雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物的制作方法

专利名称：雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型39-去甲氧基雷帕霉素衍生物(39-desmethoxyrapamycinderivatives)，它们的制备方法，及它们的用途。在另一方面，本发明提供39-去甲氧基雷帕霉素衍生物用于治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤(B-cellmalignancies)，诱导或维持免疫抑制(immunosuppression)，治疗移植排斥(transplantation rejection)、移植物抗宿主病(graft vs.host disease)、自体免疫性疾病(autoimmune disorders)、炎性疾病(diseases of inflammation)、血管疾病(vascular disease)和纤维化疾病(fibrotic diseases)，以及刺激神经再生(neuronal regeneration)或治疗真菌感染(fungal infections)。

背景技术：
雷帕霉素(西罗莫司)(

图1)是由吸湿链霉菌NRRL 5491产生的亲脂性的大环内酯(Sehgal等，1975；Vézina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993，749)，其带有与哌可酸内酯相连的1，2，3-三羰基部分(Paiva等，1991)。对于本发明的目的来说，不使用Findlay等(1980)或化学文摘(第11累积索引，1982-1986 p60719CS)的编号方式规定，而通过McAlpine等(1991)的编号方式规定来描述雷帕霉素。
由于其广谱生物活性，雷帕霉素具有显著的治疗价值。雷帕霉素表现出中等抗真菌活性，主要是抗念珠菌属(Candida)的菌种，但还能抗丝状真菌(Baker等，1978；Sehgal等，1975；Vezina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993,749)。雷帕霉素通过靶向多种细胞类型中的信号传导途径，例如，通过抑制使细胞周期从G1阶段发展到S-阶段的信号传导途径来抑制细胞增殖(Kuo等，1992)。在T细胞中，雷帕霉素抑制来自IL-2受体的信号传导和随后的导致免疫抑制的T细胞自发增殖。雷帕霉素的抑制作用并不局限于T细胞，因为雷帕霉素能抑制多种哺乳动物细胞类型的增殖(Brunn等，1996)。因此，雷帕霉素是有效的免疫抑制剂，在预防器官同种异体移植排斥和治疗自身免疫疾病方面具有已经确定的或推测的治疗应用(Kahan等，1991)。40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素(SDZ RAD，RAD 001，Certican，everolimus)是半合成的雷帕霉素类似物，它表现出免疫抑制药理学作用且也作为抗癌剂受到研究(Sedrani，R.等，1998；Kirchner等，2000；Boulay等，2004，U.S.5,665,772)。该药物作为免疫抑制剂于2003年在欧洲获得批准。雷帕霉素酯衍生物CCI-779(Wyeth-Ayerst)在体外抑制细胞生长，并且在体内抑制肿瘤生长(Yu等，2001)。CCI-779作为潜在的抗癌剂目前正处在第III阶段临床试验。雷帕霉素在治疗慢性斑块性银屑病方面的价值(Kirby和Griffiths，2001)，在诸如刺激PC12细胞的神经突长出方面的潜在用途(Lyons等，1994)，在机械损伤之后通过血管和平滑肌细胞阻断对细胞因子的增殖响应(Gregory等，1993)，以及它在预防同种异体移植纤维化方面的作用(Waller and Nicholson，2001)是强化研究的领域(Kahan and Camardo，2001)。最近的报导揭示雷帕霉素与进行长期免疫抑制治疗的器官同种异体移植患者与进行其他免疫抑制方案的患者相比较低的癌症发病率相关，并且这种降低的癌症发病率归因于抑制了血管生成(Guba等，2002)。已报导亲免素(immunophilin)配体的神经营养活性独立于它们的免疫抑制活性(Steiner等，1997)，并且神经生长刺激作用通过成熟类固醇受体复合物的破坏而得到促进，正如在专利申请WO 01/03692中所概括的。已经报导了诸如高脂血症和血小板减少症以及潜在的致畸效应的副作用(Hentges等，2001；Kahan和Camardo，2001)。
雷帕霉素的聚酮化合物(polyketide)主链是通过一共七个丙酸酯和七个乙酸酯单元与莽草酸衍生的环己烷羧酸起始单元借助包含I型聚酮化合物合酶的非常大的多官能蛋白质头尾缩合(heat-to-tail condensation)而合成(rapPKS，Paiva等，1991)。L-赖氨酸衍生的氨基酸，哌可酸通过酰胺键缩合在聚酮化合物主链的最后一个乙酸酯上(Paiva等，1993)，然后通过内酯化作用形成所述大环。
三种雷帕霉素PKS基因、NRPS-编码基因和侧翼晚期基因(flanking lategene)序列的每一种的核苷酸序列以及相应的多肽被Aparicio等，1996，和Schwecke等，1995鉴定，并且由NCBI以保藏号X86780保藏，对该序列的修正最近已经在WO 04/007709中公开。
雷帕霉素生物合成基因簇的第一种无酶产物已经被命名为前-雷帕霉素(WO 04/007709，Gregory等，2004)。全面加工过的雷帕霉素的生产需要通过由雷帕霉素晚期基因所编码的酶，RapJ，RapN，RapO，RapM，RapQ和RapI对聚酮化合物/NRPS核心进行额外加工。
迄今为止所表征的雷帕霉素的药理学作用据信是通过与被称为FKBP的细胞液受体的相互作用介导的。真核T-细胞中的主要细胞内雷帕霉素受体是FKBP12(DiLeIIa and Craig，1991)，并且所得到的复合物特异性地与靶蛋白相互作用，以抑制细胞的信号转导级联反应。
已经在酵母中鉴定了雷帕霉素-FKBP12复合物的靶物，称为TOR(雷帕霉素的靶物)(Alarcon等，1999)，并且将哺乳动物蛋白称作FRAP(FKBP-雷帕霉素相关蛋白)或mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶物)(Brown等，1994)。
已经描述了mTOR信号传导和神经元中的定位蛋白合成之间的联系；它对参与翻译控制的蛋白磷酸化状态的影响；翻译机构(translationmachinery)的成分在转录和翻译水平上的丰度；氨基酸透性酶活性的控制，以及参与代谢途径的多种酶的转录调节(Raught等，2001)。雷帕霉素敏感型信号传导途径似乎还在胚胎大脑发育，学习和记忆形成方面发挥重要作用(Tang等，2002)。在酵母中对TOR蛋白的研究也已发现了它们在调节营养物敏感型信号传导途径中的作用(Hardwick等，1999)。类似地，已将mTOR鉴定为蛋白激酶B(akt)作用的直接靶物，并且在胰岛素信号传导中起着关键作用(Shepherd等，1998；Navé等，1999)。也已将哺乳动物TOR与肌动蛋白细胞骨骼的极化和翻译起始的调控相关(Alarcon等，1999)。磷脂酰肌醇3-激酶，如mTOR，在肿瘤病理学的若干方面起作用，如细胞-周期进展，粘附，细胞存活和血管生成(Roymans和Siegers，2001)。
雷帕霉素和雷帕霉素类似物的药物动力学研究已经证实需要开发新型雷帕霉素化合物，该化合物在溶液中更稳定，具有更高的对于代谢攻击(metabolic attack)的抗性和/或具有改进的细胞膜穿透性和减少的流出，并因此具有改善的口腔生物利用度。
已经报道利用分子上可化学利用的位点来合成一些雷帕霉素类似物。以下化合物的说明与图1所述雷帕霉素分子的编号系统相适应。分子上用于衍生或取代的可化学利用的位点包括C40和C28羟基(如U.S.5,665,772；U.S.5,362,718)、C39和C16甲氧基(如WO 96/41807；U.S.5,728,710)、C32、C26和C9酮基(如U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772)。在C17、C19和/或C21上氢化，靶向于三烯，可保持抗真菌活性但相应损失了免疫抑制能力(如U.S.5,391,730；U.S.5,023,262)。通过衍生化，已经显著改善了分子的稳定性(如在C32、C40和/或C28上形成肟，U.S.5,563,145,U.S.5,446,048)、对代谢攻击的耐受性(如U.S.5,912,253)、生物利用度(如U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；WO 98/04279)并产生前药(如U.S.6,015,815；U.S.5,432,183)。
然而，仍需要大量具有改进的代谢稳定性、增加的细胞膜穿透性和减少的流出率的雷帕霉素衍生物。这些雷帕霉素衍生物在大量病症的治疗中具有很大的效用。本发明提供了大量具有改进的代谢稳定性、增加的细胞膜穿透性和减少的流出率的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物，和/或对雷帕霉素的不同细胞抑制图谱(profile)。这些化合物在医药中是有用的，特别用于治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤，诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥、移植物抗宿主病、自体免疫性疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维化疾病，以及刺激神经再生或治疗真菌感染。
发明概述 本发明提供雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物，制备这些化合物的方法，其中间体和这些化合物在医药中的用途。
在其最广义方面，本发明提供了雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物，该衍生物的特征在于，其40-羟基位点被衍生为羧酸酯、醚、磷酸酯、次膦酸酯(phosphinate)、缩醛或糖基。
如下所述，可以测试本发明化合物的代谢稳定性、细胞膜穿透性、流出和生物利用度。
当39-去甲氧基雷帕霉素被衍生为羧酸酯、醚或缩醛时，衍生基团优选含有不多于12个碳原子(特别为7个或更少，尤其为5个或更少的碳原子)。优选它含有至少一个官能团(特别是至少两个官能团)，该官能团选自-CF2PO(OH)2、-PO(OH)2、-COOH、-OH和-NH2，特别是选自-COOH和-OH，更特别为-OH。
当39-去甲氧基雷帕霉素衍生为由糖基衍生的缩醛时，优选每个糖基由优选含有不多于12个碳原子(特别为7个或更少，尤其为6个或更少的碳原子)的糖或糖苷形成。实例包括单糖和二糖，特别是形成5和6元环的单糖。优选它含有至少一个官能团(特别是至少两个官能团)，该官能团选自-COOH、-OH和-NH2，特别是选自-NH2和-OH，更特别为-OH。
当39-去甲氧基雷帕霉素被衍生为磷酸酯时，优选烷基含有不多于4个碳原子。
当39-去甲氧基雷帕霉素被衍生为次膦酸酯时，优选烷基含有不多于4个碳原子，实例为与膦酸形成的酯。
下面给出了衍生基团的具体实例。
在更具体的方面，本发明提供下式(I)的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物，或其药用盐
(I) 其中 X表示键或CH2； R1表示酮基或(H，H)； R2表示OH或OMe； R3表示H、OH或OMe； R4和R5各自独立地表示H或OH； R6表示-R7、-C(O)R7、-(CH2)2-O-[CR21R22-O]a-C(O)-R23；-CR21R22-O-C(O)-R23；-POR19R20，-PO(OR19)(OR20)或Y-R15； R7表示-(CR8R9)m(CR10R11)pCR12R13R14； R8和R9各自独立地表示C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，上述任意基团可任选被-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH或-NH2取代；或者R8和R9各自独立地表示H、三氟甲基或F； R10、R11、R12、R13和R14各自独立地表示C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，上述任意基团可任选被-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH或-NH2取代；或者R10、R11、R12、R13和R14可独立地选自H、-(CR8R9)qNH2、-(CR8R9)qOH、CF3、F、COOH；或者R10和R11或R12和R13或R13和R14可与它们连接的碳结合在一起形成C3-C6环烷基或3-6元杂烷基环，该杂烷基环含有一个或多个选自N、O和S的杂原子，并任选地被最多5个-(CR8R9)qOH、-(CR8R9)qNH2或COOH基团取代；Y＝键、-C(O)-O-；-(CH2)2-O-C(O)-O-； R15表示

或
R16各自独立为H或OH； R17独立地选自H、OH和NH2； R18独立地选自H、-CH3、-CH2OH和-COOH； 但条件是选自R16、R17和R18的最多2个基团表示H或CH3； R19和R20各自独立地表示H或C1-C4烷基或R19和R20一起表示＝CH2； R21独立地选自H、CH3； R22独立地选自H，-CH3、-CH＝CH2、-CH2Cl、-CHCl2、-CCl3、-CH(OH)Me、-CH2OH、-CH2CH3、-CH(Cl)Me； R23独立地为R7、Y-R15或5或6元芳基或杂芳基环，任选被1-3个选自OH、F、Cl、Br、NO2和NH2的基团取代； a表示0或1； m、p和q各自独立地表示0-4的整数； 但条件是，R7基团不含多于12个的碳原子，并且含有至少一个选自-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-COOH、OH或NH2的官能团。
上述结构显示了代表性的互变异构体，本发明包含式(I)化合物所有的互变异构体，例如，显示烯醇化合物时包括酮类化合物，反之亦然。
除非特别指出的特定立体异构体(例如，通过在结构式中相关立构中心处的粗体键或虚线键，通过结构式中将双键描述为E或Z构型，或者通过使用立体化学指定命名法)，所有立体异构体作为纯化合物及其混合物都包括在本发明的范围内。除非另有说明，单个对映异构体、非对映异构体、几何异构体，及它们的组合和混合物都涵盖于本发明中。同质多晶型和溶剂化物及水合物也包含在本发明的范围内。
在另一方面，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素衍生物，例如式(I)的化合物或其药用盐，用作药物。
定义 本文所用的冠词“一”和“一个“指一个或一个以上(即至少一个)合乎语法的冠词对象。例如，“类似物”指一个或一个以上类似物。
本文中使用的术语“类似物”表示结构上与其他类似物相似但是在组成上略微不同的化合物(例如，一个原子被另一个原子取代或存在或不存在特定的官能团)。
