用于生产全2’-修饰的核酸转录产物的材料和方法

专利名称：：用于生产全2’-修饰的核酸转录产物的材料和方法
技术领域：
：本发明涉及用于转录核酸的材冲+和方法，尤其涉及寸务饰的酶和在才莫^反定向聚合过程中4吏用这些》务饰的酶来增加^修饰的核苷整合入核酸，尤其是适体中的材料和方法。另外，本发明涉及筛选转录模板组成序列并使用这种组成序列提高转录产量的方法和材料，尤其是提高指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)方法过程中的转录产率的方法和材泮+。
背景技术：
：—种适体，才艮据其定义，是指一种分离的核酸分子，这种分离的核酸分子与一些靶分子，例如一种蛋白，通过相互作用，而不是沃森-克里克石咸基配对作用，以4艮高的特异性和亲合性结合。这是适体与其他核酸分子，例如基因和mRNA的基本区别。在后者中，核酸结构通过它的线状碱基序列编码信息，因此，这一序列对信息存贮功能是至关重要的。与此完全相反的是，基于其特异性结合的靶分子的适体的功能不是依赖于一种保守的线性石威基序列，而是依赖于一种特定的二级/三级结构，即，适体是一种非编码序列。一种适体所具有的任何编码能力都是完全偶然的，且在适体与其同源耙分子结合过程之中，无论在什么情况下都不会起到任何作用。因此，尽管结合相同靶分子，甚至于结合该耙分子上相同位点的适体可以具有相似的线性石咸基序列，但是在大多数情况下是不具有相似的线性结构的。适体也与天然存在的结合特定蛋白质的核酸序列有所不同。后者是天然存在的序列，^皮包括在生物体基因组范围内，所述生物体能够结合蛋白质的特定的亚基团，该蛋白质被包括在天然存在的核酸的转录、翻译和运输过程中，例如，核酸结合蛋白质。另一方面，适体是短的、^皮分离的、非天然存在的核酸分子。尽管可以识别与结合核酸的蛋白质相结合的适体，但是在大多凄t情况下，这种适体与该结合核酸的蛋白质天然识别的序列具有4艮少的序列一致性，或没有序列一致性。更重要的，适体实际上可以与任何蛋白质(不止是结合核酸的蛋白质)相结合，而是可以与基本上任何可能的靶分子结合，包括，小分子，碳水化合物、肽等等。对于大多数靶分子，甚至是蛋白质，他们能够结合的天然存在的核酸序列是不存在的。对于存在这种序列，即结合核酸的蛋白质的靶分子，这种序列与适体不同，这是由于与具有高结合能力的适体相比，这种序列具有相对低的结合亲合性。适体与噬菌体展示或抗体产生的多肽一样，能够特异通过结合作用，适体能够防止他们的革巴分子发生作用的能力。对于抗体，这种与靶分子特异性结合的功能性质是一种与生俱来的性质。同样对于抗体，尽管本领域技术人员不知道对于一种靶分子的适体具有什么精确的结构特点，但是本领域技术人员却能够在不知道其准确的结构定义的情况下确i人，制备并^f吏用这种分子。适体在单一结构改变方面还类似于小分子治疗，单一结构改变尽管看上去是不重要的，但是可以显著地影响(几倍的数量级)适体的结合和/或其他活性(或活动)。另一方面，一些结构变化则具有^艮小的作用或者无i仑在^f壬^r情况下都没有作用。这显示了适体的二级/三级结构的重要性。^换句话i兌，一种适体是一种^皮约束在一种固定构造中的三维结构，这种固定的构造<吏其与给定的靶分子特异性结合。因此(l)一些区域或具体的序列是必要的，例如(a)与靶分子特异性接触的位点，和/或(b)4巴使分子位于与耙分子想-接触的位点的序列；(2)—些区域或具体的序列具有一定范围的变异性，例如，核苷酸X必须是嘧咬，或核苦Y必须是嘌^^令，或核苦酸X和Y必须是互补的；和(3)一些区域或具体的序列可以是任意的，那就是说，它们基本上是空间元素，例如，他们可以是给定长度的任意核苷链，或是一种非核苷隔离体，例如一种PEG分子。