛋白前导序列以及结构基因的5’上游侧多克隆位点的pTNT-Luc来源的载体连接，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，进行碱基序列分析。这样，除了选择顺向(5’→3’)结合了1个MnNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例2一样进行。将得到的模板DNA命名为pMphd-FF-Luc。
除了选择逆向(3’→5’)结合了1个MnNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例16一样进行。将得到的模板DNA命名为pMphd-R-Luc。
除了使用具有序列表序列号10所示的碱基序列的SfNPV(草地夜蛾核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR以外，与参考例2同样，将制作的双链DNA片断作为插入片断，与缺失掉上述SP6启动子序列、β球蛋白前导序列以及结构基因的5’上游侧多克隆位点的pTNT-Luc来源的载体连接，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，进行碱基序列分析。这样，除了选择顺向(5’→3’)结合了1个SfNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例2一样进行。将得到的模板DNA命名为pSphd-Luc。
除了使用具有序列表序列号11所示的碱基序列的WsNPV(Wiseanasignata核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的5’UTR以外，与参考例2同样，将制作的双链DNA片断作为插入片断，与缺失掉上述SP6启动子序列、β球蛋白前导序列以及结构基因的5’上游侧多克隆位点的pTNT-Luc来源的载体连接，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，进行碱基序列分析。这样，除了选择顺向(5’→3’)结合了1个WsNPV的多角体蛋白基因的5’UTR的载体(模板DNA)以外，与参考例2一样进行。将得到的模板DNA命名为pWphd-Luc。
(1)昆虫培养细胞的培养在将细胞数2.1×107个的昆虫培养细胞High Five(Invitrogen公司制)加入到已添加L-谷氨酰胺的Express Five无血清培养基(Invitrogen公司制)的培养瓶(600cm2)内，27℃培养6天。结果细胞数为1.0×108个、湿重1.21g。
(2)昆虫培养细胞提取液的调制首先，收集在上述(1)中培养的昆虫培养细胞，用下述组成的清洗液清洗3次(在700×g、4℃、10分钟的条件下离心分离)。
·60mM HEPES-KOH(pH7.9)·200mM 醋酸钾
·4mM醋酸镁·4mMDTT向清洗后的昆虫培养细胞中加1mL下述组成的提取用液，悬浮。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸钾·2mM 醋酸镁·2mM 氯化钙·20(v/v)％ 甘油·1mM DTT·1mM PMSF在液氮中快速冻结该悬浮液。充分冻结后，在约4℃的冰水浴中解冻。完全解冻后，在30000×g、4℃下离心分离10分钟(himacCR20B3、日立工机公司制)，回收上清。在已用下述组成的凝胶过滤用缓冲液平衡化之后的PD-10脱盐柱(Amersham Biosciences公司制)中，加(apply)已回收的上清1.5mL。
加入(application)之后，用凝胶过滤用缓冲液4mL洗脱，使用分光光度计(Ultrospec3300pro、Amersham Biosciences公司制)，回收在280nm处的吸光度30以上的组分，作为昆虫培养细胞提取液。
[(1)昆虫培养细胞的培养]将昆虫细胞Sf21(Invitrogen公司制)加入到Sf900-II无血清培养基(Invitrogen公司制)中27℃培养。将每1mL培养基的细胞数为6.0×105个的Sf21加入到125mL三角烧瓶内的培养基50mL中，27℃、130rpm、悬浮培养5天。结果每1mL培养基的细胞数变为1.0×108个、湿重3g。使用该细胞，调制细胞提取液。
首先，收集在上述(1)中培养的昆虫培养细胞，用下述组成的清洗液清洗3次(在700×g、4℃、10分钟的条件下离心分离)。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸钾·2mM醋酸镁·2mM氯化钙·1mMDTT向清洗后的昆虫培养细胞中加3mL下述组成的提取用液，悬浮。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸钾·2mM 醋酸镁·2mM 氯化钙·20(v/v)％ 甘油·1mM DTT·1mM PMSF在液氮中快速冻结该悬浮液。充分冻结后，在约4℃的冰水浴中解冻。完全解冻后，在30000×g、4℃下离心分离10分钟(himacCR20B3、日立工机公司制)，回收上清。将回收后的上清进一步在45000×g、4℃下离心分离30分钟，回收上清。在已用下述组成的凝胶过滤用缓冲液平衡化之后的PD-10脱盐柱(Amersham Biosciences公司制)中，加已回收的上清1.5mL。
·40mMHEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸钾·2mM 醋酸镁·1mM DTT·0.5mM PMSF加入之后，用凝胶过滤用缓冲液3mL洗脱，使用分光光度计(Ultrospec3300pro、Amersham Biosciences公司制)，回收在280nm处的吸光度30以上的组分，作为昆虫培养细胞提取液。
使用剪刀、小镊子、手术刀、压舌板，从15只5龄期4天的蚕幼虫摘取后部丝腺3.07g，用-80℃下冻结的研钵将其研碎，使用下述组成的提取用液，进行提取。
·20mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM醋酸钾·2mM 醋酸镁·2mM DTT·0.5mMPMSF提取后，用离心分离机(himacCR20B3(日立工机公司制))离心得到的液状体，在30000×g、30分钟、4℃的条件下进行离心分离。
离心分离后，仅离析上清，再次在30000×g、10分钟、4℃的条件下进行离心分离。离心分离后，仅离析上清。在脱盐柱PD-10(AmershamBiosciences公司制)中加含有20％甘油的提取用液，对柱进行平衡化之后，供给上清，通过用上述提取用液洗脱，进行凝胶过滤。
使用分光光度计(Ultrospec3300pro、Amersham Biosciences公司制)，对凝胶过滤后的滤液的组分进行测量，分取在280nm下的吸光度10以上的组分，得到5龄期的蚕幼虫的后部丝腺来源的无细胞系蛋白质合成用提取液。
[(1)哺乳动物培养细胞的培养]在130rpm、37℃、5％CO2环境下，在已加入CHO无血清培养基(SERUM-FREE MEDIUM)(SIGMA公司制)200mL的三角烧瓶(500mL)内，培养细胞浓度4.9×105细胞/mL的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1-SFM(东北大学加龄医学研究所复苏医用细胞资源中心分让)120小时。结果细胞浓度变为8.8×106细胞/mL、湿重3.2g。
首先，通过离心分离(700×g，10分钟)收集在上述(1)中培养的动物培养细胞，用下述组成的清洗用缓冲液清洗3次(在700×g、10分钟的条件下离心分离)。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM醋酸钾·2mM 醋酸镁·2mM 氯化钙·1mM DTT向清洗后的哺乳动物培养细胞中，每1g细胞湿重添加0.8mL下述组成的提取用液，悬浮细胞。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸钾·2mM 醋酸镁·2mM 氯化钙·20(v/v)％ 甘油·1mM DTT在液氮中快速冻结该悬浮液。充分冻结后，在约4℃的冰水浴中解冻。完全解冻后，在30000×g、4℃下进行10分钟离心分离(himacCR20B3、日立工机公司制)，回收上清。将回收后的上清在30000×g、4℃下进一步离心分离30分钟，回收上清。在已用下述组成的凝胶过滤用缓冲液平衡化之后的PD-10脱盐柱(Amersham Biosciences公司制)中，加已回收的上清1.5mL。