特别是，术语“39-去甲氧基雷帕霉素类似物”指由WO 2004/007709的方法制备的和/或式(II)显示的39-去甲氧基雷帕霉素化合物。这些化合物也称为“母体化合物”，且这些术语在本申请中可互换使用。在本申请中，术语“39-去甲氧基雷帕霉素类似物”包括39-去甲氧基雷帕霉素本身。
本文中使用的术语“衍生物”指通过半合成有机化学由其母体化合物修饰而来的化合物。
特别是，术语“39-去甲氧基雷帕霉素衍生物”指根据上式(I)所示的化合物、或其药用盐，通过39-去甲氧基雷帕霉素类似物的半合成改变而制备。这些化合物也被称为“本发明的化合物”或“雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物”，且这些术语在本申请中可互换使用。
本文所用的术语“(多种)自体免疫性疾病”包括而不限于全身性红斑狼疮(SLE)，类风湿性关节炎，重症肌无力和多发性硬化。
本文所用的术语“ 炎性疾病”包括而不限于牛皮癣，皮炎，湿疹，脂溢性皮炎，炎性肠病(包括但不限于溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)，肺部炎症(包括哮喘、慢性梗阻性肺病、肺气肿、急性呼吸窘迫综合征和支气管炎)，类风湿性关节炎和眼色素层炎。
本文所用的术语“癌症”指细胞在皮肤或身体器官中恶性生长，例如但不限于在乳腺、前列腺、肺、肾、胰腺、胃或肠中。癌倾向于渗透到邻近组织并扩散(转移)到远处器官上，如转移到骨、肝、肺或脑中。本文所用的术语癌包括转移性肿瘤细胞类型(例如但不限于黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、和肥大细胞瘤)和组织癌类型(例如但不限于结肠直肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、成神经细胞瘤、原发性肝癌和卵巢癌。
本文所用的术语“B-细胞恶性肿瘤”包括疾病组，其包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、和非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。它们是血液和造血器官的瘤性疾病。它们造成骨髓和免疫系统障碍，其使宿主高度易受感染和出血影响。
本文所用的术语“血管疾病”包括而不限于超增殖性血管疾病(如再狭窄和血管闭塞)，移植物血管动脉硬化症、心血管疾病、脑血管疾病和外周血管疾病(如冠状动脉疾病、动脉硬化、动脉粥样硬化、非动脉粥样化的动脉硬化或血管壁损伤)。
本文所用的术语“神经再生”指刺激神经细胞生长，并包括神经突长出和神经细胞功能恢复。神经再生对其是有显著治疗益处的疾病和病症包括但不限于，阿耳茨海默氏病、帕金森氏症疾病、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、三叉神经痛、舌咽神经痛、颜面神经麻痹、肌肉萎缩症、中风、进行性肌萎缩、进行性延髓遗传性肌萎缩、颈部脊椎强硬症、Gullain-Barre综合症、痴呆、外周神经病和外周神经损伤，其可以是物理损伤(如脊髓损伤或外伤、坐骨或脸神经损伤或伤害)或疾病状况(如糖尿病)造成的。
本文所用的术语“纤维化疾病”指与过量产生细胞外基质相关的疾病，其包括(而不限于)肉样瘤病、瘢痕瘤、肾小球性肾炎、末期肾病、肝纤维化(包括但不限于硬化、酒精肝病和脂肪肝炎)、慢性肾移植病(chronic graftnephropathy)、外科手术粘连、血管病症、心纤维化、肺纤维化(包括但不限于先天肺纤维化和原因不明性纤维性肺泡炎)、黄斑变性、视网膜和虹膜视网膜病和化疗或放射诱发的纤维化。
本文所用的术语“移植物抗宿主病”指异源干细胞/骨髓移植后观察到的并发症。它发生在供体的对抗感染的细胞将患者身体识别为不同或外来物的时候。然后这些对抗感染的细胞攻击患者身体组织，就好像它们在攻击感染。移植物抗宿主病被分成急性的和慢性的，在移植后前100天内发生的是急性的，而移植后超过100天发生的是慢性的。组织典型地包括肝、胃肠道和皮肤。慢性移植物抗宿主病发生在干细胞/骨髓移植后约百分之10-40的患者中。
本文所用的术语“ 生物利用度”指给药后药物或其他物质被吸收或变得在生物活性位点上可利用的程度或比率。该性质依赖于许多因素，包括化合物的可溶性、肠中的吸收率、蛋白质结合和代谢的程度等。各种生物利用度测试对本领域技术人员来说是熟悉的，其在本文中有描述(也可参见Trepanier等，1998，Gallant-Haidner等，2000)。
本申请所用的术语“ 水溶性”指在水介质中的溶解度，例如pH7.4的磷酸盐缓冲盐水。
本发明化合物例如式(I)所示化合物的药用盐包括由药用无机或有机酸或碱形成的常规盐以及季铵酸式加成盐。合适的酸式盐的更具体的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、安息香酸、水杨酸、反丁烯二酸、甲苯磺酸、甲基磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘酸、氢碘酸、苹果酸、类固醇酸(steroic acid)、丹宁酸等的盐。其他酸，如草酸，它们不是药学上可接受的，可用作为中间体用于制备盐以获得本发明的化合物和它们的药用盐。合适的碱式盐的更具体的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺和普鲁卡因盐。下文对于本发明化合物的表述包括式(I)的化合物及其药用盐。
烷基、烯基和炔基可以为直链或支化的。
C1-C4烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基和正丁基。
C2-C4烯基的实例包括乙烯基和2-丙烯基。
C2-4炔基的实例包括乙炔基。
C3-C6环烷基指可任选支化的包括3-6个碳原子的环烷基环。实例包括环丙基、环丁基、甲基-环丁基、环戊基和环己基。
包含1个或多个选自N、O和S杂原子的3-6元杂烷基环包括含有1个或2个杂原子，特别是1个杂原子的环。实例包括呋喃、吡喃、氧杂环丁烷、环氧乙烷、哌啶、吡咯烷、氮杂环丁烷、吖丙啶、硫杂环丙烷、thiethane、噻吩、噻喃和吗啉。
3-6元杂烷基环的示例的任选取代基包括-OH、-CH2OH、NH2、CH2NH2和COOH。通常3-6元杂烷基环可以是未取代的或被1或2个取代基(例如，1个取代基)取代。
发明详述 如上所述，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素衍生物，制备这些化合物的方法，其中间体和这些化合物在医药中的用途。
优选R7包含7个或更少的碳原子，特别是5个或更少的碳原子。
R7优选含有选自-PO(OH)2、-OH、-COOH和-NH2的至少一个官能团，更优选-OH、-COOH或-NH2，特别是-COOH和OH，最特别地为OH。优选R7包含2个或更多个取代基，例如，2个-OH基团。
合适地X表示CH2； 合适地a表示0。
合适地p表示0或1。
合适地m表示0或1。
合适地q表示0、1或2。
合适地R11表示H。合适地R12表示H。
合适地R13表示H或OH。
当p表示1时，合适地R10表示Me、OH或CH2OH。
当p表示1时，合适地R11表示Me、H或CH2OH。
当m和p均表示0时，合适地R12和R13均表示H，R14表示-(CR8R9)q-OH，其中q＝0或1及R8和R9均表示H。
当p表示1且m表示0时，合适地R10和R11均表示H，R12表示H，R13表示H、OH或NH2，R14表示-(CR8R9)q-OH，其中q＝0或1及R8和R9均表示H。
当R6表示-POR15R16时，合适地R15和R16均表示CH3或均表示CH2CH3。
合适地R6表示通过与羟基乙酸、3-羟基-2，2-二甲基丙酸、2，3-二羟基丙酸、3-羟基-2-羟甲基丙酸或2，2-双(羟甲基)丙酸形成酯而衍生的基团。
在一示例化合物组中，R6表示C(O)R7 优选R7为通过大环类醇与酸缩合而形成的基团，所述酸选自羟基乙酸、3-羟基-2，2，二甲基丙酸、2，3-二羟基丙酸、3-羟基-2-羟甲基丙酸和2，2-双(羟甲基)丙酸，特别是2，2-双(羟甲基)丙酸。
当R15表示为
该基团的实例包括通过与(i)葡萄糖(即R18表示CH2OH且R16和R17各自表示OH)，例如D-葡萄糖形成缩醛而形成的基团；通过与(ii)葡糖胺(即R18表示CH2OH，R16各自表示OH且R17表示NH2)，例如D-葡糖胺形成缩醛而形成的基团；通过与(iii)葡糖醛酸(即R18表示COOH且R16和R17各自表示OH)，例如D-葡糖醛酸形成缩醛而形成的基团；及通过与(iv)阿拉伯糖(即R18表示H且R16和R17各自表示OH)，例如D-阿拉伯糖形成缩醛而形成的基团。
当R15表示为
该基团的实例包括通过与果糖(即R16各自表示OH)，例如D-果糖基团形成缩醛而形成的基团。
当R15表示为
该基团的实例包括通过与葡糖醛酸(即R16各自表示OH)，例如D-葡糖醛酸基团形成缩醛而形成的基团。
通常，本发明的化合物通过式(II)的39-去甲氧基雷帕霉素类似物的半合成衍生来制备。
由此，制备式(I)化合物或其药用盐的方法包括 (a)将式(II)的39-去甲氧基雷帕霉素类似物或其被保护的衍生物和式(III)的化合物或R6的活化衍生物进行反应
其中RA表示H或(CH2)2-OH HO-R6(III)； (b)将式(I)化合物或其盐转变为另一种式(I)化合物或其另一药用盐；或者 (c)将被保护的式(I)化合物脱去保护。
上述使用的术语“活化衍生物”指(例如，但非局限于)对于酯，为羧酸、酰卤、混合酸酐、对称酸酐或羧酸酯；对于醚，为烷基卤、烷基甲磺酸酯(alkyl mesylate)、烷基三氟甲磺酸酯(alkyl triflate)、烷基甲苯磺酸酯或其他合适活化的烷基衍生物；对于磷酸酯和次膦酸酯，为氯代磷酸酯、氰基磷酸二烷基酯、二烷基氨基磷酸二烷基酯或氯代亚磷酸酯；对于衍生自糖基的缩醛，使用糖基给体，例如糖基卤化物、硫代糖苷、1-O-酰基糖苷、原酯、1-O或1-S碳酸酯、三氯亚氨酸酯(trichloroimidate)、4-戊烯基糖苷、糖基磷酸酯、1-O-磺酰或1-O-硅烷化糖苷。
在方法(a)中，可以如WO 2004/007709所述及如本文实施例中进一步所示，制备式(II)的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。
除了本文中提供的特定方法和参考，本领域技术人员还可以参考合成方法的标准教科书，包括但不限于，Vogel的实用有机化学课本(Furniss et al.，1989)和March的高等有机化学(Smith和March，2001)。
另外存在的羟基基团可以通过本领域技术人员可利用的许多标准羟基保护措施之一进行保护。羟基基团可以通过形成醚而得到保护，所述醚包括但不限于取代的烷基醚、取代的苄基醚和甲硅烷基醚。优选甲硅烷基醚，其包括但不限于三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基醚，醚是通过活化形式的硅烷(包括但不限于甲硅烷基氯或甲硅烷基三氟甲磺酸酯)和39-去甲氧基雷帕霉素在合适的碱存在下反应而形成的。然后，通过酸性水解或氟化物辅助裂解除去该保护基团。1，2-二醇可以被保护为丙酮化物，基于丙酮衍生物的缩合。这可以通过酸催化除去。
式(II)的39-去甲氧基雷帕霉素类似物可以用作进一步半合成(即方法(a))的模板。在C-40上的侧羟基可以通过例如酰化、烷基化、糖基化或磷酸化经由本领域技术人员已知的大量合成转化法而进行官能化。
在方法(a)中，当R6表示为式-C(O)R7或Y-R15的基团，其中R15表示

且Y＝键时，通过式(II)化合物的羟基和相应的优选为活化形式的羧酸或式(IIIB)的化合物反应可以介导羟基酯的形成或O-酰化，该羧酸为例如式(IIIAi)或(IIIAii)的化合物
其中W为将羧酸活化为亲核攻击性(nucleophilic attack)的基团。羧酸可以通过形成例如但不限于酰卤(例如，W＝Cl)、混合酸酐(即W＝OC(O)R’)、对称酸酐(W＝OC(O)R7)或羧酸酯(即W＝OR’)而进行活化。
式(IIIAi)、(IIIAii)或(IIIB)的化合物可以由它们的商购羧酸使用本领域技术人员已知的标准方法制备，在特定方面，(IIIAi)化合物(其中R7为-(CR8R9)m(CR10R11)pCR12R13R14))可以通过US 5,362,718、US 5,665,772或EP 0663916中描述的方法制备。
优选39-去甲氧基雷帕霉素类似物在碱存在下于有机介质中与酰氯或混合酸酐反应。可使用的碱包括但不限于，吡啶、4，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、2，6-lutidene、2，6-二叔丁基吡啶、三乙基胺、二异丙基乙基胺、其他三烷基胺、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)或1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)。在本文所述的具体实例中，39-去甲氧基雷帕霉素与混合酸酐在DMAP存在下进行反应。
在方法(a)中，当R6表示式-C(O)R7或Y-R15的基团，其中R15表示

且Y＝-C(O)O-或-(CH2)2-OC(O)O-时，这些羟基酯的形成，需要式(II)化合物或40-O-(羟乙基)-式II化合物的羟基与将形成活化碳酸酯的试剂反应，例如式IV的化合物
其中T＝键或-O(CH2)2-，R24为烷基或芳基，优选为芳基，特别是对-硝基苯基。
然后，将式IV化合物与式III化合物反应，得到R6连接在40-羟基基团上的化合物，或者R6经由碳酸酯键连接在40-O-(羟乙基)基团上的化合物(WO 2004/101583)。
同样，通过使39-去甲氧基雷帕霉素类似物与选择的适当活化的烷基衍生物反应，可以用不同的羟基醚在C-40处衍生39-去甲氧基雷帕霉素类似物，形成40-O-烷基-39-去甲氧基雷帕霉素衍生物。活化烷基指通过包括但不限于形成烷基卤(RCl，RI，RBr)、烷基甲磺酸酯(ROS(O)2CH3)、烷基三氟甲磺酸酯(ROS(O)2CF3)、烷基甲苯磺酸酯(ROS(O)2PhMe)已经活化的烷基。然后，该活化烷基将和39-去甲氧基雷帕霉素类似物在合适的碱存在下于有机介质中进行反应。本领域技术人员可以采用标准方法优化反应条件以避免在其他反应位置发生烷基化。
同样，通过本领域技术人员已知的方法，39-去甲氧基雷帕霉素类似物可以被磷酸化，然后将磷酸酯去保护，可以得到40-O-磷酸-39-去甲氧基雷帕霉素衍生物或40-O-二烷基磷酸-39-去甲氧基雷帕霉素，和这些衍生物的盐。磷酸酯可以直接形成，或者经由O-亚磷酸酯(即(R’O)2POR)间接形成，其中该三价亚磷酸酯被氧化(优选通过过酸，例如但不限于mCPBA的作用)为五价磷酸酯。直接磷酸化方法包括但不限于，将39-去甲氧基雷帕霉素类似物与被保护的氯代磷酸酯(例如，(BnO)2P(O)Cl、(烷基O)2P(O)Cl)，优选在DMAP存在下于有机介质中反应，或者，将39-去甲氧基雷帕霉素类似物与三氯氧化磷(POCl3)在碱如三乙基胺存在下反应，接着将得到的O-二氯磷酸酯(即ROP(O)Cl2)酸解，或与氰基磷酸二烷基酯偶合(WO 01/81355)。通过二烷基或二芳基亚磷酸酯(即(RO)2P(O)H)和四氯化碳在碱存在下反应，可以原位产生二烷基或二芳基氯代磷酸酯。形成O-亚磷酸酯(用于氧化为O-磷酸酯)的方法包括但不限于，将39-去甲氧基雷帕霉素类似物与二烷基氨基磷酸二烷基酯(优选二异丙基氨基磷酸二烷基酯)在碱(优选四唑)存在下偶合，或者使用氯代亚磷酸酯在碱存在下偶合(Evans et al.，1992)。保护基团的选择是重要的，因为在酸性或碱性条件下，磷酸的乙酯和甲酯是不容易水解。优选保护基团包括但不限于苄基酯(经由碘化钠/氯代三甲基硅烷促进的水解而裂解，(WO 01/81355))或2-氰基乙酯(经由弱碱催化裂解而裂解)。类似地，通过39-去甲氧基雷帕霉素类似物和合适的活化(如上所述)膦酸二烷基酯或亚磷酸二烷基酯反应，可以生成40-O-二烷基磷酸-39-去甲氧基雷帕霉素衍生物。
