一种牙周病病原菌快速检验的试剂盒与检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物检测技术领域，尤其涉及病原菌的检验。
【背景技术】
[0002]牙周病仅次于龋病，是危害人类牙齿健康的第二大口腔疾病，通常由龈下菌斑引起。人口腔内的细菌附着在牙齿表面形成牙菌斑，当这些细菌及其产物进入牙龈，会引起牙龈纤维溶解及炎症，炎症导致牙槽骨吸收，随之出现牙齿松动甚至脱落。牙周病不仅会造成不适感和疼痛感，削弱咀嚼能力和消化能力，而且据相关报道，也与中风、冠心病、糖尿病等重大疾病有一定的关系。及时发现牙周病，并加以控制和治疗，对牙齿健康具有重要意义。
[0003]目前常用的临床检验方法大多基于传统的问诊方式，通过肉眼观察牙周袋的形貌，牙齿松动程度等。常用的X光检验则只能检测牙周病造成的骨组织破坏。这些方法都只能适用于对中晚期的、处于发病期的情况进行诊断，很难用于牙周病的预防和早期报告。在最近十年间，随着人们对牙周病致病菌的深入认识，微生物检测逐渐得到关注。例如牙龈口卜啉菌(PorphyromonasGingivalis,下文用 Pg 表不)，齿密螺旋体(TreponemaDenticola,下文用Td表示),福赛斯坦纳菌(TannerellaForsythensis, Tf)等被认为是与牙周病发病密切相关的特异性细菌。检测可采用如细菌培养、形态学观察、荧光抗体法、生化学形状、代谢产物、酶等多种方法，各种方法各有特点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种牙周病病原菌快速检验的试剂盒，以解决上述技术问题。
[0005]本发明的目的还在于提供一种用牙周病病原菌快速检验的试剂盒来检验牙周病病原菌的方法。
[0006]本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现:
[0007]—种牙周病病原菌快速检验的试剂盒，其特征在于，包括无菌取样器，裂解液，PCR反应液和电泳液；
[0008]所述无菌取样器是一用于从口腔中采集细菌样本的无菌取样器；
[0009]所述裂解液是一用于破坏采集到的细菌的细胞膜，使得细菌细胞的内容物，包括细菌的DNA释放到溶液中的裂解液；
[0010]所述PCR反应液是一用于对Pg细菌、Td细菌中的至少一种的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖的PCR反应液；
[0011]所述电泳液是一用于将采用所述PCR反应液得到的DNA分子进行电泳分离，使得DNA分子的电泳时间与其分子长度呈现正相关的关系的电泳液。
[0012]所述无菌取样器可以是无菌棉签、吸潮纸尖中的任意一种。
[0013]所述裂解液可以是PBS (Phosphate Buffered Saline)。
[0014]所述PCR 反应液可以包括:1X Tris 缓冲液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和dTTP)各2.5nM，DNA聚合酶，以及Pg细菌的特异性引物200nM，上述溶液均以去离子水配制。所述引物序列为:
[0015]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0016]下游引物:3’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5’
[0017]试剂盒保存条件:-20°C，
[0018]用于对Pg细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖。
[0019]所述PCR 反应液可以包括:1X Tris 缓冲液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和dTTP)各2.5nM，DNA聚合酶，以及Td细菌的特异性引物200nM，上述溶液均以去离子水配制。所述引物序列为:
[0020]上游引物:5’ -GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3 ’
[0021]下游引物:3’-TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5’
[0022]试剂盒保存条件:-20°C，
[0023]用于对Td细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖。