·40mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM醋酸钾·2mM 醋酸镁·1mM DTT加入之后，用凝胶过滤用缓冲液3mL洗脱，使用分光光度计(Ultrospec3300pro、Amersham Biosciences公司制)，回收在280nm下的吸光度30以上的组分，作为哺乳动物培养细胞提取液。
用BamH I或Bgl II消化在上述参考例1-19中制作的各载体(模板DNA)之后，通过苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀进行纯化。将得到的载体1μg作为模板，使用RiboMax大规模RNA生产系统-T7(Promega公司制)，以20μl的体系(scale)进行37℃4小时的体外转录反应，合成mRNA。
转录反应结束后，添加1U的RQ1 RNase Free DNase(Promega公司制)，37℃孵育15分钟，消化模板。通过苯酚-氯仿抽提除去蛋白质之后，进行乙醇沉淀。将得到的沉淀溶解于100μl的无菌水，加入到Nick column(Amersham Biosciences公司制)中之后，用无菌水洗脱。在洗脱组分中添加醋酸钾并使终浓度为0.3M，进行乙醇沉淀。已合成的mRNA的定量通过测量260nm与280nm的吸光度来进行。
使用在参考例20中调制的昆虫细胞提取液，分别对于利用上述实验例1中记载的方法而从上述参考例2～7、9、11～19中制作的模板DNA制作的各mRNA，调制下述组成的翻译系用反应液，进行翻译反应。
·50(v/v)％ 昆虫培养细胞提取液·320μg/mL mRNA·30mM HEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸钾·2mM 醋酸镁·2mM DTT·0.5mM ATP·0.25mMGTP·20mM 磷酸肌酸
·200μg/mL 肌酸激酶·40μM 氨基酸(20种)·0.25mM EGTA·1U/μL RNase抑制剂(来源于人胎盘)·200μg/mL tRNA分别使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20种)(Sigma公司制)、RNase抑制剂(宝酒造公司制)、tRNA(RocheDiagnostics公司制)。
作为反应装置，使用低温铝封闭(aluminum block)恒温槽MG-1000(东京理化器械公司制)。翻译反应在反应温度25℃下进行5小时，反应液量为25μL。
已合成的荧光素酶使用荧光素酶检测试剂盒(E-1500、Promega公司制)进行定量。在荧光素检测试剂50μL中添加2.5μL反应液，使用照度计(Tuner Designs TD-20/20、Promega公司制)，测量荧光素酶的发光。
图1是表示实验例2的结果的图表，将荧光素酶对照RNA(Promega公司制)为100％时的相对合成量作为纵轴表示。
使用在参考例21中调制的昆虫细胞提取液，分别对于利用上述实验例1中记载的方法而从在上述参考例2～4、6～16、18、19中制作的模板DNA制作的各mRNA，调制下述组成的翻译系用反应液，进行翻译反应。
·50(v/v)％ 昆虫培养细胞提取液·320μg/mL mRNA·40mMHEPES-KOH(pH7.9)·100mM 醋酸钾·1.5mM 醋酸镁·2mM DTT
·0.25mM ATP·0.1mMGTP·20mM 磷酸肌酸·200μg/mL肌酸激酶·80μM氨基酸(20种)·0.1mMEGTA·1U/μL RNase抑制剂(来源于人胎盘)·200μg/mLtRNA分别使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20种)(Sigma公司制)、RNase抑制剂(宝酒造公司制)、tRNA(RocheDiagnostics公司制)。
作为反应装置，使用低温铝封闭恒温槽MG-1000(东京理化器械公司制)。翻译反应在反应温度25℃下进行5小时，反应液量为25μL 。
已合成的荧光素酶使用荧光素酶检测试剂盒(E-1500、Promega公司制)进行定量。在荧光素检测试剂50μL中添加2.5μL反应液，使用照度计(Tuner Designs TD-20/20、Promega公司制)，测量荧光素酶的发光。
图2是表示实验例3的结果的图表，将荧光素酶对照RNA(Promega公司制)为100％时的相对合成量作为纵轴表示。
使用在参考例22中调制的蚕提取液，分别对于利用上述实验例1中记载的方法而从在上述参考例2～19中制作的模板DNA制作的各mRNA，调制下述组成的翻译系用反应液，进行翻译反应。
·50(v/v)％蚕提取液·160μg/mLmRNA·30mM HEPES-KOH(pH7.4)·100mM醋酸钾
·1.0mM醋酸镁·0.5mMDTT·10(v/v)％甘油·0.5mMATP·0.5mMGTP·0.25mM EGTA·25mM 磷酸肌酸·200μg/mL肌酸激酶·40μM氨基酸(20种)·2U/μL RNase抑制剂·200μg/mLtRNA分别使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20种)(Sigma公司制)、RNase抑制剂(宝酒造公司制)、tRNA(RocheDiagnostics公司制)。作为外来mRNA，使用编码荧光素酶的mRNA(荧光素酶对照RNA，Promega公司制)。
作为反应装置，使用低温铝封闭恒温槽MG-1000(东京理化器械公司制)。翻译反应在反应温度25℃下进行5小时，反应液量为25μL。已合成的荧光素酶使用荧光素酶检测试剂盒(E-1500、Promega公司制)进行定量。在荧光素检测试剂50μL中添加2.5μL反应液，使用照度计(TunerDesigns TD-20/20、Promega公司制)，测量荧光素酶的发光。
图3是表示实验例4的结果的图表，将荧光素酶对照RNA(Promega公司制)为100％时的相对合成量作为纵轴表示。
使用在参考例23中调制的哺乳动物培养细胞提取液，分别对于利用上述实验例1中记载的方法而从在上述参考例1、5、6、8、11、12、14、15、16、18、19中制作的模板DNA制作的各mRNA，调制下述组成的翻译系用反应液，进行翻译反应。
·50(v/v)％哺乳动物培养提取液·160μg/mLmRNA·50mM HEPES-KOH(pH7.9)·175mM醋酸钾·1mM 醋酸镁·0.5mM氯化钙·2mM DTT·0.5mMATP·0.25mM GTP·30mM 磷酸肌酸·200μg/mL肌酸激酶·80μM氨基酸(20种)·0.25mM EGTA分别使用ATP(Sigma公司制)、GTP(Sigma公司制)、氨基酸(20种)(Sigma公司制)。
作为反应装置，使用低温铝封闭恒温槽MG-1000(东京理化器械公司制)。在开始翻译反应时，首先制作上述翻译反应液中不含mRNA的翻译反应液，25℃下进行30分钟孵育。然后，添加mRNA，开始翻译反应(25℃下4小时)。反应液量为25μL。
已合成的荧光素酶使用荧光素酶检测试剂盒(E-1500、Promega公司制)进行定量。在荧光素检测试剂50μL中添加2.5μL反应液，使用照度计(Tuner Designs TD-20/20、Promega公司制)，测量荧光素酶的发光。
图4是表示实验例5的结果的图表，将从在上述参考例1中制作的载体pTNT-Luc转录的mRNA为100％时的相对合成量作为纵轴表示。另外，由于在上述参考例1制作的载体pTNT-Luc具有在哺乳类来源的提取液中适合促进翻译反应的DNA片断(5’β-球蛋白前导列)，所以在此，将相对于参考例1显示80％以上的合成量的上述DNA片断，作为促进翻译反应的DNA片断。