通过乂人随才几寡聚核苷酸序列库中进行体外选择过程发现，适体已经被生产用于超过130种蛋白质，包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白、和受体。一种典型的适体大小为10-15kDa(20-45个核普酸)，以纳摩到次纳摩的亲合性与它的靶分子相结合，并区分密切相关的耙分子(例如，适体一4殳不会结合来自相同基因族的其他蛋白质)。一系列结构研究表明，适体能够l吏用相同类型的结合相互作用(例如，氢4建4建合、,争电互补作用、疏水性4妄触、空间排斥)，这些结合相互作用能在抗体-抗原复合物中推动亲合性和特异性。适体具有许多理想的特征，包括高特异性和亲合性、生物学有效性和杰出的药代动力学性质，能够用作治疗剂和i貪断14剂。另外，它们提供了相对于抗体及其他蛋白质生物体的特异性竟争优势，例如l)速度和控制。适体完全地通过体外过程生产，从而允许最初先导物，包4舌治疗先导物的迅速生成。在体外筛选过程中，使适体的特异性和亲合性受到严格的控制，同时允许先导物，包括抗有毒的和无免疫原性靶分子的先导物的产生。2)毒性和免疫原性。适体，作为一个种类，显示了治疗可接受的毒性或缺乏免疫原性。然而许多单克隆抗体的效果受到对抗体本身的免疫反应严重地限制，因此，得到对此适体的抗体是非常困难的，这很可能由于适体不能被T细胞通过MHC所呈递，且免疫反应通常不识别核酸片l殳。3)给药。尽管目前最认可的抗体治疗剂是通过静脉输液(一般地超过2-4小时)给药的，适体可以通过皮下注射给药(在猴子体内进行研究时适体通过皮下《合药的生物利用率>80%(Tuckeretal，J.ChromatographyB.732:203-212,1999))。这种差异主要由于相对4交低的溶解度和因此对治疗性mAbs的大量需要。一种每周剂量的适体可以通过以小于0.5毫升体积的注射方式传递，这种适体具有4艮好的可溶性(>150毫克/毫升)和相当低的分子量(适体10-50kDa;抗体150kDa)。另外，小体积的适体使他们能够渗入抗体或抗体片段所不能渗入的符合收缩区域，乂人而表现了以适体为基础的治疗剂或预防剂的另一优势。4)可量测性和成本。治疗剂适体是化学合成的，因此可以很容易的被放大，满足生产需要。然而放大生产的难点在于对一些生物的有效性普遍存在的限制，且大规^莫的蛋白质生产制造厂的基建费用是巨大的，单一大规模的寡聚核苷酸合成器可以生产超过100千克/年的产量，且需要相对适度的创办投资。与那些用于高度优化的抗体相比，用于适体合成以千克规4莫方法的商品的市价估计为S500/g。持续的工艺发展改善有望在5年内将商品成本降低到<$100/g。稳定性。治疗剂适体是化学惰性的。在暴露于例如热源和变性剂等因素之后易于乂人本质上恢复活性，乂人而可以制成冻干粉末在室温下长时间储存(〉1年)。相反，抗体必须冷冻储存。除了适体固有的稳、定性，可以在指凄t级富集的配体系统进化技术(SELEX)过程中整合入修饰的核苷(例如，T-修饰的核普)，这些修饰的核苷价格低廉、无毒性，且可以增加对酶降解、化学降解、热降解和物理降解的4氐抗力，其中指凄t级富集的配体系统进4匕冲支术(SELEXTM)2002年12月3日递交的美国专利申请系列第10/729,851号和2004年6月21日递交的美国专利申请系列第10/873,856号中进行了描述。