在方法(a)中，当R15表式

或

的基团时，糖苷键的形成，或O-糖基化可以通过羟基和相应糖基给体的反应来介导(参见Toshima和Tatsuta(1993))，优选为活化形式，例如式(IIIC)的化合物或式(IIID)的化合物
使用“糖基给体”，包括但不限于，糖基卤化物(Z＝F，Cl，Br)、硫代糖苷(Z＝SMe，Set，SPh，SPy，SCN)、1-O-酰基糖苷(Z＝OC(O)R)、原酯(Z＝OC(Me)(R)(式(IIIC/IIID)的O-C2)、1-O或1-S碳酸酯(Z＝OC(S)SMe，Z＝OC(O)咪唑，Z＝OC(S)咪唑，Z＝SC(S)OEt)、三氯亚氨酸酯(Z＝OC(＝NH)CCl3)、4-戊烯基糖苷(Z＝OCH2CH2CH2CH＝CH2)、磷酸酯(例如，Z＝OP(O)(OPh)2)、1-O-磺酰(Z＝甲苯磺酰基)或1-O-硅烷化糖苷(Z＝OTMS或OTBS)，39-去甲氧基雷帕霉素类似物可以在有机基质中，优选在活化剂(例如Lewis酸或重金属盐，参见Toshima和Tatsuta，1993))存在下糖基化。所用的具体糖基给体和反应条件将决定形成α或β糖苷。如前述对于酰化而言，在母体化合物中存在的任何羟基基团可以被保护或屏蔽，使得采用1当量糖基给体将导致40-O-酰化。在糖基给体上保留的羟基应被保护为例如O-乙酸酯，O-苯甲酸酯、1，2-丙酮化物，因此需要进一步去保护。此外，可以使用2-去氧基糖基给体例如烯糖(还需要还原步骤)来制备2’-去氧基-39-去甲氧基雷帕霉素糖苷和可以使用2，6-二去氧基糖基给体，例如2，6-酸酐基-2-硫糖制备2’，6’-二去氧基-39-去甲氧基雷帕霉素糖苷。
在方法(b)中，通过本领域技术人员已知的方法进行盐的形成和交换。通过已知方法可以进行式(I)化合物的相互转化，例如通过本文其他地方所述的氧化/还原可以将羟基和酮基相互转化。通过将相应的其中R6表示OH的式(I)化合物磷酸化可以制备其中R6表示-PO(OH)2的式(I)化合物。本文其他地方提供了合适的条件。
在方法(a)和(c)中，保护基团的实例和它们的除去方法可以在T WGreene“Protective Groups in Organic Synthesis”(J Wiley and Sons，1991)中找到。合适的羟基保护基团包括可以通过水解除去的烷基(例如，甲基)，缩醛(例如，丙酮化物)和酰基(例如，乙酰基或苯甲酰基)；可以通过催化水解除去的芳烷基(例如，苯甲基)，或可以通过酸性水解或氟离子辅助裂解除去的甲硅烷基醚。
除了方法(a)，还可以通过脂肪酶催化酯交换反应合成其中R6表示R7的式(I)的39-去甲氧基雷帕霉素类似物。例如，但不限于，在脂肪酶PS-C“Amano”II存在下，在Gu等(2005)所述和如本文实施例进一步所示的反应条件下，可以将式(II)的39-去甲氧基雷帕霉素类似物与式(V)的乙烯基酯反应。此方法不局限于使用乙烯基酯，且所述酯交换反应可以通过其他脂肪酶或酯酶催化。

通过本来已知的方法或通过与上述方法类似的方法可以制备本发明的其他化合物。
所述新型雷帕霉素类似物是直接可用的，并且作为模板用于其他半合成或生物转化，以产生化合物，该化合物可用作免疫抑制剂，抗真菌剂，抗癌剂，抗炎剂，神经再生剂(neuroregenerative agents)，或用于治疗移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病，血管疾病和/或纤维变性疾病的试剂。用于雷帕霉素及其类似物的半合成衍生化的方法为本领域所熟知，并且包括(但不局限于)在以下文献中描述的改进，例如，U.S.5,665,772；U.S.5,362,718，WO 96/41807；U.S.5,728,710，U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772，U.S.5,391,730；U.S.5,023,262，U.S.5,563,145，U.S.5,446,048，U.S.5,912,253，U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；WO 98/04279，U.S.6,015,815和U.S.5,432,183)。
中间体(例如式(II)的化合物)的上述结构可以进行互变异构，且其中显示代表性的互变异构体，应理解，意图涉及所有的互变异构体，例如，显示烯醇化合物时也指酮类化合物，反之亦然。
另一方面，本发明提供了本发明的39-去甲基雷帕霉素衍生物在医药中的用途。另一方面，本发明提供了将本发明的39-去甲基雷帕霉素衍生物在制备用于如下方面的药品诱导或维持免疫抑制作用，刺激神经元再生或治疗癌症、B-细胞恶性肿瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维变性疾病或用于调控伤口愈合的药物中的用途。
多药物耐受性(MDR)是治疗癌症和B-细胞恶性肿瘤中的重要难题。它是许多癌症中发展出药物耐受性背后的根本原因(Persidis A，1999)。MDR与三磷酸腺苷结合的表达盒传送蛋白(cassette transporters)(ABC传送蛋白)的增加水平相关，特别是在编码P-糖蛋白(P-gp)的MDR1基因或编码MRP1的MRP1基因的表达中的增加相关。MDR1基因表达水平随着不同癌衍生出的细胞系而广泛变化着，它在一些细胞系中检测不到，而在另一些中可以显示出比标准对照增加表达多至10或100倍。
因此，本发明的另一方面提供了本发明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在治疗MDR癌症或B-细胞恶性肿瘤中的用途。在特定的方面，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在治疗表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤中的用途。在更优选的实施方案中，本发明提供了本发明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在治疗高表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤中的用途。特别地，高表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤可以相对对照水平增加表达2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。合适的对照是不表达P-gp的细胞，其具有低表达水平的P-gp或其具有低MDR功能，本领域技术人员知道或能鉴定出这种细胞系；例如(但不限于)，合适的细胞系包括MDA435/LCC6，SBC-3/CDDP，MCF7，NCI-H23，NCI-H522，A549/ATCC，EKVX，NCI-H226，NCI-H322M，NCI-H460，HOP-18，HOP-92，LXFL 529，DMS 114，DMS 273，HT29，HCC-2998，HCT-116，COLO 205，KM12，KM20L2，MDA-MB-231/ATCC，MDA-MB-435，MDA-N，BT-549，T-47D，OVCAR-3，OVCAR-4，OVCAR-5，OVCAR-8，IGROV1，SK-OV-3，K-562，MOLT-4，HL-60(TB)，RPMI-8226，SR，SN12C，RXF-631，786-0，TK-10，LOX IMVI，MALME-3M，SK-MEL-2，SK-MEL-5，SK-MEL-28，M14，UACC-62，UACC-257，PC-3，DU-145，SNB-19，SNB-75，SNB-78，U251，SF-268，SF-539，XF 498。
在可选的方面，本发明提供了本发明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在制备用于治疗MDR癌症或B-细胞恶性肿瘤的药物中的用途。在特定的方面，本发明提供了本发明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在制备用于治疗表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤的药物中的用途。在更优选的实施方案中，本发明提供了39-去甲氧基雷帕霉素衍生物在制备用于治疗高表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤的药物中的应用。特别地，高表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤可相对对照水平增加表达2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。合适的对照如上所述。
在样品中确定P-gp表达水平的方法在本文中另有描述。
所以，在另一个方面，本发明提供了用于治疗表达P-gp的癌症或B-细胞恶性肿瘤的方法，其包括给药治疗有效量的本发明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物。P-糖蛋白(P-gp)在特定癌症类型中的表达水平可由本领域技术人员利用技术来确定，所述技术包括但不限于实时RT-PCR(Szakács等，2004；Stein等，2002；Langmann等，2003；Alvarez等，1995，Boyd等，1995)、通过免疫组织化学(Stein等，2002)或利用微阵列(Lee等，2003)，这些方法仅供示例，其他合适的方法也将会为本领域技术人员所想到。
本领域技术人员能够通过常规试验确定这些化合物抑制真菌生长的能力(例如，Baker，H.，等，1978；NCCLS Reference method for broth dilutionantifungal susceptibility testing for yeastsApproved standard M27-A，17(9)，1997)。另外，本领域技术人员能够通过常规试验确定这些化合物抑制肿瘤细胞生长的能力(参见Dudkin，L.，等，2001；Yu等2001)。另一方面，本发明的化合物可用于诱导免疫抑制，用于确定化合物在这些方面的效力的试验是本领域技术人员所公知的，例如，但不局限于免疫抑制剂活性-Warner，L.M.，等，1992，Kahan等(1991)&Kahan&Camardo，2001)；同种异体移植-Fishbein，T.M.，等，2002，Kirchner等2000；自身免疫/炎症/哮喘-Carlson，R.P.等，1993，Powell，N.等，2001；I型糖尿病-Rabinovitch，A.等，2002；牛皮癣-Reitamo，S.等，2001；类风湿性关节炎-Foey，A.，等，2002；纤维化-Zhu，J.等，1999，Jain，S.，等，2001，Gregory等1993。
可在用于此目的的标准试验中验证本发明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物诱导免疫抑制的能力。另一方面，本发明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物可用于和抗纤维变性，神经再生和抗血管生成机制有关者，本领域技术人员可以通过常规试验确定这些化合物抑制血管发生(angiogenesis)的能力(例如，Guba，M.，等，2002)。本领域技术人员能够通过常规试验确定这些化合物治疗血管过度增殖性疾病例如，用于药物释放支架(drug-elutingstent)(例如，Morice，M.C，等，2002)的应用。另外，本领域技术人员可以通过常规试验确定这些化合物的神经再生能力(例如，Myckatyn，T.M.，等，2002，Steiner等1997)。
本发明还提供了药物组合物，其包括本发明的39-去甲基雷帕霉素衍生物，连同可以药用的载体。
雷帕霉素和在或正在临床试验中的相关化合物，如CCI-779和RAD001，具有差的药理学分布，差的水溶性和差的生物利用度。本发明提供了具有改善的性质如改进的稳定性和/或改进的细胞膜穿透性的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物。本领域技术人员使用标准方法能够容易地确定本发明给定化合物的溶解度。在本文的实施例中示出了代表性的方法。
此外，利用本领域技术人员已知的体内和体外方法，本领域技术人员将能确定本发明化合物的药物动力学和生物利用度，所述方法包括但不限于下面所述的和Gallant-Haidner等，2000和Trepanier等，1998和其中的参考文献中描述的那些。通过许多因素来确定化合物的生物利用度，(如水溶性、肠中的吸收速率、蛋白质结合和代谢的程度)，其中每种都可通过本文实施例所述的体外测试来确定，本领域技术人员将能理解的是，改善这些因素中的一种或多种将能改善化合物的生物利用度。可选地，化合物的生物利用度可利用以下更详细描述的的体内方法来测量。
Caco-2渗入试验 可以使用在24孔Coming Costar Transwell板上的融合的Caco-2细胞(Li，A.P.，1992；Grass，G.M.，等，1992，Volpe，D.A.，等，2001)，例如由In VtroTechnologies Inc.(IVT Inc.，Baltimore，Maryland，美国)提供。顶上的腔室含有0.15mL pH 7.4的Hank氏平衡缓冲液(HBBS)、1％DMSO、0.1mM荧光黄(Lucifer Yellow)。基部的腔室含有0.6mL pH 7.4的HBBS、1％DMSO。对照和测试品在加湿孵育箱中于37℃孵育，以130rpm震荡1h。荧光黄仅能通过薄壁纤维(在紧密接合处之间)途径渗入，荧光黄的高表观穿透性(ApparentPermeability，Papp)显示出试验期间细胞损伤了，并排除所有这些孔。普萘洛尔(有好的被动渗透性，而无已知的转运蛋白效应)和醋丁酰心安(acebutalol)(有差的被动渗透性，其通过P-糖蛋白主动流出而减轻)被用作参照化合物。通过将化合物(以0.01mM)加入顶上或基部的腔室，在单和双向板中测试化合物。通过HPLC-MS分析顶上或基部腔室中的化合物。结果表示成表观穿透性(Papp)(nm/s)和流出率(A至B对B至A)。
Papp(nm/s)＝体积受体×Δ[受体] 面积×[供体]Δ时间 体积受体0.6ml(A＞B)和0.15ml(B＞A) 单层面积0.33cm2 Δ时间 60分钟 流出率的正值表示从细胞的顶层表面主动流出。
人肝微粒体(HLM)稳定性试验 用肝匀浆液测量化合物对I阶段(氧化)酶的内在弱点，该酶包括CYP450(如CYP2C8、CYP2D6、CYP1A、CYP3A4、CYP2E1)、酯酶、酰胺酶和黄素单氧酶(FMO)。
通过LC-MS测量它们随时间的消失情况，确定测试化合物暴露于人肝微粒体的半衰期(T1/2)。0.001mM化合物与0.25mg/mL人肝微粒体亚细胞级分蛋白于37℃在pH 7.4的0.1M Tris-HCl中孵育40分钟，并将NADPH的饱和水平作为协同因子。以定时间隔，向测试样品中加入乙腈来沉淀蛋白质和终止代谢。离心样品并用HPLC-MS分析母体化合物。