用DNA合成机合成具有序列表序列号17表示的碱基序列的引物(T7pMn-Eco)以及其反义链，通过T4多核苷酸激酶，进行其5’末端的磷酸化。反应结束后，混合正义链和反义链，95℃热处理5分钟。将其静置直至变成室温，退火正义链和反义链。通过乙醇沉淀进行纯化后，溶解于水中。利用SigmaSpin后反应纯化柱，去除过量的ATP之后，再次通过乙醇沉淀进行纯化。用EcoRI(东洋纺织公司制)消化得到的双链DNA片断，将其作为插入片断，另外用EheI(东洋纺织公司制)和EcoRI消化pUC19，电泳分离后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约2.5kb的DNA片断。连接pUC19来源的载体和插入片断，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用序列表序列号18所示的M13Reverse引物，进行碱基序列分析。将得到的质粒DNA命名为pUM。
将BD BaculoGold Linearized Baculovirus DNA(BD Biosciences公司制)0.5μg作为模板，使用具有序列表序列号19所示的碱基序列的引物(Phd3 Fw)、具有序列表序列号20所示的碱基序列的引物(Phd3 Rv-Hind)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃下用2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃30秒、30个循环的PCR，扩增AcNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的3’UTR。通过T4多核苷酸激酶进行DNA片断的5’末端的磷酸化。通过乙醇沉淀纯化反应液之后，用HindIII(东洋纺织公司制)消化，将其作为插入片断。另外，还用HincII(东洋纺织公司制)和HindIII消化pUM。用电泳分离之后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约2.7kb的DNA片断。连接pUM来源的载体和插入片断，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用序列表序列号18所示的M13反向引物(Reverse primer)，进行碱基序列分析。将得到的质粒DNA命名为pTM。
用DNA合成机合成具有序列表序列号21表示的碱基序列的引物(A25T7t)的正义链、反义链，通过T4多核苷酸激酶，进行其5’末端的磷酸化。反应结束后，混合正义链和反义链，95℃热处理5分钟。将其静置直至变成室温，退火正义链和反义链。通过乙醇沉淀进行纯化后，溶解于水中。利用SigmaSpin后反应纯化柱，去除过量的ATP之后，再次通过乙醇沉淀进行纯化，将其作为插入片断。另外，将pTM 5ng作为模板，使用具有序列表序列号22所示的碱基序列的引物(Not Fw)、具有序列表序列号23所示的碱基序列的引物(Phd3 Rv)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃3分钟、30个循环的PCR。将PCR产物电泳分离后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约3.0kb的DNA片断。连接已纯化的PCR产物和插入片断，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用序列表序列号18所示的M13反向引物，进行碱基序列分析。将polyA尾部顺向插入到AcNPV多角体蛋白3’UTR序列的下游的质粒DNA命名为pTMA。
将pTMA 5ng作为模板，使用具有序列表序列号22所示的碱基序列的引物(Not Fw)、具有序列表序列号24所示的碱基序列的引物(Not Rv)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃3分钟、30个循环的PCR。通过T4多核苷酸激酶进行PCR产物的5’末端的磷酸化。用电泳分离反应液之后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约3.0kb的DNA片断。连接已纯化的PCR产物，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用序列表序列号18所示的M13反向引物，进行碱基序列分析。将得到的质粒DNA命名为pTD1载体。所制作的pTD1载体具有序列表序列号29所示的碱基序列。图7表示已作成的pTD1载体的图。图中，T7是T7启动子，增强子(Enhancer)是MnNPV来源的多角体蛋白基因5’UTR(顺向)，MCS是多克隆位点，3’UTR是AcNPV来源的多角体蛋白基因3’UTR，polyA是聚A尾部，terminator是T7终止子序列。
用DNA合成机合成具有序列表序列号25表示的碱基序列的引物(T7pEo-Eco)以及其反义链，通过T4多核苷酸激酶，进行其5’末端的磷酸化。反应结束后，混合正义链和反义链，95℃热处理5分钟。将其静置直至变成室温，退火正义链和反义链。通过乙醇沉淀进行纯化后，溶解于水中。利用SigmaSpin后反应纯化柱，去除过量的ATP之后，再次通过乙醇沉淀进行纯化。用EcoRI(东洋纺织公司制)消化得到的双链DNA片断，将其作为插入片断，另外用Ehe I(东洋纺织公司制)和EcoRI消化pUC19，电泳分离后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约2.5kb的DNA片断。连接pUC19来源的载体和插入片断，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用序列表序列号18所示的M13反向引物，进行碱基序列分析。将得到的模板DNA命名为pUE。
将BD BaculoGold Linearized Baculovirus DNA(BD Biosciences公司制)0.5μg作为模板，使用具有序列表序列号19所示的碱基序列的引物(Phd3 Fw)、具有序列表序列号20所示的碱基序列的引物(Phd3 Rv-Hind)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃30秒、30个循环的PCR，扩增AcNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)的多角体蛋白基因的3’UTR。通过T4多核苷酸激酶进行DNA片断的5’末端的磷酸化。通过乙醇沉淀纯化反应液之后，用HindIII(东洋纺织公司制)消化，将其作为插入片断。另外，还用HincII(东洋纺织公司制)和HindIII消化pUE。用电泳分离之后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约2.7kb的DNA片断。连接pUE来源的载体和插入片断，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用序列表序列号18所示的M13反向引物，进行碱基序列分析。将得到的质粒DNA命名为pTE。
用DNA合成机合成具有序列表序列号21表示的碱基序列的引物(A25T7t)的正义链、反义链，通过T4多核苷酸激酶，进行其5’末端的磷酸化。反应结束后，混合正义链和反义链，95℃热处理5分钟。将其静置直至变成室温，退火正义链和反义链。通过乙醇沉淀进行纯化后，溶解于水中。利用SigmaSpin后反应纯化柱，去除过量的ATP之后，再次通过乙醇沉淀进行纯化，将其作为插入片断。另外，将pTE 5ng作为模板，使用具有序列表序列号22所示的碱基序列的引物(Not Fw)、具有序列表序列号23所示的碱基序列的引物(Phd3 Rv)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃3分钟、30个循环的PCR。将PCR产物电泳分离后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约3.0kb的DNA片断。连接已纯化的PCR产物和插入片断，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用序列表序列号18所示的M13反向引物，进行碱基序列分析。将polyA尾部顺向插入到AcNPV多角体蛋白3’UTR序列的下游的质粒DNA命名为pTEA。