由于在后指数级富集的配体系统进化4支术(post-SELEXTM)过程中可能发生结合亲合力和活性的潜在损失，在后指数级富集的配体系统进化技术(post-SELEXTM)过程中整合入修饰的核苷常常是后指数级富集的配体系统进化技术(post-SELEXTM)修饰所优选的，尽管如此，但由于低的转录产量，在后指数级富集的配体系统进化l支术(post-SELEXTM)过程中修饰核苷的整合，例如2，-0-曱基核苷("2-OMe，)的整合一直是困难的。溶液条件和转录混合物在2002年12月3日递交的美国专利申i青系列第10/729,851号和2004年6月21日递交的美国专利申请系列第10/873,856号中进行了描述，这两篇专利申请为整合入2'-OMe核苷的适体提供了改进的转录产量。但是对于全2'-0-曱基化的适体的转录产量仍存在问题。16除了适体作为一种治疗剂的优点之外，在适体中整合入2，-0-曱基核苷还能够赋予适体价格低廉、低毒性和对核酸酶有增加的^氐抗力的优点，获得能够增加全2，-0-曱基化适体转录产量的材料和方法对于，例如，延长或增加适体治疗剂在体内的稳定性是十分有利的。本发明提供了改进的材料和方法来满足这样和那样的需要。
发明内容本发明涉及经过纯化、分离和/或重组的T7RNA聚合酶。这里4吏用的该术语单独地包4舌在一种细月包或组织中重组表达的本发明聚合酶。这里4吏用的该术语单独的包招「i殳计进入一种细胞或组织中的本发明核酸序列。在一个实施方案中，提供了在639位点和784位点包括一种改变的氨基酸的T7RNA聚合酶，其中，当在784位点的改变的氨基酸是丙氨酸时，在639位点的改变的氨基酸不是苯基丙氨酸。在另一个实施方案中，提供了在378位点进一步包括一种改变的氨基酸的上面描述的T7RNA聚合酶。在另一个实施方案中，提供了在226位点进一步包括一种改变的氨基酸的上述T7RNA聚合酶。在一种特定的实施方案中，在639位点的改变的氨基酸是一种亮氨酸，在784位点上的改变的氨基酸是一种丙氨酸。在一种进一步的实施方案中，在266位点上的改变的氨基酸是一种亮氨酸，在另一种进一步的实施方案中，在378位点的改变的氨基酸是一种精氨酸。在一种优选的实施方案中，改变的氨基酸在转录反应中通过只包括2，-0_Me核苦三磷酸的聚合酶增加了包括2，-0-Me》务饰的核酸的转录产量。在一种特定的实施方案中，当在一致的条件下分別在包^"改变的氨基酸的T7RNA聚合酶和缺少改变的氨基酸的T7RNA聚合酶中进行转录作用，相对于缺失改变的氨基酸的T7RNA聚合酶，包括改变的氨基酸的T7RNA聚合酶的转录产量有所增加。在另一个实施方案中，改变的氨基酸减少了对于2，-0-Me核苷三磷酸的分辨力。在一个特定的实施方案中，当在一致的转录条件下使用两种聚合酶时，相对于缺失改变的氨基酸的T7RNA聚合酶，包括改变的氨基酸的T7RNA聚合酶对2，-0-Me核香三磷酸的分辨力有所下降。在此方面特定的实施方案中，缺失改变的氨基酸的T7RNA聚合酶是一种野生型T7RNA聚合酶，这种野生型T7RNA聚合酶包括在639位点的氨基酸变为苯基丙氨酸，在784位点的氨基酸变为丙氨酸，或包括一种突变的聚合酶，这种突变的聚合酶除了在639位点的酪氨酸被苯基丙氨酸所耳又代，在784位点的组氨酸被丙氨酸所取代，在378位点的赖氨酸残基被精氨酸残基所取代(Y639F/H784A/K378R)之外，具有聚合酶野生型氨基酸序列。