牙周病的疫苗的制作方法

专利名称：牙周病的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的由它们的16S rRNA DNA鉴别的细菌分离株(其在伴侣动物中引起牙周病)、其中包含的多核苷酸序列、由这种多核苷酸编码的多肽和包含这种已经灭活或减毒的细菌分离株、多核苷酸或多肽的疫苗。本发明也提供用于治疗和预防牙周病的方法以及用于检测、治疗和预防牙周病的试剂盒。而且，提供了用于评估在动物中疫苗对抗牙周病的效力的方法。
背景技术：
绝大多数有关牙周病的试验数据是基于对人或从人分离的细菌的研究。有关非人动物(例如伴侣动物以及特别是狗和猫)中的牙周病所知相对甚少。
牙周病包括一组涉及牙齿支持组织的感染。这些感染的严重性从轻微且可逆的牙龈炎症到牙周组织(牙龈、牙周膜和牙槽骨)的慢性破坏，最终牙齿脱落。
从微生物学的观点，这种疾病的数个特征是重要的。细菌病因学是复杂的，多种生物体是造成人中疾病起始和发展的原因。许多(如果不是全部)的这些生物体也可能存在于牙周表现健康的个体中并可以与宿主融洽地共生。因此，疾病发作可以由细菌和宿主之间的生态平衡变化引起，例如是某些生物体的绝对或相对数目的改变或其致病潜能的改变或特定宿主因素的调节的结果。局部环境对龈缘上的牙齿表面和龈下缝隙(牙根和牙龈之间的沟，当疾病发展时其深入至牙周袋)的组成性小生物群施加了多种独特的约束。
牙齿的钙化硬组织和牙龈的上皮细胞都可用于菌株建群(colonization)。这些组织曝露于宿主唾液分泌物和龈沟液(血清渗出液)，它们两者含有直接与细菌相互作用并改变主要环境条件的分子。而且，据知在人中，牙齿和龈下区域的成功的建群者(colonizers)必须与栖生在这些区的许多(多于600种)其它细菌物种共存。人中的牙周病发病学的研究因而由于微环境的生态复杂性而变得复杂。
人中牙周病的多种征候的分类不断的改变，并且有足够理由认为，疾病在严重性、发展速率以及受影响的牙齿数目上变化并且不同年龄群体随着乳牙的长出后可以变得易受感染。致病体的种类在这些疾病个体，以及在人患者中并且甚至在一个患者的不同疾病部位而不同。然而，一般来说，严重形式的疾病与革兰氏阴性厌氧细菌有关。对于这一群体，在人中，多数的证据指向牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，以前称为Bacteroides gingivalis)的致病作用。这种生物体的存在，其或者单独起作用或表现为与其它细菌的混合感染，并可能伴随宿主中有益菌种和某些免疫反应的缺少，看起来对疾病的活动性是必要的。
口腔的菌落建群需要细菌首先进入口中并然后停留并附着在可利用的表面上。用于防止细菌菌落建群的宿主因素包括舌头运动连同唾液和龈沟液流动的机械剪力。成功的口腔建群菌种因而具有多种品质用以克服宿主的保护机制。随后积聚在口腔的硬组织和软组织上的固定的牙菌斑生物膜是沉着有不同微生物种类的动态系统。在人中，牙龈卟啉单胞菌通常是口腔的后期或次级建群菌种，其需要先前的生物体来产生必要的环境条件。
牙龈卟啉单胞菌最初进入人口腔据认为是通过从受感染的个体传播而发生的。其它载体因而也看起来是可操作的。这些研究指出个体被单一的(或至少是占优势的)基因型的细菌菌落建群，不管菌落建群的部位或临床状态。相反，许多不同克隆起源的菌株存在于不同的个体中。这支持这样一个观点，即牙龈卟啉单胞菌从本质上来说是条件致病菌，其毒性不限于特定的克隆类型。
人口腔提供了牙龈卟啉单胞菌可以附着于其上的多种表面。有牙齿矿化的硬组织，还有粘膜表面包括牙龈、颊和舌头的那些粘膜表面。
如上描述的，关于人中的牙周病已知甚多，而关于伴侣动物中的相同疾病却知之甚少。Fournier，D等，“Porphorymonas gulae sp.nov.，an Anaerobic，Gram-negative，Coccibacillus from theGingival Sulcus of Various Animal Hosts”，International Journalof a Systematic and Evolutionary Microbiology(2001)，51，1179-1189描述了从多种动物宿主分离的数种菌株，包括命名为ATCC57100的P.gulae spp.nov.。该作者猜测牙龈卟啉单胞菌的动物生物型的菌株代表了截然不同于牙龈卟啉单胞菌的卟啉单胞菌种类。还没有提到用于在伴侣动物中治疗牙周病的疫苗。在“Porphyromonasgingivicanissp.nov.and Porphyromonas crevioricanis sp.nov.，Isolated from Beagles”，International Journal of SystemicBacteriology，pp.637-640，(1994)中，Hirasawa和Takada描述了从小猎犬的龈沟液分离的菌种。这些菌种描述于美国专利号5,710,039和US5,563,063中。该作者没有提出使用这些菌种用于疫苗来治疗牙周病。国际申请案PCT/AU98/01023，公开号为WO99/29870，描述了多种牙龈卟啉单胞菌多肽和核苷酸。然而，没有提供在伴侣动物中有效预防牙周病的疫苗的证据。即使已有大量信息有关人的疾病，很少有预防和治疗疾病的方式，甚至是在人中。
仍然需要安全和有效的疫苗用于在伴侣动物中治疗和预防牙周病。
Genco等(Trends in Microbiology 6444-449，1998)描述了用于研究牙龈卟啉单胞菌-介导的牙周病的大鼠模型。Grecca等(J.Endodontics 27610，2001)描述了牙髓治疗具有诱导的根周牙周炎的狗的牙齿后根周修复的X射线照相的评估。
在本发明前，还没有可用于以确定的和定量的方式评估疫苗对抗一种或多种牙周致病性细菌的效力的动物模型。
发明概述本发明提供一种分离的有色厌氧细菌，所述的细菌的16S rRNADNA序列含有选自SEQ ID NO86-94的核苷酸序列，前提是该细菌不是称为狗20B的牙龈卟啉单胞菌的菌株。
在一个实施方案中，细菌选自Porphyromonas gulae B43犬口腔卟啉单胞菌(P. cansulci)B46、牙周卟啉单胞菌B52(P.circumdentaria B52)、P.gulae B69、牙周卟啉单胞菌B97、犬齿龈液卟啉单胞菌(P.cangingivalis)B98、唾液卟啉单胞菌B104(P.salivosa B104)、O.denticanis B106和牙髓卟啉单胞菌B114(P.endodontalisB114)，条件是该细菌不是称为狗20B的牙龈卟啉单胞菌的菌株。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的有色厌氧细菌，其直接地或与其它致病体结合在伴侣动物中引起牙周病，其中该细菌可用于制备用于在伴侣动物中治疗或预防牙周病的疫苗，其中该疫苗包含免疫有效量的至少一种经灭活或减毒的细菌，条件是该细菌不是称为ATCC 51700的P.gulae sp.nov.。优选地，该细菌的16S rRNADNA序列至少95％同源于SEQ ID NO86-94中描述的任意序列。更优选地，该细菌具有的16S rRNA DNA包括选自SEQ ID NO86-94的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的有色厌氧细菌，其直接地或与其它致病体结合在伴侣动物中引起牙周病，其中该细菌可用于制备用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗，其中该疫苗包含一种分离的多肽，所述的多肽免疫有效地作为预防或治疗伴侣动物中的牙周病的疫苗，其中该多肽由从所述细菌分离的多核苷酸分子编码，所述的细菌不是称为ATCC 51700的P.gulae sp.nov.的菌株。优选地，该细菌的16S rRNA DNA序列至少95％同源于SEQ ID NO86-94中描述的任意序列。更优选地，该细菌具有的16S rRNA DNA包含选自SEQ ID NO86-94的核苷酸序列。
在一更进一步的实施方案中，本发明提供了一种分离的有色厌氧细菌，其直接地或与其它致病体结合在伴侣动物中引起牙周病，其中该细菌可用于制备用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗，其中该疫苗包含分离的多核苷酸分子，所述的多核苷酸编码能免疫有效地作为在伴侣动物中预防或治疗牙周病的疫苗的多肽，其中该多核苷酸分子分离自所述细菌，条件是该细菌不是称为ATCC 51700的P.gulaesp.nov.的菌株。优选地，该细菌的16S rRNA DNA序列至少95％同源于SEQ ID NO86-94中描述的任意序列。更优选地，该细菌具有的16S rRNA DNA包括选自SEQ ID NO86-94的核苷酸序列。
伴侣动物优选是狗或猫。
在另一方面，本发明提供了分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含的核苷酸序列分离自细菌，所述的细菌选自具有Porphyromonas gulae B43，犬口腔卟啉单胞菌B46，牙周卟啉单胞菌B52，P.gulae B69，牙周卟啉单胞菌B97，犬齿龈液卟啉单胞菌B98，唾液卟啉单胞菌B104，O.denticanis B106和牙髓卟啉单胞菌B114的鉴别特征的细菌，条件是该细菌不是称为ATCC 51700的P.gulaesp.nov.的菌株。
在一个实施方案中，分离的多核苷酸分子分离自一种细菌，其中该细菌选自Porphyromonas gulae B43、犬口腔卟啉单胞菌B46、牙周卟啉单胞菌B52、P.gulae B69、牙周卟啉单胞菌B97、犬齿龈液卟啉单胞菌B98、唾液卟啉单胞菌B104、O.denticanis B106和牙髓卟啉单胞菌B114。
在另一实施方案中，分离的多核苷酸编码一种多肽。
然而在另一实施方案中，分离的多核苷酸编码核糖体RNA或转运RNA。
然而在一进一步的实施方案中，本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，所述的多核苷酸分子包含选自SEQ ID NO86-94的任意核苷酸序列和与其具有至少95％的同源性的同系物，条件是该核苷酸序列不是称为ATCC 51700的细菌P.gulae sp.nov.的16S rRNA DNA。
优选地，分离的多核苷酸分子包含选自SEQ ID NO95-102和111-119(分别是fimA或oprF)的任意核苷酸序列或它们的互补序列，所述的核苷酸序列编码一种多肽，所述的多肽能免疫有效地作为用于在伴侣动物中治疗或预防牙周病的疫苗。
也优选的是分离的多核苷酸分子包括SEQ ID NOS95-102和111-119中描述的任意核苷酸序列、与它具有至少95％的同源性的同系物或它们的互补序列，其中所述的序列编码一种多肽，所述的多肽能免疫有效地作为用于在伴侣动物中预防或治疗牙周病的疫苗.
在一进一步的实施方案中，分离的多核苷酸分子包括SEQ ID NOS95-102和111-119中描述的任意核苷酸序列或它们的片段或变体或其互补序列，所述的序列编码一种多肽，所述的多肽能免疫有效地作为用于在伴侣动物中预防或治疗牙周病的疫苗。
然而在一进一步的实施方案中，分离的多核苷酸分子包括在高严格条件下杂交至SEQ ID NO95-102和111-119中描述的任意序列或其互补序列的核苷酸序列。优选地，分离的多核苷酸序列(其中所述的序列含有fimA的序列)选自SEQ ID NO95-102中描述的任意序列、其片段或变体，所述的片段或变体与其具有至少约95％、98％或99％的序列一致性。也优选的是分离的多核苷酸序列(其中所述的序列含有oprF的序列)选自SEQ ID NO111-119中描述的任意序列、其片段或变体，所述的片段或变体与其具有至少约95％、98％或99％的序列一致性。
优选地，根据本发明的多核苷酸分子的片段或变体与它具有至少约98％的同源性。
在另一实施方案中，本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，其含有在高严格条件下杂交至fimA的核苷酸序列，所述fimA的核苷酸序列选自SEQ ID NO 95-102中描述的任意序列或其互补序列。
然而在另一实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸分子，其包含了在高严格条件下杂交至oprF的核苷酸序列，所述oprF的核苷酸序列选自SEQ ID NO 111-119中描述的任意序列或其互补序列。
本发明也提供了一种分离的含有约30个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子或其互补序列，所述的多核苷酸分子在高严格条件下杂交至一种DNA序列，所述的DNA序列具有的核苷酸序列编码具有至少约10个连续氨基酸的多肽，其中所述的连续氨基酸为由SEQ ID NO95-102和109-119的任意核苷酸序列编码的任意多肽。优选地，分离的多核苷酸分子包含至少约90个核苷酸或其互补序列，其在高严格条件下杂交至一种DNA分子，所述的DNA分子具有的核苷酸序列编码具有至少约30个连续氨基酸的序列，所述的连续核苷酸为由SEQ ID NO95-102和111-119的任意核苷酸序列编码的任意多肽。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的分离的多核苷酸，其有效地连接至异源启动子上。分离的多核苷酸可进一步包含在原核或真核细胞中有活性的复制起点。
在另一方面，本发明提供了重组表达载体，所述的载体包含有效连接至启动子序列上的选自任意核苷酸序列SEQ ID NO95-102和111-119、其片段或变体的多核苷酸。
然而在另一方面，本发明提供了质粒，所述的质粒包含有效连接至启动子序列上的选自任意核苷酸序列SEQ ID NO95-102和111-119、其片段或变体的多核苷酸。
在一进一步的方面，本发明提供了宿主细胞，所述的宿主细胞包括根据本发明的分离的多核苷酸序列、载体或质粒。
优选地，宿主细胞是大肠杆菌BL21并且所述的多核苷酸进一步包含表达载体pBAD/HisA或λ表达质粒。
在一进一步方面，本发明提供用于产生重组FimA或OprF(选自SEQ ID NOS103-110或120-128中描述的任意序列或其片段或变体)的方法，所述的方法包括(1)在其中含有FimA、OprF或其片段或变体的多肽得以表达的条件下培养权利要求36的细胞，以及(2)回收所述的多肽。该多肽可以以可溶或不可溶形式回收。
在另一方面，本发明分离的多肽作为用于在伴侣动物中预防或治疗牙周病的疫苗是免疫有效的，并包含SEQ ID NO103-110和120-128中描述的氨基酸序列。
在一个实施方案中，作为用于在伴侣动物中预防或治疗牙周病的疫苗免疫有效的分离的多肽包含SEQ ID NO103-110和120-128中描述的氨基酸序列和与它具有至少95％、98％或99％序列一致性的同系物。
在另一个实施方案中，作为用于在伴侣动物中预防或治疗牙周病的疫苗免疫有效的分离的多肽包含SEQ ID NO103-110和120-128中描述的氨基酸序列或其片段或变体。
然而在另一实施方案中，作为用于在伴侣动物中预防或治疗牙周病的疫苗免疫有效的分离的多肽具有由一种DNA分子编码的氨基酸序列，所述的DNA分子包含在高度严格条件下杂交至SEQ ID NO95-102和111-119中描述的任意序列的核苷酸序列。
然而在一进一步的实施方案中，分离的多肽作为用于在伴侣动物中预防或治疗牙周病的疫苗是免疫有效的，所述的多肽包含至少约10个连续的氨基酸，包含SEQ ID NO103-110和120-128的任意多肽序列的片段，所述的多肽或者单独地或连接至载体，作为用于在伴侣动物中预防或治疗牙周病的疫苗是免疫有效的。优选地，分离的多肽包含至少约25个氨基酸。
优选地，分离的多肽(用于预防或治疗伴侣动物中的牙周病)由DNA分子编码，所述的DNA分子包含含有fimA的序列(SEQ ID NO95-102)的核苷酸序列。
也优选的是，分离的多肽(用于预防或治疗伴侣动物中的牙周病)由一种DNA分子编码，所述的DNA分子包含含有oprF的序列(SEQ IDNO111-119)的核苷酸序列。
在优选的实施方案中，分离的多肽是重组表达的多肽，所述的多肽选自FimA(SEQ ID NO103-110)和OprF(SEQ ID NO120-128)。
在另一实施方案中，重组表达的多肽融合至载体多肽上。融合多肽优选基本是多组氨酸或多苏氨酸序列。
在一进一步的方面，本发明提供用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的至少一种灭活的根据本发明的有色厌氧细菌和可药用载体。
在另一实施方案中，本发明提供用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的至少一种灭活的有色厌氧细菌、至少一种其它细菌或病毒和可药用载体。
在一优选的实施方案中，疫苗包含免疫有效量的至少一种灭活的有色厌氧细菌、至少一种犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒-2(CAV-2)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPI)或犬冠状病毒(CCV)和可药用载体。
在另一方面，本发明提供用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的至少一种根据本发明的多核苷酸分子和可药用载体。
然而在另一方面，本发明提供用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗，所述疫苗包含免疫有效量的至少一种根据本发明的多肽和可药用载体。
优选地，用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗包含免疫有效量的FimA和可药用载体。
也优选的是用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗，其含有免疫有效量的OprF和可药用载体。
用于本发明的疫苗的细菌可以选自Porphyromonas gulae B43、犬口腔卟啉单胞菌B46、牙周卟啉单胞菌B52、P.gulae B69、牙周卟啉单胞菌B97、犬齿龈液卟啉单胞菌B98、唾液卟啉单胞菌B104、O.denticanis B106和牙髓卟啉单胞菌B114。
在一优选的实施方案中，有色厌氧细菌是P.gulae B43、唾液卟啉单胞菌B104和O.denticanis B106。
在另外的实施方案中，本发明提供用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗组合物，包含免疫有效量的至少一种灭活的分离的根据本发明的有色厌氧细菌、可药用载体和任选的佐剂。
然而在另一实施方案中，本发明提供用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗组合物，包含免疫有效量的至少一种根据本发明的多核苷酸分子、可药用载体以及任选地佐剂。
依然在另一实施方案中，本发明提供用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的疫苗组合物，包含免疫有效量的至少一种根据本发明的多肽、可药用载体以及任选地佐剂。
在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病的方法，所述的方法包括将根据本发明的疫苗组合物施用给有此需要的伴侣动物。
在本发明的另一方面提供了用于在伴侣动物中诊断牙周病的方法，所述的方法通过分析样品的根据本发明的细菌、多肽或多核苷酸，其中该细菌、多肽或多核苷酸的存在可指示疾病。优选地，分析步骤包括使用选自PCR、杂交和抗体检测的方法分析样品。
然而在另一方面，本发明提供试剂盒，所述的试剂盒在至少一个容器中含有用于治疗和预防伴侣动物中的牙周病的组合物，所述的组合物含有有效量的至少一种灭活的分离的本发明有色厌氧细菌、多肽或多核苷酸和可药用载体；其中该试剂盒进一步含有一份印好的说明书，该说明书说明该试剂盒可用于治疗或预防伴侣动物中的牙周病。试剂盒可进一步含有用于分配所述组合物的手段。
依然在另一方面，本发明提供了在至少一个容器中含有分离的DNA分子的试剂盒，所述的DNA分子含有至少约15个连续的选自任意SEQ ID NO86-94、95-102和111-119的核苷酸的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列在高度严格条件下杂交至SEQ ID NO86-94、95-102和111-119中描述的任意核苷酸序列的互补序列，所述试剂盒还在第二个容器中含有第二种分离的DNA分子，所述的DNA分子含有至少约15个连续的选自SEQ ID NO86-94、95-102和111-119中描述的任意核苷酸序列的互补序列的核苷酸的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在高严格条件下杂交至SEQ ID NO86-94、95-102和111-119中描述的任意核苷酸序列，其中该试剂盒进一步包含一份说明书，说明该试剂盒可用于检测卟啉单胞菌种。这种方法通常可用于所有哺乳动物，包括人。
然而，在另一方面，本发明提供了试剂盒，所述的试剂盒在至少一个容器中包含具有含有至少30个连续氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，所述的多肽由SEQ ID NO95-102和111-119的任意核苷酸序列编码，试剂盒还含有一份说明书，说明该试剂盒可用于检测卟啉单胞菌种。试剂盒可进一步包含第二种多肽，其中该第二种多肽是缀合至酶上的抗体，所述的酶催化颜色生成或该酶优选地选自碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。试剂盒可进一步含有用于比色测定或化学发光测定的试剂。
在一进一步方面，本发明提供杂交试剂盒，所述的试剂盒在至少一个容器中含有分离的DNA分子，其中所述的DNA分子含有至少约15个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列，所述的连续核苷酸选自任意SEQ ID NO86-94、95-102和111-119，其中杂交对卟啉单胞菌种是特异性的并且其中试剂盒进一步含有一份说明书，说明该试剂盒可用于检测卟啉单胞菌种。优选地，杂交在高度严格条件下进行。
在更进一步方面，本发明提供评估疫苗对抗动物中，特别是狗中的一种或多种牙周致病性细菌的效力的方法。
然而在进一步的方面，本发明提供评估疫苗对抗一种或多种牙周致病性细菌的效力的方法，其中在动物中测量的临床指征包括龈沟液、牙菌斑、受感染的骨或龈沟中增加水平的一种或多种牙周致病性细菌或经由放射照相测量法定量的牙槽骨的量的变化。
本发明的细菌、多核苷酸、多肽、疫苗、疫苗组合物或试剂盒都不含有在Fournier，D.等，“Porphorymonas gulae sp.nov.，anAnaerobic，Gram-negative，Coccibacillus from the GingivalSulcus of Various Animal Hosts”，International Journal of aSystematic and Evolutionary Microbiology(2001)，51，1179-1189中描述的任何细菌，包括称为ATCC 57100的菌株P.gulae spp.nov.、Hirasawa和Takada，“Porphyromonas gingivicanis sp.nov.andPorphyromonas crevioricanis sp.nov.，Isolated from Beagles”，International Journal of Systemic Bacteriology，pp.637-640，(1994)、美国专利号5,710,039或US5,563,063或美国专利申请案PCT/AU98/01023(公开号为WO99/29870)中描述的任何细菌、多核苷酸或肽。
附图简述

图1是来自拟杆菌纲(Bacteroidetes class)的代表的邻近-连接法(neighbor-joining)的系统树。该系统树用CLUSTAL X1.81版本和NJ Plot软件程序(两者可从ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalX/获得)产生。该系统树的根为大肠杆菌16S rRNA基因序列(登记号J01695；数据没有显示)。用1000个重复进行Bootstrap分析。Bootstrap值用图示表示((●，＞950；■，＞850；o，＞700；□，＞500；无指示，＜500)。标尺表示每个核苷酸位置0.01个取代。箭头表示O.denticanis B106T的位置。登记号牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)ATCC 33277，J01695；P.gulae B243，AF285874；犬口腔卟啉单胞菌VPB 4875，X76260；唾液卟啉单胞菌NCTC 11632，L26103；牙髓卟啉单胞菌ATCC35406，AY253728；T.forsythensis ATCC 43037，AB035460；福赛斯拟杆菌(Bacteroides cf.forsythus)口腔克隆BU45，AF385565；屎拟杆菌(B.merdae)ATCC 43184T，X83954；吉氏拟杆菌(B.distasonis)ATCC 8503，M86695；马粪细菌118ds10，AY212569；D.shahii株CCUG 43457，AJ319867；未培养的拟杆菌科(Bacteroidaceae)克隆Rs-P82，AB088919；未培养的细菌cadhufec059h7，AF530302；内脏拟杆菌(B.splanchnicus)NCTC 10825，L16496；O.denticanis B106T，AY560020；拟杆菌口腔克隆FX069，AY134906；未培养的细菌SHA-38，AJ249105；A.putredinis ATCC29800，L16497；R.microfusus ATCC 29728，L16498；B.denticaniumB78，AY549431；脆弱拟杆菌(B.fragilis)ATCC 25285T，X83935；多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)菌株17.4，AY319392；B.acidofaciens菌株A37，AB021163；P.bivia ATCC 29303.L16475；P.nigrescens ATCC 25261，L16479；P.intermedia ATCC 25611，L16468；P.denticola ATCC 35308，L16467和P.buccae ATCC 33690，L16478。
图2是Odoribacter denticanis的临床分离菌株的邻近-连接法的系统树图。该系统树是按图1生成。该系统树的根为牙龈卟啉单胞菌ATCC 53977 16S rRNA基因序列(登记号L16492；数据没有显示)。标尺表示每个核苷酸位置0.01个取代。登记号O.denticanis B106T，AY560020；O.denticanis B113，AY560022；O.denticanis B150，AY560027；O.denticanis B155，AY560030；O.denticanis B172，AY560033；O.denticanis B183，AY560035；拟杆菌口腔克隆FX069，AY134906；未培养细菌cadhufec 059h7，AF530302；内脏拟杆菌NCTC10825和未培养的拟杆菌科克隆Rs-P82，AB088919。
图3是来自牙龈卟啉单胞菌FimA蛋白家族(I-V类)的代表的邻近-连接系统树。该系统树用CLUSTAL X版本1.81和NJ Plot软件程序产生。该系统树的根为大肠杆菌CFT073菌毛蛋白(登记号NP-757241；数据没有显示)。用1000个重复进行Bootstrap分析。Bootstrap值用图示表示(●，＞950；■，＞850；o，＞700；□，＞500；无指示，＜500)。标尺表示每个氨基酸位置0.05个取代。FimA登记号O.denticanis B106T，AY573801；牙龈卟啉单胞菌HG1691，Q93R80；牙龈卟啉单胞菌BH18/10，JN0915；牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277，P13793；牙龈卟啉单胞菌OMZ314，BAA04624；牙龈卟啉单胞菌OMZ409，Q51822；牙龈卟啉单胞菌6/26，Q51826；牙龈卟啉单胞菌ATCC 49417，Q51825；牙龈卟啉单胞菌W83，AAQ67087；牙龈卟啉单胞菌HG564，Q51827和牙龈卟啉单胞菌HNA-99，Q9SOW8。
图4由(A)P.gulae B43和(B)O.denticanis B106T的扫描电子显微镜照片组成。标尺表示1000nm的距离。
图5是显示生长研究的结果的照片，所述的研究鉴别支持Porphyromonas gulae B43生长的“无动物产品”的培养基。测试了下列培养基ME-完全培养基、ME-氯高铁原卟啉、ME-维生素K、ME-既有氯高铁原卟啉又有维生素K、PYG-完全培养基、PYG-氯高铁原卟啉、PYG-维生素K、PYG-既有氯高铁原卟啉又有维生素K，以及BHI。
图6是显示用指出的细菌种超感染引起的小鼠中平均的骨丢失的图。对小鼠进行假攻击或用标明的细菌攻击小鼠。净骨丢失表示超过在假攻击组中观测到的值的骨丢失。虚线表示阳性对照组的净骨丢失。标出了标准误差。
图7是显示用标明的细菌种超感染引起的小鼠中骨丢失的百分比图。对小鼠进行假攻击或用标明的细菌攻击小鼠。百分比骨丢失是基于设定为100％骨丢失的阳性对照组的净骨丢失。
图8A和B的照片中图8A显示了SDS PAGE，在图8B中显示了蛋白质印迹分析，这些分析使用了在来自pBAD-HisA的大肠杆菌BL21中表达的重组P.gulae B43 FimA的抗-XpressTM表位血清(Invitrogen)。简写Std.(kDa)，标准；Ind，诱导的；Sol，可溶级分；Insol，不可溶级分。箭头表示rFimA的位置。
图9是显示来自表达质粒的在大肠杆菌BL21细胞中表达的重组P.gulae B43 oprF的SDS-PAGE分析的照片。T＝表示将培养物从30℃转换至42℃后的时间。分子量大小标准单位是kDa。箭头表示rOprF的位置。
图10是显示基于净骨丢失的同源疫苗的效力研究的结果图。同源疫苗效力研究是基于净骨丢失。用以下疫苗抗原和RIBI MPL+TDM佐剂(C组除外，其使用弗氏完全佐剂和不完全佐剂)对小鼠进行疫苗接种A、B和E组，仅用PBS；C和D组，用福尔马林灭活的牙龈卟啉单胞菌53977；F组，用福尔马林灭活的P.gulae B43；G组，BEI-灭活的P.gulae B43；H，热灭活的P.gulae B43；以及I组，用通气灭活的P.gulae B43。假攻击小鼠(组A)、用1％羧甲基纤维素中的牙龈卟啉单胞菌53977(阴影条)或P.gulae B43(黑条)攻击小鼠。标明了标准误差测量结果。
图11是显示基于骨丢失百分比的牙龈卟啉单胞菌53977同源疫苗的效力研究的图。用下列疫苗抗原和RIBI MPL+TDM佐剂(C组除外，其利用弗氏完全和不完全佐剂)接种小鼠A和B组，仅用PBS；C和D组，用福尔马林灭活的牙龈卟啉单胞菌53977。对A组用PBS；或对B-D组，用1％羧甲基纤维素中的牙龈卟啉单胞菌53977攻击小鼠。