将pTEA 5ng作为模板，使用具有序列表序列号22所示的碱基序列的引物(Not Fw)、具有序列表序列号24所示的碱基序列的引物(Not Rv)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃3分钟、30个循环的PCR。通过T4多核苷酸激酶进行PCR产物的5’末端的磷酸化。用电泳分离反应液之后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约3.0kb的DNA片断。连接已纯化的PCR产物，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用序列表序列号18所示的M13反向引物，进行碱基序列分析。将得到的质粒DNA命名为pTD2载体。
已制作的pTD2载体具有序列表序列号30所示的碱基序列。图8表示作成的pTD1载体的图。图中，T7是T7启动子，Enhancer(增强子)是EoNPV来源的多角体蛋白基因5’UTR(逆向)，MCS是多克隆位点，3’UTR是AcNPV来源的多角体蛋白基因3’UTR，polyA是聚A尾部，terminator是T7终止子序列。
[(1)模板DNA(载体pTD1-Luc)的制作]将具有编码荧光素酶的结构基因的pGEM-Luc载体(Promega公司制)5ng作为模板，使用具有序列表序列号16所示的碱基序列的引物(Luc-ATG)、具有序列表序列号13所示的碱基序列的引物(Luc T7-R4-Kpn)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃120秒、30个循环的PCR，扩增开放读码框(ORF)。通过T4多核苷酸激酶进行PCR产物的5’末端的磷酸化之后，通过乙醇沉淀纯化PCR产物。用KpnI消化该DNA片断之后，将其提供到电泳，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约1.6kb的DNA片断，将其作为插入片断。另外，将pTD1载体5ng作为模板，使用具有序列表序列号26所示的碱基序列的引物(Eco-Kpn)、具有序列表序列号27所示的碱基序列的引物(Mn29 Rv)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃3分钟、30个循环的PCR。通过乙醇沉淀纯化PCR产物，然后用KpnI消化。电泳分离后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约3.0kb的DNA片断。连接pTD1载体来源的DNA片断和插入片断，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用具有序列表序列号14所示的碱基序列的引物(T7启动子)和序列表序列号18所示的M13反向引物，进行碱基序列分析。将得到的质粒DNA命名为pTD1-Luc。
体外转录反应和mRNA的纯化，与上述实验例1记载的方法一样进行。
翻译反应使用在上述参考例21中制作的昆虫培养细胞(Sf21)提取液，按照上述实验例3记载的方法进行翻译反应。已合成的荧光素酶按照上述实验例3记载的方法进行定量。
图5是表示实施例1的结果的图表，横轴是合成时间(时间)、纵轴是荧光素酶合成量(μg/mL)。另外，作为比较例表示使用从在参考例16中制作的pMphd-FF-Luc转录的mRNA的合成结果。如图5所示可知，作为在参考例24中制作的促进翻译反应的DNA片断，使用显示序列表序列号9所示的碱基序列的DNA片断制作的蛋白质表达载体，显示出与使用在参考例16中制作的pMphd-FF-Luc作为模板DNA的情况相同程度的合成量。
[(1)模板DNA(载体pTD2-Luc)的制作]将具有编码荧光素酶的结构基因的pGEM-Luc载体(Promega公司制)5ng作为模板，使用具有序列表序列号16所示的碱基序列的引物(Luc-ATG)、具有序列表序列号13所示的碱基序列的引物(Luc T7-R4-Kpn)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃120秒、30个循环的PCR，扩增开放读码框(ORF)。通过T4多核苷酸激酶进行PCR产物的5’末端的磷酸化之后，通过乙醇沉淀纯化PCR产物。用Kpn I消化该DNA片断之后，将其提供到电泳，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约1.6kb的DNA片断，将其作为插入片断。另外，将pTD2载体5ng作为模板，使用具有序列表序列号26所示的碱基序列的引物(Eco-Kpn)、具有序列表序列号28所示的碱基序列的引物(Eo21 Fw)、和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃3分钟、30个循环的PCR。通过乙醇沉淀纯化PCR产物。用KpnI消化。电泳分离后，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约3.0kb的DNA片断。连接pTD2载体来源的DNA片断和插入片断，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用具有序列表序列号14所示的碱基序列的引物(T7启动子)和序列表序列号18所示的M13反向引物，进行碱基序列分析。将得到的质粒DNA命名为pTD2-Luc。
体外转录反应和mRNA的纯化，与上述实验例1记载的方法一样进行。
翻译反应使用在上述参考例20中制作的昆虫培养细胞(HighFive)提取液，按照上述实验例2记载的方法进行翻译反应。已合成的荧光素酶按照上述实验例2记载的方法进行定量。
图6是表示实施例2的结果的图表，横轴是合成时间(时间)、纵轴是荧光素酶合成量(μg/mL)。另外，作为比较例表示使用了从在参考例15中制作的pEophd-R-Luc转录的mRNA的合成结果。如图6所示可知，作为在参考例25中制作的促进翻译反应的DNA片断，使用显示序列表序列号8所示的碱基序列的DNA片断制作的蛋白质表达载体，显示出与使用在参考例15中制作的pEophd-R-Luc作为模板DNA的情况同等程度的合成量。
将具有编码荧光素酶的结构基因的pGEM-Luc载体(Promega公司制)5ng作为模板，使用具有序列表序列号16所示的碱基序列的引物(Luc-ATG)、具有序列表序列号13所示的碱基序列的引物(Luc T7-R4-Kpn)和KOD plus(东洋纺织公司制)，96℃2分钟使模板变性之后，进行96℃15秒、50℃30秒、68℃120秒、30个循环的PCR，扩增开放读码框(ORF)。通过T4多核苷酸激酶进行PCR产物的5’末端的磷酸化之后，通过乙醇沉淀纯化PCR产物。用Kpn I消化该DNA片断之后，将其提供到电泳，使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒，纯化约1.6kb的DNA片断，将其作为插入片断。另外，用EcoRV和KpnI消化pEU3-N2载体(具有烟草花叶病毒来源的Ω序列作为翻译促进序列的小麦胚芽提取液用的表达载体，东洋纺织公司制)，将上述制作的插入片断与其连接之后，转化大肠杆菌DH5α。从得到的大肠杆菌调制质粒之后，使用具有序列表序列号14所示的碱基序列的引物(T7启动子)和M13反向引物，进行碱基序列分析。将得到的质粒DNA命名为pEU3-N2-Luc。预想在使用了小麦胚芽提取液的无细胞系蛋白质合成中，会适合地表达本蛋白质表达用的质粒。
[(1)模板DNA]作为模板DNA，使用在实施例1中制作的pTD1-Luc。
体外转录反应和mRNA的纯化，与上述实验例1记载的方法一样进行。