在一种特定的实施方案中，一种分离的多肽包4舌一种氨基酸，这种氨基酸选自由SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO102和SEQIDNO103所纟且成的纟且中。在一种净争定的实施方案中，提供了一种包括一种容器的试剂盒，这种容器中包括本发明的T7RNA聚合酶。在一些实施方案中，^是供了一种用于转录单链核酸的方法，包括在反应条件下将突变的T7RNA聚合酶与一种模板核酸一起培养足够时间从而得到转录产物。在另一些实施方案中，提供了编码本发明多肽的分离的核酸。在特定的实施方案中，才是供了一种核酸序列，这种核酸序列选自由SEQIDNO122，SEQIDNO123，SEQIDNO124和SEQIDNO125所组成的组中。在一些实施方案中，摘二供了一种包括本发明的分离的核酸序列的载体。在一种特定的实施方案中，提供了一种表达载体，这种表达载体包括与一种启动子可才喿作的结合的本发明的核酸序列。在本发明另一种实施方案中，提供了一种包括本发明表达载体的细胞。在一种特定的实施方案中，提供了一种细胞，其中本发明的突变的T7RNA聚合酶净皮这种细胞所表达。在一些实施方案中，l是供了一种包括一种容器的试剂盒，这种容器中包括本发明的T7RNA聚合酶。在另一个实施方案中，提供了一种转录全2，-OMe核酸的方法，该方法包4舌以下步艰ta)在一定条^f牛下i咅养反应混合物中的模板核酸，其中反应混合物包括一种突变体RNA聚合酶，一种核酸转录才莫纟反和核苷三^粦酸，其中核苷三^粦酸是2，-OMe修饰的，和b)转录该转录混合物产生单链核酸，其中，此单链核酸中的所有核苦都是2'-OMe修饰的，除了转录过程的第一核苷不是2，-OMel'务饰的。在一些实施方案中，转录过程的第一核苷可以是2'-OH鸟噪呤。在一些本方法的实施方案中，突变的RNA聚合酶是一种在639位点和784位点包括改变的氨基酸的突变T7RNA聚合酶，尤其是这种在639位点和784位点包括改变的氨基酸的突变T7RNA聚合酶当在784位点的改变的氨基酸是丙氨酸时在639位点的改变的氨基酸不是苯基丙氨酸。特别的是，T7RNA聚合酶在378位点进一步包括一种改变的氨基酸和/或在266位点进一步包括一种改变的氨基酸。在一个特定的实施方案中，在本发明方法中4吏用的聚合酶在639位点改变的氨基酸是一种亮氨酸，在784位点改变的氨基酸是一种丙氨酸。在进一步的实施方案中，本发明方法中^f吏用的聚合酶在266位点的改变的氨基酸是一种亮氨酸。在一种进一步的实施方案中，本发明方法中使用的聚合酶在378位点的改变的氨基酸是一种精氨酸。在一种特定的实施方案中，提供了一种分离的多肽，这种分离的多肽包4套选自由SEQIDNO1,SEQIDNO2，SEQIDNO102和SEQIDNO103所组成的组的氨基酸。在本发明方法的一些实施方案中，转录反应进一步包括镁离子。在其他实施方案中，转录反应进一步包括锰离子。在其他实施方案中，4美离子在转录反应过程中的浓度比4孟离子在转录反应过程中的浓度大3.0-3.5倍。在其他实施方案中，其中每种核苷三石粦酸在转录反应中存在的浓度为1.0mM,4美离子的浓度为6.5mM,锰离子的浓度是2.0mM。在其他实施方案中，其中，在转录反应中核苷三磷酸的浓度是1.5mM，4美离子的浓度是8mM，锰离子的浓度是2.5mM。在其他实施方案中，每种核苷三石岸酸在转录反应中存在的浓度是2.0mM，4美离子存在的浓度是9.5mM，锰离子存在的浓度是3.0mM。