图12是显示基于骨丢失百分比的P.gulae B43同源疫苗的效力研究的图。用以下疫苗抗原和RIBI MPL+TDM佐剂接种小鼠A-B组，仅用PBS；C组，用福尔马林灭活的P.gulae B43；D组，用BEI-灭活的P.gulae B43；E组，热灭活的P.gulae B43；以及F组，用通气灭活的P.gulae B43。对A组用PBS；或对B-F组，用1％羧甲基纤维素中的P.gulae B43攻击小鼠。
图13是显示基于净骨丢失的异源疫苗的效力研究的结果图。用以下疫苗抗原和RIBI MPL+TDM佐剂接种小鼠对A-E组，仅用PBS；对F-I组，用福尔马林灭活的P.gulae B43；对J组，用福尔马林灭活的唾液卟啉单胞菌B104和福尔马林灭活的O.denticanis B106。用PBS(A组)、1％羧甲基纤维素中的P.gulae B43(B和F组；黑条)、P.gulae B69(C、G和J组；阴影条)、唾液卟啉单胞菌B104(D和H组；带横线的条)或O.denticanis B106(E和I组；带圆点花样的条)攻击小鼠。标明了标准误差测量结果。
图14是显示了基于骨丢失百分比的异源疫苗效力研究的P.gulae B43攻击组的结果图。用以下疫苗抗原和RIBI MPL+TDM佐剂接种小鼠A-B组，仅用PBS；C组，用福尔马林灭活的P.gulae B43。对A组用PBS；或对B-C组，用1％羧甲基纤维素中的P.gulae B43攻击小鼠。
图15是显示了基于骨丢失百分比的异源疫苗效力研究的P.gulae B69攻击组的结果图。用以下疫苗抗原和RIBI MPL+TDM佐剂接种小鼠对A-B组，仅用PBS；对C组，用福尔马林灭活的P.gulae B43；或对D组，用福尔马林灭活的唾液卟啉单胞菌B104和福尔马林灭活的O.denticanis B106。对A组用PBS；或对B-D组，用1％羧甲基纤维素中的P.gulae B69攻击小鼠。
图16是显示基于骨丢失百分比的异源疫苗效力研究的唾液卟啉单胞菌B104攻击组的结果图。用以下疫苗抗原和RIBI MPL+TDM佐剂接种小鼠对A-B组，仅用PBS；或对C组，用福尔马林灭活的P.gulaeB43。对A组用PBS；或对B-C组，用1％羧甲基纤维素中的唾液卟啉单胞菌B104攻击小鼠。
图17是显示了基于骨丢失百分比的异源疫苗效力研究的O.denticanis B106攻击组的结果图。异源疫苗效力研究是基于O.denticanis B106感染组的骨丢失百分比。用以下疫苗抗原和RIBIMPL+TDM佐剂接种小鼠对A-B组，仅用PBS；或对C组，用福尔马林灭活的P.gulae B43。对A组用PBS；或对B-C组，用1％羧甲基纤维素中的O.denticanis B106攻击小鼠。
图18是显示利用FimA特异性ELISA的用重组P.gulae B43 FimA或盐水接种的小鼠的血清学结果图。16只小鼠每只用盐水(A)或rFimA/QuilA/胆固醇(B)接种。通过FimA特异性ELISA检测收集的血清的FimA-特异性抗体。检测的最小稀释度是1∶100。在该稀释度产生阴性结果的任何样品的滴定度是50。
图19是显示利用OprF特异性ELISA的用重组P.gulae B43OprF或盐水接种的小鼠的血清学结果图。16只小鼠每只用盐水(A)或rOprF/QuilA/胆固醇(B)接种。通过OprF特异性ELISA检测收集的血清的OprF-特异性抗体。检测的最小稀释度是1∶100。在该稀释度产生阴性结果的任何样品的滴定度是50。
图20是显示在攻击0、6和12周后的骨丢失的图。T01组为狗3559424、3592669、3672859、3673375和3691926；T02组为狗3389600、3628884、3653552、3657396、3690164。
图21是显示在攻击后0、3、6、9和12周T01组(接种并攻击，或Vx/Ch)、T02组(假接种并攻击，或非-Vx/Ch)和T03(假接种和假攻击，或非-Vx/非-Ch)的骨反应评分的图。也标明了治疗效果的统计学显著性。
图22是显示在攻击后0、3、6和9周T01(Vx/Ch)、T02(非-Vx/Ch)和T03(非-Vx/非-Ch)的骨反应评分。标明了T01和T02组之间的统计学显著性。
图23A-23D是在攻击后0(23A)、3(23B)、6(23C)和9(23D)周T01(Vx/Ch)组中的单个狗的放射照相图。图23E-23H是在攻击后0(23E)、3(23F)、6(23G)和9(23H)周T02(非-Vx/Ch)组中的单个狗的放射照相图。
图24A-24C是显示T01(Vx/Ch)和T02(Non-Vx/Ch)组的平均系统反应的图；评分是基于每一个组中的所有狗的身体活动水平的等级评估。图24D-24F是显示T01(Vx/Ch)和T02(非-Vx/Ch)组的平均局部反应的图；评分是基于每一个组中的所有狗的注射位点处肿胀水平的等级评估。
发明详述细菌分离株本发明提供了分离的厌氧细菌，其通过它们的16S rRNA DNA序列鉴别，所述的细菌在伴侣动物中引起牙周病和多种其它疾病和临床表现。更具体地是，细菌选自卟啉单胞菌属。
优选地，本发明的分离的细菌包括P.gulae B43、犬口腔卟啉单胞菌B46、牙周卟啉单胞菌B52、P.gulae B69、牙周卟啉单胞菌B97、犬齿龈液卟啉单胞菌B98、唾液卟啉单胞菌B104、O.denticanis B106和牙髓卟啉单胞菌B114，尽管本发明也包含其它菌种或菌株。在一个优选的实施方案中，本发明的分离的细菌可以通过它们的SEQ IDNo.86-94中显示的16S rRNA DNA序列鉴别。
本发明的细菌感染而引起的疾病包括(但不限于)伴侣动物牙周病、伴侣动物口腔恶臭(口臭)、牛腐蹄病、犬冠心病和犬全身感染。卟啉单胞菌属中的细菌也与多种人的疾病相联系，包括冠心病、腮腺炎、口臭、龈炎、牙周病、中风、动脉粥样硬化、高脂血症、细菌性阴道病、子宫内发育迟缓(IUGR)和增加的发生率的低出生体重婴儿早产。
本发明提供卟啉单胞菌属的分离的多核苷酸和分离的多肽分子。更特别地，本发明提供分离的具有卟啉单胞菌属fimA和oprF基因或其简并变体的核苷酸序列的多核苷酸分子，以及提供分离的具有分别由这些基因编码的FimA和OprF蛋白的氨基酸序列的多肽分子。
本发明也提供多核苷酸序列，所述的序列与任一SEQ ID NO95-102和111-119具有至少约90％同源性，优选至少约95％，并最优选至少99％的序列一致性，所述的序列一致性是用任何已知的标准一致性算法测定。而且，本发明提供了多核苷酸序列，所述的多核苷酸序列在严格条件下杂交至SEQ ID NO95-102和111-119中显示的任意多核苷酸序列的互补序列。
在另一特定的实施方案中，提供了一种核酸，所述的核酸在高度严格条件下，杂交至SEQ ID No.86-102和111-119中描述的任何多核苷酸序列或它们的互补序列上。以实例的方式并且不用于限制，使用这种用于多于90个核苷酸的杂交区域的高度严格条件的程序如下。含有DNA的过滤物的预杂交在缓冲液中65℃下过夜进行8小时，所述的缓冲液由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/mL变性的鲑精DNA组成。在含有100μg/mL变性的鲑精DNA和5-20×106cpm的32P-标记的探针的预杂交混合物中将过滤物在65℃杂交48小时。过滤物的洗涤在含有2×SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液中于37℃下进行1小时。随后在50℃下0.1×SSC中洗涤45分钟，然后进行放射自显影。
其它可以使用的高度严格条件取决于核酸的性质(例如长度、GC含量等)以及杂交的目的(检测、扩增等)并且是本领域所周知的。
例如，约15-40个碱基的寡核苷酸与互补序列在聚合酶链式反应(PCR)中的严格杂交是在以下条件下进行50mM KCl的盐浓度、10mM Tris-HCl的缓冲液浓度、1.5mM的Mg2+浓度、7-7.5的pH值以及55-60℃的退火温度。在一个优选的特定的实施方案中，杂交后，洗涤条件如下。每个膜洗涤两次，每次30分钟，每次在40mM磷酸钠，pH7.2、5％SDS、1mM EDTA、0.5％牛血清白蛋白中于45℃下进行，随后洗涤四次，每次在磷酸钠，pH7.2、1％SDS、1mM EDTA中进行30分钟。对于高度严格杂交，另外将膜接受四次洗涤，每次在55℃下40mM磷酸钠，pH7.2、1％SDS、1mM EDTA中进行30分钟，随后在65℃下磷酸钠，pH7.2、1％SDS、1mM EDTA中进行4次洗涤，每次30分钟。
本发明进一步提供疫苗和疫苗制剂，当以治疗有效量施用至伴侣动物时，其可用于治疗或预防(即赋予抵抗力)伴侣动物中的牙周病。
在一个实施方案中，本发明提供了疫苗，所述的疫苗包含至少一种减毒的(改良的活的)或灭活的全细胞卟啉单胞菌属制剂(菌苗)。在一优选的实施方案中，本发明提供疫苗，所述的疫苗含有至少三种卟啉单胞菌属菌种的灭活的全细胞制剂，例如P.gulae B43、唾液卟啉单胞菌B104和O.denticanis B106的组合。细菌细胞可以用多种试剂灭活，例如福尔马林、二乙烯亚胺(BEI)或β-丙内酯。优选地，将福尔马林用作灭活剂。
在另一实施方案中，疫苗含有能诱导免疫应答的卟啉单胞菌属亚单位级分。
在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗含有一种或多种亚单位多肽或其片段或变体，或含有一种或多种分离的多核苷酸序列或其片段或变体。
减毒的(改良的活的)或灭活的疫苗(菌苗)，或分离的亚单位多肽，或分离的多核苷酸可与其它已知的疫苗制剂成分，例如与兼容的佐剂、稀释剂或载体组合。
定义和缩写术语“ORF”指“开放阅读框”，即基因的编码区。
用于核酸序列和多肽序列的术语“序列一致性百分比”是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列确定的，其中最佳比对提供了最高级别的匹配并可以将核苷酸或氨基酸引入检测或参照序列。百分比一致性是通过计算在整个序列每个位置上检测序列和参照序列之间相同的核苷酸的百分率来测定。最佳的序列比对和百分比一致性可以手动确定，或更优选地通过计算机算法测定，所述的计算机算法包括但不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、GAP、BESTFIT和CLUSTALW(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-10；Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)2444-8；Thompson等，1994，Nucleic Acids Res.22(22)4673-80；Devereux等，1984，Nuc.Acids.Res.12387-395；Higgins，等，1996，Methods Enzymol.266383-402)。优选地，将设置为默认参数的NCBI Blast Server(http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov)用于搜索多个数据库寻求同源序列。
术语“异源的”，当在此使用时表示源于不同的菌种或菌株。
术语“同源性”、“同源的”等等，当在此使用时表示多核苷酸或多肽序列之间具有的一致性程度。
术语“同源的”，当用于菌种时表示相同的细菌种或菌株。
术语“宿主细胞”，当在此使用时表示含有质粒、病毒或其它载体的细菌或真核细胞。
术语“分离的”当在此使用时表示从其天然存在的环境移开，或者是单独的或在异源宿主细胞或染色体或载体(例如质粒、噬菌体等)中。
术语“分离的厌氧细菌”、“分离的细菌”、“分离的细菌菌株”等指其中细菌基本无其它微生物的一种组合物，例如，在培养物中，例如当从其天然存在的环境分离时。
术语“分离的多核苷酸”指一种组合物，其中分离的核苷酸以重量计占至少50％的组合物。更优选地，分离的多核苷酸占约95％，以及更优选地占99％重量的组合物。
术语“分离的多肽”指一种组合物，其中分离的多肽以重量计占至少50％的组合物。更优选地，分离的多肽占约95％，以及更优选地占99％重量的组合物。
如在此使用的术语“功能等价物”指能由抗体识别的重组多肽，所述的抗体特异于由在伴侣动物中引起牙周病的细菌产生的天然的多肽，或指能激发或引起与来自内源细菌的天然蛋白引起的基本相似的免疫学应答的重组多肽。因而，产生来对抗功能等价多肽的抗体也识别由在伴侣动物中引起牙周病的细菌产生的天然多肽。
术语“免疫原性”指蛋白质或多肽激发特异性对抗在伴侣动物中引起牙周病的细菌的免疫反应的能力。
术语“抗原性”指蛋白质或多肽被产生来对抗该蛋白质或多肽的抗体免疫特异性结合的能力。
如此处使用的，术语“抗体”指能结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以是多克隆混合物或单克隆。抗体可以是源于天然来源或源于重组来源的完整的免疫球蛋白或可以是完整的免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以存在于多种形式，包括例如Fv、Fab’、F(ab’)2以及以单链存在。
如此处使用的，术语“伴侣动物”指认为是宠物的圈养的任何非人动物。这可以包括(但不限于)狗、猫、马、绵羊、兔、猴和啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和白鼬)。
术语“保护”、“保护性的”等等，如此处使用关于疫苗时，表示该疫苗预防或减少由生物体引起的疾病的症状，其中用于该疫苗的抗原来源于所述的生物体。术语“保护”和“保护性的”等等，也表示疫苗可用于“治疗”已经存在于受试者中的疾病或该疾病引起的一种或多种症状。
术语“治疗有效量”指一定量的细菌或其亚单位(例如，多肽或多核苷酸序列)以及其组合，所述的量足够在施用其的受试者中引发免疫应答。免疫应答可以包括(但不限于)细胞和/或体液免疫的诱导。
术语“预防感染”指预防或抑制在伴侣动物中引起疾病的细菌的复制、抑制该细菌的传播，或防止细菌在其宿主中自身发展，或减轻由感染引起的疾病的症状。如果细菌负载(bacterial load)减少则认为治疗是治疗性的。
术语“可药用载体”指载体介质，其不干扰活性成分的生物学活性的效力并且对施用其的受试者没有毒性。
术语“治疗剂”指任何分子、化合物或治疗物，优选抗菌分子或化合物，其有助于治疗细菌感染或由此引起的疾病或病状。
术语“其片段或变体”指根据本发明的部分核苷酸或氨基酸序列。优选地，本发明提供的多肽的片段或变体能在伴侣动物中引发体液和/或细胞免疫应答。类似物包含于术语“其片段或变体”中。可以具有一个或多个突变的突变体多核苷酸包含于术语“其片段或变体”内，其中所述的突变是核苷酸残基的缺失、插入或取代。等位基因变体包含于术语“其片段或变体”中。
卟啉单胞菌属物种的分离和鉴定本发明提供的细菌可以使用已知的采样、培养和分离技术获得。例如，微生物样品可以从一群表现牙周病的伴侣动物获得，例如从狗和猫上获得。牙周病的迹象可用已知的测量方法观测，例如牙周袋＞3mm的狗和牙周袋＞2mm的猫患有牙周病。用于鉴定牙周病的已知参数例如牙指数(牙龈指数和牙周指数)和牙周袋深度可用于测定伴侣动物的样品菌群。单独的样品可以从特定动物的牙周袋获得，保存于缺氧条件下并用多种已知的培养基培养。
临床分离种可用已知的技术鉴定，例如多种生化检测以及16SrRNA DNA序列分析用以测定它们的属和种。可将单独的菌种转移至盘上并将抗生素盘(antibiotic disk)(Anaerobe Systems)置于琼脂表面上以确定每种菌种的抗生素抗性模式。也可让纯化的菌落接受已知的吲哚和过氧化氢酶试验(Anaerobe Systems)。可测定单独菌种的脂酶和卵磷脂酶模式。
菌种可以基于它们的16S rRNA DNA序列分类。单独的、彻底分离的菌落可用作16S rRNA区的聚合酶链式反应(PCR)扩增的模板，所述的PCR扩增使用例如引物D0056和D0057(Seq.ID NO.1和Seq.IDNO.2；表1)。得到的PCR产物可用提供的PCR制备试剂盒(Promega公司；Madison，WI)纯化并通过分离而收集。然后可将纯化的PCR产物脱盐并让其接受DNA序列分析。得到的DNA序列可用于搜索可利用的DNA数据库。然后基于通过数据库搜索确定的最接近的匹配来对该细菌菌种分类。
表1.DNA序列鉴定表。所有寡核苷酸引物通过Gibco-BRL(USA)或Lark Technologies公司(USA)合成。









































注意小写字母核苷酸不存在于靶标DNA序列中。它们加在引物的5’区以助于克隆。NA，不适用下面的伴侣动物牙周菌种在2001年8月9日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA，20110，USAP.gulae B43(PTA-3618)、犬口腔卟啉单胞菌B46(PTA-3619)、牙周卟啉单胞菌B52(PTA-3620)、P.gulae B69(PTA-3621)、牙周卟啉单胞菌B97(PTA-3622)、犬齿龈液卟啉单胞菌B98(PTA-3623)、唾液卟啉单胞菌B104(PTA-36 24)、O.denticanis B106(PTA-3625)和牙髓卟啉单胞菌B114(PTA-3626)。在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸分子具有选自SEQ ID NO86-102和111-119的核苷酸序列。本发明的优选多肽具有选自SEQ ID NO103-110和120-128的氨基酸序列。
卟啉单胞菌核酸序列的克隆有数种已知的方法和技术可用于克隆本发明的卟啉单胞菌核酸序列。例如，可将序列作为限制性片段分离并克隆入克隆和/或表达载体，可将序列进行PCR扩增并克隆进克隆和/或表达载体，或可通过这两种方法的组合克隆序列。
本领域已知的并且没有明确描述的标准分子生物学技术一般可以按照如在Sambrook等，Mollecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1989)；Ausubel等，Current ProtoCols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等，Recombinant DNA，Scientific American Books，New York；Birren等(eds)Genome AnalysisA Laboratory Manual Series，Vols.1-4Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)中描述的以及在美国专利No.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中列出的方法学来进行。聚合酶链式反应(PCR)一般如在PCR ProtoColsA Guide To Methods And Applications，AcademicPress，San Diego，CA(1990)中描述的进行。
在实施例中提供了用于本发明的多核苷酸的克隆和测序的方法的实例。
fimA和oprF-编码的多肽和蛋白质本发明包括使用原核和真核表达系统(包括载体和宿主细胞)，其可以用于表达由本发明的核苷酸序列表达的截短和全长(天然蛋白质)形式的重组多肽。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸分子具有选自SEQ ID NO95-102和111-119的序列或其简并变体的其中一种的核苷酸序列；并且编码分别选自SEQ ID NO103-110和120-128的氨基酸序列的相应多肽。
多种宿主-表达载体体系可用于表达本发明的多肽。这种宿主-表达体系也表示载体，通过所述的载体可以克隆并随后纯化感兴趣的编码序列。本发明进一步提供宿主细胞，当用合适的载体或核苷酸序列转化或转染时，所述的宿主细胞表达编码的本发明的多肽基因产物。这种宿主细胞，包括但不限于，用含有编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的微生物例如细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有基因产物编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如糖酵母(Saccharomyces)、毕赤氏酵母(Pichia))；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞体系；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞体系；或容纳重组表达构建体的哺乳动物细胞体系(例如COS，CHO，BHK，293，3T3)，所述的构建体含有源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒后期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
在一个优选的实施方案中，表达体系是细菌体系。取决于要表达的产物可便利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量的这种多肽，用于产生疫苗组合物或用于产生抗体时，例如指导容易纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体是理想的。优选地，载体含有指导可诱导基因表达的启动子。合适的载体包括(但不限于)大肠杆菌pET表达载体(Studier和Moffatt，1986，J.Mol.Biol.189113；Rosenberg等，1987，Gene 56125-135；Novagen，Madison，Wisconsin)其中编码序列可以与编码多个组氨酸残基的序列按读码框融合；pBAD载体(Guzman等，1995，J.Bact.177412-4130)，在阿拉伯糖诱导蛋白质控制下从该载体表达异源蛋白质；以及pGEX载体(PharmaciaBiotech，USA)，用于将异源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。可将本发明的fim4或oprF序列克隆进λ表达载体并在λ-细菌菌株中表达。在一优选的模式中，细菌菌株是大肠杆菌BL21(Gibco-BRL，USA)。优选地，可使用的载体包括(但不限于)pLEX表达载体(LaVallie等，1992，Bio/Technology 11187-193；Mieschendahl等，1986，Bio/Technology 4802-808；Invitrogen)和pRIT2T表达载体(Nilsson等，1985，EMBO 41075；Zabeau和Stanley，1982，EMBO 11217；Pharmacia Biotech)。可使用其它载体和细菌菌株并且为本领域人员熟知。
抗体产生抗体可以是单克隆的、多克隆的或重组的。便利地，可通过对抗免疫原或其片段而制备抗体，例如基于序列的合成肽，或通过克隆技术重组制备和/或天然的基因产物和/或其部分可以分离并用作免疫原。免疫原可用于通过本领域技术人员周知的标准抗体产生技术来产生抗体，所述的标准技术是如一般在Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY，1988和Borrebaeck，Antibody Engineering-APractical Guide，W.H.Freeman and Co.，1992中描述的。
抗体片段也可通过本领域技术人员已知的技术从抗体制备并包括Fab、F(ab′)2和Fv。在抗体的产生中，可通过本领已知的免疫学中的标准技术完成对期望的抗体的筛选。没有明确描述的技术一般是按照Stites等，(eds)，Basic and Clinical Immunology(8th Edition)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)以及Mishell和Shiigi(eds)，Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Fr eeman and Co.，New York(1980)中描述的进行。一般而言，ELISA和蛋白质印迹法是优选类型的免疫测定法。这两种测定法是本领域技术人员所熟知的。多克隆和单克隆抗体可用于这些测定法。可将抗体结合至固体支持基质上或与可检测部分缀合或既可以结合又可以缀合，这是本领域周知的(对于荧光或酶部分的缀合的一般性讨论，参见Johnstone&Thorpe，Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1982)。抗体与固体支持基质的结合也是本领域所熟知的(对于一般性讨论，见Harlow&Lane AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Publications，New York，1988和Borrebaeck，Antibody Engineering-A Practical Guide，W.H.Freeman and Co.，1992)。考虑用于本发明的可检测部分可以包括(但不限于)荧光、金属、酶和放射性标记，例如生物素、金、铁蛋白、碱性磷酸酶、b-半乳糖苷酶、过氧化物酶、脲酶、荧光素、罗丹明、氚、14C和碘化作用。
如果合适，可使用其它免疫测定法例如放射性免疫测定(RIA)，这是本领域已知的。可利用的免疫测定法广泛地描述于专利和科技文献中。参见，例如，美国专利No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521，以及Sambrook等，MolecularCloningA Laborratory Manual，Cold Springs Harbor，New York，1989。
检测、诊断和预防试剂盒本发明进一步提供用于检测卟啉单胞菌的试剂盒。试剂盒包括用于分析样品中本发明的卟啉单胞菌生物体、多肽或卟啉单胞菌核苷酸序列存在的试剂，其中核苷酸序列的存在指示生物体的存在。该方法是有价值的，因为可以在症状存在前诊断疾病并因而可以在对患者产生损害前预防疾病发作。卟啉单胞菌细菌、多肽或核苷酸的存在可以用抗体、PCR、杂交和其它本领域技术人员已知的检测方法测定。
在一个实施方案中，试剂盒提供用于检测对抗卟啉单胞菌的抗体的试剂。在某些实施方案中，试剂盒可包括一份印刷的说明书或标签，说明该试剂盒可用于检测卟啉单胞菌。最低限度，试剂盒在至少一个容器中含有一种蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列含有SEQ ID NO103-110和120-128的任意多肽的至少30个连续的氨基酸。在一个实施方案中，试剂盒进一步含有第二种抗体。在一个优选的实施方案中，第二种抗体缀合在可检测部分上，例如催化比色或化学发光反应的酶(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)。在一个进一步的实施方案中，试剂盒含有用于进行比色或化学发光测定的试剂。
在另一个实施方案中，试剂盒提供用于检测对抗卟啉单胞菌核酸的试剂。在一个实施方案中，试剂盒提供了用于卟啉单胞菌核酸的PCR检测的试剂并在至少一个容器中含有第一种分离的DNA分子，所述的DNA分子含有至少约15、20、25或30个核苷酸的片段，所述的片段在严格条件下杂交至编码一种多肽的DNA分子上，其中所述的多肽含有SEQ ID NO103-110或120-128的任意多肽的至少5、10、15、20、25或30个连续氨基酸的序列或其全长氨基酸序列，所述试剂盒还含有第二种分离的DNA分子，所述的DNA分子含有至少约15、20、25或30个核苷酸的片段，所述的片段在严格条件下杂交至一种DNA分子上，所述的DNA分子互补于编码一种多肽的DNA分子，其中所述的多肽含有SEQ ID NO103-110或120-128的任意多肽的至少5、10、15、20、25或30个连续氨基酸的序列或其全长氨基酸序列，所述的第一种和第二种DNA分子可用于特异性地扩增编码16S rRNA的卟啉单胞菌核酸，其中所述的16S rRNA由选自SEQ ID NO1-9的DNA分子编码。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒在至少一个容器中含有一种分离的DNA分子，所述的DNA分子含有至少约15个连续的选自任意SEQ ID NO86-94、95-102和111-119的核苷酸的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列在高度严格条件下杂交至SEQ ID NO86-94、95-102和111-119中描述的任意核苷酸序列的互补序列，所述试剂盒还在第二个容器中含有第二种分离的DNA分子，所述的DNA分子含有至少约15个连续的选自SEQ ID NO86-94、95-102和111-119中描述的任意核苷酸序列的互补序列的核苷酸的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在高严格条件下杂交至SEQ ID NO86-94、95-102和111-119中描述的任意核苷酸序列，其中该试剂盒进一步包含一份说明书，说明该试剂盒可用于检测卟啉单胞菌。
疫苗制剂和施用的方法本发明的疫苗可以以有效量施用给伴侣动物，这样该疫苗治疗性地治疗或赋予抗性或预防伴侣动物中的牙周病。本发明的疫苗可用于控制引起牙周病的细菌。本发明的疫苗特别是可用于兽医学领域来治疗伴侣动物和用于维护公共健康，以对抗已知引起牙周病的这里描述的那些细菌。
本发明的疫苗可用于控制人和伴侣动物中的有害的或传播疾病或作为疾病载体的细菌，例如这里描述的细菌。本发明的疫苗特别可用于控制存在于伴侣动物中的细菌，为此目的可使用任何已知的施用方法(包括但不限于口服、肠胃外、鼻内、皮下或局部施用方法)施用这些疫苗。
根据本发明的进一步方面提供了一种组合物，所述的组合物含有与相容的佐剂、稀释剂或载体混合的本发明的疫苗。在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗制剂由含水混悬液或溶液组成，所述的混悬液或溶液含有至少一种本发明的细菌和/或至少一种亚单位蛋白质，优选在生理pH下缓冲，存在于现成可注射的形式。在另一优选的实施方案中，本发明的疫苗制剂由至少三种卟啉单胞菌(例如P.gulaeB43、唾液卟啉单胞菌B104和O.dentiCanis B106)的灭活的全细胞制剂组成。
本发明进一步提供了治疗或预防细菌感染的方法，所述的方法包括用治疗有效量的本发明的疫苗或疫苗制剂进行治疗。应该理解，治疗包括预防以及对细菌感染确定的症状的缓和。
本发明的疫苗和疫苗制剂可用于诱导应答，该应答防止由引发牙周病的细菌引起的牙周病的病理学变化特征。在一种疫苗制剂中，期望将免疫原性量的细菌、纯化的蛋白质、核酸或它们的组合与合适的常规疫苗佐剂和生理性赋形剂混合，以用于哺乳动物。
用于在伴侣动物中预防牙周病的疫苗制剂可以使用至少一种分离的并纯化灭活的或减毒的细菌、纯化的多肽(例如天然蛋白质、亚单位蛋白质或多肽)并与一种或多种相容佐剂、稀释剂或载体混合而产生。优选地，多肽序列是选自FimA(SEQ ID NO103-110)和OprF(SEQID NO120-128)的亚单位蛋白质。
可用于诊断性多肽或用于疫苗制剂的FimA和OprF的片段的实例包括(但不限于)ACNKDNEAEPVV、YPVLVNFESNNYTYTGDAVEK、TGPGTNNPENPITESA、NDNNNKDFVDRLGA、DLNGQINRLRREVEELSKRPVSCPECPDV和ADPTGDTQYNERLSERRAKAV(SEQ IDNO129-134)。亚单位蛋白质可以经重组表达，或者是单独表达或融合至另一多肽序列或蛋白质而表达。另一多肽序列或蛋白质可以包括(但不限于)例如多-His标签、MBP、硫氧还蛋白或GST。本发明也提供的是编码任意上述亚单位蛋白质的多核苷酸序列或基因。细菌的多核苷酸序列可选自fimA和oprF或其片段或变体，所述的片段或变体表现出与其至少约90％、95％或99％的同源性，或选自在高度严格条件下杂交的互补的核苷酸序列，或两者的组合。优选地，本发明的多核苷酸序列可用于扩增本发明的fimA或oprFDNA分子，或编码氨基酸片段，然后可将其用于产生对抗FimA或OprF的抗体。