[0024]所述PCR 反应液包括:1X Tris 缓冲液(pH=8)，dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各2.5nM，DNA聚合酶，以及Pg细菌和Td细菌的特异性引物各200nM，上述溶液均以去离子水配制。所述引物序列为:
[0025]Pg 细菌
[0026]上游引物:5’ -TGTAGATGACTGGTGAAAACC-3 ’
[0027]下游引物:3’ -ACGTCATCCCCACCTTCCTC-5，
[0028]Td 细菌
[0029]上游引物:5，-GCGTATGTAACCTGCCCGCA-3’
[0030]下游引物:3，-TCGTTCAGTGTCAGTTATACCT-5’
[0031]试剂盒保存条件:_20°C
[0032]用于同时对Pg和Td细菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖。
[0033]所述试剂盒包含的试剂体积优选不超过200 μ L，以减少试剂盒的体积。
[0034]一种用牙周病病原菌快速检验的试剂盒来检验牙周病病原菌的方法:
[0035]步骤一，使用所述无菌取样器，擦拭龈沟或牙周袋，取得含有口腔细菌的龈缝液；
[0036]步骤二，将无菌取样器沾有龈缝液的部分浸泡在所述裂解液中，使得样本中的口腔细菌的内容物释放在溶液中；
[0037]步骤三,取步骤二所得到的溶液适量,添加到所述PCR反应液中，给予PCR反应条件，使病原菌的16S rDNA序列进行特异性的复制增殖；
[0038]步骤四，取步骤三所得到的溶液适量，使用所述电泳液进行毛细管电泳分离和检测，根据电泳检测到的DNA情况，得出病原菌的类型。
[0039]上述步骤一中，擦拭龈沟或牙周袋的时间优选为I分钟。
[0040]步骤二中，浸泡时间最好不少于2分钟，优选3分钟，以使得内容物充分释放在溶液中。
[0041]步骤三中，优选取步骤二所得到的溶液适量I μ L0 PCR反应条件可以是将试剂(含样本)放置在常规PCR仪中，95°C (预热)2分钟，然后设置95°C (变性)10秒和64°C (退火和延伸)30秒两个温度阶段并反复循环多次，对Pg、Td或两者同时进行特异性的PCR增殖。分析不同样本的PCR反应条件是相同的，可以对多个样本同时进行PCR反应，例如常见的32孔、48孔、96孔等。
[0042]步骤四中:当使用含有Pg细菌的特异性引物的试剂盒时，若电泳检测到197bp的DNA,即表明口腔中有Pg细菌，反之则没有。当使用含有Td细菌的特异性引物的试剂盒时，若电泳检测到311bp的DNA，即表明口腔中有Td细菌，反之则没有。当使用含有Pg细菌和Td细菌的特异性引物的试剂盒时，若电泳检测到197bp，表明口腔中含有Pg细菌；若电泳检测到311bp，表明口腔中含有Td细菌；若197bp和311bp都被检测到，表明同时含有Pg和Td两种细菌。反之，若没有197bp，则没有Pg细菌；若没有311bp，则没有Td细菌；若197bp和311bp都没有，则两种细菌都没有。
[0043]本发明的有益效果在于:
[0044]特异性强，灵敏度高。通过PCR反应和特异性引物，样本中对应于Pg和Td的DNA序列数量得到极大增加，其增殖倍数可达I O9，样本中的少量Pg和Td细菌就可被检测到，十分适合早期预报和发现。而样本中其它来源的DNA数量则不会得到增加，不会干扰目标细菌的检验。
[0045]速度快，效率高。当使用本领域人员所知晓的常规PCR仪和常规毛细管电泳设备，每个样本平均的检验时间通常不超过8分钟。
[0046]试剂盒以及运行成本低。本发明所述试剂盒包含的试剂体积很小，通常不超过200 μ L,因此整个试剂盒的成本，以及分析检测的运行成本都很低。
【附图说明】
[0047]图1是采用(I)所述试剂盒，经过取样、裂解、PCR反应和毛细管电泳后得到的检测信号。
[0048]图2是采用(2)所述试剂盒，经过取样、裂解、PCR反应和毛细管电泳后得到的检测信号。
【具体实施方式】
[0049]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示进一步阐述本发明。
[0050]( I) Pg快速检验试剂盒
[0051](1.1)所述Pg快速检验试剂盒包括有:无菌取样器，裂解液，PCR反应液和电泳液。
[0052](1.2)所述无菌取样器用于从口腔中采集细菌样本，例如无菌棉签、吸潮纸尖。
[0053](1.3)所述裂解液用于破坏