在其他实施方案中，转录反应进一步包4舌一种非2，-OMe鸟嘌呤非三磷酸化残基，尤其是，其中，非2，-OMe鸟噤呤非三磷酸化残基选自由鸟噤呤一石寿酸盐、鸟噤呤二石粦酸盐、2，氟代鸟嘌呤一》粦酸盐、2，氟代鸟嘌呤二磷酸盐、2，氨基鸟嘌呤一磷酸盐、2，氨基鸟噤呤二^粦酸盐、2，脱氧鸟嘌呤一磷酸盐和2，脱氧鸟噤p令二-粦卧吏盐所组成的《且中。在其4也实施方案中，寿争录模板包括一种T7RNA聚合酶启动子。在另一个实施方案中，转录反应进一步包括聚乙二醇。在另一实施方案中，转录反应包括无才几焦磷酸酶。在本发明其他方面才是供了一种用于识别适体的方法。在一个实施方案中，用于识別适体的方法包括a)制备包4舌本发明突变聚合酶的转录反应混合物，和一种或一种以上核酸转录模板，b)转录该转录反应混合物从而得到单链核酸的候选混合物，其中，除了一个单链核酸的核苦之外，单链核酸上的所有核苷都是2，修饰的，c)将候选混合物与靶分子相接触，d)相对于候选混合物的亲合性，从候选混合物中分离对輩巴分子具有增加的亲合性的核酸，和e)扩增具有增加的亲合性的核酸/人而产生一20种富集适体的混合物，因此，识别包括除了适体第一核苷可以是2，-未修饰的之外全2'-修饰核苷的对于靶分子的适体。在一些实施方案中，扩增步骤f)包括i)从靶分子中任选的分离具有增加的亲合性的核酸，ii)从核酸-耙分子复合物中反转录具有增加的亲合性的核酸，iii)扩增反转录的具有增加的亲合性的核酸；和(ii)制备包括扩增所得的反转录的具有增加的亲合性的核酸的转录混合物，作为转录过程的;f莫板，转录该转录混合物。在本发明适体识别方法的一些实施方案中，突变体RNA聚合酶是一种突变的T7RNA聚合酶，这种突变的T7RNA聚合酶在639位点和784位点包括一种改变的氨基酸，尤其是一种在639位点和784位点包括一种改变的氨基酸的T7RNA聚合酶，其中当在784位点的改变的氨基酸是丙氨酸时，在639位点的改变的氨基酸不是苯基丙氨酸。特别的是，T7RNA聚合酶在378位点进一步包括一种改变的氨基酸和/或在266位点进一步包括一种改变的氨基酸。在一个特定的实施方案中，在本发明方法中使用的聚合酶在639位点改变的氨基酸是一种亮氨酸，在784位点改变的氨基酸是一种丙氨酸。在进一步的实施方案中，本发明方法中使用的聚合酶在266位点的改变的氨基酸是一种亮氨酸。在一种进一步的实施方案中，本发明方法中使用的聚合酶在378位点的改变的氨基酸是一种精氨酸。在一种特定的实施方案中，在本发明适体识别方法中^f吏用了一种分离的多肽，这种分离的多肽包4舌选自由SEQIDNO1，SEQIDNO2,SEQIDNO102和SEQIDNO103所组成的组的氨基酸。在一些实施方案中，转录混合物中所有的核苦三石粦酸都是2，-OMe修饰的。在一个实施方案中，一个或一个以上核酸转录才莫一反包括一种T7RNA聚合酶启动子和一种直4妾对于T7RNA聚合酶启动子3，端的先导序列。在本方面的一些实施方案中，本发明包括不断地重复a)到e)步骤。在本发明适体识别方法的一些实施方案中，转录反应进一步包括镁离子。在其他的实施方案中，转录反应进一步包括锰离子。在其他的实施方案中，4美离子在转录反应过程中的浓度比锰离子在转录反应过程中的浓度大3.0-3.5倍。在其他实施方案中，其中每种核苷三石舞酸在转录反应中存在的浓度为1.0mM，4美离子的浓度为6.5mM,確孟离子的浓度是2.0mM。在其4也实施方案中，其中，在转录反应中核苷三磷酸的浓度是1.5mM,4美离子的浓度是8mM,锰离子的浓度是2.5mM。在其他实施方案中，每种核苦三磷酸在转录反应中存在的浓度是2.0mM,镁离子存在的浓度是9.5mM，锰离子存在的浓度是3.0mM。