体内生物利用度试验 还可以使用体内试验测量化合物的生物利用度(参见，例如Crowe et al，1999)。通常，所述化合物向测试动物(如小鼠或大鼠)腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)并口服(p.o.)给药，定期取血样以检测药物的血浆浓度如何随时间变化。血浆浓度随时间的时程可用于将化合物的绝对生物利用度计算成利用标准模型的百分比。典型规程的实例如下所述。
向小鼠i.v.给药3mg/kg本发明化合物或母体化合物或者p.o.给药10mg/kg本发明化合物或母体化合物。在5分钟、15分钟、1h、4h和24h间隔时取血样，通过HPLC确定样品中本发明化合物或母体化合物的浓度。然后可用血浆浓度的时程来得出关键的参数，如血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC-其直接与实现全身循环的未改变的药物总量成比例)、最大(峰值)血浆药物浓度、最大血浆药物浓度产生的时间(峰值时间)、用于精确确定生物利用度的其他因素包括化合物的末半衰期、全身清除率、分布的稳态体积和F％。然后通过非间隔或间隔方法分析这些参数以给出计算好的生物利用度百分比，这种方法的例子参见Gallant-Haidner等，2000和Trepanier等，1998和其中的参考文献，以及本文的参考文献。
前述本发明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物或其制剂可通过任何常规方法给药，例如但不限于非肠道、口服、局部(包括口腔、舌下或透皮)、通过医疗设备(如移植片固定模)、通过吸入或通过注射(皮下或肌肉)给药。治疗可由一段时间的单剂量或多剂量构成。
尽管本发明的化合物可以单独给药，但它优选作为药物制剂连同一种或多种可接受的载体存在。所述载体在与本发明的化合物兼容的意义上必须是“可接受的”，并且对它的受体是无害的。合适载体的例子在下文进行更详细地描述。
本发明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物可以单独或者与其他治疗剂组合施用，两种(或更多种)试剂的联合用药用于显著降低待施用的每一种的剂量，从而减少出现的副作用。
在一种实施方案中，将39-去甲基雷帕霉素衍生物与另一种治疗剂联合用药，用于诱导或维持免疫抑制，用于治疗移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病或炎性疾病，优选的试剂包括，但不局限于，免疫调节剂，例如，硫唑嘌呤(azathioprine)，皮质类固醇(corticosteroid)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，环孢霉素A(cyclosporin A)，FK506，霉酚酸酯(Mycophenolate Mofetil)，OKT-3和ATG。
在另一种实施方案中，将39-去甲基雷帕霉素衍生物与另一种治疗剂联合用药用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤，优选的试剂包括，但不局限于，甲氨喋呤(methotrexate)，亚叶酸(leukovorin)，阿霉素(adriamycin)，prenisone，博来霉素(bleomycin)，环磷酰胺，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，紫杉醇(paclitaxel)，多西紫杉醇(docetaxel)，长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，维诺瑞滨(vinorelbine)，多柔比星(doxorubicin)，他莫昔芬(tamoxifen)，托若米芬(toremifene)，醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，阿纳托唑(anastrozole)，果丝瑞宁(goserelin)，抗-HER2单克隆抗体(例如，赫赛汀(HerceptinTM))，卡培他滨(capecitabine)，盐酸雷洛昔芬(raloxifenehydrochloride)，EGFR抑制剂(例如，lressa，TarcevaTM，ErbituxTM)，VEGF抑制剂(例如，AvastinTM)，蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM)，Glivec或hsp90抑制剂(例如，17-AAG)。另外，39-去甲基雷帕霉素衍生物可以与其他治疗组合施用，所述的其它治疗包括，但不局限于，放射治疗或手术。
在一种实施方案中，39-去甲氧基雷帕霉素衍生物与另一种治疗剂联合给药，用于治疗血管疾病，优选的试剂包括但不限于，ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、神经纤维酸衍生物、HMG-CoA还原酶抑制剂、β肾上腺素阻断剂、钙通道阻断剂、抗氧化剂、抗凝血剂和血小板抑制剂(如PlavixTM)。
在一种实施方案中，39-去甲氧基雷帕霉素衍生物与另一种治疗剂联合给药，用于刺激神经再生，优选的试剂包括但不限于，神经营养因子，诸如神经生长因子、神经胶质衍生的生长因子、脑衍生的生长因子、睫状神经营养因子和神经营养因子-3。
在一种实施方案中，39-去甲氧基雷帕霉素衍生物与另一种治疗剂联合给药，用于治疗真菌感染；优选的试剂包括但不限于，两性霉素B、氟胞嘧啶、棘白菌素(echinocandins)(如卡泊芬净、阿尼芬净或米卡芬净(micafungin))、灰黄霉素、咪唑或三唑抗真菌剂(如克霉唑、密康唑、酮康唑、益康唑、布康唑、奥昔康唑、特康唑、伊曲康唑、氟康唑或伏立康唑)。
联合给药包括任何向患者递送两种或更多治疗剂的方法作为同样治疗方案的部分，这对于普通技术人员来说是显而易见的。两种或更多试剂可在单一制剂中同时给药，然而这不是必要的。试剂可用不同制剂并在不同时间给药。
制剂可方便地表示为单位剂型，并可由任何现有公知制药技术来制备。这些方法包括组合活性成分(本发明的化合物)和构成一种或多种辅助成分的载体的步骤。通常，制剂通过均一并紧密地组合活性成分和液体载体或细分的固体载体或二者来制备，然后必要时，给产品赋形。
本发明的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物通常以包括活性成分的药物配制物形式口服或通过任何非肠道途径给药，任选是非毒性有机或无机酸、或碱、加成盐的形式，以药用剂型。根据要治疗的疾病和患者、以及给药途径，组合物可以可变剂量给药。
例如，本发明的化合物可以口服、口腔或舌下给药，给药形式有片剂、胶囊、丸、酏剂、溶液或混悬液，其中可含调味剂或着色剂，用于即时、延时或控释使用。
适于口服给药的39-去甲氧基雷帕霉素衍生物溶液或混悬液还可包含赋形剂(如N，N-二甲基乙酰胺)、分散剂(如聚山梨酸酯80)、表面活性剂、和助溶剂(如聚乙二醇、Phosal 50PG(其由卵磷脂、大豆脂肪酸、乙醇、单/二甘油酯、丙二醇和抗坏血酸棕榈酸酯组成))。
这些片剂可包含赋形剂，如微晶纤维素、乳糖(如乳糖一水合物或乳糖酐)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸、崩解剂(如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉))、淀粉乙醇酸盐、交联羟甲基纤维素钠、和某些复合硅酸盐、和粒状粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙甲基纤维素(HPMC)、羟基-丙基纤维素(HPC)、聚乙二醇8000、蔗糖、凝胶和阿拉伯树胶。另外，可包括润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山嵛酸盐和滑石。
相似类型的固体组合物也可用作凝胶胶囊中的填充物。在这方面，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、牛乳糖或高分子量聚乙二醇。对于水混悬液和/或酏剂来说，本发明的化合物可与多种甜味剂或调味剂、着色物质或染料组合，与乳化和/或悬浮剂并与稀释剂(如水、乙醇、丙二醇和甘油、及其组合)组合。
片剂可通过压缩或铸模压制而制造出，可任选与一种或多种辅助成分一起制造。压制的片剂的制备是在合适的机器中压缩自由流动形式(如粉或颗粒)的活性成分，可任选与粘合剂(如聚维酮、明胶、羟基丙甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(如淀粉乙醇酸钠、交联的聚维酮、交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合在一起。铸模压制的片剂的制造是在合适的机器中铸模压制用惰性液体稀释剂弄湿的粉状化合物的混合物。任选将片剂涂覆或刻痕并制成制剂，从而缓释或控释其中所用的活性成分，例如，以各种比例的羟基丙基甲基纤维素来提供所需的释放分布。
根据本发明所述的适于口服给药的制剂可以离散单位来提供，如胶囊、扁胶剂或片剂，每种都包含预先确定量的活性成分；如粉末或颗粒；如水溶性液体或非水溶性液体的溶液或混悬液；或如水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分也可以丸药、药糖剂或糊剂来提供。
适于口中局部给药的制剂包括糖锭剂，其包含调味基质中的活性成分，基质通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶；包括锭剂，其包含惰性基质中的活性成分，基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶；并包括漱口水，其包含合适液体载体中的活性成分。
应该能理解除了上述特定成分，本发明的制剂可包括其他所述制剂类型得出的现有常规试剂，例如适于口服给药的那些可包括调味剂。
适于局部给药的药物组合物可配成药膏、乳剂、混悬液、洗液、粉、溶液、糊剂、凝胶、浸渍敷料剂、喷雾剂、气雾剂或油、透皮设备、扑粉等。这些组合物可通过包含活性试剂的常规方法来制备。因此，它们也可包含相容的常规载体和添加剂，如防腐剂、辅助药物渗透的溶剂、乳剂或药膏中的润肤剂和用于洗液的乙醇或油醇。这些载体可以占组合物约1％至约98％的形式来提供。更常用的是，它们将至多构成组合物的约80％，仅作为示例，乳剂或药膏的制备是混合足量的亲水物质和水，其包含占化合物约5-10％的量，该量足以产生具有所需粘稠度的乳剂或药膏。
适于透皮给药的药物组合物可以离散的贴片来提供，从而长期保持与接收者表皮的密切接触。例如，通过电离子渗透疗法可将活性试剂从贴片上传送出来。
为了用于外部组织，如口和皮肤，组合物优选制成局部使用的乳剂或药膏。当要配成药膏时，活性试剂可与含蜡或易溶于水的药膏基质一起运用。
可选地，活性试剂可与水包油乳剂基质或油包水基质一起配成乳剂。
对于非肠道给药，液体单位剂型的制备是利用活性成分和无菌载体，例如但不限于水，醇、多羟基醇、甘油和植物油，优选是水。根据所用的载体和浓度，活性成分可溶解或悬浮在载体中。在制备溶液时，活性成分可溶于注射用水中并过滤除菌，然后装入合适的小瓶或安瓿中并密封。
有益的是，试剂(如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂)可溶于载体中。为了增强稳定性，组合物可在装入小瓶并真空脱水后冷冻。然后将冻干粉密封在小瓶内，并提供注射用水的另一个相应的小瓶从而在使用前能重新形成液体。
用与溶液基本相同的方式制备非肠道混悬液，不同在于将活性成分悬浮于载体中而不是溶解其中，而且不能通过过滤来完成灭菌。可通过暴露于环氧乙烷而对活性成分灭菌，然后悬浮于无菌载体中。有益的是，表面活性剂或润湿剂包括在组合物中以使活性成分更容易分布均匀。
本发明的化合物也可利用现有已知医药设备来给药。例如，在一种实施方案中，本发明的药物组合物可用无针皮下注射设备来给药，如公开于U.S.5,399,163；U.S.5,383,851；U.S.5,312,335；U.S.5,064,413；U.S.4,941,880；U.S.4,790,824；或U.S.4,596,556的设备。用于本发明的公知的植入和组件实例包括US 4,487,603，其公开了可植入的微输注泵，用于以可控速率分发药物；US 4,486,194，其公开了治疗设备，用于通过皮肤来给药药物；US 4,447,233，其公开了药物输注泵，用于以精确输注率递送药物；US 4,447,224，其公开了可变流量的可植入的输注装置，用于持续递送药物；US 4,439,196，其公开了渗透性药物递送系统，其具有多腔间隔小室；和US 4,475,196，其公开了渗透性药物递送系统。在特定的具体实施方式
中，39-去甲氧基雷帕霉素衍生物可以利用药物-洗脱拉伸器来给药，例如WO 01/87263及相关公开文献所述的那些之一或Perin(Perin，EC，2005)所述的那些。许多其他这类植入、递送系统和组件对本领域技术人员来说是已知的。
给药本发明39-去甲氧基雷帕霉素衍生物的剂量将根据特定化合物、所涉及的疾病、个体、和疾病性质和严重度以及个体的身体状况、和所选择的给药途径而变化。本领域技术人员能容易地确定合适的剂量。
根据给药方法，组合物可包含超过0.1重量％、优选5-60％、更优选的10-30重量％的本发明化合物。
本领域技术人员将会认识到，通过要治疗的病况性质和范围、给药形式、途径和位点、和要治疗的特定个体的年龄和病况，将会确定出本发明化合物的个体剂量的最佳量和间隔，而且医师会最终确定合适的用量。该剂量可以合适的频率重复。如果副作用产生了，则可以根据常规临床实践，改变或减少给药剂量和/或频率。
附图简述 图1显示了雷帕霉素的结构 图2显示了39-去甲氧基雷帕霉素的裂解途径 图3显示了39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素的裂解途径 图4显示了39-去甲氧基-40-O-[2-羟乙基3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯]雷帕霉素的裂解途径 图5显示了27-O-去甲基-39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素的裂解途径 图6显示了相比于雷帕霉素(实心方块)，39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素(A-实心三角形)和39-去甲氧基-40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素的mTOR抑制活性(B-实心三角形) 实施例 通用方法和材料 材料 除非另外说明，所有试剂都得自商业渠道，并进行使用而没有进一步纯化。
培养物 吸湿链霉菌(S.hygroscopicus)MG2-10[IJMNOQLhis](WO 04/007709；Gregory等，2004)于28℃维持在培养基1琼脂平板(见下)上。在培养基1上生长出后制备出孢子体，保存于20％w/v甘油含10％w/v乳糖的蒸馏水中并保存于-80℃。将0.1mL冷冻的孢子体接种到250 mL长颈瓶中的50mL培养基2(见下)中，制备出生长性培养物。培养物于28℃孵育36至48小时，300rpm。
生产方法 以2.5-5％v/v将生长性培养物接种入培养基3中。以26℃进行培养6-7天，300rpm。
补充过程 除非另外说明，接种后24-48小时补充/添加所选羧酸并以1-2mM补充。
培养基1 然后培养基于121℃高压灭菌20分钟。
