专利名称：胡杨PeDREB2基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明设计胡杨(Populus euphratica)DREB类转录因子及其编码基因与应用，特别是涉及胡杨DREB类耐寒和耐旱转录因子及其编码基因与应用。
背景技术：
胡杨(Populus euphratica)是唯一能在干旱盐碱和温差剧烈变化的干旱沙漠地区生长的乔木建群树种。作为天然的抗逆性极强的典型植物，胡杨已引起国际学术界的重视。研究、开发和利用胡杨抗逆性基因资源，对于深入林木抗逆性机理以及定向培育抗逆林木新品种具有重要的价值。生物体的细胞能够对外界环境条件的变化做出相应的反应，在植物中，AP2/DREB家族中的DREB类转录因子能够接受环境胁迫信号，启动一系列胁迫应答基因的表达，从而增强植物对逆境的耐受力。
发明内容
本发明的目的是提供胡杨中的一种与抗逆性相关的DREB类转录因子及其编码基因，该转录因子首次在胡杨中克隆，在抗寒和抗旱反应中具有调控作用。本发明所提供的DREB类转录因子来源于胡杨，是DREB2家族中的一个，命名为PeDREB2，是具有与序列表2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列表2氨基酸残基序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与序列的氨基酸残基序列相同活性的由序列衍生的蛋白质序列表中序列氨基酸残基序列是由287个氨基酸残基组成的蛋白质，序列表2下划线为直线的序列为该基因核定位信号，其保守的AP2/DREB结构域序列为自氮端到碳端第78-135位氨基酸残基，即序列表2中下划线为虚线的部分。
抗逆转录因子PeDREB2的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列2)与序列中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由864个碱基组成，为该基因的开放读码框序列，含有保守的AP2/DREBP结构域序列，其表达受到低温、干旱和高盐的诱导。
本发明所提供的编码转录因子PeDREB2的基因，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体(包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，可获得对低温和干旱胁迫抗性增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以使用增强子，但是必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。
为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择性标记，通常使用的可选择性标记可以是编码对抗生素(包括庆大霉素、卡那霉素、潮霉素)抗性酶的基因，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。
携带有本发明的PeDREB2基因的表达载体可以通过多种方法转化植物宿主，以培育抗寒或抗旱的植物品种，例如Ti质粒、Ri质粒、电穿孔、微注射、植物病毒载体、直接DNA转化或植物病毒载体等，所转化的植物宿主可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明
图1是通过RT-PCR技术克隆得到的基因全长电泳图，图中M为markerD2000，1为基因PeDREB2；图2为PeDREB2基因在低温条件下RT-PCR检测结果；图3为PeDREB2基因在干旱条件下RT-PCR检测结果；图4为PeDREB2基因在高盐条件下RT-PCR检测结果。
具体实施例方式
实施例1，胡杨总DNA的提取用CTAB(萨姆布鲁克，分子克隆实验指南，第三版)的方法从干旱处理的胡杨中提取总DNA。
实施例2，PeDREB2开读框的克隆总用引物PDR1(GGTCCTGAGATCGAGAATATG)和PDR2(AGAAAACGCTACAAAGATGTC)对提取的胡杨DNA进行PCR。PCR程序为(1)94℃，变性5分钟。(2)PCR扩增，30个循环94℃，变性45秒；55℃退火45秒；72℃，延伸45秒；(3)72℃，延伸10分钟。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分离，然后用天为时代的琼脂糖DNA分离试剂盒回收目的片断并与TaKaRa公司的pMD18载体进行连接，连接的反应体系为目的片断4μl，1μl pMD18 vector，5μlLigation Mix，(60ng/μl)，于16℃过夜连接，再将连接产物转化感受态的大肠杆菌TOP10，用PCR的方法检测阳性菌株，最后取转化成功的菌株在奥科进行DNA序列测定。
实施例3，胡杨总RNA的提取及PeDREB2 cDNA序列的克隆用CTAB(萨姆布鲁克，分子克隆实验指南，第三版)的方法从干旱处理的胡杨中提取总RNA，总RNA用逆转录酶反转录合成cDNA，然后用引物PDR1(GGTCCTGAGATCGAGAATATG)和PDR2(AGAAAACGCTACAAAGATGTC)对该cDNA进行PCR。PCR程序为(1)94℃，变性5分钟。(2)PCR扩增，30个循环94℃，变性45秒；55℃退火45秒；72℃，延伸45秒；(3)72℃，延伸10分钟。将PCR产物用琼脂糖进行电泳分离，然后用天为时代的琼脂糖 DNA分离试剂盒回收目的片断并与pGM-T Easy载体进行连接，连接的反应体系为目的片断7μl，1μl 10×连接酶缓冲液，1μl pGM-T Easy Vector(60ng/μl)，1μl的T4DNA连接酶，于16℃连接过夜。再将连接产物转化进感受态的大肠杆菌Top10，最后取转化成功的菌株在奥科公司进行序列测定，测定结果和其DNA序列相比得知PeDREB2不含内含子。