在其他实施方案中，在本发明适体识别方法中使用的转录反应进一步包括一种非2'-OMe鸟嘌p令非三》粦酸化残基，尤其是，其中，非2'-OMe鸟嘌呤非三磷酸化残基选自由鸟嘌呤一磷酸盐、鸟嘌呤二磷酸盐、2，氟代鸟嘌呤一磷酸盐、2，氟代鸟噤呤二磷酸盐、2，氨基鸟噪呤一磷酸盐、2，氨基鸟嘌呤二磷酉臾盐、2，脱氧鸟噪呤一》粦酸盐和2，脱氧鸟嘌p令二-寿酸盐所纟且成的组中。在其他实施方案中，转录模^反包括一种T7RNA聚合酶启动子。在另一个实施方案中，转录反应进一步包括聚乙二醇。在另一实施方案中，转录反应包^舌无才几焦^粦酸酶。本发明还涉及一种筛选用于直4妾转录的核酸才莫4反组成序列的方法。在一个实施方案中，组成序列提高了直接转录的模板的转录产量。在一个特殊的实施方案中，本发明涉及筛选先导序列用于提高转录产量的方法，还涉及先导序列、包括该先导序列的核酸才莫才反和4吏用本发明先导序列和核酸才莫4反的方法。本发明还涉及新型的突变聚合酶及其在转录过程中的应用，尤其是其用于提高转录产量的应用，其中，在转录过程之中2'修饰的核苷被整合，更尤其是其中所有被整合的核苷都是2，修饰的，例如，是2，-OMe修饰的。本发明还涉及能够提高转录产量的修饰的转录反应条件。本发明尤其涉及上述方面的两个方法或三个方法的组合，从而尤其改进转录产量，其中除了起始转录产物核苷之外的所有转录产物的核苷都是2，-修饰的，尤其是2，-OMe修饰的("全2，-OMe"或"mRmY，，or"MNA"转录产物)。本发明第一方面的一个实施方案中，4是供了一种识别用于提高转录作用的核酸模板组成序列的方法，该方法包括a)制备转录模板候选物文库，其中，该模板包括一种启动子，一种才妻近启动子3'端的第一固定区域，一种4妻近第一固定区域3'端的退化区域和4妾近退化区域的第二固定区i或；b)在转录反应中转录该转录模板候选物文库，从而得到一种转录文库；c)反转录该转录混合物从而得到一种cDNA的候选混合物，其中，该cDNA模板包括一种5，和3'末端；d)在连接反应中将编码启动子的DNA序列与cDNA模板的3'末端相连；e)扩增cDNA才莫板从而产生一种转录才莫纟反4美选物文库；和f)从转录一莫4反候选物文库中识别核酸序列组分，乂人而才是高转录作用，其中，该核酸序列组分包括一种4汙生自至少一部分退化区域的序列。在本发明方法的一个实施方案中，步骤f)包括i)将转录才莫^1候选物文库克隆入单独的转录模板中；ii)在转录反应中转录单独的转录模板从而产生一定的转录产物产量；iii)评估单独的转录模板的转录产物产量；和iv)在转录模板中识别能够产生预先希望的转录产物产量的核酸序列组分。在本发明方法的一种特定的实施方案中，预先希望的转录产物产量是比步骤b)中通过转录该转录模板候选混合物所获得的转录产物产量更高的产量。23在本发明方法的其他实施方案中，步骤f)包括分析转录模板候选物文库退化区域的碱基组合物，和根据转录模板候选物文库的平均石威基组合物识别核酸序列组分。在本发明这一方面的一些实施方案中，本方法的步-骤b)进一步包4舌用DNase处理转录的转录产物。在本发明方法的进一步实施方案中，步骤b)进一步包括通过将转录的转录产物模板从转录反应的其他组分中分离出来，来纯化转录的转录产物混合物。在本发明方法的一种特定的实施方案中，纯化步骤包括:将转录反应緩沖液改为使转录反应运行穿过脱盐柱。在本发明这一方面的其^f也实施方案中，本方法的步艰《d)在步骤c)之前完成。