培养基2RapV7种子培养基 然后培养基于121℃高压灭菌20分钟。
灭菌后每7mL培养基中加入0.16mL 40％葡萄糖。
培养基3MD6培养基(发酵培养基) 灭菌前将0.4mL Sigmaα-淀粉酶(BAN 250)加到1L培养基中。
培养基于121℃灭菌20分钟。
灭菌后每7mL中加入0.35mL无菌40％果糖和0.10mL L-赖氨酸(140mg/mL，水中，过滤除菌)。
培养基4RapV7a种子培养基 然后培养基于121℃高压灭菌20分钟。
培养基5MD6/5-1培养基(发酵培养基) 培养基于121℃灭菌30分钟。
灭菌后每L加入15g果糖。
48h后加入0.5g/L ofL-赖氨酸。
分析方法 方法A 注射体积0.005-0.1mL(根据灵敏度需要)。HPLC在Agilent″Spherisorb″″快速拆分″滤筒SB C8上进行，所述SB C8为3微米、30mm×2.1mm，其运行的流动相为 流动相A含0.01％蚁酸的纯水 流动相B含0.01％蚁酸的乙腈 流速1mL/分钟。
使用线性梯度，从第0分钟的5％B到第2.5分钟的95％B，保持95％B直到第4分钟回到5％B，再进行下一轮。通过254nm处的UV吸收和/或通过利用Micromasss Quattro-Micro仪器进行质谱电喷雾(阳或阴)离子化来检测。
方法B 注射体积0.02mL。HPLC在3微米BDS C18 Hypersil(ThermoHypersil-Keystone Ltd)柱上进行，其为150×4.6mm，维持在50℃，其运行的流动相为 流动相A乙腈(100mL)，三氟醋酸(1mL)，1 M醋酸铵(10mL)，用去离子水加至1L。
流动相B去离子水(100mL)，三氟醋酸(1mL)，1M醋酸铵(10mL)，用乙腈加至1L。
流速1mL/分钟。
利用55％B-95％B的线性梯度进行10分钟，然后在95％B 2分钟，0.5分钟至55％B并在55％B再经2.5分钟。通过280nm处的UV吸收来检测化合物。
方法C HPLC系统包括Agilent HP 1100并在3微米BDS C18 Hypersil(ThermoHypersil-Keystone Ltd)柱上进行，其为150×4.6mm，维持在40℃，其运行的流动相为 流动相A去离子水。
流动相B乙腈。
流速1mL/分钟。
该系统与Bruker Daltonics Esquire3000电喷雾质谱相连。使用阳性阴性转换用以扫描500至1000道尔顿的范围。
利用55％B-95％B的线性梯度进行10分钟，然后在95％B 2分钟，0.5分钟至55％B并在55％B再经2.5分钟。
合成方法 除非另有说明，所用的合成都是使用市售无水溶剂在无水条件下进行的。在耦连至装配有电喷雾源的Bruker Daltonics Esquire3000+质谱仪的Agilent 1100 HPLC上通过LC-UV-MS监测反应。通过PhenomenexHyperclone柱，BDS C18 3u(150×4.6mm)，以1mL/min，水∶乙腈v∶v 30∶70至100％乙腈进行线性梯度洗脱10分钟，然后以100％乙腈同样进行5分钟，达到分离。
以CDCl3记录NMR光谱，δH和δC化学位移参照溶剂的化学位移(分别为7.26ppm和77.0ppm)。由于39-去甲氧基雷帕霉素及其衍生物以构象异构体的混合物形式存在，因此所有指认仅对应于主要的构象异构体。
针对抗癌活性的体外生物试验 在12种人肿瘤细胞系板上以单层增殖试验用Oncotest测试工具(实验肿瘤学研究所，Oncotest GmbH，Freiburg)进行体外评估化合物的抗癌活性。所选的12种细胞系的特征在表1中有简述。
表1 测试细胞系 如Roth等1999所述，Oncotest细胞系从人肿瘤异种移植体中建立。供体异种移植体的来源如Fiebig等1999所述。其他细胞系得自NCI(H460，SF-268，OVCAR-3，DU145，MDA-MB-231，MDA-MB-468)或购自DSMZ(Braunschweig，德国)(LNCAP)。
所有细胞系，除非另外指明，均于37℃生长在空气潮湿(95％空气，5％CO2)的含RPMI 1640培养基、10％胎牛血清、和0.1mg/mL庆大霉素(PAA，Clbe，德国)的‘掺水即可用的’培养基中。
单层试验-规程1的简述 使用改进的亚丙基碘(propidium iodide)试验评估测试化合物对12种人肿瘤细胞系生长的影响(Dengler等，1995)。
简而言之，在指数生长阶段的培养物中通过胰蛋白酶化来收获细胞，计数并置于96孔平底微滴定板中，其中细胞密度取决于细胞系(5-10.000个活细胞/孔)。24h后回收以使细胞继续指数生长，将0.01mL培养基(每个平板6个对照孔)或含macbecin的培养基加入到孔中。每种浓度重复加入3个孔。化合物用两种浓度(0.001μM和0.01μM)。持续暴露4天后，有或没有测试化合物的细胞培养基用0.2mL亚丙基碘(PI)水溶液(7mg/L)替换。为了测量活细胞的比例，冷冻平板以渗出细胞。熔融平板后，用Cytofluor4000微板读数仪测量荧光(530nm激发，620nm发射)，得出与活细胞总数的直接关系。
生长抑制被表示成处理/对照×100(％T/C)。绘制化合物浓度相对于细胞存活的图，来评估活性化合物的IC50和IC70值。
实施例1.39-去甲氧基雷帕霉素的发酵和分离 如下所述，通过使吸湿链霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]培养物生长并加入环己烷羧酸(CHCA)，来产生39-去甲氧基雷帕霉素。
液体培养物 如材料和方法中所述，培养吸湿链霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]的生长培养物。生产培养物与生长培养物以0.5mL接种于50mL试管中的7mL培养基3中。于26℃培养7天，300rpm。取1毫升样品以1∶1与乙腈混合，震荡30分钟，13000rpm离心10分钟，并根据分析方法B(参见材料和方法)分析并定量。通过利用分析方法C(参见材料和方法)进行质谱来确认产物。
根据以下表征中所讨论的分析数据，观察到的雷帕霉素类似物被认为是所希望的39-去甲氧基雷帕霉素。
发酵 基本如材料和方法中所述，用培养基4培养吸湿链霉菌MG2-10[IJMNOQLhis]的初级生长培养物。次级生长培养物被以10％v/v接种入培养基4中，于28℃培养24h，250rpm。生长培养物被以5％v/v接种入20 L发酵罐中的培养基5中(参见材料和方法)。于26℃、0.5vvm培养6天。通过改变推进叶片速度来保持≥30％的溶解氧，其中最小叶片速度为1.18ms-1，最大叶片速度为2.75ms-1。孵育后第24和48小时加入环己胺羧酸，使最终浓度为2mM。
提取和纯化 发酵肉汤(30L)与等体积甲醇一起搅拌2小时，然后离心聚集细胞(10分钟、3500rpm)。上清液与DiaionHP20树脂(43g/L)一起搅拌1小时，然后过滤。用丙酮分步洗涤树脂以洗脱出雷帕霉素类似物，真空除去溶剂。然后用水将该含水浓缩物稀释至2L，并用乙酸乙酯(3×2L)萃取。真空去除溶剂，得到棕色油状物(20.5g)。
将萃取物溶于丙酮，在硅胶上干燥，施加于硅胶柱(6×6.5cm直径)并用丙酮/己烷(20％-40％)逐步梯度洗脱。收集含雷帕霉素类似物的级分，真空除去溶剂。残余物(2.6g)进一步过Sephadex LH20柱层析(分三次)，用10∶10∶1的氯仿/庚烷/乙醇洗脱。通过反相(C18)制备性HPLC，利用GilsonHPLC，用65％乙腈/水以21mL/分钟洗脱Phenomenex 21.2×250mm Luna5μm C18 BDS柱，来纯化半纯化的雷帕霉素类似物(1.7g)。合并最纯的级分(通过分析HPLC来鉴定，方法B)，真空除去溶剂，得到39-去甲氧基雷帕霉素(563mg)。
表征 39-去甲氧基雷帕霉素的1H NMR谱与标准(P.Lowden，Ph.D.Dissertation，University of Cambridge，1997)相同。13C-NMR(125MHz)，δC(ppm)215.75，208.27，169.19，166.71，140.13，135.94，133.61，130.10，129.62，126.80，126.33，98.42，84.77，84.37，75.85，70.91，67.10，59.44，55.82，51.21，46.50，44.17，41.39，40.70，40.16，38.74，38.37，35.44，35.26，35.08，33.78，33.64，33.04，32.37，31.22，30.41，27.24，27.02，25.27，21.48，20.58，16.24，15.95，15.78，13.74，13.00，10.12。
LCMS和LCMSn分析培养物的萃取物，显示新型雷帕霉素类似物的m/z率低于雷帕霉素30个原子质量单位，符合其缺少了甲氧基。观察到的离子[M-H]- 882.3，[M+NH4]+ 901.4，[M+Na]+ 906.2，[M+K]+922.2。钠加合物的裂解片段得到预测出的39-去甲氧基雷帕霉素的离子，符合以前鉴定出的裂解途径(图2)(J.A.Reather，Ph.D.Dissertation，University ofCambridge，2000)。该质谱裂解数据收窄了该新型雷帕霉素类似物的区域，其中丢失甲氧基是发生在含环己基部分的片段C28-C42上。
这些质谱裂解数据完全符合39-去甲氧基雷帕霉素的结构。
实施例239-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素 根据以下步骤由39-去甲氧基雷帕霉素合成39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素。
2.139-去甲氧基-28-O-三甲基甲硅烷基雷帕霉素的合成 在0℃将39-去甲氧基雷帕霉素(170mg，0.17mmol)和咪唑(51mg，0.75mmol)溶于5mL乙酸乙酯中。在10分钟内向该冷溶液中滴加氯代三甲基硅烷(77mg，0.09mL，0.71mmol)。继续搅拌60分钟，完成28，39-二-O-三甲基甲硅烷基醚的形成。该阶段之后在0℃添加0.4mL 0.5N硫酸水溶液，并将混合物搅拌2.5h。添加20mL乙酸乙酯，用盐水、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤有机层。在硫酸钠上干燥并减压浓缩，得到28-O-三甲基甲硅烷基醚，为无色固体，其用于后续反应而未进一步纯化。
1H-NMR(400 MHz，CDCl3)，δ(ppm)4.07(d，1H，J＝6.5Hz，C(28)-H)，0.00(s，9H，28-O-TMS) MS(ESI)m/z 978[M+Na]+ 2.2. 2，4，6-三氯苯甲酸2’，2’，5’-三甲基-1’，3’-二噁烷-5’羧酸酐的合成 将2，2-二甲氧基丙烷(13.5g，130mmol)和对甲苯磺酸一水合物(100mg，0.53mmol，0.4mol％)添加至2，2-双(羟甲基)丙酸(13.5g，100mmol)的丙酮(100mL)溶液中。将反应混合物在室温搅拌2h。该阶段之后，添加潮湿的碳酸氢钠并将混合物再搅拌5分钟。滗出上清液并减压浓缩。用二乙醚(3×50mL)处理所得的固体，并将合并的有机萃取物减压浓缩，得到白色固体，16.2g(93％)。
1H-NMR(400 MHz，CDCl3)，δ(ppm)4.19(d，1H，J＝12.0Hz)3.68(d，1H，J＝12.0Hz)1.45(s，1H)1.41(s，1H)1.20(s，1H)。
然后，通过US 5,362,718的方法将该物质转变为活化的混合酸酐。因此，将该丙酮化物(1.04g，5.98mmol)溶解在冷却至0℃的THF(20mL)中并用滴加的三乙基胺(0.83mL，5.98mmol)和2，4，6-三氯代苯甲酰氯(0.93mL，5.98mmol)处理。室温搅拌该反应混合物5小时。将所得的固体过滤并用THF(10mL)洗涤。将合并的滤液真空减压，得到白色非晶态固体，其(如下)进行使用而未进一步纯化。
2.3.合成含有2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸的39-去甲氧基雷帕霉素28-O-三甲基甲硅烷基醚，40-酯 将得自实施例2.1的粗制28-O-三甲基甲硅烷基-39-去甲氧基雷帕霉素(200mg，得自0.17mmol 39-去甲氧基雷帕霉素)溶于2mL二氯甲烷。将溶液冷却至0℃并添加DMAP(102mg，0.84mmol)。然后，在10分钟内添加2，4，6-三氯苯甲酸2′，2′，5′-三甲基-1′，3′-二噁烷-5′羧酸酐(159mg，0.42mmol)在1mL二氯甲烷中的溶液。在0℃搅拌反应混合物5h并用LC/MS监测转化率。将反应混合物用7mL二氯甲烷稀释并添加5mL水中止反应。分离有机层并用0.5N硫酸、碳酸氢钠溶液和水连续洗涤。在硫酸钠上干燥并减压浓缩，得到标题化合物，为无色泡沫状物，其立即使用而未进一步纯化。
MS(ESI)m/z 1111[M-H]- 2.4.39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素 将得自实施例2.3的粗制39-去甲氧基雷帕霉素-28-O-三甲基甲硅烷基醚40-酯和2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸溶于2mL丙酮并添加0.5mL0.5N硫酸。将反应混合物在室温搅拌5h并接着添加5mL饱和碳酸氢钠溶液和5mL水进行中和。用乙酸乙酯萃取含水混合物，并在硫酸钠上干燥合并的有机萃取液。减压浓缩，得到无色固体，其通过尺寸排除层析法(sizeexclusion chromatography)在Sephadex LH20上使用氯仿/庚烷/乙醇(v∶v∶v10∶10∶1)作为洗脱液进行纯化。
1H-NMR(500 MHz，CDCl3)，δ(ppm)4.72(m，1H，C(40)-H)，3.87(m，2H)，3.69(m，2H)，1.03(s，3H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)，δ(ppm)175.52，74.04(C(40))，68.73(2C)，48.90，17.09。
MS(ESI)m/z 1023[M+Na]+ 实施例339-去甲氧基-40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素 3.1.2-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧乙基三氟甲磺酸酯 将2-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-乙二醇(125mg，0.71mmol)和2，6-二甲基吡啶(0.08mL，0.69mmol)在6ml二氯甲烷中的溶液冷却至-78℃。在5分钟内添加三氟甲磺酸酐(0.11mL，0.65mmol)并在-78℃继续搅拌15分钟，完成三氟甲磺酸酯的形成。将该三氟甲磺酸酯原位用于如下3.2所述的反应。
3.2.40-O-[2-(叔丁基二甲基甲硅烷基)]乙基-39-去甲氧基雷帕霉素 在室温用2-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧乙基三氟甲磺酸酯(0.65mmol，于6mL二氯甲烷中)处理39-去甲氧基雷帕霉素(300mg，0.34mmol)和2，6-二叔丁基吡啶(1.5mL，6.68mmol)。用温和的氮气流浓缩该溶液至其原来体积的三分之一，将所得的混悬液在室温再搅拌72 h。该阶段之后，添加饱和碳酸氢钠溶液(5mL)和水(5mL)，搅拌混合物30分钟。分离有机层并用乙酸乙酯(2×5mL)萃取水相。在硫酸钠上干燥合并的有机萃取液并减压浓缩，得到无色油状物。通过柱层析在硅胶上使用己烷至己烷/丙酮(v∶v 1∶1)梯度洗脱纯化，得到产物，为无色固体。