对于基于DNA的疗法，可以使用能将异源核酸递送或转移进宿主细胞中的载体。表达载体可以包括元件来以本领域已知的细胞选择性方式控制核酸的靶向、表达和转录。表达载体可以包括用于控制异源物质的转录的启动子并既可以是组成型启动子又可以是诱导型启动子而使得能选择性转录。可任选包括获得必要的转录水平可能所需的增强子。
通过多种本领域已知的方法可将载体介导进入细胞或组织。在Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSprings Harbor Laboratory，New York(1989，1992)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Chang等，Somatic Gene THerapy，CRCPress，Ann Arbor，MI(1995)；Vega等，Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)；R.L.Rodriguez VectorsA Survey ofMolecular Cloning Vectors and Their Uses，Butterworths，BostonMA(1988)中的一般性描述中可以找到这些方法，并包括例如，稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔法以及用重组病毒载体感染。
本发明进一步提供了组合疫苗，所述的疫苗具有至少一种本发明的灭活的或减毒的细菌、核苷酸序列或多肽序列，其与一种或多种额外的免疫原性成分组合。这种组合疫苗在接种的动物中可以产生比通过把单独施用每种成分的效果的简单加和所期望的效果出乎意料地大的效果。因而，组合疫苗可以在动物中刺激抗体的协同产生。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合疫苗由至少三种卟啉单胞菌(例如P.gulae B43、唾液卟啉单胞菌B104和O.denticanis B106)的灭活的全细胞制剂组成，并与一种或多种额外的细菌或病毒的免疫原性成分组合。适合用于本发明的组合疫苗的额外的免疫原性成分包括(但不限于)犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒-2(CAV-2)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPI)和犬冠状病毒(CCV)。
本发明的疫苗可以通过将至少一种本发明的灭活的或减毒的细菌、核苷酸序列或多肽序列与可药用载体，以及优选地，佐剂组合而得以制备。
本发明疫苗的合适的制剂包括注射剂，或者是液体溶液或者是悬液。也可以制备在注射前适于溶解于或悬浮于液体可药用载体中的固体形式。可将疫苗制剂乳化。优选将活性的免疫原性成分与佐剂混合，所述的佐剂是可药用的并与该活性免疫原性成分相容。合适的佐剂包括(但不限于)矿物胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，例如溶血卵磷脂；糖苷类，例如，皂甙衍生物如Quil A或GPI-0100(美国专利No.5,977,081)；阳离子表面活性剂，例如DDA、pluronic多元醇；聚阴离子；非离子嵌段聚合物，例如Pluronic F-127(B.A.S.F.，USA)；肽；矿物油，例如Montanide ISA-50(Seppic，Paris，France)、卡巴普、Amphigen(Hydronics，Omaha，NE USA)、Alhydrogel(SuperfosBiosector，Frederikssund，Denmark)油乳剂，例如矿物油(如BayolF/ArlacelA)和水的乳剂，或植物油、水和乳化剂(如卵磷脂)的乳剂；明矾、胆固醇、rmLT、细胞因子及其组合。也可将免疫原性成分整合进脂质体中，或将其缀合至多糖和/或其它聚合物上用于疫苗制剂。可以包括在用于本发明方法的产物中的额外的物质包括(但不限于)一种或多种防腐剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)的二钠盐或四钠盐、硫柳汞等等。
接受疫苗施用的受试者优选是伴侣动物，更优选地是狗或猫。
优选的是，本发明的疫苗，当在疫苗制剂中时，存在于单位剂量形式。为本发明目的，免疫原性的量，当施用时含有约1×104-1×1013个灭活的细菌细胞、0.1μg-1mg的纯化蛋白质或0.1μg-10mg的核酸。在含有多种成分的疫苗制剂中，可有效地采用相同的或较少的免疫原性的量。
合适的治疗有效的剂量可由本领域技术人员方便地确定，所述的确定是基于上面的免疫原性的量、要治疗的状况以及动物的生理学特征。因此，疫苗制剂提供一剂量的免疫原性的量的活性成分的无菌制剂，其中该活性成分是至少一种细菌、蛋白质、核酸或它们的任意组合。存在额外的活性剂时，这些单位剂量可以通过本领域技术人员容易地调整。
理想的给药方案包括施用至少一剂量的期望的疫苗组合物，其中每部分的抗原含量是如上面说明的。本发明疫苗的有效剂量(致免疫剂量)也可以从源于模型试验体系的剂量-反应曲线外推得来。本发明疫苗的施用模式可以是将该疫苗递送至宿主的任何合适的途径。这些途径包括(但不限于)口服、皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、鼻内途径，以及通过划痕法(划过皮肤的上层，例如用分叉的针)。然而，疫苗优选经皮下施用或通过肌肉内注射施用。如果需要，也可以采用其它施用模式，例如经皮内、经静脉内、经鼻内或经扁桃体内的模式。
研究已经显示，对于每种上述的疫苗组合物，理想的是对幼小动物(8周大后)进行初次免疫，在12周和16周大后施用加强剂量。建议每年再接种。
本发明的疫苗根据好的医学实践，考虑个体受试者的临床情况、施用的位点和方法、施用的方案、受试者的年龄、性别、体重和医学从业者已知的其它因素来施用和给药。
本发明进一步提供用于在伴侣动物中预防牙周病的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒提供含有治疗有效量的组合物的容器，所述的组合物在伴侣动物中预防牙周病。在相同或不同的容器中也提供的是可用于组合物中的可药用载体。试剂盒可额外包括佐剂，所述的佐剂可用于帮助产生对本发明组合物的反应。而且，试剂盒可以包括分配器(dispenser)，所述的分配器用于分配组合物，优选以单位剂量形式分配。分配器可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩。试剂盒可以带有标签或打印的说明书，其描述了施用组合物用于在伴侣动物中预防牙周病。也可以制备含有配制于可药用载体中的本发明疫苗组合物的组合物，将其置于合适的容器中，贴上标签说明用于治疗指出的牙周病。
疫苗效力的测定由本发明的疫苗和疫苗组合物诱导的特定的保护机制是在接种的动物中诱导了抗体和/或细胞免疫应答，如通过下面描述的体内动物试验说明的。
本发明的细菌、多核苷酸、多肽、疫苗和疫苗组合物可用于治疗或预防伴侣动物的牙周病、牛腐蹄病、冠心病(狗)或全身感染(狗)。而且，本发明的组合物也可用于在伴侣动物中治疗或预防某些疾病，所述的疾病类似于人中的疾病，例如冠心(或血管或动脉)病、腮腺炎、口臭、龈炎、牙周炎、中风、动脉粥样硬化、高脂血症、增加的发生率的低出生体重婴儿早产、细菌性阴道炎和子宫内发育迟缓(IUGR)。
在本发明的进一步方面，本发明提供评估疫苗对抗动物中的一种或多种牙周病致病性细菌的效力的方法。本发明也显示，可以在动物物种例如小鼠或狗，特别是狗中评估对抗一种或多种牙周病致病性细菌的疫苗。
根据本发明，对抗多种牙周病致病性细菌的疫苗可以用上面描述的方法评估，所述的细菌包括(但不限于)卟啉单胞菌、拟杆菌、普雷沃氏菌属、TTannerella(Tannerella forsythensis，以前称为福赛斯拟杆菌)和密螺旋体属，所述的疫苗设计用于治疗或预防由这些细菌引起的人或伴侣动物中的牙周病。疫苗可以含有任何这些细菌菌种的灭活的或减毒的细菌、多肽或多核苷酸。
疫苗的效力可以通过将攻击培养物分别地引入至接种的动物和未接种的动物中，并比较这两者动物中的临床征兆。攻击培养物可由与疫苗相同的牙周病致病性细菌组成。然而，攻击培养物可含有不同于疫苗中的那些的细菌，用以评价该疫苗可能具有的对抗其它菌种的任何交叉保护。
根据本发明，理想的是将攻击培养物引入至牙根物质已经被除去了的动物牙齿的根管内，随后再放置上修复物。攻击的培养物通常含有每攻击剂量约1×102-约1×1012个菌落形成单位(CFU)；优选地为，每攻击剂量约1×105-约1×1010个菌落形成单位(CFU)；更优选地是每攻击剂量约5×107-约5×1010个菌落形成单位(CFU)。
可以评价的疾病的临床征兆包括龈沟液、牙菌斑、感染的骨或龈沟中一种或多种牙周病致病性细菌的增加的水平，或牙槽骨的量的变化，特别是根尖区域的牙槽骨的量的变化。骨的变化可以通过，例如放射照相测量法来定量。
本发明进一步通过下面的非限制性实施例和附带的附图来阐述。
实施例1伴侣动物的龈沟液样品微生物样品取自在做牙周治疗的兽医门诊检查的狗和猫，或在用于正常检查的Pfizer Terre Haute或Pfizer Sandwich机构处检查的狗。牙周袋＞3mm的狗和牙周袋＞2mm的猫包括在本研究内。记录齿指数(牙龈指数和牙周指数)和牙周袋深度。将单独的粗糙吸水纸尖(Henry Schein；Melville，NY)无菌操作插入进牙周袋内。一旦移开后，将该纸尖立即插入进小瓶中，所述的小瓶含有Pre-ReducedAnaerobically sterile(PRAS)Anaerobic Dental Transport(ADT)培养基(Anaerobe Systems；Morgan Hills，CA)。
将小瓶转移进Bactron IV厌氧培养室(Sheldon Manufacturing，Cornelius，OR)中并在90％N2、5％H2、5％CO2下处理。将该纸尖无菌操作置于50μl PRAS脑心浸液(BHI)培养基(Anaerobe Systems)中并搅动30秒钟。在BHI培养基中制备1∶100和1∶1000的稀释物。将100μl的1∶100和1∶1000稀释物的等份样品涂布于PRAS BurcellaBlood Agar(BRU)平板(Anaerobe Systems)上。在厌氧培养室中于37℃下孵育5-7天。将细菌菌落的总数和黑色厌氧细菌(BPAB)菌落的数目计数。将单个的BPAP菌落转移至新的BRU平板并如上再孵育。
临床菌种的鉴定将每种临床菌种接受多种生化分析和16S rRNA DNA序列分析，序列分析使用引物D0056和D0057(Seq.ID No.1和Seq.ID No.2；表1)，用以确定属和种。将单个的菌种在BRU平板上划线接种。将卡那霉素、万古霉素和多粘菌素E盘(Anaerobe Systems)放置在琼脂表面上以确定每种菌种的KVC抗性模式。也让纯化的菌落接受吲哚和过氧化氢酶试验(Anaerobe Systems)。将单独的菌种转移至卵黄琼脂(Egg Yolk Agar)(EYA)平板(Anaerobe Systems)上以便测定脂酶和卵磷脂酶产生模式。该数据显示于表2中。
表2.犬和猫BPAB分离株表征














缩写D，狗；C，猫；NA，不适用；ND，未确定；M，雄性；F，雌性；Y，是；N，否；P，阳性；Ne，阴性菌种可以基于它们的16S rRNA DNA序列分类。单独的、彻底分离的菌落可用作16S rRNA区的聚合酶链式反应(PCR)扩增的模板，所述的PCR扩增使用引物D0056和D0057(Seq.ID NO.1和Seq.ID NO.2；表1)，重复3次。PCR在50μl反应体积中进行，所述的反应体积含有1×PCR缓冲液(Life Technologies；Rockville，MD)、1.0mMMgCl2、1.25μM每种引物、300μM每种脱氧-NTP以及2.5U铂PfxDNA聚合酶(Life Technologies)。使用下列的PCR循环条件在94℃下两分钟变性；在94℃下变性40秒钟、60℃下退火40秒并在72℃下延伸1分钟，进行30个循环；最后的延伸步骤在72℃下进行2分钟；并最后的步骤冷却至4℃。GeneAmp 9700热循环仪(Perkin ElmerApplied Biosystems；Foster City，CA)用于全部的PCR扩增。
得到的PCR产物用PCR制备试剂盒(Promega公司；Madison，WI)纯化并通过分离收集。然后使用0.025μm硝酸纤维素滤膜通过用25ml的无菌水进行点滴分析进行脱盐。将纯化的、脱盐的PCR产物在ABI自动DNA测序仪(University of Texas Genetics Core Facility，Houston，TX and Lark Technologies Inc.，Houston，TX)上使用DyeDeoxy终止反应进行DNA序列分析。将合成的寡核苷酸引物D0056、D0057、PFZ175-AP1、PFZ175-AP2和PFZ175-AP3(分别是Seq.ID No.1-5；表1)用于获得双链DNA序列。将得到的DNA序列用于搜索公众可得的DNA数据库，所述的搜索使用从The National Center forBiotechnology Information，USA公开获得的BLAST-N程序。
基于通过数据库搜索确定的最接近的匹配来对细菌菌种分类。B106菌种没有精确的匹配，说明它可能代表新的细菌属/种。(见如下。)所有菌种以及它们各自的特性的完全清单位于表2中。前9个最频繁分离的菌株通过下列的菌种来作为例子P.gulae B43(狗样品Sandwich 4)、犬口腔卟啉单胞菌B46(狗样品VHUP 1B)、牙周卟啉单胞菌B52(猫样品VHUP 2A)、P.gulae B69(猫样品VHUP 3A)、牙周卟啉单胞菌B97(狗样品TH 1bC)、犬齿龈液卟啉单胞菌B98(狗样品TH 1aC)、唾液卟啉单胞菌B104(狗样品TH 1bC)、O.denticanis B106(狗样品TH 1bE)和牙髓卟啉单胞菌B114(狗样品TH 2bA)。菌种的分布显示于表3中。
表3.鉴定的含有标明的菌种的狗和猫的数目的概括。

上面列出的菌种代表最频繁鉴定的并存在于最高百分比的狗和猫中的那些菌种。
下面的伴侣动物牙周菌种在2001年8月9日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA，20110，USAP.gulae B43(PTA-3618)、犬口腔卟啉单胞菌B46(PTA-3619)、牙周卟啉单胞菌B52(PTA-3620)、P.gulae B69(PTA-3621)、牙周卟啉单胞菌B97(PTA-3622)、犬齿龈液卟啉单胞菌B98(PTA-3623)、唾液卟啉单胞菌B104(PTA-3624)、O.denticanis B106(PTA-3625)和牙髓卟啉单胞菌B114(PTA-3626)。
新属/种(Odoribacter denticanis)的鉴定在本研究过程中我们鉴定了众多临床菌种，所述的这些菌种的16S rRNA序列在可利用的数据库中不具有高度相似匹配，说明该细菌可能代表新的菌种。一群这些菌种看起来代表新的菌种。基于这里提出的数据，我们提议将这种新的菌种归属于一个新的属，称为Odoribacter gen.nov.。Odoribacter denticanis的典型株是菌株B106T(＝ATCC PTA-3625T；＝CNCM I-3225T)。
Odoribacter denticanis B106T是从未知年龄的患有牙周病的成年、杂种、雄性狗上分离的。纸尖样品是从下颌第一臼齿上获得的，该臼齿牙周袋为4mm深并且其牙龈指数为1。如上面描述的处理该样品。将纯化的细胞使用RapID ANA II临床试验试剂盒(Remel；Lenexa，KS)和Vitek Anaerobe Identification(ANI)card system(BioMerieux公司；Durham，NC)进行生化分析。简而言之，将在Brucella血琼脂平板上生长至汇合的细菌细胞再悬浮于McFarland#3等价物。将该悬液加至RapID ANA II测试孔中或Vitek ANI card上并在37℃下孵育4小时。孵育期过后，记录生化测试的结果。表4显示了O.denticanis B106T以及6个相关细菌的RapID ANA II试验的结果。
在用RapID ANA II试剂盒进行的18个试验中，仅两个(LGY和IND)对O.denticanis B106T为阳性。
相较而言，牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277、中间拟杆菌(Prevotella intermedia)ATCC 25611、Tannerella forsythensisATCC 43037、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)ATCC29148、脆弱拟杆菌ATCC 25285和内脏拟杆菌(Bacteroidessplanchnicus)ATCC 29572分别产生了5、4、10、12、9和8个阳性试验。
表4.O.denticanis B106T和相关菌株的RapID ANA II生化测试

*在每个试验中的活性成分URE，尿素；BLTS，对硝基苯基-β，D-二糖；αARA，对硝基苯基-α，L-阿拉伯糖苷；ONPG，邻硝基苯基-β，D-半乳糖苷；αGLU，对硝基苯基-α，D-葡糖苷；βGLU，对硝基苯基-β，D-葡糖苷；αGAL，对硝基苯基-α，D-半乳糖苷；αFUC，对硝基苯基-α，L-墨角藻糖苷；NAG，对硝基苯基-n-乙酰基-α，D-氨基葡萄糖苷；PO4，对硝基苯基磷酸酯；LGY，亮氨酰-甘氨酸-□萘基酰胺；GLY，甘氨酸-β-萘基酰胺；PRO，脯氨酸-β-萘基酰胺；PAL，苯基丙氨酸-β-萘基酰胺；ARG，精氨酸-□-萘基酰胺；SER，丝氨酸-β-萘基酰胺；PYR，吡咯烷酮基-β-萘基酰胺；以及IND，色氨酸。
缩写P，阳性；N，阴性；V，不定。
O.denticanis B106T、牙龈卟啉单胞菌ATCC 53977和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)亚种nucleatum ATCC 23726的生化反应模式用Vitek ANI card测定(表5)。O.denticanis B106T仅产生2个阳性试验(INDOL和TTZ)，而牙龈卟啉单胞菌ATCC 53977产生5个阳性试验(INDOL、PO4、NAG、BANA和TTZ)。RapID-ANA II和Vitek ANI card之间共有的12个试验中，全部产生相似的结果。使用Vitek提供的数据库，O.denticanis B106T菌种错误地鉴定为具核梭杆菌，置信水平为63％(数据没有显示)。这种错误的鉴定可能是由于在Vitek数据库中缺少兽医PAB菌种。
表5 O.denticanis B106T和相关菌株的Vitek ANI生化试验*。

*每个试验中的活性成分IND，色氨酸；PO4，对硝基苯基磷酸酯；PHC，对硝基苯基磷酸胆碱；ONPG，邻硝基苯基-β，D-吡喃半乳糖苷；AGAL，对硝基苯基-α，D-吡喃半乳糖苷；BGLU，对硝基苯基-β，D-吡喃葡糖苷；AGLU，对硝基苯基-α，D-吡喃葡糖苷；BGUR，对硝基苯基-β，D-葡糖醛酸苷；BLAC，对硝基苯基-β，D-乳糖苷；AMAN，对硝基苯基-α，D-吡喃甘露糖苷；AFUC，对硝基苯基-α，L-吡喃岩藻糖苷；BFUC，对硝基苯基-β，D-吡喃岩藻糖苷；BXYL，对硝基苯基-β，D-吡喃木糖苷；AARA，对硝基苯基-α，L-呋喃阿糖苷；NAG，对硝基苯基-N-乙酰基-氨基葡糖苷；BANA，N-苯甲基-DL-精氨酸对硝基苯胺；LEU，L-亮氨酸对硝基苯胺；PRO，L-脯氨酸对硝基苯胺；ALA，L-丙氨酸对硝基苯胺；LYS，L-赖氨酸对硝基苯胺；GGT，Y-谷氨酰对硝基苯胺；TTZ，三苯基四唑_；ADH，精胺酸；URE，尿素；GLU，葡萄糖；TRE，海藻糖；ARA，阿拉伯糖；RAF，reaffinose；XLY，木糖。
缩写+，阳性；-，阴性。
使用引物D134(SEQ ID NO.169)和D5 7(SEQ ID NO.2) 将来自O.den ticanis B106T的16S rRNA基因PCR扩增一式3份。将PCR产物收集、纯化、脱盐并接受直接的DNA序列分析。用O.denticanisB106T16S rRNA基因序列对位于National Center for BiotechnologyInformation的非-冗余核苷酸数据库的BLAST-N(Altschul等，1990)搜索表明，O.denticanis B106T菌种与拟杆菌属的成员相关。O.denticanis B106T16S r RNA基因序列最接近地与拟杆菌口腔克隆FX069(登记号AY134906)的16S rRNA基因序列相关，在1,465bp上显示96.3％的一致性。拟杆菌口腔克隆FX069是在定义HIV-阳性患者中与NUP相关的细菌菌种的研究中从患有坏死性溃疡性牙周炎(NUP)的人患者分离的(Paster，B.J.等，“Phylogeny of Bacteroides，Prevotella，and Porphyromonas spp.and related bacteria”，JBacteriol.(1994)，176725-732)。
使用CLUSTAL X 1.81版本软件(Thompsom，J.D.，等，“CLUSTALWimproving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting，positions-specific gappenalties and weight matrix choice”，Nucleic Acids Res.(1994)224673-4680)进行了基于16S rRNA基因序列的系统进化分析。使用邻近-连接法(Saitou，N.&Nei，M.“The neighbor-joining methoda new method for reconstructing phylogenetic trees.”Mol.Biol.Evol.(1987)4406-425)产生了系统树。用1000个重复进行Bootstrap分析。图1显示了O.denticanis B106T菌种的系统进化分析的结果。大多数属(卟啉单胞菌属、拟杆菌属、普雷沃氏菌属、Tannerella等)的位置与先前公开的噬纤维菌属-黄杆菌属-拟杆菌属(CFB)组的系统树(Paster等，1994；Sakamoto，M.等，“Reclassification of Bacteroides forsythus(Tanner等，1986)as Tannerella forsythensis corrig.，gen.nov.，comb.nov.”Int.J Syst.Evol.Microbiol.(2002)52841-849；Shah，H.N.&Collins，D.“Proposal for reclassification of Bacteroidesasaccharolyticus，Bacteroides gingivalis，and Bacteroidesendodontalis in a new genus，Porphyromonas.”Int.J Syst.Bacteriol.(1998)38128-131)一致。
O.denticanis B106T归于拟杆菌属的外类群(out-group)，所述的外类群包括B.splanchnicus(Werner，H.等，“A new butyricacid-producing Bacteroidess peciesB.splanchnicus n.sp.”Zentralbl.Bakteriol.(1975)231133-144)、数种口腔菌株和多种未培养的菌株。O.denticanis B106T和B.splanchnicus的分枝点处71.0％的bootstrap置信值表明了适度高的确定性，即这两种生物体相关。然而，存在有历史性的讨论，有关拟杆菌属内B.splanchnicus的位置(Paster等，1994；Shah等，1998)。Paster等建议B.splanchnicus可能代表新的属。Shah等指出，B.splanchnicus与卟啉单胞菌属的成员共有许多化学分类学特征。我们的数据与这种假设一致，因为B.splanchnicus/B.denticanis B106T组分支比拟杆菌属的组分支更靠近卟啉单胞菌属(图1)。
将来自25个额外的O.denticanis的犬临床菌种(表1)的16SrRNA基因的约580-bp的区域用如上描述的D56和D57引物进行PCR扩增。将PCR产物纯化并脱盐。然后测定PCR产物的DNA序列。发现来自O.denticani菌种的部分16S rRNA序列(SEQ ID NO.138-162)全部成簇为相同的或高度保守序列的组，这些族之间最大的分歧在所分析的区域上有97％的一致性。图2显示了O.denticanis菌种部分16S rRNA基因序列的系统进化分析的结果；选取来自每组相关序列的代表性菌种用于分析。基于这些观测，可以得出结论，即所有这些菌种是相同菌种的不同菌株。
也从猫获得了O.denticanis的临床菌株(表1)。使用D56和D57通过PCR从这些菌种扩增了上述的16S rRNA基因的相同的约580-bp的区域。将从纯化的PCR产物(SEQ ID NO.163-168)获得的DNA序列与从犬菌种获得的序列进行比对。比对结果表明猫的O.denticanis分离株是在狗中发现的相同种的不同菌株。
为了进一步分析O.denticanis B106T与卟啉单胞菌属的关系，我们用简并的PCR引物D122(SEQ ID NO.84)和D123(SEQ ID NO.85)(Invitrogen公司)PCR扩增fimA基因(重复三次)。将该PCR产物纯化、脱盐、收集并接受直接的DNA序列分析。使用FimA氨基酸序列对位于National Center for Biotechnology Information的非冗余多肽数据库进行BLAST-P搜索(Altschul等，1990)表明，O.denticanis B106TFimA蛋白质与来自卟啉单胞菌属的成员的FimA蛋白相关。图3显示了多种F imA蛋白序列的系统进化关系。O.denticanis B106T蛋白和卟啉单胞菌的数种I型菌毛蛋白之间存在十分强的关系(100％的bootstrap值)。
让O.denticanis B106T和Porphyromonas gulae B43接受扫描电子显微镜来测定细胞的形态学。简单地说，将改良的PYG培养基中的36-小时液体培养物在1800 X g下离心。用0.1M磷酸缓冲液(pH7.3)中的3％EM级戊二醛(Polysciences公司，Warrington，PA)代替培养基并在4℃下孵育1小时。然后将细胞在0.1M磷酸缓冲液(pH7.3)中洗涤两次并将其在室温下悬浮于缓冲了的1％四氧化锇(Polysciences公司，Warrington，PA)中1小时。在乙醇梯度中使样品脱水，通过将其浸没在六甲基二硅氮烷中15分钟进行最后的脱水，随后空气-干燥1小时。将样品安放在铝短柱(aluminum stub)上并在Polaron SEM autocoating unit(Polaron Intruments公司，Hatfield，PA)中用200_的金包被。用ISI，DS-130扫描电子显微镜(ISI公司，Tokyo，Japan)检测每个样品。用Noran 4485数字束流控制界面(digital beam control interface)(NoranIntruments，Inc.，U.S.A.)捕获图像。图4显示了P.gulae B43和O.denticanis B106T的扫描电子显微镜照片。P.gulae B43的短棍状的形态学(平均长为1.25μm)(图4A)是卟啉单胞菌属成员的典型特征。相较而言，O.denticanis B106T是纺锤状的，两端逐渐变细并且平均细胞长度为5.9μm(图4B)。在这些生长条件下O.denticanis B106T的形态学类似于Tannerella forsythensis的形态学(Tanner等，1986)。P.gulae和O.denticanis之间形态学的不同进一步支持O.denticanis位置在卟啉单胞菌属外。
卟啉单胞菌的培养条件因为用于卟啉单胞菌的标准生长培养基(脑心浸液(BHI)和碎肉碳水化合物(CMC)培养基)含有动物产品，这对疫苗产生是不利的，因而寻求不含有这些成分的生长培养基。对多种培养基组合物(有和没有加入氯高铁原卟啉和维生素K)支持生长的能力进行了试验，检验这种能力是否等价于BHI或CMC支持生长的能力。PYG-完全培养基和ME-完全培养基都支持P.gulae B43(PTA-3618)生长至等价于BHI(图5)支持的生长水平。由于其在发酵过程中产生高密度培养物的能力而选取PYG-完全培养基作为P.gulae B43(PTA-3618)生长培养基。该培养基含有以下成分3％植胨(Becton Dickinson；Cockeysville，MD)、0.3％酵母提取液(Becton Dickinson)、0.3％葡萄糖(Sigma公司；St.Louis，MO)、0.05％巯基乙酸钠(BectonDickinson)、0.5％氯化钠(Sigma公司)、5μg/ml氯高铁原卟啉(Sigma公司)(高压灭菌后加入)、0.5g/ml甲萘醌(Sigma公司)(高压灭菌后加入)和0.2％碳酸氢钠(Sigma公司)，pH7.0。
将P.gulae B43(PTA-3618)按常规在Bactron IV厌氧培养室(Shel Labs；Cornelius，OR)中的Brucella血琼脂平板(AnaerobeSystems)上或在完全PYG培养基或BHI中培养，所述的培养在90％N2、5％CO2下培养3-5天(平板)或24-48小时(液体培养物)。对于全细胞菌苗制剂，将P.gulae B43(PTA-3618)在BioFlo 3000生物反应器中培养，该培养使用5升的PYG完全培养基。在高压灭菌后立即喷射95-99.5％N2和0.5-5％CO2使得容器中的培养基变为厌氧环境。将减少的培养基用0.02％P.gulae B43(PTA-3618)储液接种并在37℃下培养，搅动速率为100rpm，通过自动加入NaOH使pH保持在7.0。在培养过程中定时用N2和CO2喷射该容器。36-48小时后在OD600为2.0-3.5时收集细菌细胞，这时细胞仍然处在对数生长。
小鼠中的临床分离菌株的致病性试验在小鼠牙周骨丢失模型中试验了9种分离菌株(P.gulae B43、犬口腔卟啉单胞菌B46、牙周卟啉单胞菌B52、P.gulae B69、牙周卟啉单胞菌B97、犬齿龈液卟啉单胞菌B98、唾液卟啉单胞菌B104、O.denticanis B106和牙髓卟啉单胞菌B114)的致病性。将3周大、年龄匹配的雄性Balb/c CyJ小鼠(Jackson Laboratories；Bar Harbor，ME)用于该研究，该小鼠估计重为14-15克。将小鼠圈养在正压的、隔开的笼子的小间内。在整个试验中，这种物种的标准食物颗粒和水随意提供。使用的草垫是粒状的Bed O’Cobbs，以将牙龈组织中的嵌塞最小化。收到动物后，将所有动物适应环境5-7天。为了减少竞争性口腔菌丛，将动物置于sulfamathoxazole和甲氧苄啶(10ml饮用水；分别是约2mg和0.4mg/ml)的混合物上10天，然后是5天的间歇期。血清样品取自每只小鼠的尾部静脉放血。通过管饲法用1％羧甲基纤维素中约1×1010cfu/ml的合适菌株的0.5ml悬液感染动物。将额外几滴滴入口腔中。再重复这种感染两次，总共3次(星期一、星期三和星期五)。