在本发明这一方面的其他实施方案中，该方法包括在进行步骤f)之前重复步骤b)到步骤e)—次以上。在本发明这方面的一种进一步的实施方案中，连接反应是一种夹4反连4妄反应，且该连4妄反应包4舌一种核酸夹4反和一种编码启动子的5'-单^岸酸化的寡聚核苷酸。在本发明这方面的一种具体的实施方案中，本方法中使用的转录反应包括一个或一个以上修饰的核苷三磷酸盐和一种突变聚合酶。在一些实施方案中，修饰的核苷三磷酸盐是一种2'-修饰的核苦三磷酸盐，尤其是2，-OMe修饰的核苷三磷酸盐。在一些实施方案中，突变聚合酶是一种突变的T7RNA聚合酶。在一些实施方案中本发明方法使用的转录反应包括4美离子和锰离子(Mn2+)且突变的T7RNA聚合酶选自由SEQIDNO1,SEQIDNO2,SEQIDNO100和SEQIDNO101所组成的组中。在本发明这方面的一些实施方案中，4美离子在转录反应过程中的浓度比锰离子(Mi^+)在转录反应过程中的浓度大3.0-3.5倍。在本发明这一方面的其他实施方案中，每种核苷三石岸酸在專争录反应中存在的;农度为1.0mM，4美离子的纟农度为6.5mM，锰离子的浓度是2.0mM。在本发明这一方面的其他实施方案中，在转录反应中每种核苷三磷酸的浓度是1.5mM，镁离子的浓度是8mM,锰离子的浓度是2.5mM。在本发明这一方面的其他实施方案中，每种核苷三石粦酸在转录反应中存在的浓度是2.0mM，镁离子存在的浓度是9.5mM,锰离子存在的浓度是3.0mM。在本方法的一些实施方案中，转录反应进一步包4舌一种聚亚烷基二醇，尤其是聚乙二醇。在本方法的一些实施方案中，尤其在需要全2'-OMe转录产物的实施方案中，转录反应进一步包括一种鸟噤呤残基，这种鸟。票呤残基选自由鸟噤呤一^粦酸盐、鸟嘌卩令二^粦酸盐、2，氟代鸟噤呤一^粦酸盐、2,氟^鸟嘌p令二;粦酸盐、2，氨基鸟嘌呤一^粦酸盐、2，氨基鸟嘌呤二磷酸盐、2，脱氧鸟噤吟一裤酸盐和2，脱氧鸟嘌呤二磷酸盐及其它修饰得核苷所组成的组中。在进一步的实施方案中，本方法的转录反应包4舌无机焦磷酸酶。在进一步的实施方案中，本发明方法的转录反应任选地包括一些基团的结合物，这些基团由H沖液、去污剂(例如，TritonX-100)、聚胺(例如，精胺或亚4青胺)和还原剂(例如，二;f危苏糖醇(DTT)或PME)所组成。在更进一步的实施方案中，本发明方法的转录反应包括核苷三磷酸盐、镁离子、锰离子(例如Mn2—)、聚乙二醇、鸟噪呤单石粦酸盐、无冲几焦石粦酸酶、緩沖液、去污剂、聚胺、和二^^苏糖醇(DTT)、和一个或一个以上寡聚核苷酸转录才莫^反、和一种T7RNA聚合酶，例如一种突变的T7RNA聚合酶，例如选自由SEQIDNO1,2,100和101所组成的组的突变的T7RNA聚合酶。在本发明识别方法的一些实施方案中，转录模板候选物文库的第一固定区由2个、3个、4个或5个鸟嘌呤残基组成，在本发明的一些实施方案中，转录才莫^J芙选物文库的退化区包括:至少4个、至少10个、至少20个或至少30个4亥普。在本方法的一些实施方案中，识別的核酸才莫板组成序列是一种先导序列。在一些实施方案中，该先导序列包括第一固定区域和一种来源于至少一部分转录才莫板候选物退化区域文库的序列。在一些实施方案中，本发明的方法进一步包4舌整合^皮i只别的先导序列进入寡聚核苷酸转录模板中。本发明还提供了通过本发明识别方法识别的先导序列。在一些实施方案中，本发明的先导序列包括选自由SEQIDNOs10到99所组成的组中的序列中从核苷22到核苷32的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的先导序列包括选自由SEQIDNOs10到99所组成的组中的序列中从核苷18到核苷32的核酸序列。