1H-NMR(500 MHz，CDCl3)，δ(ppm)4.16(d，1H，J＝6.5Hz，C(28)-H)，3.73(t，2H，J＝5.7Hz)，3.52(t，2H，J＝5.7Hz)，0.89(s，9H)，0.06(s，6H)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)，δ(ppm)76.61(C-40)，69.31(CH2)，63.03(CH2)，25.92(3C)，18.36，-5.23(2C). MS(ESI)m/z 1065[M+Na]+ 3.3.39-去甲氧基-40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素 在室温用0.3mL的0.5N硫酸处理40-O-[2-(叔丁基二甲基甲硅烷基)]乙基-39-去甲氧基雷帕霉素(160mg，0.15mmol)在2mL丙酮中的溶液。使溶液在室温静置3h，接着加入5mL饱和碳酸氢钠溶液和10mL水中止反应。用乙酸乙酯(3×10mL)萃取含水混合物并在硫酸钠上干燥合并的有机萃取液。减压浓缩，得到无色固体，其通过HPLC(水/乙腈v∶v 20/80)进一步纯化。
1H-NMR(500 MHz，CDCl3)，δ(ppm)4.16(d，1H，J＝6 Hz)，3.70(m，2H)，3.57(m，2H)，3.20(m，1H，C(40)-H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)，δ(ppm)78.65(C-40)，77.20(C-28)，68.93(CH2O)，62.10(CH2O). MS(ESI)m/z 951[M+Na]+ 实施例4通过39-去甲氧基雷帕霉素的脂肪酶催化酯化得到39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素 将39-去甲氧基雷帕霉素(720mg，0.82mmol)，乙烯基2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸酯(244mg，1.22mmol)，脂肪酶PS-C“Amano”II(720mg)和分子筛0.5nm(250mg)在无水叔丁基甲基醚(3.5mL)中的混合物在氩气氛围下加热至43℃。48h之后LC/MS监测显示原料完全转化。添加THF(10mL)并通过硅藻土垫过滤混合物。用THF(2×10mL)洗涤酶，并减压浓缩合并的有机萃取液。将残余物溶解在THF(50mL)中并添加H2SO4(15mL，0.5N)。使溶液在室温静置5h，随后添加NaHCO3(50mL，5％)和盐水(50mL)中止反应。用EtOAc(3×100mL)萃取含水混合物，在MgSO4上干燥合并的有机萃取液。除去溶剂，得到半固体态产物。通过急骤层析法(己烷/丙酮1∶1)进行纯化，得到产物，为无色固体。
NMR数据与实施例2.4相同。
MS(ESI)m/z 1022[M+Na]+根据图3所示的碎片图谱，该钠加合物的碎片在m/z 850，728，693，614，560，545，441和431处给出离子。
实施例5.39-去甲氧基-40-O-[2-羟乙基3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯]雷帕霉素 将39-去甲氧基-40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素(40mg，0.04mmol)，乙烯基2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸酯(25mg，0.13mmol)，脂肪酶PS-C“Amano”II(40mg)和分子筛0.5nm(40mg)在无水叔丁基甲基醚(2mL)中的混合物在氩气氛围下加热至43℃。72h之后LC/MS监测显示原料完全转化。添加THF(10mL)并通过硅藻土垫过滤混合物。用THF(2×10mL)洗涤酶，并减压浓缩合并的有机萃取液。将残余物溶解在丙酮(7.5mL)中并添加H2SO4(2.5mL，0.5N)。使溶液在室温静置2h，随后添加饱和NaHCO3(10mL)和水(10mL)中止反应。用EtOAc(3×10mL)萃取含水混合物，在MgSO4上干燥合并的有机萃取液。除去溶剂，得到产物，为黄色固体。通过制备性HPLC在Phenomenex 21.2×50mm Luna 5μm C18 BDS柱上使用70∶30MeCN/水至100％MeCN在15分钟梯度洗脱进行纯化，得到产物，为无色固体。
MS(ESI)m/z 1067[M+Na]+根据图4所示的碎片图谱，该钠加合物的碎片在m/z 894，772，738，614，604，5 89，475和441处给出离子。
实施例6 27-O-去甲基-39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素 6.1含有2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸的27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素，40-酯 将27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素(30mg，0.034mmol)，乙烯基2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-羧酸酯(34mg，0.17mmol)，脂肪酶PS-C“Amano”II(30mg)和分子筛0.5nm(30mg)在无水叔丁基甲基醚(2mL)中的混合物在氩气氛围下加热至43℃，持续72h。添加THF(10mL)并通过硅藻土垫过滤混合物。用THF(2×10mL)洗涤酶，并减压浓缩合并的有机萃取液，得到微黄色半固体态产物。通过急骤层析法使用己烷∶丙酮(v∶v 2∶1)进行纯化，得到产物，为浅黄色固体。
MS(ESI)m/z 1049[M+Na]++ 6.2 27-O-去甲基-39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素 将得自6.1的物质溶解在丙酮(6mL)中并添加H2SO4(2mL，0.5N)。使溶液在室温静置2h，随后添加饱和NaHCO3(10mL)和水(10mL)中止反应。用EtOAc(3×10mL)萃取含水混合物，在MgSO4上干燥合并的有机萃取液。除去溶剂，得到产物，为微黄色固体。通过制备性HPLC在Phenomenex 21.2×50mm Luna 5μm C18 BDS柱上使用70∶30 MeCN/水至100％MeCN在15分钟梯度洗脱进行纯化，得到产物，为无色固体。
MS(ESI)m/z 1009[M+Na]+根据图5所示的碎片图谱，该钠加合物的碎片在m/z 836，679，600，560，531，431，427处给出离子。
1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ ppm 4.73(m，1H，C(40)-H)，4.32(d，J＝4.5Hz，1H，C(27)-H)，4.19(d，J＝4.5 Hz，1H，C(28)-H)，3.89(m，2 H)，3.70(m，2 H)1.03(s，3 H)。
实施例7.体外评估39-去甲氧基-40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素和39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素的抗癌活性 如以上利用改良的亚甲基碘试验的通用方法中的规程1所述，用单层增殖试验在12种人肿瘤细胞系板上进行体外评估39-去甲氧基-40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素和39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素的抗癌活性。
结果显示在下表3中，每个结果代表两次重复实验的平均值。表4显示了这些化合物和雷帕霉素对测试细胞系的IC50和IC70，用雷帕霉素作为参照物。
表3 表4 *-平均值是基于可获得数据的9个细胞系 实施例8.体外结合实验 FKBP12 FKBP12能在化学变性剂盐酸胍(GdnHCl)中可逆展开(unfold)，而且能通过蛋白质固有荧光的变化而监测(Main等，1998)。特异结合并稳定FKBP12天然状态的配体可改变变性曲线，由此可使蛋白质在较高化学变性剂浓度下才展开(Main等，1999)。通过稳定性的差异，配体结合常数可用方程式1来确定。
其中ΔGapp是游离和配体结合形式间展开自由能的表观差值，

是游离蛋白质在水中的展开自由能，[L]是配体浓度，而Kd是蛋白质-配体复合物的解离常数(Meiering等，1992)。利用以下方程式，展开自由能可与展开转变的中点成比例 其中mD-N是针对给定蛋白质和给定变性剂的常数，其与展开中残基暴露程度的变化成比例(Tanford 1968和Tanford 1970)，而且[D]50％是对应展开中点的变性剂浓度。我们将ΔΔGD-NL——用雷帕霉素和未知配体(以相同配体浓度)对FKBP12稳定性的差值，定义为 其中<mD-N>是展开转化的平均m-值，而且Δ[D]50％是雷帕霉素-FKBP12展开转化和未知配体-FKBP12复合物展开转化中点的差值。在[L]＞Kd的条件下，通过方程式4，则ΔΔGD-N能与两种化合物的相对Kd成比例 其中Kdrap是针对雷帕霉素的解离常数，而Kdx是针对未知配体的解离常数。所以， 拟合每条变性曲线来产生针对mD-N和[D]50％的值，用其可以计算平均m-值、<mD-N>、和Δ[D]50％，并由此计算Kdx。用0.2nM时的Kdrap的文献值。
在一些情况中，由于测试化合物的低溶解度，使用比雷帕霉素对照实验低的测试化合物浓度。在这些情况中，使用下面的方程式6考虑测试化合物浓度和雷帕霉素对照浓度之间的差异 表5-FKBP-12体外结合实验结果 mTOR 通过测定mTOR途径替代品标记物和p70S6激酶和S6的磷酸化水平，可间接进行抑制mTOR (Brunn等，1997；Mothe-Satney等，2000；Tee和Proud，2002；Huang和Houghton，2002)。
HEK293细胞与FLAG-标记的mTOR和myc-标记的调节性相关蛋白(raptor)共转染，培养24h，然后除血清过夜。用100nM胰岛素刺激细胞，然后收获并通过3次冷冻/熔融循环裂解。收集裂解产物并与等量针对mTOR/调节性相关蛋白复合物的FLAG抗体进行免疫沉淀。进行免疫沉淀用化合物(0.00001-0.003mM)处理的样品与FKBP12/雷帕霉素、FKBP12/39-去甲氧基雷帕霉素衍生物或载体(DMSO)于30℃预孵育30分钟，未处理的样品在激酶缓冲液中孵育。然后免疫沉淀产物用于进行体外激酶试验，其中存在3mM ATP、10mM Mn2+和GST-4E-BP1作为底物。用4x上样缓冲液终止反应，然后加入15％SDS-PAGE，湿法转移到PVDF膜上，然后探测磷酸-4E-BP1(T37/46)。使用图像J(Image J)(http://rsb.info.nih.gov/ij/)通过图像分析定量分析蛋白质印迹带(Western blotband)。图6A显示了雷帕霉素(实心方块)和39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素(实心三角形)的剂量-响应曲线。图6B显示了雷帕霉素(实心方块)和39-去甲氧基-40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素(实心三角形)的剂量-响应曲线。
可选地，HEK293细胞加入到6孔板中并预孵育24h，然后除去血清过夜。用载体或化合物于30℃预处理细胞30分钟，然后用100nM胰岛素于30℃刺激30分钟并通过3个冷冻/熔融循环裂解，并测定蛋白质浓度。将等量蛋白质上样于SDS-PAGE胶上并分离。用湿法将蛋白质转移到PVDF膜上并探测磷酸-S6(S235/36)或磷酸-p70 S6K(T389)。使用图像J(http://rsb.info.nih.gov/ij/)通过图像分析定量分析蛋白质印迹带。
参考文献
Alarcon，C.M.，Heitman，J.，and Cardenas，M.E.(1999)Protein kinase activity and identificationof a toxic effector domain of the target of rapamycin TOR proteins in yeast.MolecularBiology of the Cell 102531-2546.
Alvarez，M.，Paull，K.，Monks，A.，Hose，C.，Lee，J.S.，Weinstein，J.，Grever，M.，Bates，S.，Fojo，T.，1995.Generation of a drug resistance profile by quantitation of mdr-1/P-glycoproteinin the cell lines of the National Cancer Institute Anticancer Drug Screen.Journal ofClinical lnvestigation，95，2205-2214.
Aparicio，J.F.，Molnár，l.，Schwecke，T.，Knig，A.，Haydock，S.F.，Khaw，L.E.，Staunton，J.，andLeadiay，P.F.(1996)Organization of the biosynthetic gene cluster for rapamycin inStreptomyces hygroscopicusanalysis of the enzymatic domains in the modularpolyketide synthase.Gene 1699-16.
Baker，H.，Sidorowicz，A.，Sehgal，S.N.，and Vézina，C.(1978)Rapamycin(AY-22，98g)，a newantifungal antibiotic.III.In vitro and in vivo evaluation.Journal of Antibiotics 31539-545.
Boulay，A.，Zumstein-Mecker，S.，Stephan，C.，Beuvink，l.，Zilbermann，F.，Haller，R.，Tobler，S.，Heusser，C.，O′Reilly，T.，Stolz，B.，Marti，A.，Thomas，G.，Lane，H.A.，.2004，Antitumorefficacy of intermittent treatment schedules with the rapamycin derivative RAD001correlates with prolonged inactivation of ribosomal protein S6 kinase 1 in pe ripheralblood mononuclear cells.Cancer Res.64(1)，252-61.