将试验的第1天定为第一次感染后的星期二。在第2天杀死所有动物。收集感染后的血清，其为微生物样品。撕开每只小鼠的颌骨、染色并在显微镜下对横骨丢失进行打分。重复进行打分3次以减少操作误差。将平均的骨丢失表示为平均骨丢失/位点/颌骨(单位mm)。结果的统计分析用SPSS Science公司(Chicago，IL)提供的Systat(版本9)、SigmaStat(版本2)和SigmaPlot(版本2000)进行。表6显示了开始的9个分离菌株的数字结果。
表6.小鼠牙周病致病性试验的概括。

在该模型中这些的每个都产生了统计显著的骨丢失。
图6用照片显示了净骨丢失。在14个上颌骨位点获得了平均的牙槽骨水平(牙骨质釉质界-牙槽骨嵴)(单位mm)，并测定了每个颌骨的平均值。对于每个试验组，加和每个颌骨的平均值并通过除以在该组中的动物的总数得到组的平均值。
图7用照片显示了净骨丢失的比较。在14个上颌骨位点获得了平均的牙槽骨水平(牙骨质釉质界-牙槽嵴)(单位mm)，并测定了每个颌骨的平均值。对于每个试验组，加和每个颌骨的平均值并通过除以在该组中的动物的总数得到组的平均值。通过从每个试验组减去假感染的平均值测定净骨丢失。该数据表示为阳性对照组(牙龈卟啉单胞菌53977)的百分比，该阳性对照组设置为100％。牙龈卟啉单胞菌W50是不佳地丝束蛋白化(fimbrinated)的菌株，其在该动物模型中具有减少的毒性。
这些数据表明，以下临床分离菌株能在牙周病的小鼠模型中产生高水平的骨丢失P.gulae B43(PTA-3618)、P.gulae B69(PTA-3621)、犬齿龈液卟啉单胞菌B98(PTA-3623)和O.denticanisB106(PTA-3625)。以下临床分离菌株在小鼠牙周模型中产生中等水平的骨丢失犬口腔卟啉单胞菌B46(PTA-3619)、唾液卟啉单胞菌B104(PTA-3624)和牙髓卟啉单胞菌B114(PTA-3626)。以下临床分离菌株在小鼠牙周模型中产生最小水平的骨丢失牙周卟啉单胞菌B52(PTA-3620)和牙周卟啉单胞菌B97(PTA-3622)。虽然在临床分离菌株之间观测到了不同量的骨丢失，应该注意到在每种情况中，观测到的骨丢失量相当地高于在假感染的小鼠中观测到的量。基于这些数据，可以得出结论，前面的9种临床菌株的每种都能单独或与其它细菌一起引起牙周病。
细菌细胞和基因组DNA的制备在37℃下在BHI或完全PYG中无氧培养细菌菌种48小时。通过离心将来自1-3ml培养物的细胞形成沉淀颗粒，在等体积的无氧PBS中洗涤一次，再离心，并再悬浮于1/10体积的无氧PBS中。
从5ml在37℃下BHI或完全PYG中厌氧培养48小时的细菌菌种培养物纯化基因组DNA。将Wizard基因组DNA提取试剂盒(Promega公司)用于全部的基因组DNA制备。
克隆来自临床分离菌株的Fimbrial基因使用以下PCR引物D0067(正向引物；Seq.ID No.6)、D0078(正向引物；Seq.ID No.8)、D0097(正向引物；Seq.ID No.9)、D0068(反向引物；Seq.ID No.7)和D0098(反向引物；Seq.ID No.10)的组合，从分离自前面10种临床分离菌株的基因组DNA PCR扩增fimA基因。PCR在50ul反应体积中进行，所述的反应体积含有1×PCR缓冲液(Life Technologies)、1.0mM MgCl2、1.25μM每种引物、300M每种脱氧-NTP以及2.5U铂pfx DNA聚合酶(LifeTechnologies)。使用下列的PCR循环条件在94℃下两分钟变性；在94℃下变性40秒钟、60℃下退火40秒，并在72℃下延伸1.5分钟，进行30个循环；最后的延伸步骤在72℃下进行5分钟；并且最后步骤冷却至4℃。GeneAmp 9700热循环仪(Perkin Elmer AppliedBiosystems；Foster City，CA)用于全部的PCR扩增。将扩增产物在1.2％E-gel(Invitrogen；Carlsbad，CA)上显影。
使用10单位的KlenTaq聚合酶(Ab Peptides公司，St.Louis，MO)将PCR产物加上A-尾，在72℃下进行5分钟。用厂商提供的方法立即将得到的产物通过T-尾克隆进pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)上并转化进大肠杆菌Top10F’(Novagen；Madison，WI)中。包容有含有正确插入的DNA的重组体质粒的转化体通过将菌薄PCR、限制性酶消化和在ABI自动DNA测序仪(Lark Technologies公司)利用DyeDeoxy终止反应的DNA序列分析组合使用来鉴定。将合成的寡核苷酸引物(Seq.ID No.6、7、8、11-42)用于获得双链DNA序列。
将P.gulae B43 fimA基因克隆进表达质粒中为了高水平表达蛋白，将P.gulae B43(PTA-3618)fimA基因克隆进pBAD/HisA表达载体(Invitrogen)中。用基因组DNA提取试剂盒(Promega公司)从5ml P.gulae B43的培养物纯化基因组DNA，所述的培养物已经在BHI中于37℃下厌氧孵育两天。用引物D0097和D0098(Seq.ID No.9和Seq.ID No.10)将fimA基因PCR扩增三份。PCR在50ul反应体积中进行，所述的反应体积含有1×PCR缓冲液(Life Technologies)、50ng P.gulae B43基因组DNA、1.0mM MgCl2、1.25μM每种引物、300μM每种脱氧-NTP以及2.5U铂Pfx DNA聚合酶(Life Technologies，USA)。
使用下列的PCR循环条件在94℃下两分钟变性；在94℃下变性40秒钟、58℃下退火40秒，并在72℃下延伸1.5分钟，进行5个循环；在94℃下变性40秒钟、65℃下退火40秒，并在72℃下延伸1.5分钟，进行30个循环；最后的延伸步骤在72℃下进行5分钟；并且最后冷却步骤至4℃。GeneAmp 9700热循环仪(Perkin Elmer AppliedBiosystems)用于全部的PCR扩增。用PCR制备试剂盒(Promega公司)纯化PCR产物。将纯化的PCR产物和pBAD/HisA用HindIII和XhoI在37℃下双酶切3小时。消化进行一半时，加入5单位的虾碱性磷酸酶(SAP)(Amersham Pharmacia Biotech公司，Piscataway，NJ)至载体消化物。用DNA Clean-Up试剂盒(Promega公司)纯化消化的DNA。在16℃下存在1 X T4 DNA连接酶缓冲液时，将纯化的、HindIII/XhoI消化的PCR产物用T4 DNA连接酶(Life Technologies)连接进HindIII/XhoI消化的、SAP处理的pBAD/His A中，进行18小时。将一部分得到的连接混合物转化进感受态的大肠杆菌Top1OF’细胞(Novagen)中。发现重组质粒pBADB43fimA4以正确的方向含有fimA基因。得到的重组FimA含有末端的、载体-编码的序列(MGGSHHHHHHGMASMTGGQMGRDLYDDDDKDRWGSELEICSQYHMGI，SEQ ID NO135)，其后为以天冬酰胺-20开始的FimA的成熟部分。
将这种质粒转化进感受态的大肠杆菌BL21细胞(Novagen)中用于进一步的蛋白质表达分析。
重组FimA蛋白的表达和纯化解冻大肠杆菌BL21/pBADB43fimA4的冰冻的操作储液，以1∶5000的稀释接种进含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取液，0.5％NaCl)中，并在5升操作体积的BioFlo 3000生物反应器(New Brunswick Scientific；Edison，NJ)中于37℃下以100rpm的搅动速率进行生长直至A625为2.5-3.5。然后以0.1％的终浓度将L-阿拉伯糖加入至培养物中用以诱导FimA表达。孵育培养物另外3小时。通过SDS-PAGE和使用anti-Express血清(Invitrogen)的蛋白质印迹检测重组FimA的表达(图8)。该重组FimA蛋白具有45kDa的预计分子量。
来自5升发酵物的表达重组FimA的大肠杆菌BL21转化体的湿细胞通过离心和再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中而得以收集。将细胞进行机械破碎。离心后，弃去沉淀颗粒。将上清液通过Ni2+-亲和柱，并用咪唑梯度洗脱。收集含有重组蛋白的级分，透析除去咪唑，并用0.2μm滤膜过滤灭菌。
克隆来自临床分离菌株的oprF基因基于牙龈卟啉单胞菌菌株W50 oprF同系物的序列，设计基因PG32(Genbank登记号AF175714)、寡核苷酸引物D0086(SEQ ID No.43)、D0087(SEQ ID NO.44)和KWK-Pg-03(SEQ ID NO.45)并合成(LifeTechnologies)。对于PCR，将引物D0086(SEQ ID NO.43)与D0087(SEQ ID NO.44)或KWK-Pg-03(SEQ ID NO.45)协同使用，所述的PCR在1 X PC2缓冲液(Ab Peptides)、200μM每种dNTP、7.5UKlenTaql(Ab Peptides)和0.15U克隆的Pfu(Stratagene；La Jolla，CA)热稳定性聚合酶的50μl终样品体积中进行。使用洗涤过的细胞悬液或纯化的基因组DNA作为模板进行反应，重复3次，所述的细胞和DNA来自P.gulae B43、犬口腔卟啉单胞菌B46、牙周卟啉单胞菌B52、P.gulae B69、牙周卟啉单胞菌B97、犬齿龈液卟啉单胞菌B98、唾液卟啉单胞菌B104、O.denticanis B106和牙髓卟啉单胞菌B114。扩增按如下进行变性(94℃，9分钟)；30-40个循环的变性(94℃，30秒)、退火(55-60℃，30秒)和聚合反应(72℃，1.5分钟)；随后在72℃下进行最后的延伸反应7分钟。
对于来自犬齿龈液卟啉单胞菌B98的oprF同系物的聚合酶链式扩增，将引物KWK-Ps-04b(SEQ ID No.81)连同KWK-Ps-06b(SEQ IDNo.83)一起使用。对于来自唾液卟啉单胞菌B104的类似物的扩增，将引物KWK-Ps-04b(SEQ ID No.81)与KWK-Ps-05b(SEQ ID No.82)-起使用。对于来自O.denticanis B106的基因的扩增，将引物KWK-Ps-02(SEQ ID No.79)与KWK-Ps-03(SEQ ID No.80)一起使用。使用来自菌株犬齿龈液卟啉单胞菌B98，唾液卟啉单胞菌B104，和O.denticanis B106的纯化的染色体DNA作为模板进行反应，重复3次。扩增按如下进行变性(94℃，9分钟)；30-35个循环的变性(94℃，30秒)、退火(61-72℃，30秒)和聚合反应(72℃，1.5分钟)；随后在72℃下进行最后的延伸反应7分钟。
通过在1.0％琼脂糖凝胶(Sigma)上跑胶显影PCR扩增基因产物。用QIAquicKTMPCR纯化试剂盒(Qiagen；Valancia，CA)纯化PCR产物，并将三次重复的样品每组进行合并。然后将这些片段直接测序以努力避免由于在PCR扩增和随后的克隆步骤产生的突变而引入假序列。然后将合并的混合物在ABI自动DNA测序仪(Lark Technologies)上用DyeDeoxy终止反应进行直接的序列分析。将合成的寡核苷酸引物(SEQ ID NO.46-75)用于进行扩增产物的两条DNA链的测序。
编码来自P.gulae B43、犬口腔卟啉单胞菌B46、牙周卟啉单胞菌B52、P.gulae B69、牙周卟啉单胞菌B97、犬齿龈液卟啉单胞菌B98、唾液卟啉单胞菌B104、O.denticanis B106、犬齿龈液卟啉单胞菌B98、唾液卟啉单胞菌B104、O.denticanis B106和牙髓卟啉单胞菌B114的OprF同系物的核苷酸序列描述于SEQ ID NO.111-119中。除去对应用于每个基因的PCR扩增的5’和3’引物的序列，因为它可能不代表各个菌株中的基因的实际序列。由SEQ ID NO.111-119编码的ORF分别显示于SEQ ID No.120-128中。对于每个编码的ORF，氨基酸末端序列，甚至当把由5’引物编码的序列排除时，仍然保持了原核信号序列的特性(von Heijne，1985，J.Mol.Biol.18499-105；Nielsen，H.，Engelbrecht，J.，Brunak，S.和vonHeijne，G.，1997 Protein Engineering，101-6)。使用Basis LocalAlign Search Tool(BLAST)程序(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.，Lipman，D.J.，1990，J.Mol.Biol.215403-410)将每个ORF与现存的核苷酸和蛋白质数据库进行比较。每个都与其具有最大同源性的个体(entry)是来自牙龈卟啉单胞菌的PG32。
将P.gulae B43 oprF基因克隆进表达质粒中为了表达重组蛋白，将编码OprF的基因与编码其信号肽的序列一起克隆。使用寡核苷酸引物KWK-Pg-06(SEQ ID NO.76)和KWK-Pg-03(SEQ ID NO.45)从P.gulae B43扩增OprF。对于聚合酶链式扩增，准备了两份50μl反应物，反应物含有染色体DNA作为模板、1 X PC2缓冲液、200μM每种dNTP、50pMol每种引物、7.5 U KlenTaql和O.15克隆的Pfu热稳定性聚合酶。扩增按如下进行变性(94℃，9分钟)；30个循环的变性(94℃，30秒)、退火(60℃，30秒)和聚合反应(72℃，1.5分钟)；随后在72℃下进行最后的延伸反应7分钟。扩增后，纯化(QIAquickTMPCR纯化试剂盒)样品并合并。将纯化的PCR产物直接克隆进pBAD-TOPO和pBAD/Thio-TOPO(Invitrogen)两者的TA克隆位点。将连接的产物转化进MaxEfficiency大肠杆菌DH5α细胞中。从pBAD-TOPO:OprF表达的、编码的蛋白质的预测氨基末端序列由载体-编码的序列MGSGSGDDDDKLALM(SEQ ID NO136)和其后直接连接的OprF的以谷氨酰胺-13开始的序列(SEQ ID No.120)组成。鉴定含有适当质粒的克隆，并用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)将纯化的质粒从小规模的液体培养物分离。将这种质粒转化进大肠杆菌BL21细胞(Novagen)中，并鉴定含有适当质粒的克隆。
从pBAD/Thio-TOPO:oprF表达的、编码的融合蛋白的预测的氨基末端序列应该由硫氧还蛋白和14个氨基酸残基的连接序列以及随后直接连接的OprF的以谷氨酰胺-13开始的序列(SEQ ID NO.120)组成。鉴定含有适当质粒的克隆，并用QIAprep Spin Miniprep试剂盒将纯化的质粒从小规模的液体培养物分离。将这种质粒转化进大肠杆菌BL21细胞中，并鉴定含有适当质粒的克隆。
将缺少编码信号肽的序列的oprF基因也克隆进两种不同的表达质粒中。这两种质粒都编码温度-敏感的λ抑制物cI857，其在30℃下抑制从λ启动子表达。在42℃下，该抑制物失活并激活从启动子的表达，产生高水平的转录和翻译。为了克隆进这些载体中，使用寡核苷酸引物KWK-Pgu-14(SEQ ID NO.77)和KWK-Pgu-15(SEQ ID NO.78)从P.gulae B43扩增oprF。对于聚合酶链式扩增，准备了两份50μl反应物，反应物含有洗涤过的P.gulae B43细胞作为模板、1 X PC2缓冲液、200μM每种dNTP、50pMol每种引物、7.5U KlenTaql和0.15U克隆的Pfu热稳定性聚合酶。扩增按如下进行变性(94℃，9分钟)；45个循环的变性(94℃，30秒)、退火(55℃，30秒)和聚合反应(72℃，1.5分钟)；随后在72℃下进行最后的延伸反应7分钟。扩增后，收集样品并用限制性内切酶消化，产生与已经用相同酶线性化的质粒兼容的突出端。限制性酶切消化后，纯化(QIAquickTMPCR纯化试剂盒；Qiagen公司)PCR片段和质粒，连接，并转化进大肠杆菌DH5α细胞(Novagen)中。预测的氨基末端由载体-编码的序列MGTTTTTTSLHM(SEQ ID NO137)和随后直接连接的OprF的以谷氨酰胺-13开始的序列(SEQ ID NO.120)组成。从第二种质粒表达的蛋白质将仅由载体-编码的Met和随后的OprF的谷氨酰胺-13组成(SEQ ID NO120)。鉴定含有适当质粒的克隆，并使用QIAprep SpinMiniprep试剂盒(Qiagen公司)从小规模液体培养物分离质粒。将这些质粒转化进大肠杆菌BL21细胞中，并鉴定含有适当质粒的分离的克隆。
重组OprF蛋白的表达和纯化将表达重组OprF(在其N-末端融合至SEQ ID NO137上)的大肠杆菌BL21细胞用于表达研究。解冻冰冻的储液，以1∶5000的稀释物接种进含有50μg/ml硫酸卡那霉素的2 X YT培养基(1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取液，0.5％NaCl)中，并在5升操作体积的BioFlo 3000生物反应器(New Brunswick Scientific；Edison，NJ)中于29℃下以100rpm的搅动速率进行生长直至A625为2.5-3.5。然后将培养物调至42℃以诱导OprF表达。孵育培养物另外3小时。在不同的时间点移出等分样品，离心，并再悬浮于减少的样品缓冲液中。将所有样品在10％NuPAGE凝胶(Invitrogen，USA)上分析(图9)。
来自5升发酵物的表达重组OprF的大肠杆菌BL21转化体的湿细胞通过离心并再悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中而得以收集。将细胞进行机械破碎。离心后，弃去沉淀颗粒。将上清液通过离子交换柱，并用NaCl梯度洗脱。收集含有重组蛋白的级分，透析除去NaCl，并用0.2μm滤膜过滤灭菌。
全细胞菌苗制备将一批5升的P.gulae B43生长于如上描述的发酵罐中并分成1升一份。通过以下处理使每一份1升的级分中的细胞(4.4×1012个总的P.gulae B43细胞)失活23℃下曝露于0.4％的福尔马林24小时，37℃下曝露于pH 8.5的10mM二乙烯亚胺(BEI)48小时，在连续的两天中加热至60℃30分钟，并曝露于空气48小时。BEI处理后，通过用50mM硫代硫酸钠处理使BEI失活。通过离心收集细胞。将得到的细胞沉淀颗粒再悬浮于220ml PBS中，产生2×1010个细胞/ml的终浓度。将7ml的每种灭活的细胞与7ml MPL+TDM佐剂(Sigma公司)混合，得到1.0×1010个细胞/ml的终浓度。
其它8种前面的临床分离菌株(犬口腔卟啉单胞菌B46、牙周卟啉单胞菌B52、P.gulae B69、牙周卟啉单胞菌B97、犬齿龈液卟啉单胞菌B98、唾液卟啉单胞菌B104、O.denticanis B106和牙髓卟啉单胞菌B114)或其它有色厌氧细菌的全细胞菌苗制剂可以以相同的方式制备。
小鼠中同源疫苗的效力在同源疫苗效力研究中，通过两次注射0.2ml每种上述的在MPL+TDM佐剂中的灭活的P.gulae B43细胞免疫小鼠，每次注射隔开3周。加强免疫后两周，如先前描述用P.gulae B43感染小鼠。感染后42天，杀死小鼠并如前面描述处理。表7显示了骨丢失测量的数字结果。
表7.小鼠同源疫苗效力的研究结果。

(a)基于作为阳性对照组的组B计算的百分比。
(b)基于作为阳性对照组的组C计算的百分比。
(c)NA＝不适用。
图10、11和12用图表显示了这些结果。图11显示对照试验的百分比骨丢失。含有福尔马林-灭活的牙龈卟啉单胞菌53977和弗氏完全佐剂/不完全佐剂或MPL+TDM佐剂的疫苗分别减少了由牙龈卟啉单胞菌53977感染引起的骨丢失约32％和43％。图12显示检测试验的百分比骨丢失。含有福尔马林-、热-或空气-灭活的P.gulae B43和MPL+TDM佐剂的疫苗分别减少了由P.gulae B43感染引起的骨丢失约45％、35％和75％。基于这些数据，可以得出结论，福尔马林-、热-或空气-灭活的P.gulae B43疫苗有效地能在这种超感染模型中减少骨丢失。外推该数据至临床情况中，这三种疫苗在预防性防止牙周病中可能是有效的并在治疗性处理牙周病中可能充分证明是有效的。
小鼠中异源疫苗效力的研究在异源疫苗效力研究中，通过两次注射0.2ml每种在MPL+TDM佐剂中的福尔马林-灭活的P.gulae B43或福尔马林-灭活的唾液卟啉单胞菌B104和O.denticanis B106细胞来免疫小鼠，这两次注射分开3周。加强免疫后两周，如先前描述用P.gulae B43、P.gulae B69、唾液卟啉单胞菌B104或O.denticanis B106感染小鼠。感染后42天，杀死小鼠并如前面描述处理。表8显示了骨丢失测量的数字结果。
表8.小鼠异源疫苗效力的研究结果。

a计算的P.gulae B43感染的小鼠的百分比骨丢失。
b计算的P.gulae B69感染的小鼠的百分比骨丢失。
c计算的唾液卟啉单胞菌B104感染的小鼠的百分比骨丢失。
d计算的O.denticanis B106感染的小鼠的百分比骨丢失。
eNA，不适用。b图13、14、15、16和17用图表显示了这些结果。图9显示这些试验的净骨丢失。图14显示了P.gulae B43感染组的百分比骨丢失。福尔马林-灭活的P.gulae B43和MPL+TDM佐剂减少了由P.gulaeB43感染引起的骨丢失约84％。图15显示了P.gulae B69感染组的百分比骨丢失。含有MPL+TDM佐剂的福尔马林-灭活的P.gulae B43和福尔马林-灭活的唾液卟啉单胞菌B104/O.denticanis B106疫苗分别减少了由P.gulae B69感染引起的骨丢失约40％和49％。图16显示了唾液卟啉单胞菌B104感染组的百分比骨丢失。福尔马林-灭活的P.gulae B43和MPL+TDM佐剂减少了由唾液卟啉单胞菌B104感染引起的骨丢失约65％。图17显示了O.denticanis B106感染组的百分比骨丢失。具有MPL+TDM佐剂的福尔马林-灭活的P.gulae B43不能交叉防止O.denticanis B106的攻击。基于这些数据，可以得出结论，具有MPL+TDM佐剂的福尔马林-灭活的P.gulae B43疫苗不仅能提供对同源攻击的保护，也能提供对P.gulae B69异源攻击的保护。而且，在两个卟啉单胞菌种之间观测到了如P.gulae B43疫苗防止唾液卟啉单胞菌B104攻击的保护作用。外推该数据至临床情况中，多价疫苗在预防性防止牙周病中可能是有效的并在治疗性处理牙周病中可能充分证明是有效的。
重组FimA和OprF小鼠血清学研究在亚单位疫苗血清学研究中，通过两次注射0.2ml每种QuilA/胆固醇佐剂中的重组表达的、纯化的P.gulae B43 FimA或重组表达的、纯化的P.gulae B43 OprF来免疫小鼠，两次注射隔开三周。在第一次接种前和加强免疫后2周将小鼠放血。表9显示了数据结果而图18和19通过图表显示结果表9.小鼠亚单位疫苗血清学研究。

实施例2犬攻击模型中的牙周病源性将具有恒齿(adult dentition)的10只小猎犬用于本研究。麻醉这些动物，并在具有高速机头的Schein Ultima 2000牙科综合治疗台中用梨形牙钻(Midwest Dental Products公司；Des Plaines，IL)打通至下颌前磨牙和第一磨牙的牙根管。通过兽用拔髓针(21mm，大小#5；Roydent Dental Products；Johnson City，TN)穿入根管至接近牙根管的深度来确证对牙根管的畅通。通过重复穿过拔髓针除去结缔组织、血管和神经组织。出血较少；用消毒纸尖(Henry Schein公司)放置在牙根管中获得止血。在这一点上确保在钻孔和清空牙根管过程中除去对牙根管无意的污染是重要的。因此用10％的漂白溶液冲洗牙根管。为了产生用于放置修复物的合适表面，用40％硫酸凝胶(sulfuric acidgel)(Scotchbond Etching Gel，3M；St.Paul，MN)腐蚀环绕入口的牙釉质。为了防止残留的漂白溶液或酸凝胶对攻击材料的生存的任何影响，用牙髓针(27ga.，DentsplyPharmaceutical；York，PA)和大量的无菌盐水，从内至外冲洗牙根管。入口区域和牙根管用消毒纸尖干燥。
通过在Brucella血琼脂(Anaerobe Systems；Morgan Hill，CA)上生长P.gulae菌株B69，并在厌氧环境中(5％H2，5％CO2，90％N2)于37℃下孵育制备攻击材料。收集细胞并再悬浮于无菌SSYG培养基中。然后将约7.5×108个菌落形成单位(CFU)的攻击剂量用牙髓针引入选择的牙齿的暴露的牙根管腔中。5只动物接受了攻击材料(T01)，而另外5只接受了由无菌SSYG培养基(T02)组成的假攻击。然后用玻璃离聚物和光固化牙科复合充填剂的组合物(Revolution 3；3M)密封入口。
基于牙齿周围的牙周骨密度的变化测定攻击生物体的牙周病原学。这种评估通过在研究的0、3、6、9和12周使用Schick ComputedDental Radiography(CDR_)传感器和软件测量数字式X光照片的像数强度来进行。为了获得基线值，在马上进行该方法前获取X光照片。攻击后，拍摄X光照片。每三周一次，进行至攻击后12周。通过两种不同方法分析X光照片。第一种由通过受过牙科X光照片分析训练的兽医对X光照片的主观性评估组成。简而言之，这由以下步骤组成训练过的观测者检查X光照片，在直观类比标度上对每条狗记录下异常并标注异常的程度。第二种方法是，使用X射线照片软件内的面积测量工具，测量X射线照片中明显的受影响的骨的面积，所述的X射线照片是在攻击后0、6和12周后拍摄的。这由使用Schick CDR软件内的Straight-line测量工具在X射线照片上对可见的损伤划分大体的直径组成。从得到的距离，测定损伤的大概面积。对每条狗加和这些面积并列表。
使用这两种建议的方法对X射线的分析表明T01比T02组丢失了更多的牙周骨(图20)。从该研究得出结论，已经开发了一种可行的攻击模型。然而，由于基于二维测量(X射线照片)的对三维区域(牙周骨)中发生的变化定量的困难，将继续寻求改良的定量方法。
实施例3犬攻击模型中三价疫苗效力的评价模型开发后，在狗中进行了研究来检测三价疫苗制剂的效力。三价菌苗含有福尔马林-灭活的P.gulae(B43)、唾液卟啉单胞菌(B104)和O.denticanis(B106)，每剂量佐以每种50μg的Quil A和胆固醇。以约1×1010CFU/疫苗剂量的浓度组装每种菌苗菌株。将三组具有恒齿的8只动物用于本研究中。将第一组(T01)中的狗用1ml三价疫苗肌内(IM)接种。将第二组(T02)和第三组(T03)用1ml无菌盐水假接种。全部的狗接受3次肌内(IM)施用，两次施用间间隔3周。最后施用后3周，如上面描述的麻醉动物，并在除去牙根物质后将攻击材料导入至下颌前磨牙和第一磨牙的牙根管中。T01和T02组中的狗用1×1010CFU的异源P.gulae菌株(B69)攻击，所述的菌株如实施例1中描述的制备。T03组中的狗用无菌培养基攻击，以便测量该方法的效果。
在攻击后3、6、9和12周，用Heliodont dental radiograph仪器、Schick_CDR(computerized digital radiography)捕获系统以及标准的技术获取X射线照片。对于该研究，一旦获得数字化X射线照片后，通过ImageJ(v1.28，NIH；Bethesda，MD)，使用具有标度旋转技术(scaled rotation technique)的插件TurboReg_首先将来自每条狗的连续的图像相互对照地登记。然后使用具有3次多项式函数的外部灰度校准登记的图像集。然后描出处理的牙齿周围的骨的面积(不包括牙齿和空气)并记录每个图像的该面积的平均密度。因而，客观地得出了代表牙根周围的骨的“白度”的数目，并可供分析。该数目称为“骨反应性打分(bone reactivity score)”并且代表平均的骨密度。
该研究的结果显示于图21中。在攻击后直至攻击后12周，T02组中的动物的平均骨打分下降了，或变得更白，在攻击后12周它们恢复至攻击前的水平。T01和T03组中的平均骨反应打分最初也下降了，然后逐渐恢复至接近正常水平，直至攻击后12周，这时它们产生差别。T03组中的操作对照变得更白，而T01组中接种的动物保持类似于攻击前水平的平均值。因而，接受疫苗的狗比未接种的狗面对牙髓攻击时能更快地恢复骨密度。而且，对在每个观测点收集的血清的分析表明，接受疫苗的动物产生了高的对抗疫苗株的抗体滴度并增加了对抗攻击菌株的交叉-反应性(数据没有显示)。
攻击后，X射线照片变得更白，与更暗相反，在骨感染的情况下更为直观。骨以双重的方式对炎症和感染反应，既丢失骨基质又增加周围的骨来“屏蔽(wall off)”扩散的感染。这种混合的溶解-硬化损伤通常可见于数种骨感染，但受以下的影响1)病原体的毒性，2)动物的年龄，3)动物的遗传，以及4)与炎症相关的损伤的量。用于本研究的动物是年轻的(10-14月大)，并且牙齿和周围的骨有与攻击过程有关的明显的损伤。这些因素，当与有关骨如何对感染和炎症反应的已知的知识一起考虑时，可以解释为什么周围的骨的密度会增加。
实施例4犬攻击模型中的疫苗效力该疫苗效力研究设计上类似于实施例3中描述的。每个处理组含有10只动物。将T01组中的狗接种并攻击；T02组在攻击前接受假接种，并且将T03组进行假接种和假攻击。每种疫苗含有福尔马林-灭活的P.gulae菌株B43，唾液卟啉单胞菌菌株B104和O.denticanis菌株B106，浓度为每剂量每种菌株1×107CFU。接种的方案与实施例3列出的相同。攻击接种物是P.gulae菌株B69，在第三次接种后3周施用。每3周间隔拍摄X射线照片，但仅到攻击后9周为止，并且以类似于实施例2中描述的方式进行分析。图22说明了骨反应性分析的结果。
在该研究中，动物对攻击过程的反应是平均骨反应性打分增加。这表示，X射线照片变得更暗，对应于骨密度增加(图23)。同时X射线照片也表明T01组和T02组中都有显著的损伤，非接种动物中的骨整体上比接种动物中的骨密度低得多。在第9周，T02组中的非接种的狗的平均骨反应性打分显著不同于接种的T01组(p＝0.05)。该研究中的狗比实施例2中的狗统一要年长，并且操作者的技术已经极大地提高了。可以假定，这些因素有助于使反应更代表与骨感染相关的反应，即骨密度的降低。因而，犬牙周炎的牙髓模型是新颖的并且是研究牙周炎的有用工具。其不仅在与疫苗评价相关的接种/攻击研究中有价值，而且其也可用于抗微生物和局部疗法研究。
实施例5对疫苗的全身反应和局部反应的评价对施用至狗的与其它疫苗组合的三价疫苗的全身和局部组织反应进行评估。将两组5只狗(研究初始时约6周大)在6、9和12周大时IM接种。在每次接种前收集血液样品。每次接种后每天检查所有狗的全身和局部反应，进行1周。在这些天中也测定体温并记录。用三价菌苗(如实施例3和4中描述的制备)，浓度为3×108CFU的总抗原并每剂量佐以每种50μg的Quil A和胆固醇，与以下改良的活的和杀死的病毒成分的组合物接种T01组犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒-2(CAV-2)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPI)和犬冠状病毒(CCV)。T02组接受浓度为3×106CFU的三价菌苗和病毒成分的相同组合。图24中的结果说明了，三价疫苗，当加至通常施用给幼犬的病毒成分的组合中时，在实验组中没有引起不利的全身性或局部反应。
在整个本申请案中，多种专利和科学出版物，包括美国专利，通过作者和年份以及专利号进行引用。这些出版物和专利的公开内容在此通过全文引用作为参考以便更完全地描述本申请所属的领域的状况。
序列表<110>Hardham，John M.