翻译反应将在上述(2)中制作的mRNA作为模板，进行使用了小麦胚芽提取液的无细胞系蛋白质合成。作为小麦胚芽提取液，使用PROTEIOSTM ver.2(东洋纺织公司制)。将mRNA添加到终浓度为240μg/mL，按照操作说明书，以50μL的反应体系(批量反应)，进行蛋白质合成反应。已合成的荧光素酶按照上述实验例2记载的方法进行定量。
图9是结果，纵轴表示荧光素酶的相对合成量(％)。作为参考，显示使用在参考例26中制作的pEU3-N2-Luc作为模板DNA、进行使用小麦胚芽提取液的无细胞系蛋白质合成的结果(参考例26)。如图9所示可知，在实施例1中制作的pTD1-Luc与pEU3-N2-Luc比较，显示出约170％的合成量，pTD1载体即使在使用了小麦胚芽提取液的无细胞系蛋白质合成中，也可以适合用作能够促进翻译反应的表达载体。
[(1)模板DNA]作为模板DNA，使用在实施例1中制作的pTD1-Luc。
体外转录反应和mRNA的纯化，与上述实验例1记载的方法一样进行。
翻译反应将在上述(2)中制作的mRNA作为模板，进行使用了兔网织红细胞提取液的无细胞系蛋白质合成。作为兔网织红细胞提取液，使用已处理过的兔网织红细胞溶解产物(Rabbit Reticulocyte Lysate，NucleaseTreated)(Promega公司制)。将mRNA添加到终浓度为40μg/mL，按照操作说明书，以50μL的反应体系进行蛋白质合成反应。已合成的荧光素酶按照上述实验例2记载的方法进行定量。
图10表示结果，纵轴表示荧光素酶的相对合成量(％)。作为参考，显示使用在参考例1中制作的pTNT-Luc作为模板DNA、进行使用兔网织红细胞提取液的无细胞系蛋白质合成的结果(参考例1)。如图10所示可知，在使用了兔网织红细胞提取液的无细胞系蛋白质合成中，pTD1-Luc显示出与pTNT-Luc同等程度的合成量，pTD1载体即使在使用了兔网织红细胞提取液的无细胞系蛋白质合成中，也可以适合用作能够促进翻译反应的表达载体。
在参考例24和25中，作为具有翻译反应活性的DNA片断，分别使用具有序列表序列号9和8所示的碱基序列的DNA片断，制作蛋白质表达载体，但即使使用具有其它序列号所示的碱基序列的DNA片断，也可以容易地制作蛋白质表达载体。
进而，通过使用这些表达载体，在无细胞系合成中，提高蛋白质的合成量可以从实验例2～5以及实施例1～4可知。
本发明不被上述实施例所限定，可以以其它很多方式实施。所以，上述实施例在所有的方面都不过是例示而已，不是限定性解释。进而，属于技术方案的均等范围的变更全部在本发明的范围内。
序列表<110>株式会社岛津制作所<120>促翻译反应DNA片断和使用该片断的无细胞系蛋白合成法<130>G17-09<150>JP 2004-354553<151>2004-12-07<160>30<210>1<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(家蚕蚕丝蛋白L-链基因)<400>1ctgtatagta tataccgatt ggtcacataa cagaccacta aa 42<210>2
<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(家蚕丝胶蛋白基因)<400>2atagtcgtct tatcatcggg tctctaagga tcaagcgatc caaagaccgc caac 54<210>3<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(AcNPV多角体蛋白基因)<400>3agtattttac tgttttcgta acagttttgt aataaaaaaa cctataaat 49<210>4<211>41<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>5’UTR(BmCPV多角体蛋白基因)<400>4agtaaaagtc agtatcttaccggcataata cgtaaaggat c 41<210>5<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(EsCPV多角体蛋白基因)<400>5agtttaaaat cctcagcgga attaaaacac caag 34<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(HcNPV多角体蛋白基因)
<400>6gctgttattg tagcaatttt gtaataaaaa tatcctataa ct 42<210>7<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(CrNPV多角体蛋白基因)<400>7agtaatttgc tggttttgta gcaattttgt aatataattt cgtataact 49<210>8<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(EoNPV多角体蛋白基因)<400>8agtattgtag tcctttcgta attgtttgtg aaatctaaaa tacaccgta 49
<210>9<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(MnNPV多角体蛋白基因)<400>9agtattttta ttctttcgta aaaaaattag aaaaataaaa tataaa 46<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(SfNPV多角体蛋白基因)<400>10agtaattttt tcctttcgta aaacattgtg aaaaaataaa 40<210>11<211>48
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’UTR(WsNPV多角体蛋白基因)<400>11agaattttag agtaatcgtt cgcgattgtg aaaaaaaggt ttgccata 48<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Luc T7-F3-Kpn<400>12ggggtaccat ggaagacgcc aaaaacataa 30<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Luc T7-R4-Kpn<400>13ggggtacctt acaatttgga ctttccgcc 29<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T7启动子<400>14cttaatacga ctcactatag g 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T7p Rv
<400>15cctatagtga gtcgtattaa g 21<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Luc-ATG<400>16atggaagacg ccaaaaacat aa 22<210>17<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T7pMn-Eco<400>17cttaatacga ctcactatag gagtattttt attctttcgt aaaaaaatta gaaaaataaa atataaagatatcgaattcg 80