Boyd，M.R.and Paull，K.D.，1995.Some Practical Consideratioms and Applications of theNational Cancer Institute In Vitro Anticancer Drug Discovery Screen.Drug DevelopmentResearch 34，91-109，
Brown，E.J.，Albers，M.W.，Shin，T.B.，lchikawa，K.，Keith，C.T.，Lane，W.S.，and Schreiber，S.L.(1994)A mammalian protein targeted by G1-arresting rapamycin-receptor complex.Nature 369756-758.
Brunn，G.J.，Fadden，P.，Haystead，T.A.，Lawrence，J.C.Jr.1997 The mammalian target ofrapamycin phosphorylates sites having a(Ser/Thr)-Pro motif and is activated byantibodies to a region near its COOH terminus.J Biol.Chem.272(51)，32547-32550.
Brunn，G.J.，Williams，J.，Sabers，C.，Wiederrecht，G.，Lawrence，J.C.，and Abraham，R.T.(1996)Direct inhibition of the signaling functions of the mammalian target of rapamycinby the phosphoinositide 3-kinase inhibitors，wortmannin and LY294002.EMBO Journal155256-5267.
Carlson，R.P.，Hartman，D.A.，Tomchek，L.A.，Walter，T.L.，Lugay，J.R.，Calhoun，W.，Sehgal，S.N.，Chang，J.Y.(1993).Rapamycin，a potential disease-modifying antia rtharitic drug.J.Pharmacol.Exp.Ther.266(2)1125-38.
Crowe A，BruelisauerA，Duerr L，Guntz P，Lemaire M.(1999)Absorption and intestinalmetabolism of SDZ-RAD and rapamycin in rats.Drug Metab Dispos，27(5)，627-32Dengler W.A.，Schulte J.，Berger D.P.，Mertelsmann R.and Fiebig HH.(1995)Development of a
propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assay.Anti-CancerDrugs，6522-532.
DiLelia，A.G.，and Craig，R.J.(1991)Exon organization of the human FKBP-12 genecorrelationwith structural and functional protein domains.Biochemistry 308512-8517.
Dudkin，L.，Dilling，M.B.，Cheshire，P.J.，Harwood，F.C.，Hollingshead，M.，Arbuck，S.G.，Travis，R.，Sausville，E.A.，Houghton，P.J.(2001).Biochemical correlates of mTOR inhibition bythe rapamycin ester CC1-77g and tumor growth inhibition.Clin.Cancer Res.7(6)1758-64
Evans D.A.，Gage J.R.and Leighton J.L.(1992)Assymetric synthesis of calyculin A.3.Assembiage of the calyculin skeleton and the introduction of a new phosphatemonoester synthesis.J.Org.Chem.，571964-1966
Fiebig H.H.，Dengler W.A.and Roth T.(1999)Human tumor xenograftsPredictivity，characte rization，and discovery of new anticancer agents.InFiebig HH，Burger AM(eds).Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development.Contrib.Oncol.，5429-50.
Findlay J.A，and Radics，L.(1980)Canadian Journal of Chemistry 58579.Fishbein，T.M.，Florman，S.，Gondolesi，G.，Schiano，T.，LeLeiko，N.，Tschernia，A.，Kaufman，S.(2002).Intestinal transplantation before and after the introduction of sirolimus.Transplantation.73(10)1538-42.
Foey，A.，Green，P.，Foxwell，B.，Feldmann，M.，Brennan，F.(2002).Cytokine-stimulated T cellsinduce macrophage IL-10 production dependent on phosphatidylinositol 3-kinase andp70S6Kimplications for rheumatoid arthritis.Arthritis Res.4(1)64-70.Epub 2001 Oct10.
Furniss B.S.，Hannaford A.J.，Smith P.W.G.and Tatchell A.R.(1989)Vogel′s textbook ofpracticalorganic chemistry，5th Ed，Pearson，Prentice Hall， Harlow，UK.
Gallant-Haidner HL，Trepanier DJ，Freitag DG，Yatscoff RW.2000，“Pharmacokinetics andmetabolism of sirolimus”.Ther Drug Monit.22(1)，31-5.
Grass，G.M.，Rubas，W.，Jezyk，N.，(1992)Evaluation of CACO-2 monolayers as a predictor ofdrug permeability in colonic tissues.FASEB Journal，6，A1002.
Gregory，C.R.，Huie，P.，Biilingham，M.E.and Morris，R.E.(1993).Rapamycin inhibits arterialintimal thickening caused by both alloimmune and mechanical injury.lts effect oncellular，growth factor and cytokine response in injured vessels.Transplantation55(6)1409-1418.
Gregory MA，Gaisser S，Lill RE，Hong H，Sheridan RM，Wilkinson B，Petkovic H，Weston AJ，Carletti l，Lee HL，Staunton J，Leadlay PF.(2004)″lsolation and characterization of pre-rapamycin，the first macrocyclic intermediate in the biosynthesis of theimmunosuppressant rapamycin by S.hygroscopicus”.Angew Chem Int Ed Engl.43(19)，2551-3
Gu，J，Ruppen ME，Cai P.(2005)，“Lipase-Catalyzed Regioselective Esterification ofRapamycinSynthesisofTemsirolimus(CC1-779).Org.Lett.7(1 8)3945-3948.
Guba，M.，von Breitenbuch，P.，Steinbauer，M.，Koehl，G.，Flegel，S.，Hornung，M.，Bruns，C.J.，Zuelke，C.，Farkas，S.，Anthuber，M.，Jauch，K.W.，and Geissler，E.K.(2002)Rapamycininhibits primary and metastatic tumor growth by antiangiogenesisinvolvement ofvascular endothelial growth factor.Nature Medicine 8128-135.
Hardwick，J.S.，Kuruvilla，F.G.，Tong，J.K.，Shamji，A.F.，and Schreiber，S.L.(1999)Rapamycin-modulated transcription defines the subset of nutrient-sensitive signaling pathwaysdirectly controlled by the Torproteins.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 9614866-14870.
Hentges，K.E.，Sirry，B.，Gingeras，A.C.，Sarbassov，D.，Sonenberg，N.，Sabatini，D.，andPeterson，A.S.(2001)FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning duringembryonic developmentin the mouse.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 9813796-13801.
Huang，S.and Houghton，P.J.，2002.Mechanisms of resistance to rapamycins.Drug Resist.Update，4(6)，378-391.
Jain，S.，Bicknell，G.R.，Whiting，P.H.，Nicholson，M.L.(2001).Rapamycin reduces expressionof fibrosis-associated genes in an experimental model of renal ischaemia reperfusioninjury.Transplant Proc.33(1-2)556-8.
Kahan，B.D.，and Camardo，J.S.(2001)RapamycinClinical results and futureopportunities.Transplantation 721181-1193.
Kahan，B.D.，Chang，J.Y.，and Sehgal，S.N.(1991)Preclinical evaluation of a new potentimmunosuppressive agent，rapamycin.Transplantation 52185-191.
Kirby，B.，and Griffiths，C.E.M.(2001)Psoriasisthe future.British Journal of Dermatology14437-43.
Kirchner，G.l.，Winkler，M.，Mueller L.，Vidal，C.，Jacobsen，W.，Franzke，A.，Wagner，S.，Blick，S.，Manns M.P.，and Sewing K.-F.(2000)Phamacokinetics of SDZ RAD and cyclosporinincluding their metabolites in seven kidney graft patients after the first dose of SDZ RAD.British Journal of Clinical Pharmacology 50449-454.
Kuo，C.J.，Chung，J.K.，Fiorentino，D.F.，Flanagan，W.M.，Blenis，J.，and Crabtree，G.R.(1992)Rapamycin selectively inhibitsinterleukin-2 activation of p70 S6 kinase.Nature 35870-73.
Langmann T，Mauerer R，Zahn A，Moehle C，Probst M，Stremmel W，Schmitz G.(2003)“Real-time reverse transcription-PCR expression profiling of the complete human ATP-bindingcassette transportersuperfamily in various tissues”.Clin Chem.49(2)，230-8.Lee，J-S，Paull，K.，Alvarez，M.，Hose，C.，Monks，A.，Grever，M.，Fojo，A.T.，Bates，S.E.，1 994.
Rhodamine efflux patterns predict P-glycoprotein substrates in the National CancerInstitute drug scraen.Molecular Pharmacology 46，627-638.
Li，A.P.(1 992)Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery.DrugDiscovery Today，6，357-366.
Lowden，P.A.S.，(1997)Ph.D.Dissertation，University of Cambridge.“Studies on thebiosynthesis of rapamycin”.
Lyons，W.E.，George，E.B.，Dawson，T.M.，Steiner，J.P.，and Snyder，S.H.(1994)Immunosuppressant FK506 promotes neurite outgrowth in cultures of PC12 cells andsensory ganglia.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United StatesofAmerica 913191-3195.
Main，E.R.G.，Fulton，K.F.&Jackson，S.E.(1998).The Context-Dependent Nature ofDestabilising Mutations on The Stability of FKBP12.Biochemistry 37，6145-6153.
Main，E.R.G.，Fulton，K.F.&Jackson，S.E.(1999a).Folding of FKBP12Pathway of Foldingand Characterisation of the Transition State.J.Mol.Biol.291，429-444.McAlpine，J.B，.Swanson S.J.，Jackson，M.，Whittern，D.N.(1991).Revised NMRassignments for rapamycin.Journal of Antibiotics 44688-690.
Meiering，E.M.，Serrano，L.&Fersht，A.R.(1992).Effect of Active Site Residues in Barnase onActivity and Stability.J.Mol. Biol.225，585-589.
Morice，M.C.，Serruys，P.W.，Sousa，J.E.，Fajadet，J.，Ban Hayashi，E.，Perin，M.，Colombo，A.，Schuler，G.，Barragan，P.，Guagliumi，G.，Molnar，F.，Falotico，R.(2002).RAVEL StudyGroup.Randomized Study with the Sirolimus-Coated Bx Velocity Balloon-ExpandableStent in the Treatment of Patients with de Novo Native Coronary Artery Lesions.Arandomized compa rison of a sirolimus-eluting stent with a standard stent for coronaryrevascula rization.N. Eng.l.J. Med.346(23)1773-80.
Mothe-Satney，l.，Brunn，G.J.，McMahon，L.P.，Capaldo，C.T.，Abraham，R.T.，Lawrence，J.C.Jr-.2000 Mammalian target of rapamycin-dependent phosphorylation of PHAS-1 in four(S/T)P sites detected by phospho-specific antibodies.J BiolChem.275(43)，33836-33843.
Myckatyn，T.M.，Ellis，R.A.，Grand，A.G.，Sen，S.K.，Lowe，J.B.3rd，Hunter，D.A.，Mackinnon，S.E.(2002).The effects of rapamycin in murine pe ripheral nerve isografts and allografts.Plast. Reconstr.Surg.109(7)2405-17.
Navé，B.T.，Ouwens，D.M.，Withers，D.J.，Alessi，D.R.，and Sheperd，P.R.(1999)Mammaliantarget of rapamycin is a direct target for protein kinase Bidentification of a convergencepoint for opposing effects of insulin and amino-acid deficiency on protein trans lation.Biochemical Journal 344427-431.
NCCLS Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing for YeastsApproved Standard M27-A，vol.17 No.9.(1997).
Paiva，N.L.，Demain，A.L.，and Roberts，M.F.(1991)Incorporation of acetate，propionate，andmethionine into rapamycin By Streptomyces hygroscopicus.Journalof Natural Products54167-177.
Paiva，N.L.，Demain，A.L.，and Roberts，M.F.(1993)The immediate precursor of the nitrogen-containing ring of rapamycin is free pipecolic acid.Enzyme and Microbial Technology15581-585.
Perin，E C，(2005)，“Choosing a Drug-Eluting StentA Comparison Between CYPHER andTAXUS″，Reviews in Cardiovascular Medicine，6(suppl1)，ppS13-S21.
Persidis A.(1999)，“Cancer multidrug resistance”Nat Biotechnol.1794-5
Powell， N.，Till，S.，Bungre，J.，Corrigan，C.(2001).The immunomodulatory drugs cyclosporin A，mycophenolate mofetil，and sirolimus(rapamycin)inhibit allergen-induced proliferationand IL-5 production by PBMCs from atopic asthmatic patients.J.Allergy Clin.Immunol.108(6)915-7
Rabinovitch，A.，Suarez-Pinzon，W.L.，Shapiro，A.M.，Rajotte，R.V.，Power，R.(2002).Combination therapy with sirolimus and interleukin-2 prevents spontaneous andrecurrent autoimmune diabetes in NOD mice.Diabetes.51(3)638-45.
Raught，B.，Gingras，A.C.，and Sonenberg，N.(2001)The target of rapamycin(TOR)proteins.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 987037-7044.
Reather，J.A.，(2000)，Ph.D.Dissertation，University of Cambridge.“Late steps in thebiosynthesis of macrocyclic lactones”.
Reitamo，S.，Spuls，P.，Sassolas，B.，Lahfa，M.，Claudy，A.，Griffiths，C.E.；Sirolimus EuropeanPsoriasis Study Group.(2001).Efficacy of sirolimus(rapamycin)administeredconcomitantly with a subtherapeutic dose of cyclosporin in the treatment of severepsoriasisa randomized controlled trial.Br.J.Dermatol.145(3)438-45.
Roth T.，Burger A.M.，Dengler W.，Willmann H.and Fiebig H.H.(1999)Human tumor cell linesdemonstrating the characteristics of patient tumors as useful models for anticancer drugscreening.InFiebig HH，Burger AM(eds).Relevance of Tumor Models for AnticancerDrug Development.Contrib.Oncol.，54145-156.
Roymans，D.，and Slegers，H.(2001)Phosphaditidylinositol 3-kinases in tumor progression.European Journal of Biochemistry 268487-498.
Schwecke，T.，Apa ricio，J.F.，Molnár，l.，Knig，A.，Khaw，L.E.，Haydock，S.F.，Oliynyk，M.，Caffrey，P.，Cortés，J.，Lester，J.B.，Bhm，G.A.，Staunton，J.，and Leadlay，P.F.(1995)The biosynthetic gene cluster for the polyketide immunosuppressant rapamycin.
Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 927839-7843.