King，Kendall W.
Krishnan，RajendraDreir，Kimberly J.
Haworth，John David<120>牙周病的疫苗<130>PC32761A<140>
<141>
<160>169<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D0056<400>1ggattagata ccctggtagt c21<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D0057<400>2cccgggaacg tattcaccg 19<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ175-AP1<400>3ggcttaagtg ccataacgag 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ175-AP2<400>4ctggcgtctt acgacggctg 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ175-AP3<400>5tgtcgtcagc tcgtgccgtg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D0067<400>6gcgcagcaag gccagcccgg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D0068<400>7gagcgaaccc cgctccctgt 20<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D0078<400>8gcgacgctat atgcaagaca atc 23<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D0097
<400>9ggcctcgaga acaaagacaa cgaagcagaa ccc 33<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D0098<400>10ggcaagctta ccaaataaca ttttgtacaa cacc 34<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ185-AP1<400>11tcatccgaca atcctgtgtg 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ185-AP2<400>12agcagctgct aaatcggctc 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ185-AP3<400>13ttggcaagac tcttgcagag 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ185-AP4
<400>14ctgcagtcag ttcagttgtc 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ186-AP1<400>15tacgtcaaca ggctctgctg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ186-AP2<400>16gacaactgaa ctaactgcag 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ186-AP3<400>17aacatagaaa ccttgtggag 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ186-AP4<400>18tgtcgtctgg ttgggaagag 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ186-AP5<400>19
aatctgattg cctccctgag20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP1<400>20gggaaccgat ttagcagcag20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP2<400>21ccaatacagg gtaataggtc20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP3<400>22gttgtcaatg cttttacctc20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP4<400>23gattgagaat atcaaatgtg20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP5<400>24ttaggcgtat aaccattgtc20
<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP6<400>25atttaacggt gcttacacac20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP7<400>26ccaattggcg gcctgagctg20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP8<400>27tggcatagtt ggtaggtgtg20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP9<400>28tgtaagcacc gttaaatgtg20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP11<400>29ctgacaggtt ctttgaccac20
<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP12<400>30tgttccttgg ttgagccgtg20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP13<400>31gtggtcaaag aacctgtcag20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP14<400>32cataaacaca caggattgtc20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP15<400>33ttgcttcttt gcaatgagac20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP16<400>34agccatgcga gcatgtacac20
<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP17<400>35ctgtcatgat caaacctgtg20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ187-AP18<400>36accgtctgca ttcacgagtg20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ188-AP1<400>37gccttccaat gatgctccac20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ188-AP2<400>38ggacgtagac ctgcattctg20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ188-AP3<400>39cgcaatacgg gcatgaacac20<210>40
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ188-AP4<400>40ttatggttat gatggacctc20<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ188-AP5<400>41tggtactcct ttgagttctg20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ188-AP6<400>42cacacttgcg cggtaaccac20<210>43<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D0086<400>43atgaaggtaaagtacttaat gc 22<210>44<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D0087<400>44agatgaatta cttggagcga acgat 25<210>45<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述KWK-Pg-03<400>45ttacttggag cgaacgatta caacacg27<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ209-AP1<400>46ttggtgcagc tcacttcgac20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ209-AP2<400>47accacatcaa acataaagtc20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ209-AP3<400>48acattcgggg catgatacag20<210>49<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ209-AP4<400>49atgccattga gccaatggac20<210>50<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ210-AP1<400>50ttgacttcat gttcgatgtg 20<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ210-AP2<400>51tgccaatgaa ttttatgctg 20<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ210-AP3<400>52cgcttggaga gttcttcgac 20<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ210-AP4<400>53tatcaacgat ctgaatggtc 20<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ211-AP1<400>54aactacttca agccctacag 20<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述PFZ211-AP2<400>55cgtaacccaa acctacccac20<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ211-AP3<400>56acgggacgct tgctcaactc20<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ211-AP4<400>57attggggctt ggtaaatgac20<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ211-AP5<400>58atacgctcta cacgaggctc20<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ212-AP1<400>59ccgccatggc tggagctcac20<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述PFZ212-AP2<400>60tttgaaacca tatcccacac20<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ212-AP3<400>61agtaacttca ggacattctg20<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ212-AP4<400>62acgtccagtt tcttgcccag20<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ213-AP1<400>63ttgacttcat gttcgatgtg20<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ213-AP2<400>64tttgtgttgg taaccaacac20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ213-AP3<400>65acaggacgct tagagagctc20<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ213-AP4<400>66acgcgcttat caacgatctg20<210>67<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ213-AP5<400>67cttcccaagg aacgtgtgtg20<210>68<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ214-AP1<400>68actttatgtt tgatgttgtg20<210>69<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ214-AP2<400>69ccaacaccga accaaggcac20<210>70<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ214-AP3
<400>70tctcaactca gtattctcag20<210>71<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ214-AP4<400>71taaccttaat tttggtcgtg20<210>72<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ215-AP1<400>72cacacctaca acactgccac20<210>73<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ215-AP2<400>73tcaaacatga aatcatagtg20<210>74<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ215-AP3<400>74ctcggggcag aaagcaggac20<210>75<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述PFZ215-AP4
<400>75gacttgaact ctcagatcag 20<210>76<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述KWK-Pg-06<400>76atgcaggaaa atactgtacc ggcaacg 27<210>77<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述KWK-Pgu-14<400>77gtgtgtcata tgcaggaaaa tactgtacc 29<210>78<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述KWK-Pgu-15<400>78gtgtgttcta gattattact tggagcgaac 931<210>79<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述KWK-Ps-02<400>79acacctgaga ctcagacatt gc 22<210>80<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述KWK-Ps-02<400>80
catgcgcgag cctcaaaaag c 21<210>81<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述KWK-Ps-04b<400>81cctgccactc aacagaaatc atatcagaag gaactcc37<210>82<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述KWK-Ps-05b<400>82ctgctcataa gacggctttt gaccgttctg cagg 34<210>83<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述KWK-Ps-06b<400>83cttttgaccg ttctgcagga cattggttct tgactctcc 39<210>84<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D122<400>84tggctaaryt gacygtaatg gtyta 25<210>85<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述D123<400>85agttyacyaa tacaggrtaa taggt 25
<210>86<211>572<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B4316S rRNA多核苷酸序列<400>86cacgcagtaa acgatgatta ctaggagttt gcgatatacc gtcaagcttc cacagcgaaa 60gcgttaagta atccacctgg ggagtacgcc ggcaacggtg aaactcaaag gaattgacgg 120gggcccgcac aagcggagga acatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttaccc 180gggattgaaa tgtagacgac ggatggtgaa agccgtcttc ccttcggggc gtctatgtag 240gtgctgcatg gttgtcgtca gctcgtgccg tgaggtgtcg gcttaagtgc cataacgagc 300gcaacccaca tcggtagttg ctaacaggtt tagctgagga ctctaccgag actgccgtcg 360taaggcgcga ggaaggtgtg gatgacgtca aatcagcacg gcccttacat ccggggcgac 420acacgtgtta caatgggagg gacaaagggc agctaccggg cgaccgggtg cgaatctcga 480aacccttccc cagttcggat cggagtctgc aactcgactc cgtgaagctg gattcgctag 540taatcgcgca tcagccatgg cgcggtgaatac572<210>87<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述犬口腔卟啉单胞菌B46 16S rRNA多核苷酸序列<400>87cacgccgtaa acgatgatta ctcggagtat gcgatatgag tgtatgcttc ttagcgaaag 60cgttaagtaa tccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg 120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg 180ggattgaaat atagatgaca ggcagcgaga gttgttatcc cttcggggca tctatgtagg 240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg cttaagtgcc ctaacgagcg 300caacccacat tattagttac taacaggtta agctgaggac tctaataaga ctgccggcgt 360aagccgtgag gaaggtgtgg atgacgtcaa atcagcacgg cccttacatc cggggcgaca 420cacgtgttac aatggtaggg acaaagggca gctaccgggc gaccggatgc gaatctccaa 480accctatccc agttcggatc ggagtctgca actcgactct gtgaagctgg attcgctagt 540aatcgcgcat cagccatggc gcggtgaata c571<210>88<211>573<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙周卟啉单胞菌B52 16S rRNA多核苷酸序列<400>88cacgctgtaa acgatgaata ctagattttt gcgatataca gtaagagtct aagcgaaagc 60gataagtatt ccacctgggg agtacgccgg caacggtgaa actcaaagga attgacgggg 120gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacctgg 180gattgaaatt taggagaacg atttatgaaa gtagattttc ccttcggggc tcctaagtag 240
gtgctgcatg gttgtcgtca gctcgtgccg tgaggtgtcg gcttaagtgc cataacgagc 300gcaacccgcg ttgatagtta ctaacagata aagctgagga ctctatcgag acagccgtcg 360taagacgcga ggaaggggcg gatgacgtca aatcagcacg gcccttacat ccagggcgac 420acacgtgtta caatggcaag gacaaaggga agccacatag cgatatggag cagatcctca 480aaccttgtcc cagttcggat cggagtctgc aactcgactc cgtgaagctg gattcgctag 540taatcgcgca tcagccatgg cgcggtgaat acc 573<210>89<211>573<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B69 16S rRNA多核苷酸序列<400>89cacgcagtaa acgatgatta ctaggagttt gcgatatacc gataagcttc cacagcgaaa 60gcgttaagta atccacctgg ggagtacgcc ggcaacggtg aaactcaaag gaattgacgg 120gggcccgcac aagcggagga acatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttaccc 180gggattgaaa tgtagatgac agatggtgaa agccgtcttc ccttcggggc gtctatgtag 240gtgctgcatg gttgtcgtca gctcgtgccg tgaggtgtcg gcttaagtgc cataacgagc 300gcaacccata tcggtagttg ctaacaggtc aagctgagga ctctaccgag actgccgtcg 360taaggcgaga ggaaggtgtg gatgacgtca aatcagcacg gcccttacat ccggggcgac 420acacgtgtta caatgggagg gacaaagggc agctaccggg cgaccggatg cgaatctcga 480aacccttccc cagttcggat cggagtctgc aactcgactc cgtgaagctg gattcgctag 540taatcgcgca tcagccatgg cgcggtgaat acc 573<210>90<211>572<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙周卟啉单胞菌B97 16S rRNA多核苷酸序列<400>90cacgctgtaa acgatgaata ctagattttt gcgatataca gtaagagtct aagcgaaagc 60gataagtatt ccacctgggg agtacgccgg caacggtgaa actcaaagga attgacgggg 120gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacctgg 180gattgaaatt taggagaacg atttatgaaa gtagattttc ccttcggggc tcctaagtag 240gtgctgcatg gttgtcgtca gctcgtgccg tgaggtgtcg gcttaagtgc cataacgagc 300gcaacccgcg tcgatagtta ctaacaggta atgctgagga ctctatcgag acagccgtcg 360taagacgaga ggaaggggcg gatgacgtca aatcagcacg gcccttacat ccagggcgac 420acacgtgtta caatggcaag gacaaaggga agccacatag cgatatggag cagatcctca 480aaccttgtcc cagttcggat cggagtctgc aactcgactc cgtgaagctg gattcgctag 540taatcgcgca tcagccatgg cgcggtgaat ac 572<210>91<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述犬齿龈液卟啉单胞菌B98 16S rRNA多核苷酸序列
<400>91cagtaaacga tgattactcg gagtatgcga tatatggtat gctcccaagg gaaaccgata 60agtaatccac ctggggagta cgccggcaac ggtgaaactc aaaggaattg acgggggccc 120gcacaagcgg aggaacatgt ggtttaattc gatgatacgc gaggaacctt acccgggatt 180gaaatgtaca tgacggttgg gcgagagcct gacttccctt cggggcatgt atgtaggtgc 240tgcatggttg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgtcggctt aagtgccata acgagcgcaa 300cccacatcgt cagttactaa caggtagagc tgaggactct gacgagactg ccgtcgtaag 360gcgcgaggaa ggtgtggatg acgtcaaatc agcacggccc ttacatccgg ggcgacacac 420gtgttacaat ggtagggaca aagggcagct acctggcgac aggatgcgaa tctccaaacc 480ctatctcagt tcggatcgga gtctgcaact cgactccgtg aagctggatt cgctagtaat 540cgcgcatcag ccatggcgcg gtgaatacgt t 571<210>92<211>384<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述唾液卟啉单胞菌B104 16S rRNA多核苷酸序列<400>92cagtaaacga tgataactgg gcgtatgcga tatacagtat gctcctgagc gaaagcgtta 60agttatccac ctggggagta cgccggcaac ggtgaaactc aaaggaattg acgggggccc 120gcacaagcgg aggaacatgt ggtttaattc gatgatacgc gaggaacctt acccgggatt 180gaaatttagc ggactatgta tgaaagtaca tatcctgtca caaggccgct aagtaggtgc 240tgcatggttg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgtcggctt aagtgccata acgagcgcaa 300cccacgttgt cagttactat cgggtaaagc cgaggactct gacaagactg ccgtcgtaag 360gcgcgaggaa ggtgtggatg acgt384<210>93<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.denticanis B106 16S rRNA多核苷酸序列<400>93cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat 60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg 120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg 180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg 240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg 300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt 360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca 420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa 480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt 540aatcgcacat cagccatggt gcggtgaata c 571<210>94<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙髓卟啉单胞菌B114 16S rRNA多核苷酸序列<400>94caccgcagta aacgatgaat actagatctt tgcgatatac ggtaagggtc taagcgaaag 60cgataagtat tccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg 120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg 180ggattgaaat ttagcgggcg ggctatgaga gtagcctttc ctacgggact gctaagtagg 240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgttgg cttaagtgcc ataacgagcg 300caacccacgt tgatagttac taacagttaa agctgaggac tctatcgaga cagccggcgt 360aagccgtgag gaaggtgtgg atgacgtcaa atcagcacgg cccttacatc cggggcgaca 420cacgtgttac aatggtgagg acagcgggaa gcggcctggt gacaggtagc agatccccaa 480acctcatccc agttcggatt ggagtctgca actcgactct atgaagctgg attcgctagt 540aatcgcgcat cagccatggc gcggtgaata c571<210>95<211>1024<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B43 fimA多核苷酸序列<400>95tctaaatcga aaaagatcct aataaaacaa tattcacttt taaaacaaaa acgagatgaa 60aaagactaag tttttcttgt tgggacttgc tgcccttgct atgacagctt gtaacaaaga 120caacgaagca gaacccgttg tagaaggtaa cgctaccatt agcgtagtat tgaagaccag 180caatccgaat cgtgctttcg gggttgcaga tgacgaagca aaagtggcta aactgactgt 240aatggtctac aagggtgagc agcaggaagc catcaaatca gccgaaaatg caattaaggt 300tgagaacatc aaatgtggtg caggctcacg tacgctggtc gtaatggcca atacgggtgg 360aatggaattg gctggcaaga ctcttgcaga ggtaaaagca ttgacaactg aactaactgc 420agaaaaccaa gaggctacag gtttgatcat gacagcagag cctgttgacg taacacttgt 480cgccggcaat aactattatg gttatgatgg aactcaggga ggcaatcaga tttcgcaagg 540tactcctctt gaaatcaaac gtgttcatgc ccgtattgcg ttcaccaaga ttgaagtgaa 600gatgagcgag tcttatgtga acaaatacaa ctttaccccc gaaaacatct atgcacttgt 660ggctaagaag aagtctaatc tattcggtac ttcattggca aatagtgatg atgcttattt 720gaccggttct ttgacgactt tcaacggtgc ttatacccct gcaaactata ctcatgtcgt 780ctggttggga agaggctaca cagcgccttc caatgatgct ccacaaggtt tctatgtttt 840ggagagtgca tacgctcaga atgcaggtct acgtcctacc attctatgtg taaagggtaa 900gctgacaaag catgatggta ctcctttgag ttctgaggaa atgacagctg cattcaatgc 960cggctggatt gttgcaaaca atgatcctac gacctattat cctgtattag tgaactttga 1020gagc 1024<210>96<211>733<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙周卟啉单胞菌B52 fimA多核苷酸序列<400>96taatggagaa cagcaggaag ccatcgaatc agccgaaaat gcgactaaga ttgagaatat 60caaatgtggt gcaggccaac gtacgctggt cgtaatggcc aatacgggtg gaatggaatt 120ggctggcaag actcttgcag aggtaaaagc attgacaact gtactgactg aagaaaacca 180agaggccaca ggtttgatca tgacagcaga gccaaaagca atcgttttga aggcaggcaa 240gaactatatt ggatacgatg gagccggaga gggcaaccac attgagaatg ctcctcttga 300
aatcaaacgt gtacatgctc gcatggcttt caccgaaatt aaagtacaga tgagcgcagc 360ctacgataac atttacacat ttacccctga aaagatttat ggtctcattg caaagaagca 420atctaatttg ttcggggcaa cactcgtgaa tgcagacgct aattatctga caggttcttt 480gaccacattt aacggtgctt acacacctac caactatgcc aatgttcctt ggttgagccg 540tgattacgtt gcacctaccg ctggtgctcc tcagggcttc tacgtattag aaaatgacta 600ctcagctaac agtggaacta ttcatccgac aatcctgtgt gtttatggca aacttcagaa 660aaacggagcc gacctgacgg gaaccgattt agcagcagct caggccgcca attgggtgga 720tgcagaaggc aag733<210>97<211>1024<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B69 fimA多核苷酸序列<400>97ggcgcagcat aacctcgacg aactgcgaca ctatatgcag gacaatctct aaatcgaata 60aagattctaa taaaacaata ttcactttta aaacaaaaac aagatgaaaa agactaagtt 120tttcttgttg ggacttgctg cccttgctat gacagcttgt aacaaagaca acgaagcaga 180acccgttgta gaaggtaacg ctaccattag cgtagtattg aagaccagca atccgaatcg 240tgttttcggg gttgcagatg acgaagcaaa agtggctaag ttgaccgtaa tggtttataa 300tggagaacag caggaagcca tcgaatcagc cgaaaatgcg actaagattg agaatatcaa 360atgtggtgca ggccaacgta cgctggtcgt aatggccaat acgggtggaa tggaattggc 420tggcaagact cttgcagagg taaaagcatt gacaactgta ctgactgaag aaaaccaagg 480ggccacaggt ttgatcatga cagcagagcc aaaagcaatc gttttgaagg caggcaagaa 540ctatattgga tacgatggag ccggagaggg caaccacatt gagaatgctc ctcttgaaat 600caaacgtgta catgctcgca tggctttcac cgaaattaaa gtacagatga gcgcagccta 660cgataacatt tacacattta cccctgaaaa gatttatggt ctcattgcaa agaagcaatc 720taatttgttc ggggcaacac tcgtgaatgc agacgctaat tatctgacag gttctttgac 780cacatttaac ggtgcttaca cacctaccaa ctatgccaat gttccttggt tgagccgtga 840ttacgttgca cctaccgctg gtgctcctca gggcttctac gtattagaaa atgactactc 900agctaacagt ggaactattc atccgacaat cctgtgtgtt tatggcaaac ttcagaaaaa 960cggagccgac ctgacgggaa ccgatttagc agcagctcag gccgccaatt gggtggatgc 1020agaa 1024<210>98<211>733<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙周卟啉单胞菌B97 fimA多核苷酸序列<400>98taatggagaa cagcaggaag ccatcgaatc agccgaaaat gcgactaaga ttgagaatat 60caaatgtggt gcaggccaac gtacgctggt cgtaatggcc aatacgggtg gaatggaatt 120ggctggcaag actcttgcag aggtaaaagc attgacaact gtactgactg aagaaaacca 180agaggccaca ggtttgatca tgacagcaga gccaaaagca atcgttttga aggcaggcaa 240gaactatatt ggatacgatg gagccggaga gggcaaccac attgagaatg ctcctcttga 300aatcaaacgt gtacatgctc gcatggcttt caccgaaatt aaagtacaga tgagcgcagc 360ctacgataac atttacacat ttacccctga aaagatttat ggtctcattg caaagaagca 420atctaatttg ttcggggcaa cactcgtgaa tgcagacgct aattatctga caggttcttt 480gaccacattt aacggtgctt acacacctac caactatgcc aatgttcctt ggttgagccg 540tgattacgtt gcacctaccg ctggtgctcc tcagggcttc tacgtattag aaaatgacta 600ctcagctaac agtggaacta ttcatccgac aatcctgtgt gtttatggca aacttcagaa 660
aaacggagcc gacctgacgg gaaccgattt agcagcagct caggccgcca attgggtgga 720tgcagaaggc aag733<210>99<211>1024<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述犬齿龈液卟啉单胞菌B98 fimA多核苷酸序列<400>99ggcctcgaga acaaagacaa cgaagcagaa cccgttgtag aaggtaacgc taccattagc 60gtagtattga agaccagcaa tccgaatcgt gctttcgggg ttgcagatga cgaagcaaaa 120gtggctaaac tgactgtaat ggtctacaag ggtgagcagc aggaagccat caaatcagcc 180gaaaatgcaa ttaaggttga gaacatcaaa tgtggtgcag gctcacgtac gctggtcgta 240atggccaata cgggtggaat ggaattggct ggcaagactc ttgcagaggt aaaagcattg 300acaactgaac taactgcaga aaaccaagag gctacaggtt tgatcatgac agcagagcct 360gttgacgtaa cacttgtcgc cggcaataac tattatggtt atgatggaac tcagggaggc 420aatcagattt cgcaaggtac tcctcttgaa atcaaacgtg ttcatgcccg tattgcgttc 480accaagattg aagtgaagat gagcgagtct tatgtgaaca aatacaactt tacccccgaa 540aacatctatg cacttgtggc taagaagaag tctaatctat tcggtacttc attggcaaat 600agtgatgatg cttatttgac cggttctttg acgactttca acggtgctta tacccctgca 660aactatactc atgtcgtctg gttgggaaga ggctacacag cgccttccaa tgatgctcca 720caaggtttct atgttttgga gagtgcatac gctcagaatg caggtctacg tcctaccatt 780ctatgtgtaa agggtaagct gacaaagcat gatggtactc ctttgagttc tgaggaaatg 840acagctgcat tcaatgccgg ctggattgtt gcaaacaatg atcctacgac ctattatcct 900gtattagtga actttgagag caataattac acctacacag gtgatgctgt tgagaaaggg 960aaaatcgttc gtaaccacaa gtttgacatc aatctgacga tcaccggtcc tggtacgaat 1020aatc 1024<210>100<211>783<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述唾液卟啉单胞菌B104 fimA多核苷酸序列<400>100tggctaartt gactgtaatg gtttataatg gagaacagca ggaagccatc raatcagccg 60aaaatgcgac taagrttgar rayatcaaat gtrgtgcagg ccaacgtacg ctggtcgtaa 120tggccaatac gggtgsaatg gaaytggytg gcaagactct tgcagaggta aaagcattga 180caactgwact gactgmagaa aaccaagagg cyrcaggktt gatcatgaca gcagagccaa 240aarcaatcgt tttgaaggca ggcaagaact ayattggata crrtggarcc ggagagggya 300aycacattga gaatgmtcct cttraratca arcgtgtwca tgctcgcatg gctttcaccg 360aaattaaagt rcaratgagc gcagcctacg ataacattta cacattyryc cctgaaaaga 420tttatggtct cattgcaaag aagcaatcta atttgttcgg ggcaacactc gtraatgcag 480acgctaatta tctgacaggt tctttgacca catttaacgg tgcttacaca cctrccaact 540atgccaatgt kccttggytg agccgtratt acgttgcacc trccgcygrt gctcctcagg 600gyttctacgt attagaaaat gactactcag ctaacrgtgg aactattcat ccgacaatcc 660tgtgtgttta tggcaaactt cagaaaaacg gagccgacyt grcgggarcc gatttagcar 720cwgctcaggc cgccaattgg gtggatgcag aaggcaagac ctattaccct gtattrgtra 780act 783<210>101