实施例4，胡杨PeDREB2基因在逆境中的表达特性对于从新疆取得的两年生胡杨植株，分别进行低温处理(4℃)或干旱处理、盐处理，根据实验设计的时间取叶片，经液氮速冻，提取RNA作RT-PCR分析，RT-PCR反应以胡杨的Actin2为对照，以控制PCR反应中模板cDNA的浓度一致，结果如图2，3，4所示。
实施例5，胡杨PeDREB2基因表达载体的构建用两头加有Xbal酶切位点接头的引物从含有其cDNA序列的克隆载体上进行PCR，得到的产物连接到克隆载体上，菌落鉴定后将得到的阳性克隆摇菌、提质粒，并用Xbal酶切3小时，同时提取pBI121质粒，也用Xbal酶切3小时将得到的酶切产物用天为时代的连接酶16℃过夜连接，分别转化大肠杆菌Top10，得到的正向和反向的阳性产物进一步转化农杆菌LBA4404。
序列表序列表1 ATGGGTACTCTTATTCAAGGTTCTAACGCCACTTCCATGTCCATGGATTCTACCAAGAAG序列表2 M G T L I Q G S N A T S M S M D S TK K61 AGGAAAAGGGCAAGTAATAAATCTGTAGCTGAGACCCTTCAAAAGTGGAAGGAATACAAT21R K RA S N K S V A E T L Q K W K E Y N121 GAGTATCTTGATGCTCAAGGTGATGAAGGTAACAAACCAGTTCGTAAAGTTCCTGCCAAG41E Y L D A Q G D E G N K P V R K V P A K181 GGCTCAAAGAAGGGGTGCATGAAAGGTAAAGGAGGCCCAGAGAATTCAGTCTGCAATTAC61G S K K G C M K G K G G P E N S VC N Y241 AGAGGTGTGAGACAGAGGACATGGGGGAAGTGGGTTGCTGAGATTCGGGAGCCAGACAGA81R G V R Q R T W G K W V A E I R E P D R301 GGGCCTAGGCTATGGCTTGGTACTTTTCCTACTGCCTATGAAGCTGCTCTTGCCTATGAT101G P R L W L G T F P T A Y E A A L A Y D361 AATGCTGCACGAACTATGTATGGTCCTCGTGCTCGTTTAAACATTCCAGATGTGGTGAAT121N A A R T M Y G P R A R L N IP D V V N421 TCAACAAGCTCATCGAAGGATAACTTCTCTGCTGTGACACCATCATACTATTATTCAGCT141 S T S S S K D N F S A V T P S Y Y Y S A481 GCAAGTTCTGCTGACTCCGTCACCACATCAACCCACTCTGAGGTTTGTGCGTACGAGGAT161 A S S A D S V T T S T H S E V C A Y E D541 CCTAACCAGAATGTATTAAGCCATGCTGAGGATTGGATGACAAATATATCAAGCCAAGCT181 P N Q N V L S H A E D W M T N I S S Q A601 GAGGTTTGCGAGCAGAATGCATCAAGCCAAACTGAGGTTTACGAGCAGAATGTATCAAGC201 E V C E Q N A S S Q T E V Y E Q N V S S661 CAGCATGTCGAGGATTGTTCTCGGGGAGTTGAAAAAAATAGCAAGCTGAGTCAAGATGAG221 Q H V E D C S R G V E K N S K L S Q D E721 CTGAAGATTCAACCAGAAAATCCTTCGTGGGCCAATGACTGTCACGACTACGGCTGGGAT241 L K I Q P E N P S W A N D C H D Y G W D781 GAGATCTTTAGCGTAGAAGAGCTGCTAGGGGATATCGATTCTGGGATGACAGGAGCAGAG261 E I F S V E E L L G D I D S G M T G A E841 GGGTACTTCAGCTTAGGATTTTGA281 G Y F S L G F *
权利要求
1.胡杨的DREB类转录因子PeDREB2，它具有与序列表中序列2的氨基酸残基序列获将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
3.胡杨DREB类转录因子PeDREB2的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述胡杨DREB类转录因子PeDREB2的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.权利要求4所述的基因，其开放阅读框是自5’端第1到第864位碱基。
6.含有权利要求3所述的基因的表达载体。
7.含有权利要求3所述的基因的细胞系
8.权利要求3所述的基因在培育抗寒和抗旱植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了胡杨(Populus euphratica Olive)DREB类耐寒和耐旱转录因子及其编码基因与应用，目的是提供胡杨的DREB类转录因子及其编码基因，该转录因子在植物抗寒和抗旱中有调控作用，本发明提供的DREB类转录因子命名为PeDREB2，具有与序列表2的氨基酸序列或将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。抗逆转录因子PeDREB2的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的PeDREB2基因在培育抗寒和抗旱植物品种中具有重要作用。
文档编号C07H21/04GK1982334SQ20051013045
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月13日 优先权日2005年12月13日
发明者尹伟伦, 夏新莉, 陈金焕 申请人:尹伟伦, 夏新莉, 陈金焕