Sedrani，R.，Cottens，S.，Kallen，J.，and Schuler，W.(1998)Chemical modifications ofrapamycinthe discovery of SDZ RAD.Transplantation Proceedings 302192-2194.
Sehgal，S.N.，Baker，H.，and Vézina，C.(1975)Rapamycin(AY-22，989)，a new antifungalantibiotic ll.Fermentation，isolation and characterization.The Journal of Antibiotics 28727-733.
Shepherd，P.R，Withers，D.J.，and Siddle K.(1998)Phosphoinositide 3-kinasethe key switchmechanism in insulin signalling.Biochemical Journal333471-490.
Smith M.B.and March J.(2001)March’s advanced organic chemistry，5th Ed，John Wiley andSons lnc.，UK
Steiner，J.P.，Hamilton，G.S.，Ross，D.T.，Valentine，H.L.，Guo，H.，Connolly，M.A.，Liang，S.，Ramsey，C.，Li，J.-H.J.，Huang，W.，Howorth，P.，Soni，R.，Fuller，M.，Sauer，H.，Nowotnik，A.C.，and Suzdak，P.D.(1997)Neutrophic immunophilin ligands stimulatestructural and functionalrecovery in neurodegenerative animal models.Proceedingsofthe National Academy of Sciences of the United States of America 942019-2024.
Stein U，Jurchott K，Schlafke M，Hohenberger P.(2002)“Expression of multidrug resistancegenes MVP，MDR1，and MRP1 determined sequentially before，diring，and afterhyperthermic isolated limb perfusion of soft tissue sarcoma and melanoma patients”.JClin Oncol.20(15)3282-92.
Szakacs G，Annereau JP，Lababidi S，Shankavaram U，Arciello A，Bussey KJ，Reinhold W，GuoY，Kruh GD，Reimers M，Weinstein JN，Gottesman MM.2004，“Predicting drugsensitivity and resistanceprofiling ABC transporter genes in cancer cells”.Cancer Cell.6(2)129-37.
Tanford，C.(1968).Protein Denaturation.Adv.Prot.Chem.23，121-282.
Tanford，C.(1970).Protein Denaturation.Part C.Theoretical models for the mechanism ofdenaturation.Advances in Protein Chemistry 24，1-95
Tang，S.J.，Reis，G.，Kang，H.，Gingras，A.-C.，Sonenberg，N.，and Schuman，E.M.(2002)Arapamycin-sensitive signaling pathway contributes to long-term synaptic plasticity in thehippocampus.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 1467-472.
Tee，A.R.and Proud，C.G.2002 Caspase cleavage of initiation factor 4E-binding protein 1yields a dominant inhibitorof Cap-dependent translation and reveals a novelregulatorymotif.Mol.Cell.Biol.22.1674-1683
Toshima K.and Tatsuta K.(1993)Recent progress in O-glycosylation methods and itsapplication to natural product synthesis.Chem.Rev.，931503-1531.Trepanier DJ，Gallant H，Legatt DF，Yatscoff RW.(1998)，“Rapamycindistribution，
pharmacokinetics and therapeutic range investigationsan update”.Clin Biochem.31(5)345-51.
Vézina，C.，Kudelski，A.，and Sehgal，S.N.(1975)Rapamycin(AY-22，989)，a new antifungalantibiotic.l.Taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the activeprinciple.The Journal of Antibiotics 28721-726.
Volpe，D.A.，Faustino，P.J.，Yu，L.X.，(2001)Towards standardisation of an in vitro method ofdrug absorption.Pharmacopeial Forum，27，291 6-2922.
Waller，J.R.，and Nicholson，M.L.(2001)Molecular mechanisms of renal allograft fibrosis.BritishJournal of Surgery 881429-1441.
Warner，L.M.，Adams，L.M.，Chang，J.Y.，Sehgal，S.N.(1992).A modification of the in vivomixed lymphocyte reaction and rapamycin′s effect in this model.Clin.Immunol.Immunopathol.64(3)242-7.
Yu，K.，Toral-Barza，L.，Discafani，C.，Zhang，W.G.，Skotnicki，J.，Frost，P.，Gibbons，J.J.(2001)mTOR，a novel target in breast cancerthe effect of CC1-779，an mTOR inhibitor，inpreclinical models of breast cancer.Endocrine-Related Cancer 8249-258.
Zhu，J.，Wu J.，Frizell，E.，Liu，S.L.，Bashey，R.，Rubin，R.，Norton，P.，Zern，M.A.(1999).Rapamycin inhibits hepatic stellate cell proliferation in vitro and limits fibrogenesis in anin vivo model of liver fibrosis.Gastroenterology.117(5)1198-204.
权利要求
1.雷帕霉素的39-去甲氧基衍生物，其特征在于，40-羟基位点被衍生为羧酸酯、醚、磷酸酯、次膦酸酯、缩醛或糖基。
2.根据下式(I)的化合物，或其药用盐
其中
X表示键或CH2；
R1表示酮基或(H，H)；
R2表示OH或OMe；
R3表示H、OH或OMe；
R4和R5各自独立地表示H或OH；
R6表示-R7、-C(O)R7、-(CH2)2-O-[CR21R22-O]a-C(O)-R23；-CR21R22-O-C(O)-R23；-POR19R20；-PO(OR19)(OR20)或Y-R15；
R7表示-(CR8R9)m(CR10R11)pCR12R13R14；
R8和R9各自独立地表示C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，上述任意基团可任选被-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH或-NH2取代；或者R8和R9各自独立地表示H、三氟甲基或F；
R10，R11，R12，R13和R14各自独立地表示C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，上述任意基团可任选被-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH或-NH2取代；或者R10、R11、R12、R13和R14可独立地选自H、-(CR8R9)qNH2、-(CR8R9)qOH、CF3、F、COOH；或者R10和R11或R12和R13或R13和R14可与它们连接的碳结合在一起形成C3-C6环烷基或3-6元杂烷基环，该杂烷基环含有一个或多个选自N、O和S的杂原子，并任选地被最多5个-(CR8R9)qOH、-(CR8R9)qNH2或COOH基团取代；Y＝键、-C(O)-O-；-(CH2)2-O-C(O)-O-；
R15代表
或
R16各自独立地为H或OH；
R17独立地选自H、OH和NH2；
R18独立地选自H、-CH3、-CH2OH和-COOH；
但条件是选自R16、R17和R18的最多2个基团表示H或CH3；
R19和R20各自独立地表示H或C1-C4烷基或者R19和R20一起表示＝CH2；
R21独立地选自H、CH3；
R22独立地选自H、-CH3、-CH＝CH2、-CH2Cl、-CHCl2、-CCl3、-CH(OH)Me、-CH2OH、-CH2CH3、-CH(Cl)Me；
R23独立地为R7、Y-R15或5或6元芳基或杂芳基环，任选被1-3个选自OH、F、Cl、Br、NO2和NH2的基团取代；
a表示0或1；
m、p和q各自独立地表示0-4的整数；
但条件是，R7基团不含多于12个的碳原子，并且含有至少一个选自-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-COOH、OH或NH2的官能团。
3.权利要求2的化合物，其中R6表示-R7。
4.权利要求2的化合物，其中R6表示-C(O)R7。
5.权利要求2的化合物，其中R6表示-(CH2)2-O-[CR21R22-O]a-C(O)-R23。
6.权利要求5的化合物，其中R23表示R7。
7.权利要求5的化合物，其中R23表示Y-R15。
8.权利要求2-6任一项的化合物，其中R7含有7个或更少的碳原子。
9.权利要求8的化合物，其中R7含有5个或更少的碳原子。
10.权利要求2-6、8或9的化合物，其中R7含有选自-PO(OH)2，-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH和-NH2的两个基团。
11.权利要求2-6、8-10任一项的化合物，其中R7含有选自-COOH、-OH和-NH2的至少一个官能团。
12.权利要求2-6、8-11任一项的化合物，其中p表示0或1。
13.权利要求2-6、8-12任一项的化合物，其中m表示0或1。
14.权利要求2-6、8-13任一项的化合物，其中q表示0、1或2。
15.权利要求2-6、8-14任一项的化合物，其中R11表示H。
16.权利要求2-6、8-15任一项的化合物，其中R12表示H。
17.权利要求2-6、8-16任一项的化合物，其中R13表示H或OH。
18.权利要求2-6、8-17任一项的化合物，其中p表示1，R10表示Me、OH或CH2OH。
19.权利要求2-6、8-17任一项的化合物，其中p表示1，R11表示Me、OH或CH2OH。
20.权利要求2-6、8-11任一项的化合物，其中m和p均表示0，R12和R13均表示H，且R14表示-(CR8R9)q-OH，其中q＝0或1，R8和R9均表示H。
21.权利要求2-6、8-11任一项的化合物，其中p表示1，m表示0，R10和R11均表示H，R12表示H，R13表示H、OH或NH2，及R14表示-(CR8R9)q-OH，其中q＝0或1，R8和R9均表示H。
22.权利要求2-6、8-11任一项的化合物，其中R6表示通过和羟基乙酸，3-羟基-2，2-二甲基丙酸，2，3-二羟基丙酸，3-羟基-2-羟甲基丙酸或2，2-双(羟甲基)丙酸形成酯而衍生的基团。
23.权利要求2-6、8-11任一项的化合物，其中R6表示通过和羟基乙酸，3-羟基-2，2-二甲基丙酸，2，3-二羟基丙酸，3-羟基-2-羟甲基丙酸或2，2-双(羟甲基)丙酸形成醚而衍生的基团。
24.权利要求2的化合物，其为39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素或其药用盐。
25.权利要求2的化合物，其为39-去甲氧基-40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素或其药用盐。
26.权利要求2的化合物，其为39-去甲氧基-40-O-[2-羟乙基3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯]雷帕霉素或其药用盐。
27.权利要求2的化合物，其为27-O-去甲基-39-去甲氧基-40-O-[2，2-双(羟甲基)丙酰基]雷帕霉素或其药用盐。
28.权利要求2的化合物，其中R6表示-POR19R20。
29.权利要求2的化合物，其中R6表示-PO(OR19)(OR20)。
30.权利要求28或29的化合物，其中R19和R20均表示CH3或均表示CH2CH3。
31.权利要求2的化合物，其中R6表示Y-R15。
32.权利要求31的化合物，其中R15基团表示
33.权利要求32的化合物，其中R15为通过和葡萄糖、葡糖胺、葡糖醛酸或阿拉伯糖形成缩醛而形成的基团。
34.权利要求32的化合物，其中R15为通过和D-葡萄糖形成缩醛而形成的基团。
35.权利要求32的化合物，其中R15为通过和D-葡糖胺形成缩醛而形成的基团。
36.权利要求32的化合物，其中R15为通过和D-葡糖醛酸形成缩醛而形成的基团。
37.权利要求31的化合物，其中R15表示
38.权利要求37的化合物，其中R15是通过和果糖形成缩醛而形成的基团。
39.权利要求31的化合物，其中R15表示
40.权利要求39的化合物，其中R15为通过和葡糖醛酸形成酯而形成的基团。
41.权利要求31-40任一项的化合物，其中Y表示键。
42.权利要求31-40任一项的化合物，其中Y表示-(CH2)2-O-C(O)-O-。
43.权利要求31-40任一项的化合物，其中Y表示-C(O)-O-。
44.权利要求1-43任一项的化合物，其用作药物。
45.权利要求1-43任一项的化合物，用于治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤，诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥、移植物抗宿主病、自体免疫性疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维化疾病，以及刺激神经再生或治疗真菌感染。
46.权利要求1-43任一项的化合物，用于治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤的药物。
47.药物组合物，包括权利要求1-43任一项的化合物和一种或多种药用稀释剂或载体。
48.用于治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤，诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥、移植物抗宿主病、自体免疫性疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维化疾病，以及刺激神经再生或治疗真菌感染的方法，其包括给予患者有效量的权利要求1-43任一项的化合物。
49.用于治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤的方法，其包括给予患者有效量的权利要求1-43任一项的化合物。
50.权利要求1-43任一项的化合物在制备治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤，诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥、移植物抗宿主病、自体免疫性疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维化疾病，以及刺激神经再生或治疗真菌感染的药物中的用途。
51.权利要求50的用途，其中所述药物用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤。
52.制备根据权利要求2-43任一项的式(I)化合物的方法，其包括
(a)将式(II)的化合物或其被保护的衍生物和式(III)的化合物或其活化衍生物进行反应
式(II)为
其中RA表示H或(CH2)2-OH
式(III)为
HO-R6(III)
其中R6如上述式(I)化合物或其被保护的衍生物所定义的；或者
(b)将式(I)化合物或其盐转变为另一种式(I)化合物或其另一种药用盐；或者
(c)将被保护的式(I)化合物脱去保护。
53.组合物或各部分的试剂盒，包括(i)权利要求1-43任一项的化合物和(ii)一种或多种其他有效治疗剂。
54.权利要求53的组合物或各部分的试剂盒，其中一种或多种有效治疗剂选自
甲氨喋呤、亚叶酸、阿霉素、prenisone，博来霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、多西紫杉醇、长春新碱、长春碱、维诺瑞滨、多柔比星、他莫昔芬、托若米芬、醋酸甲地孕酮、阿纳托唑、果丝瑞宁、抗-HER2单克隆抗体(例如，HerceptinTM)、卡培他滨、盐酸雷洛昔芬、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、蛋白酶体抑制剂、hsp90抑制剂、硫唑嘌呤、皮质类固醇、环磷酰胺、环孢霉素A、FK506、霉酚酸酯、OKT-3、ATG、两性霉素B、氟胞嘧啶、棘白菌素、灰黄霉素、咪唑或三唑抗真菌剂。
全文摘要
本发明涉及新型39-去甲氧基雷帕霉素衍生物，它们的制备方法，及它们的用途。在另一方面，本发明提供39-去甲氧基雷帕霉素衍生物用于治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤，诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥、移植物抗宿主病、自体免疫性疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维化疾病，以及刺激神经再生或治疗真菌感染。
文档编号C07D498/18GK101175760SQ200680016325
公开日2008年5月7日 申请日期2006年3月10日 优先权日2005年3月11日
发明者克里斯托弗·H·贝克曼, 斯蒂芬·J·莫斯, 罗斯·M·谢里登, 张明强, 巴里·威尔金森 申请人:比奥蒂卡科技有限公司