<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M13Reverse<400>18ggaaacagct atgaccatg 19<210>19<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Phd3 Fw<400>19gggcggctgt aaaacacgat acattgttat tagta 35<210>20<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Phd3 Rv-Hind<400>20cccaagcttg cggataatat tttgaacgac gtcga 35<210>21<211>73<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>A25T7t<400>21aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttg73<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Not Fw<400>22cgcaagcttg gcgtaatcat gg 22<210>23<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Phd 3Rv<400>23gcggataata ttttgaacga cgtcga 26<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Not Rv
<400>24gccgcaaaaa acccctcaag accc 24<210>25<211>83<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T7pEo-Eco<400>25cttaatacga ctcactatag gtacggtgta ttttagattt cacaaacaat tacgaaagga ctacaatactgatatcgaat tcg 83<210>26<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Eco-Kpn<400>26
gatatcgaat tcgagctcgg tac 23<210>27<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Mn29 Rv<400>27tttatatttt atttttctaa tttttttac 29<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Eo21 Fw<400>28agtattgtag tcctttcgta a 21<210>29
<211>3052<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pTD1 Vector<400>3052TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA60CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG120TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC180ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCCTT240AATACGACTC ACTATAGGAG TATTTTTATT CTTTCGTAAA AAAATTAGAA AAATAAAATA300TAAAGATATC GAATTCGAGC TCGGTACCCG GGGATCCTCT AGAGTCGGGC GGCTGTAAAA360CACGATACAT TGTTATTAGT ACATTTATTA AGCGCTAGAT TCTGTGCGTT GTTGATTTAC420AGACAATTGT TGTACGTATT TTAATAATTC ATTAAATTTA TAATCTTTAG GGTGGTATGT480TAGAGCGAAA ATCAAATGAT TTTCAGCGTC TTTATATCTG AATTTAAATA TTAAATCCTC540AATAGATTTG TAAAATAGGT TTCGATTAGT TTCAAACAaG GGTTGTTTTT CCGAACCGAT600GGCTGGACTA TCTAATGGAT TTTCGCTCAA CGCCACAAAA CTTGCCAAAT CTTGTAGCAG660CAATCTAGCT TTGTCGATAT TCGTTTGTGT TTTGTTTTGT AATAAaGGTT CGACGTCGTT720CAAAATATTA TCCGCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAACTA GCATAACCCC TTGGGGCCTC780TAAACGGGTC TTGAGGGGTT TTTTGCGGCC GCAAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG840TTTCCTGTGT GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA900AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA960CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC1020
GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 1080CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA 1140TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 1200AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG 1260CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 1320CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC 1380GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCATAG CTCACGCTGT 1440AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC 1500GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA 1560CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA 1620GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGAACAGTA 1680TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA 1740TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG 1800CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG 1860TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC 1920TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT 1980TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT 2040CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA 2100CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA 2160TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC 2220GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT 2280AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT 2340ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG 2400TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA 2460GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA 2520
AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG2580CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT2640TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG2700CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT2760ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAaAGGGA2820ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC2880ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA2940CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC CTGACGTCTA AGAAACCATT3000ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG CGTATCACGA GGCCCTTTCG TC3052<210>30<211>3055<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pTD2 Vector<400>3055TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA60CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG120TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC180ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCCTT240AATACGACTC ACTATAGGTA CGGTGTATTT TAGATTTCAC AAACAATTAC GAAAGGACTA300CAATACTGAT ATCGAATTCG AGCTCGGTAC CCGGGGATCC TCTAGAGTCG GGCGGCTGTA360
AAACACGATA CATTGTTATT AGTACATTTA TTAAGCGCTA GATTCTGTGC GTTGTTGATT 420TACAGACAAT TGTTGTACGT ATTTTAATAA TTCATTAAAT TTATAATCTT TAGGGTGGTA 480TGTTAGAGCG AAAATCAAAT GATTTTCAGC GTCTTTATAT CTGAATTTAA ATATTAAATC 540CTCAATAGAT TTGTAAAATA GGTTTCGATT AGTTTCAAAC AAGGGTTGTT TTTCCGAACC 600GATGGCTGGA CTATCTAATG GATTTTCGCT CAACGCCACA AAACTTGCCA AATCTTGTAG 660CAGCAATCTA GCTTTGTCGA TATTCGTTTG TGTTTTGTTT TGTAATAAAG GTTCGACGTC 720GTTCAAAATA TTATCCGCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTAGCATAAC CCCTTGGGGC 780CTCTAAACGG GTCTTGAGGG GTTTTTTGCG GCCGCAAGCT TGGCGTAATC ATGGTCATAG 840CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG AGCCGGAAGC 900ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC TCACATTAAT TGCGTTGCGC 960TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA 1020CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT GCGTATTGGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT CACTGACTCG 1080CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG 1140TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG 1200GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC 1260GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA 1320TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT 1380ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA TAGCTCACGC 1440TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC 1500CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA 1560AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT 1620GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGAACA 1680GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT 1740TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT 1800ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT 1860
CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC 1920ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA 1980ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA 2040TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC 2100TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT 2160TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA 2220TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT 2280AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT ACAGGCATCG TGGTGTCACG CTCGTCGTTT 2340GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCCCATG 2400TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC 2460GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC 2520GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG 2580CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC ACATAGCAGA 2640ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA 2700CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT 2760TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG 2820GGAATAAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA ATATTATTGA 2880AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT TTAGAAAAAT 2940AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGACGT CTAAGAAACC 3000ATTATTATCA TGACATTAAC CTATAAAAAT AGGCGTATCA CGAGGCCCTT TCGTC 305权利要求
1.一种DNA片断，是在无细胞系蛋白质合成中，为了促进翻译反应而使用的下述的(a)～(1)的任意的DNA片断(a)具有序列表的序列号1中所示的碱基序列的DNA片断，(b)具有序列表的序列号2中所示的碱基序列的DNA片断，(c)具有序列表的序列号3中所示的碱基序列的DNA片断，(d)具有序列表的序列号4中所示的碱基序列的DNA片断，(e)具有序列表的序列号5中所示的碱基序列的DNA片断，(f)具有序列表的序列号6中所示的碱基序列的DNA片断，(g)具有序列表的序列号7中所示的碱基序列的DNA片断，(h)具有序列表的序列号8中所示的碱基序列的DNA片断，(i)具有序列表的序列号9中所示的碱基序列的DNA片断，(j)具有序列表的序列号10中所示的碱基序列的DNA片断，(k)具有序列表的序列号11中所示的碱基序列的DNA片断，以及(l)具有在所述(a)～(k)的任意的碱基序列中1或多个碱基被缺失、置换、插入或添加的碱基序列、且具有促翻译反应活性的DNA片断。
2.一种表达载体，是含有从具有促翻译反应活性的下述的(a)～(1)中选择的至少一种DNA片断的表达载体(a)具有序列表的序列号1中所示的碱基序列的DNA片断，(b)具有序列表的序列号2中所示的碱基序列的DNA片断，(c)具有序列表的序列号3中所示的碱基序列的DNA片断，(d)具有序列表的序列号4中所示的碱基序列的DNA片断，(e)具有序列表的序列号5中所示的碱基序列的DNA片断，(f)具有序列表的序列号6中所示的碱基序列的DNA片断，(g)具有序列表的序列号7中所示的碱基序列的DNA片断，(h)具有序列表的序列号8中所示的碱基序列的DNA片断，(i)具有序列表的序列号9中所示的碱基序列的DNA片断，(j)具有序列表的序列号10中所示的碱基序列的DNA片断，(k)具有序列表的序列号11中所示的碱基序列的DNA片断，以及(l)具有在所述(a)～(k)的任意的碱基序列中1或多个碱基被缺失、置换、插入或添加的碱基序列，且具有促翻译反应活性的DNA片断。
3.一种模板DNA，是具有编码蛋白质的结构基因和被结合到结构基因的5’上游侧的DNA片断的无细胞系蛋白质合成用的模板DNA，其中，DNA片断是从下述的(a)～(1)中选择的至少一种，即(a)具有序列表的序列号1中所示的碱基序列的DNA片断，(b)具有序列表的序列号2中所示的碱基序列的DNA片断，(c)具有序列表的序列号3中所示的碱基序列的DNA片断，(d)具有序列表的序列号4中所示的碱基序列的DNA片断，(e)具有序列表的序列号5中所示的碱基序列的DNA片断，(f)具有序列表的序列号6中所示的碱基序列的DNA片断，(g)具有序列表的序列号7中所示的碱基序列的DNA片断，(h)具有序列表的序列号8中所示的碱基序列的DNA片断，(i)具有序列表的序列号9中所示的碱基序列的DNA片断，(j)具有序列表的序列号10中所示的碱基序列的DNA片断，(k)具有序列表的序列号11中所示的碱基序列的DNA片断，以及(l)具有在所述(a)～(k)的任意的碱基序列中1或多个碱基被缺失、置换、插入或添加的碱基序列，且具有促翻译反应活性的DNA片断。
4.一种mRNA，是转录权利要求3所述的模板DNA得到的mRNA，其中，在无细胞系蛋白质合成中作为翻译模板使用。
5.一种无细胞系蛋白质合成用反应液，其中，含有权利要求3所述的模板DNA或转录所述模板DNA得到的mRNA。
6.一种无细胞系蛋白质合成方法，其中，是使用权利要求3所述的模板DNA或转录所述模板DNA得到的mRNA。
7.如权利要求6所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，使用了含有动物来源的提取物的无细胞系蛋白质合成反应液。
8.如权利要求7所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，动物来源的提取物是从蚕组织提取的。
9.如权利要求7所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，动物来源的提取物是从昆虫培养细胞提取的。
10.如权利要求9所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，昆虫培养细胞是粉丝夜蛾的卵细胞来源以及/或草地夜蛾卵巢细胞来源的细胞。
11.如权利要求7所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，动物来源的提取物是从哺乳动物细胞提取的。
12.如权利要求11所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，哺乳动物细胞是兔网织红细胞。
13.如权利要求11所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，哺乳动物细胞是哺乳动物培养细胞。
14.如权利要求13所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，哺乳培养动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
15.如权利要求6所述的无细胞系蛋白质合成方法，其中，使用了含有小麦胚芽来源的提取物的无细胞系蛋白质合成反应液。
16.一种无细胞系蛋白质合成用试剂盒，其中，包括权利要求2所述的表达载体。
全文摘要
本发明提供能够简单地克隆需要的基因并可以进一步提高翻译效率的DNA片断、具有该DNA片断的蛋白质表达载体以及模板DNA、从该模板DNA得到的mRNA、含有该模板DNA或mRNA的无细胞系蛋白质合成反应液、使用该模板DNA的无细胞系蛋白质合成方法以及含有该表达载体的无细胞系蛋白质合成试剂盒。是用于促进翻译反应的具有序列表序列号1～11中任意所示的碱基序列的DNA片断、具有该DNA片断的蛋白质表达载体以及模板DNA、从该模板DNA得到的mRNA、含有该模板DNA或mRNA的无细胞系蛋白质合成反应液、使用该模板DNA的无细胞系蛋白质合成方法以及含有该表达载体的无细胞系蛋白质合成试剂盒。
文档编号C07H21/00GK1796554SQ20051013104
公开日2006年7月5日 申请日期2005年12月7日 优先权日2004年12月7日
发明者铃木崇, 伊东昌章, 江连彻, 四方正光, 小林慎一郎 申请人:株式会社岛津制作所