<211>733<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.denticanis B106 fimA多核苷酸序列<400>101taatggagaa cagcaggaag ccatcgaatc agccgaaaat gcgactaaga ttgagaatat 60caaatgtggt gcaggccaac gtacgctggt cgtaatggcc aatacgggtg gaatggaatt 120ggctggcaag actcttgcag aggtaaaagc attgacaact gtactgactg aagaaaacca 180agaggccaca ggtttgatca tgacagcaga gccaaaagca atcgttttga aggcaggcaa 240gaactatatt ggatacgatg gagccggaga gggcaaccac attgagaatg ctcctcttga 300aatcaaacgt gtacatgctc gcatggcttt caccgaaatt aaagtacaga tgagcgcagc 360ctacgataac atttacacat ttacccctga aaagatttat ggtctcattg caaagaagca 420atctaatttg ttcggggcaa cactcgtgaa tgcagacgct aattatctga caggttcttt 480gaccacattt aacggtgctt acacacctac caactatgcc aatgttcctt ggttgagccg 540tgattacgtt gcacctaccg ctggtgctcc tcagggcttc tacgtattag aaaatgacta 600ctcagctaac agtggaacta ttcatccgac aatcctgtgt gtttatggca aacttcagaa 660aaacggagcc gacctgacgg gaaccgattt agcagcagct caggccgcca attgggtgga 720tgcagaaggc aag733<210>102<211>742<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙髓卟啉单胞菌B114 fimA多核苷酸序列<400>102caagggtgag cagcaggaag ccatcaaatc agccgaaaat gcaattaagg ttgagaacat 60caaatgtggt gcaggctcac gtacgctggt cgtaatggcc aatacgggtg gaatggaatt 120ggctggcaag actcttgcag aggtaaaagc attgacaact gaactaactg cagaaaacca 180agaggctaca ggtttgatca tgacagcaga gcctgttgac gtaacacttg tcgccggcaa 240taactattat ggttatgatg gaactcaggg aggcaatcag atttcgcaag gtactcctct 300tgaaatcaaa cgtgttcatg cccgtattgc gttcaccaag attgaagtga agatgagcga 360gtcttatgtg aacaaataca actttacccc cgaaaacatc tatgcacttg tggctaagaa 420gaagtctaat ctattcggta cttcattggc aaatagtgat gatgcttatt tgaccggttc 480tttgacgact ttcaacggtg cttatacccc tgcaaactat actcatgtcg tctggttggg 540aagaggctac acagcgcctt ccaatgatgc tccacaaggt ttctatgttt tggagagtgc 600atacgctcag aatgcaggtc tacgtcctac cattctatgt gtaaagggta agctgacaaa 660gcatgatggt actcctttga gttctgagga aatgacagct gcattcaatg ccggctggat 720tgttgcaaac aatgatccta cg 742<210>103<211>281<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>P.gulae B43 fimA多肽序列<400>103Met Lys Lys Thr Lys Gly Ala Ala Ala Met Thr Ala Cys Asn Lys Asp1 5 10 15
Asn Ala Val Val Gly Asn Ala Thr Ser Val Val Lys Thr Ser Asn Asn20 25 30Arg Ala Gly Val Ala Asp Asp Ala Lys Val Ala Lys Thr Val Met Val35 40 45Tyr Lys Gly Ala Lys Ser Ala Asn Ala Lys Val Asn Lys Cys Gly Ala50 55 60Gly Ser Arg Thr Val Val Met Ala Asn Thr Gly Gly Met Ala Gly Lys65 70 75 80Thr Ala Val Lys Ala Thr Thr Thr Ala Asn Ala Thr Gly Met Thr Ala85 90 95Val Asp Val Thr Val Ala Gly Asn Asn Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Thr100 105 110Gly Gly Asn Ser Gly Thr Lys Arg Val His Ala Arg Ala Thr Lys Val115 120 125Lye Met Ser Ser Tyr Val Asn Lys Tyr Asn Thr Asn Tyr Ala Val Ala130 135 140Lys Lys Lys Ser Asn Gly Thr Ser Ala Asn Ser Asp Asp Ala Tyr Thr145 150 155 160Gly Ser Thr Thr Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Tyr Thr His Val Val165 170 175Trp Gly Arg Gly Tyr Thr Ala Ser Asn Asp Ala Gly Tyr Val Ser Ala180 185 190Tyr Ala Asn Ala Gly Arg Thr Cys Val Lys Gly Lys Thr Lys His Asp195 200 205Gly Thr Ser Ser Met Thr Ala Ala Asn Ala Gly Trp Val Ala Asn Asn210 215 220Asp Thr Thr Tyr Tyr Val Val Asn Ser Asn Asn Tyr Thr Tyr Thr Gly225 230 235 240Asp Ala Val Lys Gly Lys Val Arg Asn His Lys Asp Ash Thr Thr Gly245 250 255
Gly Thr Asn Asn Asn Thr Ser Ala Asn Asn Val Asn cys Val Val Ala260 265 270Ala Trp Lys Gly Val Val Asn Val Trp275 280<210>104<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙周卟啉单胞菌B52 FimA多肽序列<400>104Asn Gly Ala Ser Ala Asn Ala Thr Lys Asn Lys Cys Gly Ala Gly Arg1 5 10 15Thr Val Val Met Ala Asn Thr Gly Gly Met Ala Gly Lys Thr Ala Val20 25 30Lys Ala Thr Thr Val Thr Asn Ala Thr Gly Met Thr Ala Lys Ala Val35 40 45Lys Ala Gly Lys Asn Tyr Gly Tyr Asp Gly Ala Gly Gly Asn His Asn50 55 60Ala Lys Arg Val His Ala Arg Met Ala Thr Lys Val Met Ser Ala Ala65 70 75 80Tyr Asp Asn Tyr Thr Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Lys Ser Asn Gly Ala85 90 95Thr Val Asn Ala Asp Ala Asn Tyr Thr Gly Ser Thr Thr Asn Gly Ala100 105 110Tyr Thr Thr Asn Tyr Ala Asn Val Trp Ser Arg Asp Tyr Val Ala Thr115 120 125Ala Gly Ala Gly Tyr Val Asn Asp Tyr Ser Ala Asn Ser Gly Thr His130 135 140Thr Cys Val Tyr Gly Lys Lys Asn Gly Ala Asp Thr Gly Thr Asp Ala145 150 155 160Ala Ala Ala Ala Asn Trp Val Asp Ala Gly165 170
<210>105<211>275<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>P.gulae B69 FimA AA<400>105Met Lys Lys Thr Lys Gly Ala Ala Ala Met Thr Ala Cys Asn Lys Asp1 5 10 15Asn Ala Val Val Gly Asn Ala Thr Ser Val Val Lys Thr Ser Asn Asn20 25 30Arg Val Gly Val Ala Asp Asp Ala Lys Val Ala Lys Thr Val Met Val35 40 45Tyr Asn Gly Ala Ser Ala Asn Ala Thr Lys Asn Lys Cys Gly Ala Gly50 55 60Arg Thr Val Val Met Ala Asn Thr Gly Gly Met Ala Gly Lys Thr Ala65 70 75 80Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Asn Gly Ala Thr Gly Met Thr Ala Lys85 90 95Ala Val Lys Ala Gly Lys Asn Tyr Gly Tyr Asp Gly Ala Gly Gly Asn100 105 110His Asn Ala Lys Arg Val His Ala Arg Met Ala Thr Lys Val Met Ser115 120 125Ala Ala Tyr Asp Asn Tyr Thr Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Lys Ser Asn130 135 140Gly Ala Thr Val Asn Ala Asp Ala Asn Tyr Thr Gly Ser Thr Thr Asn145 150 155 160Gly Ala Tyr Thr Thr Asn Tyr Ala Asn Val Trp Ser Arg Asp Tyr Val165 170 175Ala Thr Ala Gly Ala Gly Tyr Val Asn Asp Tyr Ser Ala Asn Ser Gly180 185 190Thr His Thr Cys Val Tyr Gly Lys Lys Asn Gly Ala Asp Thr Gly Thr
195 200 205Asp Ala Ala Ala Ala Ala Asn Trp Val Asp Ala Gly Lys Thr Tyr Tyr210 215 220Val Val Asn Asn Ser Asn Asn Tyr Thr Tyr Asp Asn Gly Tyr Thr Lys225 230 235 240Asn Lys Arg Asn His Lys Tyr Asp Lys Thr Thr Gly Gly Thr Asn Asn245 250 255Asn Thr Ser Ala His Asn Val cys Thr Val Ala Trp Val Val Gly Asn260 265 270Ala Thr Trp275<210>106<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙周卟啉单胞菌B97 FimA多肽序列<400>106Asn Gly Ala Ser Ala Asn Ala Thr Lys Asn Lys Cys Gly Ala Gly Arg1 5 10 15Thr Val Val Met Ala Asn Thr Gly Gly Met Ala Gly Lys Thr Ala Val20 25 30Lys Ala Thr Thr Val Thr Asn Ala Thr Gly Met Thr Ala Lys Ala Val35 40 45Lys Ala Gly Lys Asn Tyr Gly Tyr Asp Gly Ala Gly Gly Asn His Asn50 55 60Ala Lys Arg Val His Ala Arg Met Ala Thr Lys Val Met Ser Ala Ala65 70 75 80Tyr Asp Asn Tyr Thr Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Lys Ser Asn Gly Ala85 90 95Thr Val Asn Ala Asp Ala Asn Tyr Thr Gly Ser Thr Thr Asn Gly Ala100 105 110
Tyr Thr Thr Asn Tyr Ala Asn Val Trp Ser Arg Asp Tyr Val Ala Thr115 120 125Ala Gly Ala Gly Tyr Val Asn Asp Tyr Ser Ala Asn Ser Gly Thr His130 135 140Thr Cys Val Tyr Gly Lys Lys Asn Gly Ala Asp Thr Gly Thr Asp Ala145 150 155 160Ala Ala Ala Ala Asn Trp Val Asp Ala Gly165 170<210>107<211>257<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述犬齿龈液卟啉单胞菌B98 FimA AA<400>107Val Val Gly Asn Ala Thr Ser Val Val Lys Thr Ser Asn Asn Arg Ala1 5 10 15Gly Val Ala Asp Asp Ala Lys Val Ala Lys Thr Val Met Val Tyr Lys20 25 30Gly Ala Lys Ser Ala Asn Ala Lys Val Asn Lys Cys Gly Ala Gly Ser35 40 45Arg Thr Val Val Met Ala Asn Thr Gly Gly Met Ala Gly Lys Thr Ala50 55 60Val Lys Ala Thr Thr Thr Ala Asn Ala Thr Gly Met Thr Ala Val Asp65 70 75 80Val Thr Val Ala Gly Asn Asn Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Thr Gly Gly85 90 95Asn Ser Gly Thr Lys Arg Val His Ala Arg Ala Thr Lys Val Lys Met100 105 110Ser Ser Tyr Val Asn Lys Tyr Asn Thr Asn Tyr Ala Val Ala Lys Lys115 120 125Lys Ser Asn Gly Thr Ser Ala Asn Ser Asp Asp Ala Tyr Thr Gly Ser130 135 140
Thr Thr Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Tyr Thr His Val Val Trp Gly145 150 155 160Arg Gly Tyr Thr Ala Ser Asn Asp Ala Gly Tyr Val Ser Ala Tyr Ala165 170 175Asn Ala Gly Arg Thr Cys Val Lys Gly Lys Thr Lys His Asp Gly Thr180 185 190Ser Ser Met Thr Ala Ala Asn Ala Gly Trp Val Ala Asn Asn Asp Thr195 200 205Thr Tyr Tyr Val Val Asn Ser Asn Asn Tyr Thr Tyr Thr Gly Asp Ala210 215 220Val Lys Gly Lys Val Arg Asn His Lys Asp Asn Thr Thr Gly Gly Thr225 230 235 240Asn Asn Asn Thr Ser Ala Asn Asn Val Asn Cys Val Val Ala Ala Trp245 250 255Lys<210>108<211>161<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述唾液卟啉单胞菌B1 04 FimA多肽序列<400>108Ala Thr Val Met Val Tyr Asn Gly Ala Ser Ala Asn Ala Thr Lys Lys1 5 10 15Cys Ala Gly Arg Thr Val Val Met Ala Asn Thr Gly Met Gly Lys Thr20 25 30Ala Val Lys Ala Thr Thr Thr Asn Ala Gly Met Thr Ala Lys Val Lys35 40 45Ala Gly Lys Asn Gly Tyr Gly Gly Gly His Asn Arg Val His Ala Arg50 55 60Met Ala Thr Lys Val Met Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Tyr Thr Lys Tyr65 70 75 80
Gly Ala Lys Lys Ser Asn Gly Ala Thr Val Asn Ala Asp Ala Asn Tyr85 90 95Thr Gly Ser Thr Thr Asn Gly Ala Tyr Thr Asn Tyr Ala Asn Val Trp100 105 110Ser Arg Tyr Val Ala Ala Ala Gly Tyr Val Asn Asp Tyr Ser Ala Asn115 120 125Gly Thr His Thr Cys Val Tyr Gly Lys Lys Asn Gly Ala Asp Gly Asp130 135 140Ala Ala Ala Ala Asn Trp Val Asp Ala Gly Lys Thr Tyr Tyr Val Val145 150 155 160Asn<210>109<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.denticanis B106 FimA多肽序列<400>109Asn Gly Ala Ser Ala Asn Ala Thr Lys Asn Lys Cys Gly Ala Gly Arg1 5 10 15Thr Val Val Met Ala Asn Thr Gly Gly Met Ala Gly Lys Thr Ala Val20 25 30Lys Ala Thr Thr Val Thr Asn Ala Thr Gly Met Thr Ala Lys Ala Val35 40 45Lys Ala Gly Lys Asn Tyr Gly Tyr Asp Gly Ala Gly Gly Asn His Asn50 55 60Ala Lys Arg Val His Ala Arg Met Ala Thr Lys Val Met Ser Ala Ala65 70 75 80Tyr Asp Asn Tyr Thr Thr Lys Tyr Gly Ala Lys Lys Ser Asn Gly Ala85 90 95Thr Val Asn Ala Asp Ala Asn Tyr Thr Gly Ser Thr Thr Asn Gly Ala100 105 110
Tyr Thr Thr Asn Tyr Ala Asn Val Trp Ser Arg Asp Tyr Val Ala Thr115 120 125Ala Gly Ala Gly Tyr Val Asn Asp Tyr Ser Ala Asn Ser Gly Thr His130 135 140Thr Cys Val Tyr Gly Lys Lys Asn Gly Ala Asp Thr Gly Thr Asp Ala145 150 155 160Ala Ala Ala Ala Asn Trp Val Asp Ala Gly165 170<210>110<211>177<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙髓卟啉单胞菌B114 FimA多肽序列<400>110Lys Gly Ala Lys Ser Ala Asn Ala Lys Val Asn Lys Cys Gly Ala Gly1 5 10 15Ser Arg Thr Val Val Met Ala Asn Thr Gly Gly Met Ala Gly Lys Thr20 25 30Ala Val Lys Ala Thr Thr Thr Ala Asn Ala Thr Gly Met Thr Ala Val35 40 45Asp Val Thr Val Ala Gly Asn Asn Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Thr Gly50 55 60Gly Asn Ser Gly Thr Lys Arg Val His Ala Arg Ala Thr Lys Val Lys65 70 75 80Met Ser Ser Tyr Val Asn Lys Tyr Asn Thr Asn Tyr Ala Val Ala Lys85 90 95Lys Lys Ser Asn Gly Thr Ser Ala Asn Ser Asp Asp Ala Tyr Thr Gly100 105 110Ser Thr Thr Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Tyr Thr His Val Val Trp115 120 125Gly Arg Gly Tyr Thr Ala Ser Asn Asp Ala Gly Tyr Val Ser Ala Tyr
130 135 140Ala Asn Ala Gly Arg Thr Cys Val Lys Gly Lys Thr Lys His Asp Gly145 150 155 160Thr Ser Ser Met Thr Ala Ala Asn Ala Gly Trp Val Ala Asn Asn Asp165 170 175Thr<210>111<211>1024<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B43 oprF多核苷酸序列<400>111acattcgttg gagctattgc actgaatgca agtgcacagg aaaatactgt accggcaacg 60ggtcagttac ccgccaaaaa tgttgctttc gctcgcaaca aagcaggcag caattggttc 120gtaacactgc agggcggtgt tgcagcgcag ttcctcaatg acaacaacaa caaagatttt 180gtagaccgct tgggtgctgc cggctctatt tcagttggaa aatatcacaa tccattcttt 240gcaacccgtt tgcaaattaa cggagctcag gcacacacgt tccttggaaa aaatgcggaa 300caagaaatta agaccaattt tggcgcagct cactttgact tcatgttcga tgtggttaat 360tactttgcgc catatcgcga aaatcgtttc ttccatttaa ttccatgggt aggtgttggt 420taccagcata aattcattgg cagcaaatgg agtaaagaca atgtcgagtc tctgactgcc 480aatctgggtg ttatgatggc tttcagatta ggaaaacgtg tagactttgt gatcgaagca 540caagcagcac actccaatct caacttaagc cgtgctttca atgccaagcc gactcctatt 600ttccaggatc aggaaggacg ttattacaat ggattccaag gaatggcgac agcaggtctt 660aacttccgct tgggtgctgt aggcttcaat gccatcgagc ccatggacta cgcgcttatc 720aacgatctga atggtcagat taatcgcctg cgcagagaag tcgaagaact ctccaagcgt 780cctgtatcat gtcccgaatg ccccgacgtt acacccgtta ccaagacaga aaacaagcta 840accgagaagg ctgtactctt ccgtttcgac agctatgttg tagacaaaga ccagcttatc 900aatctgtatg acgtagctca gtttgtaaaa gaaaccaacg agccgattac tgttgtaggc 960tatgctgatc ctacgggtga cactcagtac aacgaaagat tgtctgagcg tcgcgcaaaa 1020gccg 1024<210>112<211>1024<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述犬口腔卟啉单胞菌B46 oprF多核苷酸序列<400>112acattggccg gggtttacgc cctttcagcc tctgctcagc aggagaatat gccacgaatg 60gggcagactc ccgccaagaa taccgcttac gctcgctctg aagccggtga caattggttt 120gtgactttgc aaggaggtgc tgctatgcag tttgggaaag gtaacgagga tgccgacttc 180ttcgaccgcc aaactgttgc tcccactttt gccgtaggta aatggcacaa tcctttcttc 240gggaccagat tgcaaatggg cttgggggta tctcacgact tctcgaacaa cgaagcgaaa 300tccaagttgg agatgaacca cgctcgctat gctaacgcac actttgactt tatgtttgat 360gtgattaact acttcaagcc ctacagtgag gaccgcgtat tccaccttat tccgtgggta 420
ggtttgggtt acgatcacaa gtttgagaaa aacagcaact tcaaggtgga tgctcttaca 480gccaacgccg gtttgatgtt tgctttccgt gtgatggagc gtatggacat tgtgttggaa 540agccaggtaa tgtattctga cttcaacctc aacacagctc tgcccgagcc tcgctacaca 600gcttgctccg gcatgctcac tgccggtttg aacttccgta taggaaatat cggatggagc 660gagatcctac caatggattg gggcttggta aatgacctga acggacaaat caacgccatg 720cgtgctaaga acgcagagtt gagcaagcgt cccgtttctt gccccgaatg cccggaagtt 780gagcctcgtg tagagcgtat caatatgctt tcggacaagt ctgttctttt ccgtgccggc 840aagacaactg tagacagcga tcaaatggta acgatcttcg acgtagctca gtttgcaaag 900aagaatggca cacagatcac cgttacaggc tatgcagaca agaagggcaa agaaagcgat 960cgcacctctg aacttcgtgc aaaagccgta gccaagattc tcaccgacaa gtacggtgta 1020cctt 1024<210>113<211>1024<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙周卟啉单胞菌B52 oprF多核苷酸序列<400>113tctataatgg gagctacagc actctccgcg agtgctcaac aatctacgac acctgagact 60caaactttgc cagctcgcaa gacggctttt gaccgttccg cgggtcactg gttcttgact 120ctacagggtg gtgtaaatgc acagtttttg gaagaaaacg agtctcaaga catcgtaaat 180cgtctccgtg tgatgccaac tctttcttta ggaaagtggc acaatcccta ttttgcaacc 240cgtttgcaag tttttggggg gccaacccct acttactaca aggaggtttc tggggaggtt 300aagaccctaa ataccgccat ggctggagct cactttgatt ttatgtttga tgtagtaaac 360ttctatgcaa agtataatcc taaacgagta ttccatttga ttccttggtt cggtgtggga 420tatggtttca aatactataa cgattttgct gatttagctg atatgattca gtttaatgaa 480cccttccgtc actcagcaac tgcgaatgct ggtttgatga tgagttttcg cttggcaaaa 540cgtttggatt tggttctgga agggcaggct atatattcta acttgaatat tgtaaagcaa 600gagatagatt ataaagcccc cattatgccc tattcaaata tctacaacgg attgacaggt 660gtcgttactg caggtctcaa ctttaatctc ggtcgtgttg cttgggagtc cgtaactcct 720atggatatgg atcttattaa tgacctaaac ggacaaatta accgtttgcg ttctgagaat 780acagagttga gaaaacgtcc agtttcttgc ccagaatgtc ctgaagttac tgcagagacg 840gaagtagtta ctgaaaacgt tttaggtgat aaggcgattg ttttcaagtt taatagcgca 900actattgaca aagatcaaca cattgttttg caggatatcg ctgactttgt taaagatggc 960aacaaagcta ttgttgtaat aggcttcgca gatacaacag gtgatattaa ttacaetatg 1020catt 1024<210>114<211>1024<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B69 0prF多核苷酸序列<400>114acattcgttg gagctattgc actgaatgca agtgcacagg aaaatactgt accggcaacg 60ggtcagttac ccgccaaaaa tgttgctttt gcccgcaata aagcaggcgg caattggttt 120gtaacactgc aaggtggtgt tgcagcacag ttccttaatg acaacaacaa caaagatcta 180gtagaccgct taggagctac cggatctatc tccgttggaa aatatcacaa tccattcttt 240gcgactcgtt tgcaaattaa cggaggtcaa gcacacacgt tccttgggaa gaatgcggaa 300caagaaatta acaccaattt tggagcagct cactttgact tcatgttcga tgtggttaac 360tactttgcgc catatcgcga aaaccgtttc ttccatttaa ttccatgggt aggtgttggt 420taccaacaca aattcatcgg tagcgaatgg agtaaagaca acgtcgagtc gctgaccgca 480
aacatgggtg ttatgatggc tttcagatta gggaagcgcg tggactttgt gatcgaagca 540caagctgctc actccaatct taatttaagt cgcgcattca atgccaagaa aactcctatt 600ttccacgatc aagaaggtcg ctattacaat ggattccaag gaatggctac agcgggtctt 660aacttccgct taggtgctgt tggcttcaat gccatcgagc caatggacta cgcgcttatc 720aacgatctga atggtcagat taaccgtttg cgcagagaag ttgaagagct ctctaagcgt 780cctgtatcat gccccgaatg tcccgatgta acacccgtta ctaagacaga aaacaagcta 840accgagaagg ctgtactctt ccgcttcgac agctatgttg tagacaaaga ccagctgatc 900aatctgtatg acgttgctca gttcgtaaaa gaaactaacg aaccgattac cgttgtaggt 960tatgccgatc ctacgggcag cactcagtac aacgaaagat tgtctgagcg tcgcgcaaaa 1020gccg 1024<210>115<211>1024<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙周卟啉单胞菌B97 oprF多核苷酸序列<400>115tctgttatgg gagctacagc actcacagtt agtgctcagc aacctactac acctgagact 60cagacattgc ctgctcataa gacggctttt gaccgttctg caggacattg gttcttgact 120ctccaaggtg gagttagtgc tcaattttta gaagaaaatg aaagtcaaga aatcttgaat 180cgtcttcatg ttatgcctac aatctcttta ggcaagtggc acaatcctta ttttgcaact 240cgtttgcaag tgttcggagg tcctactcct actttttata agaatgctgc tggtaaggtg 300atgaaggaaa atgcggctat ggctggggct cactttgact ttatgtttga tgttgtgaac 360tactttggta agtataatcc aaagagagtc tttcatcttg tgccttggtt cggtgttgga 420tatggcttta aataccataa tgatttcgcc gaaatgagtg atatcattaa gtttaatgag 480ccttatcgcc attcagcaac agcgaatgca gggttgatga tgagtttccg cttagcaaaa 540cgtcttgatt tagtgcttga aggacaggct atatattcta atttgaatat tgttaagcaa 600gaaattgatt ataaagctcc ttctactcct tattctccaa attataatgg gcttttggga 660gttgttacag caggtcttaa ctttaatctt ggtcgtgttg cttgggagac tgttactccc 720atggatatgg atttgattaa tgatcttaat ggtcaaatca atcgtttgcg ttctgagaat 780actgagttga gaaaacgtcc tgtttcttgt cctgaatgcc cagaagtttc taaagaaaca 840actgtagtta cagaaaatgt attgggagac aaagctattg ttttcaaatt taatagtgca 900actatcagca aagatcaaca tattgttttg caagacattg cggactttgt taagaatgga 960aataaggggg ttgccgtgat aggtttcgca gatgtaacag gagatgccaa ttacaatatg 1020caac 1024<210>116<211>948<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述犬齿龈液卟啉单胞菌B98 oprF多核苷酸序列<400>116ggtggagtta gtgctcaatt tttagaagaa aatgaaagtc aagaaatctt gaatcgtctt 60catgttatgc ctacaatctc tttaggcaag tggcacaatc cttattttgc aactcgtttg 120caagtgttcg gaggtcctac tcctactttt tataagaatg ctgctggtaa ggtgatgaag 180gaaaatgcgg ctatggctgg ggctcacttt gactttatgt ttgatgttgt gaactacttt 240ggtaagtata atccaaagag agtctttcat cttgtgcctt ggttcggtgt tggatatggc 300tttaaatacc ataatgattt cgccgaaatg agtgatatca ttaagtttaa tgagccttat 360cgccattcag caacagcgaa tgcagggttg atgatgagtt tccgcttagc aaaacgtctt 420gatttagtgc ttgaaggaca ggctatatat tctaatttga atattgttaa gcaagaaatt 480gattataaag ctccttctac tccttattct ccaaattata atgggctttt gggagttgtt 540
acagcaggtc ttaactttaa tcttggtcgt gttgcttggg agactgttac tcccatggat 600atggatttga ttaatgatct taatggtcaa atcaatcgtt tgcgttctga gaatactgag 660ttgagaaaac gtcctgtttc ttgtcctgaa tgcccagaag tttctaaaga aacaactgta 720gttacagaaa atgtattggg agacaaagct attgttttca aatttaatag tgcaactatc 780agcaaagatc aacatattgt tttgcaagac attgcggact ttgttaagaa tggaaataag 840ggggttgccg tgataggttt cgcagatgta acaggagatg ccaattacaa tatgcaactt 900tctgaacgtc gtgctaaggc tgttgcggaa gctcttgtga atcaattc 948<210>117<211>969<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述唾液卟啉单胞菌B104 oprF多核苷酸序列<400>117cattggttct tgactctcca aggtggagtt agtgctcaat ttttagaaga aaatgaaagt 60caagaaatct tgaatcgtct tcatgttatg cctacaatct ctttaggcaa gtggcacaat 120ccttattttg caactcgttt gcaagtgttc ggaggtccta ctcctacttt ttataagaat 180gctgctggta aggtgatgaa ggaaaatgcg gctatggctg gggctcactt tgactttatg 240tttgatgttg tgaactactt tggtaagtat aatccaaaga gagtctttca tcttgtgcct 300tggttcggtg ttggatatgg ctttaaatac cataatgatt tcgccgaaat gagtgatatc 360attaagttta atgagcctta tcgccattca gcaacagcga atgcagggtt gatgatgagt 420ttccgcttag caaaacgtct tgatttagtg cttgaaggac aggctatata ttctaatttg 480aatattgtta agcaagaaat tgattataaa gctccttcta ctccttattc tccaaattat 540aatgggcttt tgggagttgt tacagcaggt cttaacttta atcttggtcg tgttgcctgg 600gagactatta ctcccatgga tatggatttg attaatgatc ttaatggtca aatcaatcgt 660ttgcgttctg agaatactga gttgagaaaa cgtcctgttt cttgtcctga atgcccagaa 720gtttctaaag aaacaactgt agttacagaa aatgtattgg gagacaaagc tattgttttc 780aaatttaata gtgcaactat cagcaaagat caacatattg ttttgcaaga cattgcggac 840tttgttaaga atggaaataa gggggttgcc gtgataggtt tcgcagatgt aacaggagat 900gccaattaca atatgcaact ttctgaacgt cgtgctaagg ctgttgcgga agctcttgtg 960aatcaattc 969<210>118<211>1024<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.denticanis B106 oprF多核苷酸序列<400>118gctcataaga cggcttttga ccgttctgca ggacattggt tcttgactct ccaaggtgga 60gttagtgctc aatttttaga agaaaatgaa agtcaagaaa tcttgaatcg tcttcatgtt 120atgcctacaa tctctttagg caagtggcac aatccttatt ttgcaactcg tttgcaagtg 180ttcggaggtc ctactcctac tttttataag aatgctgctg gtaaggtgat gaaggaaaat 240gcggctatgg ctggggctca ctttgacttt atgtttgatg ttgtgaacta ctttggtaag 300tataatccaa agagagtctt tcatcttgtg ccttggttcg gtgttggata tggctttaaa 360taccataatg atttcgccga aatgagtgat atcattaagt ttaatgagcc ttatcgccat 420tcagcaacag cgaatgcagg gttgatgatg agtttccgct tagcaaaacg tcttgattta 480gtgcttgaag gacaggctat atattctaat ttgaatattg ttaagcaaga aattgattat 540aaagctcctt ctactcctta ttctccaaat tataatgggc ttttgggagt tgttacagca 600ggtcttaact ttaatcttgg tcgtgttgct tgggagactg ttactcccat ggatatggat 660ttgattaatg atcttaatgg tcaaatcaat cgtttgcgtt ctgagaatac tgagttgaga 720aaacgtcctg tttcttgtcc tgaatgccca gaagtttcta aagaaacaac tgtagttaca 780
gaaaatgtat tgggagacaa agctattgtt ttcaaattta atagtgcaac tatcagcaaa 840gatcaacata ttgttttgca agacattgcg gactttgtta agaatggaaa taagggggtt 900gccgtgatag gtttcgcaga tgtaacagga gatgccaatt acaatatgca actttctgaa 960cgtcgtgcta aggctgttgc ggaagctctt gtgaatcaat tcggagttcc ttctgatatg 1020attt 1024<210>119<211>1024<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙髓卟啉单胞菌B114 0prF多核苷酸序列<400>119tcagcactgg gggctttggc acttacagct agtgctcaac aaactacgaa accagcgaat 60agtatgcccg cattcaagac tgcatttgaa cgcagcggcg gtcattggtt tctgacaatt 120cagggtggcc tgagtgctca acttttgggt gaaaatgaaa agatggactt tggcaagcgt 180ctgctacatg ctgccaaggc cagtgacaac acccaaacag aggctagcta cctacgcatc 240atgcccacgc tctctgtagg taaatggcat aatccctact ttgctactcg tgtacagctc 300ttcggtggtc tcactcctct ctacaatact gagggtggcg ttaatgtaca cacctacaac 360actgccacga tcggtgccca ctatgatttc atgtttgatg tagtaaacta tttcgccaag 420tacaacccca aacgtttctt ccacgtaatt ccttgggtgg gtcttggtta caacttcaag 480tatcatgatg tatttggatt caaggagccc tatcgtcact ctgtcacagg taacgcaggc 540atggagtttg ctttccgcct cggtaagcgt gtagaccttg tactcgaagc tcaggtagtg 600tacaacaacc tgaacctgat caagcaggaa gtcgactacg atgtagtcac tactccctat 660gtacctgctg atacatacgc tggtcttatg accatgttta ctgctggtct taacttcaat 720ctgggcaagg ttgagtggga aactgttgag ccgatggact accagctcat aaacgacttg 780aactctcaga tcagccgtct acgtagcgaa aacgcagagc tttccaagcg tcctgctttc 840tgccccgagt gtcccgaagt agaggaagta gaagatgttg ttgttgacca gtatgtcctc 900accgacaagg ctatcctctt cgactttgac aagagcaaca tccgcaagga ccaacaagct 960cagcttggta tgattgctga attcgtgaag aagtacaata cgcctatcgt ggtagtaggc 1020tatg 1024<210>120<211>375<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B43 OprF多肽序列<400>120Thr Phe Val Gly Ala Ile AlaLeu Asn Ala Ser Ala Gln Glu Asn Thr1 5 10 15Val Pro Ala Thr Gly Gln Leu Pro Ala Lys Asn Val Ala Phe Ala Arg20 25 30Asn Lys Ala Gly Ser Asn Trp Phe Val Thr Leu Gln Gly Gly Val Ala35 40 45Ala Gln Phe Leu Asn Asp Asn Asn Asn Lys Asp phe Val Asp Arg Leu50 55 60Gly Ala Ala Gly Ser Ile Ser Val Gly Lys Tyr His Asn Pro Phe Phe65 70 75 80
Ala Thr Arg Leu Gln Ile Asn Gly Ala Gln Ala His Thr Phe Leu Gly85 90 95Lys Asn Ala Glu Gln Glu Ile Lys Thr Asn Phe Gly Ala Ala His Phe100 105 110Asp Phe Met Phe Asp Val Val Asn Tyr Phe Ala Pro Tyr Arg Glu Asn115 120 125Arg Phe Phe His Leu Ile Pro Trp Val Gly Val Gly Tyr Gln His Lys130 135 140Phe Ile Gly Ser Lys Trp Ser Lys Asp Asn Val Glu Ser Leu Thr Ala145 150 155 160Asn Leu Gly Val Met Met Ala Phe Arg Leu Gly Lys Arg Val Asp Phe165 170 175Val Ile Glu Ala Gln Ala Ala His Ser Asn Leu Asn Leu Ser Arg Ala180 185 190Phe Asn Ala Lys Pro Thr Pro Ile Phe Gln Asp Gln Glu Gly Arg Tyr195 200 205Tyr Asn Gly Phe Gln Gly Met Ala Thr Ala Gly Leu Asn Phe Arg Leu210 215 220Gly Ala Val Gly Phe Asn Ala Ile Glu Pro Met Asp Tyr Ala Leu Ile225 230 235 240Asn Asp Leu Asn Gly Gln Ile Asn Arg Leu Arg Arg Glu Val Glu Glu245 250 255Leu Ser Lys Arg Pro Val Ser Cys Pro Glu Cys Pro Asp Val Thr Pro260 265 270Val Thr Lys Thr Glu Asn Lys Leu Thr Glu Lys Ala Val Leu Phe Arg275 280 285Phe Asp Ser Tyr Val Val Asp Lys Asp Gln Leu Ile Asn Leu Tyr Asp290 295 300Val Ala Gln Phe Val Lys Glu Thr Asn Glu Pro Ile Thr Val Val Gly305 310 315 320Tyr Ala Asp Pro Thr Gly Asp Thr Gln Tyr Asn Glu Arg Leu Ser Glu325 330 335Arg Arg Ala Lys Ala Val Val Asp Val Leu Thr Gly Lys Tyr Gly Val340 345 350Pro Ser Glu Leu Ile Ser Val Glu Trp Lys Gly Asp Thr Thr Gln Pro355 360 365Phe Asn Lys Lys Ala Trp Asn370 375<210>121<211>366
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述犬口腔卟啉单胞菌B46 oprF多肽序列<400>121Thr Leu Ala Gly Val Tyr Ala Leu Ser Ala Ser Ala Gln Gln Glu Asn1 5 10 15Met Pro Arg Met Gly Gln Thr Pro Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Ala Arg20 25 30Ser Glu Ala Gly Asp Asn Trp Phe Val Thr Leu Gln Gly Gly Ala Ala35 40 45Met Gln Phe Gly Lys Gly Asn Glu Asp Ala Asp Phe Phe Asp Arg Gln50 55 60Thr Val Ala Pro Thr Phe Ala Val Gly Lys Trp His Asn Pro Phe Phe65 70 75 80Gly Thr Arg Leu Gln Net Gly Leu Gly Val Ser His Asp Phe Ser Asn85 90 95Asn Glu Ala Lys Ser Lys Leu Glu Met Asn His Ala Arg Tyr Ala Asn100 105 110Ala His Phe Asp Phe Met Phe Asp Val Ile Asn Tyr Phe Lys Pro Tyr115 120 125Ser Glu Asp Arg Val Phe His Leu Ile Pro Trp Val Gly Leu Gly Tyr130 135 140Asp His Lys Phe Glu Lys Asn Ser Asn Phe Lys Val Asp Ala Leu Thr145 150 155 160Ala Asn Ala Gly Leu Met Phe Ala Phe Arg Val Met Glu Arg Met Asp165 170 175Ile Val Leu Glu Ser Gln Val Met Tyr Ser Asp Phe Asn Leu Asn Thr180 185 190Ala Leu Pro Glu Pro Arg Tyr Thr Ala Cys Ser Gly Met Leu Thr Ala195 200 205Gly Leu Asn Phe Arg Ile Gly Asn Ile Gly Trp Ser Glu Ile Leu Pro210 215 220Met Asp Trp Gly Leu Val Asn Asp Leu Asn Gly Gln Ile Asn Ala Met225 230 235 240Arg Ala Lys Asn Ala Glu Leu Ser Lys Arg Pro Val Ser Cys Pro Glu245 250 255Cys Pro Glu Val Glu Pro Arg Val Glu Arg Ile Asn Met Leu Ser Asp260 265 270Lys Sar Val Leu Phe Arg Ala Gly Lys Thr Thr Val Asp Ser Asp Gln275 280 285
Met Val Thr Ile Phe Asp Val Ala Gln Phe Ala Lys Lys Asn Gly Thr290 295 300Gln Ile Thr Val Thr Gly Tyr Ala Asp Lys Lys Gly Lys Glu Ser Asp305 310 315 320Arg Thr Ser Glu Leu Arg Ala Lys Ala Val Ala Lys Ile Leu Thr Asp325 330 335Lys Tyr Gly Val Pro Ser Asp Arg Ile Ser Ile Glu Trp Lys Gly VaL340 345 350Ser Glu Gln Val Tyr Asp Asn Arg Asp Trp Asn Arg Val Val355 360 365<210>122<211>382<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙周卟啉单胞菌B52 oprF多肽序列<400>122Ser Ile Met Gly Ala Thr Ala Leu Ser Ala Ser Ala Gln Gln Ser Thr1 5 10 15Thr Pro Glu Thr Gln Thr Leu Pro Ala Arg Lys Thr Ala Phe Asp Arg20 25 30Ser Ala Gly His Trp Phe Leu Thr Leu Gln Gly Gly Val Asn Ala Gln35 40 45Phe Leu Glu Glu Asn Glu Ser Gln Asp Ile Val Asn Arg Leu Arg Val50 55 60Met Pro Thr Leu Ser Leu Gly Lye Trp His Asn Pro Tyr Phe Ala Thr65 70 75 80Arg Leu Gln Val Phe Gly Gly Pro Thr Pro Thr Tyr Tyr Lys Glu Val85 90 95Ser Gly Glu Val Lys Thr Leu Asn Thr Ala Met Ala Gly Ala His Phe100 105 110Asp Phe Met Phe Asp Val Val Asn Phe Tyr Ala Lys Tyr Asn Pro Lys115 120 125Arg Val Phe His Leu Ile Pro Trp Phe Gly Val Gly Tyr Gly Phe Lys130 135 140Tyr Tyr Asn Asp Phe Ala Asp Leu Ala Asp Met Ile Gln Phe Asn Glu145 150 155 160Pro Phe Arg His Ser Ala Thr Ala Asn Ala Gly Leu Met Met Ser Phe165 170 175Arg Leu Ala Lys Arg Leu Asp Leu Val Leu Glu Gly Gln Ala Ile Tyr
180 185 190Ser Asn Leu Asn Ile Val Lys Gln Glu Ile Asp Tyr Lys Ala Pro Ile195 200 205Met Pro Tyr Ser Asn Ile Tyr Asn Gly Leu Thr Gly Val Val Thr Ala210 215 220Gly Leu Asn Phe Asn Leu Gly Arg Val Ala Trp Glu Ser Val Thr Pro225 230 235 240Met Asp Met Asp Leu Ile Asn Asp Leu Asn Gly Gln Ile Asn Arg Leu245 250 255Arg Ser Glu Asn Thr Glu Leu Arg Lys Arg Pro Val Ser Cys Pro Glu260 265 270Cys Pro Glu Val Thr Ala Glu Thr Glu Val Val Thr Glu Asn Val Leu275 280 285Gly Asp Lys Ala Ile Val Phe Lys Phe Asn Ser Ala Thr Ile Asp Lys290 295 300Asp Gln His Ile Val Leu Gln Asp Ile Ala Asp Phe Val Lye Asp Gly305 310 315 320Asn Lys Ala Ile Val Val Ile Gly Phe Ala Asp Thr Thr Gly Asp Ile325 330 335Asn Tyr Asn Met His Leu Ser Glu Arg Arg Ala Lys Ala Val Ala Glu340 345 350Ala Leu Val Asn Lys Phe Gly Val Ser Ser Asp Met Ile Ser Val Glu355 360 365Trp Gln Gly Glu Thr Glu Gln Phe Asn Pro Arg Ala Trp Asn370 375 380<210>123<211>375<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B69 OprF多肽序列<400>123Thr Phe Val Gly Ala Ile Ala Leu Asn Ala Ser Ala Gln Glu Asn Thr1 5 10 15Val Pro Ala Thr Gly Gln Leu Pro Ala Lys Asn Val Ala Phe Ala Arg20 25 30Asn Lys Ala Gly Gly Asn Trp Phe Val Thr Leu Gln Gly Gly Val Ala35 40 45Ala Gln Phe Leu Asn Asp Asn Asn Asn Lys Asp Leu Val Asp Arg Leu50 55 60
Gly Ala Thr Gly Ser Ile Ser Val Gly Lys Tyr His Asn Pro Phe Phe65 70 75 80Ala Thr Arg Leu Gln Ile Asn Gly Gly Gln Ala His Thr Phe Leu Gly85 90 95Lys Asn Ala Glu Gln Glu Ile Asn Thr Asn Phe Gly Ala Ala His Phe100 105 110Asp Phe Met Phe Asp Val Val Asn Tyr Phe Ala Pro Tyr Arg Glu Asn115 120 125Arg Phe Phe His Leu Ile Pro Trp Val Gly Val Gly Tyr Gln His Lys130 135 140Phe Ile Gly Ser Glu Trp Ser Lys Asp Asn Val Glu Ser Leu Thr Ala145 150 155 160Asn Met Gly Val Met Met Ala Phe Arg Leu Gly Lys Arg Val Asp Phe165 170 175Val Ile Glu Ala Gln Ala Ala His Ser Asn Leu Asn Leu Ser Arg Ala180 185 190Phe Asn Ala Lys Lys Thr Pro Ile Phe His Asp Gln Glu Gly Arg Tyr195 200 205Tyr Asn Gly Phe Gln Gly Met Ala Thr Ala Gly Leu Asn Phe Arg Leu210 215 220Gly Ala Val Gly Phe Asn Ala Ile Glu Pro Met Asp Tyr Ala Leu Ile225 230 235 240Asn Asp Leu Asn Gly Gln Ile Asn Arg Leu Arg Arg Glu Val Glu Glu245 250 255Leu Ser Lys Arg Pro Val Ser Cys Pro Glu Cys Pro Asp Val Thr Pro260 265 270Val Thr Lys Thr Glu Asn Lys Leu Thr Glu Lys Ala Val Leu Phe Arg275 280 285Phe Asp Ser Tyr Val Val Asp Lys Asp Gln Leu Ile Asn Leu Tyr Asp290 295 300Val Ala Gln Phe Val Lys Glu Thr Asn Glu Pro Ile Thr Val Val Gly305 310 315 320Tyr Ala Asp Pro Thr Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Arg Leu Ser Glu325 330 335Arg Arg Ala Lys Ala Val Val Asp Val Leu Thr Gly Lys Tyr Gly Val340 345 350Pro Ser Glu Leu Ile Ser Val Glu Trp Lys Gly Asp Ser Thr Gln Pro355 360 365Phe Asn Lys Lys Ala Trp Asn370 375
<210>124<211>382<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙周卟啉单胞菌B97oprF多肽序列<400>124Ser Val Met Gly Ala Thr Ala Leu Thr Val Ser Ala Gln Gln Pro Thr1 5 10 15Thr Pro Glu Thr Gln Thr Leu Pro Ala His Lys Thr Ala Phe Asp Arg20 25 30Ser Ala Gly His Trp Phe Leu Thr Leu Gln Gly Gly Val Ser Ala Gln35 40 45Phe Leu Glu Glu Asn Glu Ser Gln Glu Ile Leu Asn Arg Leu His Val50 55 60Met Pro Thr Ile Ser Leu Gly Lys Trp His Asn Pro Tyr Phe Ala Thr65 70 75 80Arg Leu Gln Val Phe Gly Gly Pro Thr Pro Thr Phe Tyr Lys Asn Ala85 90 95Ala Gly Lys Val Met Lys Glu Asn Ala Ala Met Ala Gly Ala His Phe100 105 110Asp Phe Met Phe Asp Val Val Asn Tyr Phe Gly Lys Tyr Asn Pro Lys115 120 125Arg Val Phe His Leu Val Pro Trp Phe Gly Val Gly Tyr Gly Phe Lys130 135 140Tyr His Asn Asp Phe Ala Glu Met Ser Asp Ile Ile Lys Phe Asn Glu145 150 155 160Pro Tyr Arg His Ser Ala Thr Ala Asn Ala Gly Leu Met Met Ser Phe165 170 175Arg Leu Ala Lys Arg Leu Asp Leu Val Leu Glu Gly Gln Ala Ile Tyr180 185 190Ser Asn Leu Asn Ile Val Lys Gln Glu Ile Asp Tyr Ays Ala Pro Ser195 200 205Thr Pro Tyr Ser Pro Asn Tyr Asn Gly Leu Leu Gly Val Val Thr Ala210 215 220Gly Leu Asn Phe Asn Leu Gly Arg Val Ala Trp Glu Thr Val Thr Pro225 230 235 240Met Asp Met Asp Leu Ile Asn Asp Leu Asn Gly Gln Ile Asn Arg Leu245 250 255Arg Ser Glu Asn Thr Glu Leu Arg Lys Arg Pro Val Ser Cys Pro Glu260 265 270
Cys Pro Glu Val Ser Lys Glu Thr Thr Val Val Thr Glu Asn Val Leu275 280 285Gly Asp Lys Ala Ile Val Phe Lys Phe Asn Ser Ala Thr Ile Ser Lys290 295 300Asp Gln His Ile Val Leu Gln Asp Ile Ala Asp Phe Val Lys Asn Gly305 310 315 320Asn Lys Gly Val Ala Val Ile Gly Phe Ala Asp Val Thr Gly Asp Ala325 330 335Asn Tyr Asn Met Gln Leu Ser Glu Arg Arg Ala Lys Ala Val Ala Glu340 345 350Ala Leu Val Asn Gln Phe Gly Val Pro Ser Asp Met Ile Ser Val Glu355 360 365Trp Gln Gly Glu Thr Glu Leu Phe Glu Ala Arg Ala Trp Asn370 375 380<210>125<211>316<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述犬齿龈液卟啉单胞菌B98 oprF多肽序列<400>125Gly Gly Val Ser Ala Gln Phe Leu Glu Glu Asn Glu Ser Gln Glu Ile1 5 10 15Leu Asn Arg Leu His Val Met Pro Thr Ile Ser Leu Gly Lys Trp His20 25 30Asn Pro Tyr Phe Ala Thr Arg Leu Gln Val Phe Gly Gly Pro Thr Pro35 40 45Thr Phe Tyr Lys Asn Ala Ala Gly Lys Val Met Lys Glu Asn Ala Ala50 55 60Met Ala Gly Ala His Phe Asp Phe Met Phe Asp Val Val Asn Tyr Phe65 70 75 80Gly Lys Tyr Asn Pro Lys Arg Val Phe His Leu Val Pro Trp Phe Gly85 90 95Val Gly Tyr Gly Phe Lys Tyr His Asn Asp Phe Ala Glu Met Ser Asp100 105 110Ile Ile Lys Phe Asn Glu Pro Tyr Arg His Ser Ala Thr Ala Asn Ala115 120 125Gly Leu Met Met Ser Phe Arg Leu Ala Lys Arg Leu Asp Leu Val Leu130 135 140Glu Gly Gln Ala Ile Tyr Ser Asn Leu Asn Ile Val Lys Gln Glu Ile145 150 155 160
Asp Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Pro Tyr Ser Pro Asn Tyr Asn Gly Leu165 170 175Leu Gly Val Val Thr Ala Gly Leu Asn Phe Asn Leu Gly Arg Val Ala180 185 190Trp Glu Thr Val Thr Pro Met Asp Met Asp Leu Ile Asn Asp Leu Asn195 200 205Gly Gln Ile Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asn Thr Glu Leu Arg Lys Arg210 215 220Pro Val Ser Cys Pro Glu Cys Pro Glu Val Ser Lys Glu Thr Thr Val225 230 235 240Val Thr Glu Asn Val Leu Gly Asp Lys Ala Ile Val Phe Lys Phe Asn245 250 255Ser Ala Thr Ile Ser Lys Asp Gln His Ile Val Leu Gln Asp Ile Ala260 265 270Asp Phe Val Lys Asn Gly Asn Lys Gly Val Ala Val Ile Gly Phe Ala275 280 285Asp Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Asn Met Gln Leu Ser Glu Arg Arg290 295 300Ala Lys Ala Val Ala Glu Ala Leu Val Asn Gln Phe305 310 315<210>126<211>323<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述唾液卟啉单胞菌B104 oprF多肽序列<400>126His Trp Phe Leu Thr Leu Gln Gly Gly Val Ser Ala Gln Phe Leu Glu1 5 10 15Glu Asn Glu Ser Gln Glu Ile Leu Asn Arg Leu His Val Met Pro Thr20 25 30Ile Ser Leu Gly Lys Trp His Asn Pro Tyr Phe Ala Thr Arg Leu Gln35 40 45Val Phe Gly Gly Pro Thr Pro Thr Phe Tyr Lys Asn Ala Ala Gly Lys50 55 60Val Met Lys Glu Asn Ala Ala Met Ala Gly Ala His Phe Asp Phe Met65 70 75 80Phe Asp Val Val Asn Tyr Phe Gly Lys Tyr Asn Pro Lys Arg Val Phe85 90 95His Leu Val Pro Trp Phe Gly Val Gly Tyr Gly Phe Lys Tyr His Asn
46/72100 105 110Asp Phe Ala Glu Met Ser Asp Ile Ile Lys Phe Asn Glu Pro Tyr Arg115 120 125His Ser Ala Thr Ala Asn Ala Gly Leu Met Met Ser Phe Arg Leu Ala130 135 140Lys Arg Leu Asp Leu Val Leu Glu Gly Gln Ala Ile Tyr Ser Asn Leu145 150 155 160Asn Ile Val Lys Gln Glu Ile Asp Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Pro Tyr165 170 175Ser Pro Asn Tyr Asn Gly Leu Leu Gly Val Val Thr Ala Gly Leu Asn180 185 190Phe Asn Leu Gly Arg Val Ala Trp Glu Thr Ile Thr Pro Met Asp Met195 200 205Asp Leu Ile Asn Asp Leu Asn Gly Gln Ile Asn Arg Leu Arg Ser Glu210 215 220Asn Thr Glu Leu Arg Lys Arg Pro Val Ser Cys Pro Glu Cys Pro Glu225 230 235 240Val Ser Lys Glu Thr Thr Val Val Thr Glu Asn Val Leu Gly Asp Lys245 250 255Ala Ile Val Phe Lys Phe Asn Ser Ala Thr Ile Ser Lys Asp Gln His260 265 270Ile Val Leu Gln Asp Ile Ala Asp Phe Val Lys Asn Gly Asn Lys Gly275 280 285Val Ala Val Ile Gly Phe Ala Asp Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Asn290 295 300Met Gln Leu Ser Glu Arg Arg Ala Ays Ala Val Ala Glu Ala Leu Val305 310 315 320Asn Gln Phe<210>127<211>349<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.denticanis B106 oprF多肽序列<400>127Ala His Lys Thr Ala Phe Asp Arg Ser Ala Gly His Trp Phe Leu Thr1 5 10 15Leu Gln Gly Gly Val Ser Ala Gln Phe Leu Glu Glu Asn Giu Ser Gln20 25 30
Glu Ile Leu Asn Arg Leu His Val Met Pro Thr Ile Ser Leu Gly Lys35 40 45Trp His Asn Pro Tyr Phe Ala Thr Arg Leu Gln Val Phe Gly Gly Pro50 55 60Thr Pro Thr Phe Tyr Lys Asn Ala Ala Gly Lys Val Met Lys Glu Asn65 70 75 80Ala Ala Met Ala Gly Ala His Phe Asp Phe Met Phe Asp Val Val Asn85 90 95Tyr Phe Gly Lys Tyr Asn Pro Lys Arg Val Phe His Leu Val Pro Trp100 105 110Phe Gly Val Gly Tyr Gly Phe Lys Tyr His Asn Asp Phe Ala Glu Met115 120 125Ser Asp Ile Ile Lys Phe Asn Glu Pro Tyr Arg His Ser Ala Thr Ala130 135 140Asn Ala Gly Leu Met Met Ser Phe Arg Leu Ala Lys Arg Leu Asp Leu145 150 155 160Val Leu Glu Gly Gln Ala Ile ryr Ser Asn Leu Asn Ile Val Lys Gln165 170 175Glu Ile Asp Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Pro Tyr Ser Pro Asn Tyr Asn180 185 190Gly Leu Leu Gly Val Val Thr Ala Gly Leu Asn Phe Asn Leu Gly Arg195 200 205Val Ala Trp Glu Thr Val Thr Pro Met Asp Met Asp Leu Ile Asn Asp210 215 220Leu Asn Gly Gln Ile Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asn Thr Glu Leu Arg225 230 235 240Lys Arg Pro Val Ser Cys Pro Glu Cys Pro Glu Val Ser Lys Glu Thr245 250 255Thr Val Val Thr Glu Asn Val Leu Gly Asp Lys Ala Ile Val Phe Lys260 265 270Phe Asn Ser Ala Thr Ile Ser Lys Asp Gln His Ile Val Leu Gln Asp275 280 285Ile Ala Asp Phe Val Lys Asn Gly Asn Lys Gly Val Ala Val Ile Gly290 295 300Phe Ala Asp Val Thr Gly Asp Ala Asn Tyr Asn Met Gln Leu Ser Glu305 310 315 320Arg Arg Ala Lys Ala Val Ala Glu Ala Leu Val Asn Gln Phe Gly Val325 330 335Pro Ser Asp Met Ile Ser Val Glu Trp Gln Gly Glu Thr340 345
<210>128<211>395<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述牙髓卟啉单胞菌B114 oprF多肽序列
<400>128Ser Ala Leu Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Gln Gln Thr Thr1 5 10 15Lys Pro Ala Asn Ser Met Pro Ala Phe Lys Thr Ala Phe Glu Arg Ser20 25 30Gly Gly His Trp Phe Leu Thr Ile Gln Gly Gly Leu Ser Ala Gln Leu35 40 45Leu Gly Glu Asn Glu Lys Met Asp Phe Gly Lys Arg Leu Leu His Ala50 55 60Ala Lys Ala Ser Asp Asn Thr Gln Thr Glu Ala Ser Tyr Leu Arg Ile65 70 75 80Met Pro Thr Leu Ser Val Gly Lys Trp His Asn Pro Tyr Phe Ala Thr85 90 95Arg Val Gln Leu Phe Gly Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Asn Thr Glu Gly100 105 110Gly Val Asn Val His Thr Tyr Asn Thr Ala Thr Ile Gly Ala His Tyr115 120 125Asp Phe Met Phe Asp Val Val Asn Tyr Phe Ala Lys Tyr Asn Pro Lys130 135 140Arg Phe Phe His Val Ile Pro Trp Val Gly Leu Gly Tyr Asn Phe Lys145 150 155 160Tyr His Asp Val Phe Gly Phe Lys Glu Pro Tyr Arg His Ser Val Thr165 170 175Gly Asn Ala Gly Met Glu Phe Ala Phe Arg Leu Gly Lys Arg Val Asp180 185 190Leu Val Leu Glu Ala Gln Val Val Tyr Asn Asn Leu Asn Leu Ile Lys195 200 205Gln Glu Val Asp Tyr Asp Val Val Thr Thr Pro Tyr Val Pro Ala Asp210 215 220Thr Tyr Ala Gly Leu Met Thr Met Phe Thr Ala Gly Leu Asn Phe Asn225 230 235 240Leu Gly Lys Val Glu Trp Glu Thr Val Glu Pro Met Asp Tyr Gln Leu245 250 255Ile Asn Asp Leu Asn Ser Gln Ile Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asn Ala260 265 270
Glu Leu Ser Lys Arg Pro Ala Phe Cys Pro Glu Cys Pro Glu Val Glu275 280 285Glu Val Glu Asp Val Val Val Asp Gln Tyr Val Leu Thr Asp Lys Ala290 295 300Ile Leu Phe Asp Phe Asp Lys Ser Asn Ile Arg Lys Asp Gln Gln Ala305 310 315 320Gln Leu Gly Met Ile Ala Glu Phe Val Lys Lys Tyr Asn Thr Pro Ile325 330 335Val Val Val Gly Tyr Ala Asp Pro Thr Gly Lys Ser Lys Tyr Asn Met340 345 350Glu Leu Ser Lys Arg Arg Ala Gln Ala Val Val Asn Glu Leu Thr Asn355 360 365Arg His Gly Val Pro Ala Asp Leu Ile Thr Met Glu Trp Glu Gly Ala370 375 380Thr Asn Lys Phe Thr Pro Pro Thr Ala Trp Asn385 390 395<210>129<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B43 FimA多肽片段序列#1<400>129Ala Cys Asn Lys Asp Asn Glu Ala Glu Pro Val Val1 5 10<210>130<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B43 FimA多肽片段序列#2<400>130Tyr Pro Val Leu Val Asn Phe Glu Ser Asn Asn Tyr Thr Tyr Thr Gly1 5 10 15Asp Ala Val Glu Lys20<210>131<211>16<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B43 FimA多肽片段序列#3<400>131Thr Gly Pro Gly Thr Asn Asn Pro Glu Asn Pro Ile Thr Glu Ser Ala1 5 10 15<210>132<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B43 OprF多肽片段序列#1<400>132Asn Asp Asn Asn Asn Lys Asp Phe Val Asp Arg Leu Gly Ala1 5 10<210>133<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B43 OprF多肽片段序列#2<400>133Asp Leu Asn Gly Gln Ile Asn Arg Leu Arg Arg Glu Val Glu Glu Leu1 5 10 15Ser Lys Arg Pro Val Ser Cys Pro Glu Cys Pro Asp Val20 25<210>134<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述P.gulae B43 OprF多肽片段序列#3<400>134Ala Asp Pro Thr Gly Asp Thr Gln Tyr Asn Glu Arg Leu Ser Glu Arg1 5 10 15Arg Ala Lys Ala Val20<210>135<211>47<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pBAD-HisA氨基末端多肽序列<400>135Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr1 5 10 15Gly Gly Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Arg20 25 30Trp Gly Ser Glu Leu Glu Ile Cys Ser Gln Tyr His Met Gly Ile35 40 45<210>136<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述pBAD-TOPO氨基末端多肽序列<400>136Met Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Leu Ala Leu Met1 5 10 15<210>137<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述1载体氨基末端多肽序列<400>137Met Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Leu His Met1 5 10<210>138<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B107 16S rRNA多核苷酸序列<400>138cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180
ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt540aatcgcacat cagccatggt gcggtgaata c 571<210>139<211>515<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B113 16S rRNA多核苷酸序列<400>139cacgccgtta aacgatgctc accggctcta tgcgataaga cagtatgggg ctaatagaaa60taattaagtg agccacctgg ggagtacgtc ggcaacgatg aaactcaaag gaattgacgg120gggcccgcac aagcggagga acatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttaccc180gggtttaaat gtatgttgca ttatgtagaa atacgtattt tcttcggaac tgcatacaag240gtgctgcatg gttgtcgtca gctcgtgccg tgaggtgtcg ggttaagtcc cataacgagc300gcaaccctta tgattagttg ctaacggttc aagccgagca ctctattcac actgccaccg360taaggtgcga ggaaggaggg gatgatgtca aatcagcacg gcccttatat ccggggctac420acacgtgtta caatggtcgg tacagcgggt tgcatttacg tgagtaacag ctaatcccaa480aaatcggtct cagttcggat tggagtctgc aactc 515<210>140<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B126 16S rRNA 多核苷酸序列<400>140cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180
ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt540aatcgcacat cagccatggt gcggtgaata c 571<210>141<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B129 16S rRNA多核苷酸序列<400>141cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt540aatcgcacat cagccatggt gcggtgaata c 571<210>142<211>574<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B135 16S rRNA多核苷酸序列<400>142cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180
ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actccactcc atgaagttgg attcgctagt540aatcgcacat caaccatggt gcggtgaata cgtt574<210>143<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B140 16S rRNA多核苷酸序列<400>143cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt540aatcgcacat cagccatggt gcggtgaata c 571<210>144<211>514<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B150 16S rRNA多核苷酸序列<400>144cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac ggtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120
ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actc514<210>145<211>514<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B151 16S rRNA多核苷酸序列<400>145cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac ggtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actc514<210>146<211>553<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B152 16S rRNA多核苷酸序列<400>146cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac ggtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240
tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt540aatcgcacat caa 553<210>147<211>568<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B155 16S rRNA多核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(209)..(209)<223>n是a，c，g，或t<400>147cacgccgtaa acgatgctca ccgtgctcta tgcgataaga cggtatgggg ctaatagaaa60taattaagtg atgccacctg gggagtacgt cggcaacgat gaaactcaaa ggaattgacg120ggggcccgca caagcggagg aacatgtggt ttaattcgat gatacgcgag gaaccttacc180cgggtttaaa tgtatgttgc attatgtana aatacgtatt ttcttcggaa ctgcatacaa240ggtgctgcat ggttgtcgtc agctcgtgcc gtgaggtgtc gggttaagtc ccataacgag300cgcaaccctt acgattagtt gctaacggtt caagccgagc actctattca cactgccacc360gtaaggtgcg aggaaggagg ggatgatgtc aaatcagcac ggcccttata tccggggcta420cacacgtgtt acaatggtcg gtacagcggg ttgcatttac gtgagtaaca gctaatccca480aaaatcggtc tcagttcgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtt ggattcgcta540gtaatcgcac atcaaccatg gtgcgggt 568<210>148<211>569<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B163 16S rRNA多核苷酸序列<400>148
cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attccctagt540aatcgcacat caaccatggt gcggtcaat 569<210>149<211>353<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B171 16S rRNA多核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(197)..(197)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(225)..(225)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(264)..(264)<223>n是a ， c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(280)..(280)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(289)..(289)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(297)..(297)<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature<222>(336)..(336)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(338)..(338)<223>n是a，c，g，或t<400>149cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatacgaaa60taattaagtg agccacctgg ggagtacgtc ggcaacgatg aaactcaaag gaattgacgg120gggcccgcac aagcggagga acatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttaccc180gggtttaaat gtatgtngca ttatgtagaa atacgtattt tcttnggaac tgcatacaag240gtgctgcatg gttgtcgtca gctngtgccg tgaggtgtcn ggttaagtnc cataacnagc300gcaaccctta tgattagttg ctaacggttc aagccnanca ctctattcac act 353<210>150<211>570<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B172 16S rRNA多核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(195)..(195)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(278)..(278)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(287)..(287)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(295)..(295)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(334)..(334)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature
<222>(353)..(353)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(355)..(35 5)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(367)..(367)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(373)..(373)<223> n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(387)..(387)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(409)..(409)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(486)..(486)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(540)..(540)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(550)..(550)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(562)..(562)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(564)..(564)<223>n是a，c，g，或t<400>150cacgccgtaa acgatgctcc cggctctatg cgataagaca gtatggggct aatagaaata60attaagtgag ccacctgggg agtacgtcgg caacgatgaa actcaaagga attgacgggg120gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacccgg180gtttaaatgt atgtngcatt atgtagaaat acgtattttc ttcggaactg catacaaggt240
gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgtcngg ttaagtncca taacnagcgc300aacccttatg attagttgct aacggttcaa gccnagcact ctattcacac tgncnccgta360aggtgcnagg aangagggga tgatgtnaaa tcagcacggc ccttatatnc ggggctacac420acttgttaca atggtcggta cagcgggttg catttacgtg agtaacagct aatcccaaaa480atcggnctca gttcggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagttgga ttcgctagtn540atcgcacatn acccatggtg cngngaatac 570<210>151<211>514<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B174 16S rRNA多核苷酸序列<400>151cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actc514<210>152<211>572<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B183 16S rRNA多核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(56)..(56)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(127)..(127)
<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(197)..(197)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(225)..(225)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(265)..(265)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(278)..(278)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(289)..(289)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(336)..(336)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(357)..(357)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(369)..(369)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(375)..(375)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(389)..(389)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(425)..(425)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(453)..(453)<223>n是a，c，g，或t
<220>
<221>misc_feature<222>(488)..(488)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(516)..(516)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(527)..(527)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(547)..(547)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(552)..(552)<223>n是a，c，g，或t<400>152cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatangaaa60taattaagtg agccacctgg ggagtacgtc ggcaacgatg aaactcaaag gaattgacgg120gggcccncac aagcggagga acatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttaccc180gggtttaaat gtatgtngca ttatgtagaa atacgtattt tcttnggaac tgcatacaag240gtgctgcatg gttgtcgtca gctcntgccg tgaggtgncg ggttaagtnc cataacgagc300gcaaccctta tgattagttg ctaacggttc aagccnagca ctctattcac actgtcnccg360taaggtgcna ggaangaggg gatgatgtna aatcagcacg gcccttatat tcggggctac420acacntgtta caatggtcgg tacagcgggt tgnatttacg tgagtaacag ctaatcccaa480aaatcggnct cagttcggat tggagtctgc aactcnactc catgaangtt ggattcctag540taatcgnaca tnaaccatgg tgcggtgaat ac 572<210>153<211>572<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B264 16S rRNA多核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(70)..(70)
<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(343)..(343)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(345)..(345)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(389)..(389)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(462)..(462)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_eature<222>(493)..(493)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(505)..(505)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(515)..(515)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(517)..(517)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(554)..(554)<223>n是a，c，g，或t<400>153caccgccgta aacgatgaat actaggtgta ggaggtatcg accccttctg tgccgtcgca60aacgcaatan gtattccacc tggggagtac ggccgcaagg ttgaaactca aaggaattga120cgggggcccg cacaagcagt ggagtatgtg gtttaattcg acgcaacgcg aagaacctta180ccagggcttg acatcctctg accggcttag agataagcct tcccttcggg gcagagagac240aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tcggttaagt ccggcaacga300gcgcaacccc tatggtctgt taccagcatt gagttgggga ctnanacaag actgccgttg360acaaaacgga ggaaggtggg gacgacgtna aatcatcatg ccccttatgt cctgggctac420
acacgtacta caatggctac aacagagggc agcgacaccg cnaggtgaag cgaatcccga480aatgtaatcc canttcggat tgcangctgc aactngnctg catgaagtcg gaattgctag540taatggcagg tcangcatac tgccgtgaat ac 572<210>154<211>570<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B265 16S rRNA多核苷酸序列<400>154acgccgtaaa cgatgctcac cggctctatg cgataagacg gtatggggct aatagaaata60attaagtgag ccacctgggg agtacgtcgg caacgatgaa actcaaagga attgacgggg120gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacccgg180gtttaaatgt atgttgcatt atgtagaaat acgtattttc ttcggaactg catacaaggt240gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgtcggg ttaagtccca taacgagcgc300aacccttatg attagttgct aacggttcaa gccgagcact ctattcacac tgccaccgta360aggtgcgagg aaggagggga tgatgtcaaa tcagcacggc ccttatatcc ggggctacac420acgtgttaca atggtcggta cagcgggttg catttacgtg agtaacagct aatcccaaaa480atcggtctca gttcggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagttgga ttcgctagta540atcgcacatc aaccatggtg cggtgaatac 570<210>155<211>570<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B26716S rRNA多核苷酸序列<400>155cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac ggtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360
aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca 420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa 480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt 540aatcgcacat caaccatggt gcggtgaata 570<210>156<211>570<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B269 16S rRNA多核苷酸序列<400>156cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac ggtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt540aatcgcacat cagccatggt gcggtgaata 570<210>157<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B363 16S rRNA多核苷酸序列<400>157cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360
aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt540aatcgcacat cagccatggt gcggtgaata c 571<210>158<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B365 16S rRNA多核苷酸序列<400>158cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt540aatcgcacat cagccatggt gcggtgaata c 571<210>159<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B366 16S rRNA多核苷酸序列<400>159cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac agtatggggc taatagaaat60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg300
caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt 360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca 420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa 480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt 540aatcgcacat cagccatggt gcggtgaata c 571<210>160<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B368 16S rRNA多核苷酸序列<400>160cacgccgtaa acgatgctca ccggctctat gcgataagac ggtatggggc taatagaaat 60aattaagtga gccacctggg gagtacgtcg gcaacgatga aactcaaagg aattgacggg 120ggcccgcaca agcggaggaa catgtggttt aattcgatga tacgcgagga accttacccg 180ggtttaaatg tatgttgcat tatgtagaaa tacgtatttt cttcggaact gcatacaagg 240tgctgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgccgt gaggtgtcgg gttaagtccc ataacgagcg 300caacccttat gattagttgc taacggttca agccgagcac tctattcaca ctgccaccgt 360aaggtgcgag gaaggagggg atgatgtcaa atcagcacgg cccttatatc cggggctaca 420cacgtgttac aatggtcggt acagcgggtt gcatttacgt gagtaacagc taatcccaaa 480aatcggtctc agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagttgg attcgctagt 540aatcgcacat cagccatggt gcggtgaata c 571<210>161<211>572<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticania B456 16S rRNA多核苷酸序列<400>161caccgccgta aacgatgctc accggctcta tgcgataaga cagtatgggg ctaatagaaa 60taattaagtg agccacctgg ggagtacgtc ggcaacgatg aaactcaaag gaattgacgg 120gggcccgcac aagcggagga acatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttaccc 180gggtttaaat gtatgttgca ttatgtagaa atacgtattt tcttcggaac tgcatacaag 240gtgctgcatg gttgtcgtca gctcgtgccg tgaggtgtcg ggttaagtcc cataacgagc 300
gcaaccctta tgattagttg ctaacggttc aagccgagca ctctattcac actgccaccg360taaggtgcga ggaaggaggg gatgatgtca aatcagcacg gcccttatat ccggggctac420acacgtgtta caatggtcgg tacagcgggt tgcatttacg tgagtaacag ctaatcccaa480aaatcggtct cagttcggat tggagtctgc aactcgactc catgaagttg gattcgctag540taatcgcaca tcagccatgg tgcggtgaat ac 572<210>162<211>571<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B457 16S rRNA多核苷酸序列<400>162caccgccgta aacgatgctc accggctcta tgcgataaga cagtatgggg ctaatagaaa60taattaagtg agccacctgg ggagtacgtc ggcaacgatg aaactcaaag gaattgacgg120gggcccgcac aagcggagga acatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttaccc180gggtttaaat gtatgttgca ttatgtagaa atacgtattt tcttcggaac tgcatacaag240gtgctgcatg gttgtcgtca gctcgtgccg tgaggtgtcg ggttaagtcc cataacgagc300gcaaccctta tgattagttg ctaacggttc aagccgagca ctctattcac actgccaccg360taaggtgcga ggaaggaggg gatgatgtca aatcagcacg gcccttatat ccggggctac420acacgtgtta caatggtcgg tacagcgggt tgcatttacg tgagtaacag ctaatcccaa480aaatcggtct cagttcggat tggagtctgc aactcgactc catgaagttg gattcgctag540taatcgcaca tcagccatgg tgcggtgaat a 571<210>163<211>567<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B381 16S rRNA多核苷酸序列<400>163cgcacagtaa acgatgaata ctcgctgttt gcgatacacg gtaagcggcc aagcgaaagc60gttaagtatt ccacctgggg agtacgccgg caacggtgaa actcaaagga attgacgggg120gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacccgg180gcttaaattg cgctggcttt taccggaaac ggtattttct tcggaccagc gtgaaggtgc240
tgcatggttg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgtcggctt aagtgccata acgagcgcaa300cccttatctt tagttgccat caggttttgc tggggactct aaagagactg ccgtcgtaag360atgcgaggaa ggtggggatg acgtcaaatc agcacggccc ttacgtccgg ggctacacac420gtgttacaat ggggagcaca gcaggttgct acacggcgac gtgatgccaa tccgtaaaac480tcctctcagt tcggatcgaa gtctgcaacc cgacttcgtg aagctggatt cgctagtaat540cgcgcatcag ccacggcgcg gtgaata567<210>164<211>564<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B401 16S rRNA多核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(20)..(20)<223>n是a，c，g，或t<220>
<221>misc_feature<222>(545)..(545)<223>n是a，c，g，或t<400>164catgtaaacg angaatactn gctgtttgcg atacacggta agcggccaag cgaaagcgtt60aagtattcca cctggggagt acgccggcaa cggtgaaact caaaggaatt gacgggggcc120cgcacaagcg gaggaacatg tggtttaatt cgatgatacg cgaggaacct tacccgggct180taaattgcgc tggcttttac cggaaacggt attttcttcg gaccagcgtg aaggtgctgc240atggttgtcg tcagctcgtg ccgtgaggtg tcggcttaag tgccataacg agcgcaaccc300ttatctttag ttgccatcag gttttgctgg ggactctaaa gagactgccg tcgtaagatg360cgaggaaggt ggggatgacg tcaaatcagc acggccctta cgtccggggc tacacacgtg420ttacaatggg gagcacagca ggttgctaca cggcgacgtg atgccaatcc gtaaaactcc480tctcagttcg gatcgaagtc tgcaacccga cttcgtgaag ctggattcgc tagtaatcgc540gcatnagcca cggcgcggtg aata 564<210>165
<211>564<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B417 16S rRNA多核苷酸序列<400>165acagtaaacg atgaatactc gctgtttgcg atacacggta agcggccaag cgaaagcgtt 60aagtattcca cctggggagt acgccggcaa cggtgaaact caaaggaatt gacgggggcc 120cgcacaagcg gaggaacatg tggtttaatt cgatgatacg cgaggaacct tacccgggct 180taaattgcgc tggcttttac cggaaacggt attttcttcg gaccagcgtg aaggtgctgc 240atggttgtcg tcagctcgtg ccgtgaggtg tcggcttaag tgccataacg agcgcaaccc 300ttatctttag ttgccatcag gttttgctgg ggactctaaa gagactgccg tcgtaagatg 360cgaggaaggt ggggatgacg tcaaatcagc acggccctta cgtccggggc tacacacgtg 420ttacaatggg gagcacagca ggttgctaca cggcgacgtg atgccaatcc gtaaaactcc 480tctcagttcg gatcgaagtc tgcaacccga cttcgtgaag ctggattcgc tagtaatcgc 540gcatcagcca cggcgcggtg aata 564<210>166<211>567<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B418 16S rRNA多核苷酸序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>n是a，c，g，或t<400>156cncacagtaa acgatgaata ctcgctgttt gcgatacacg gtaagcggcc aagcgaaagc 60gttaagtatt ccacctgggg agtacgccgg caacggtgaa actcaaagga attgacgggg 120gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacccgg 180gcttaaattg cgctggcttt taccggaaac ggtattttct tcggaccagc gtgaaggtgc 240tgcatggttg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgtcggctt aagtgccata acgagcgcaa 300cccttatctt tagttgccat caggttttgc tggggactct aaagagactg ccgtcgtaag 360atgcgaggaa ggtggggatg acgtcaaatc agcacggccc ttacgtccgg ggctacacac 420gtgttacaat ggggagcaca gcaggttgct acacggcgac gtgatgccaa tccgtaaaac 480
tcctctcagt tcggatcgaa gtctgcaacc cgacttcgtg aagctggatt cgctagtaat540cgcgcatcag ccacggcgcg gtgaata567<210>167<211>567<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B421 16S rRNA多核苷酸序列<400>167cgcacagtaa acgatgaata ctcgctgttt gcgatacacg gtaagcggcc aagcgaaagc60gttaagtatt ccacctgggg agtacgccgg caacggtgaa actcaaagga attgacgggg120gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacccgg180gcttaaattg cgctggcttt taccggaaac ggtattttct tcggaccagc gtgaaggtgc240tgcatggttg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgtcggctt aagtgccata acgagcgcaa300cccttatctt tagttgccat caggttttgc tggggactct aaagagactg ccgtcgtaag360atgcgaggaa ggtggggatg acgtcaaatc agcacggccc ttacgtccgg ggctacacac420gtgttacaat ggggagcaca gcaggttgct acacggcgac gtgatgccaa tccgtaaaac480tcctctcagt tcggatcgaa gtctgcaacc cgacttcgtg aagctggatt cgctagtaat540cgcgcatcag ccacggcgcg gtgaata567<210>168<211>565<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述o.denticanis B422 16S rRNA多核苷酸序列<400>168acagtaaacg atgaatactc gctgtttgcg atacacggta agcggccaag cgaaagcgtt60aagtattcca cctggggagt acgccggcaa cggtgaaact caaaggaatt gacgggggcc120cgcacaagcg gaggaacatg tggtttaatt cgatgatacg cgaggaacct tacccgggct180taaattgcgc tggcttttac cggaaacggt attttcttcg gaccagcgtg aaggtgctgc240atggttgtcg tcagctcgtg ccgtgaggtg tcggcttaag tgccataacg agcgcaaccc300ttatctttag ttgccatcag gttttgctgg ggactctaaa gagactgccg tcgtaagatg360cgaggaaggt ggggatgacg tcaaatcagc acggccctta cgtccggggc tacacacgtg420
ttacaatggg gagcacagca ggttgctaca cggcgacgtg atgccaatcc gtaaaactcc480tctoagttcg gatcgaagtc tgcaacccga cttcgtgaag ctggattcgc tagtaatcgc540gcatcagcca cggggcggtg aatac 565<210>169<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>169gagtttgatc ctggctcagg20
权利要求
1.疫苗，所述的疫苗用于在伴侣动物中治疗或预防牙周病，其含有P.gulae B43，唾液卟啉单胞菌B104和0.denticanis B106的灭活的全细胞制剂和可药用载体。
2.权利要求1的疫苗，其中细菌通过福尔马林灭活。
3.权利要求1的疫苗，所述的疫苗进一步含有犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒-2(CAV-2)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPI)或犬冠状病毒(CCV)中至少一种。
4.用于在伴侣动物中治疗或预防牙周病的方法，所述的方法包括将根据权利要求1-3任意一项的疫苗施用给有此需要的伴侣动物。
5.试剂盒，所述的试剂盒在至少一个容器中含有用于在伴侣动物中治疗和预防牙周病的组合物，其中所述的组合物含有可药用载体和P.gulae B43、唾液卟啉单胞菌B104和0.denticanis B106的灭活的全细胞制剂；其中该试剂盒进一步包含一份打印的说明书，其标明该试剂盒可用于在伴侣动物中治疗或预防牙周病。
6.一种评估疫苗对抗一种或多种牙周病致病性细菌的效力的方法，所述的方法包括a.将含有一种或多种灭活的或减毒的牙周致病性细菌的疫苗施用给第一种动物；b.用有效量的含有一种或多种牙周致病性细菌的攻击培养物攻击所述的动物；c.用相同量的所述的攻击培养物攻击第二种未接种的动物，其中第二种动物是与第一种动物相同的物种。d.测量由所述牙周致病性细菌引起的疾病的临床信号；并且e.将接种动物中表现的疾病的临床信号与未接种动物中表现的疾病的临床信号比较，因而测定所述的疫苗的效力。
7.权利要求6的方法，其中所述的疫苗含有卟啉单胞菌、拟杆菌、普雷沃氏菌、Tannerella或密螺旋体的至少一个种的减毒的或活的细菌。
8.权利要求6的方法，其中将所述的攻击培养物导入至牙根物质已经除去了的牙齿的牙根管中，随后放置修复物。
9.权利要求6的方法，其中所述的第一种和第二种动物是伴侣动物。
10.权利要求6的方法，其中每攻击剂量所述的攻击培养物含有约1×102-约1×1012菌落形成单位(CFU)。
11.权利要求6的方法，其中每攻击剂量所述的攻击培养物含有约1×105-约1×1011菌落形成单位(CFU)。
12.权利要求6的方法，其中每攻击剂量所述的攻击培养物含有约5×107-约5×1010菌落形成单位(CFU)。
13.权利要求6的方法，其中所述的临床信号包括龈沟液、牙菌斑、受感染的骨或龈沟中增加水平的一种或多种牙周致病性细菌，或牙槽骨的量的变化。
14.权利要求6的方法，其中所述的骨的变化是在牙槽骨的根尖周围区域。
15.权利要求6的方法，其中所述的骨的变化通过放射照相测量来定量。
全文摘要
本发明涉及新的由它们的16S rRNA DNA鉴别的细菌分离菌株(其在伴侣动物中引起牙周病)、其中包含的多核苷酸序列、由这种多核苷酸编码的多肽和包含这种细菌、多核苷酸或多肽的疫苗。本发明也提供用于治疗和预防牙周病的方法以及用于检测和治疗牙周病的试剂盒和用于检测和预防牙周病的试剂盒。而且，提供了用于评估在动物中疫苗对抗牙周病的效力的方法。
文档编号C07K14/195GK101014363SQ200580023018
公开日2007年8月8日 申请日期2005年3月21日 优先权日2004年5月21日
发明者K·J·德雷尔, J·M·哈德翰姆, J·D·豪沃斯, K·W·金, R·科里珊, D·R·麦加文 申请人:辉瑞产品公司