本发明还提供了一种寡聚核苦酸转录模板，这种寡聚核苦酸举争录才莫斧反选自由SEQIDNO3到6和SEQIDNO106所纟且成的纟且。在本发明的另一个方面，4是供了一种用于增加核酸转录产物产量的方法，其中转录由寡聚核苷酸转录模板控制。在本发明这方面的一些实施方案中，增加转录产物产量的方法包括用一种寡聚核苷酸转录模板控制转录作用，其中，寡聚核苷酸转录模板包括一种先导序列，这种先导序列是已经被本发明使用与转录反应相同的核苷组合物和/或聚合酶和/或情况识别的先导序列，其中所述转录反应是提高转录产物产量所希望的。图l是一种示意图，表示了从寡聚核苷酸随才几序列库中体外适体筛选过程(指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM))。图2是表示末端区域指数级富集的配体系统进化才支术(TR-SELEXTM)方法的流禾呈图。图3表示了在进4亍末端区域指凄丈级富集的配体系统进化技术(TR-SELEXTM)之前(RO)和之后(R3),选自转录才莫板候选物文库中二十个退化位点区域的结合的平均核苷组合物的图表分析。图4表示了使用Y639F/H784A/K378R("FAR")和Y639L/H784A/K378R("LAR")突变体T7RNA聚合酶只寸ARC2118、ARC2119、ARC2120、和ARC2121进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得紫外阴影测量出的相对转录产物产量，同时在转录混合物中掺有2，-OHGTP。*表示相对于LAR突变体聚合酶转录的ARC2118的给定的产量，其中LAR突变体聚合酶转录的ARC2118能够产生最高的紫外线-阴影测量值。图5A表示了核酸(SEQIDNO120)，和图5B给出了野生型T7RNA聚合酶(SEQIDNO121)的氨基酸序列。图6A表示了突变体T7RNA聚合酶Y639L/H784A的核酸序列(SEQIDNO122)。图6B表示了T7突变体聚合酶Y639L/H784A/K378R的核酸序列(SEQIDNO123)。图6C表示了突变体T7聚合酶P266L/Y639L/H784A的核酸序列(SEQIDNO124)。图6D表示了突变体T7聚合酶P266L/Y639L/H784A/K378R的核酸序列(SEQIDNO125)。图7表示了使用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶对ARC2118和ARC2119进行聚丙蜂酰胺凝胶分析的紫外-阴影测量的相对转录产物产量，同时滴定在转录混合物中的rGTP(2，-OHGTP)。*表示了相对于用20uMrGTP转录的ARC2118的给定的产量，其中用20uMrGTP转录的ARC2118能够产生最高的紫外线-阴影测量值。图8表示了用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶和在转录混合物中改变浓度的2'-OMeNTP(A、U、C和G)、MgCh和MnCl2对ARC2119和进4亍聚丙烯酰胺凝月交分才斤的紫外-阴影测得的相对转录产物产量，在转录混合物中没有rGTP(2，-OHGTP)。得到的产量是以1mM的各种2，-OMeNTP、6.5mM的MgCl2、和2mM的MnCl2这一转录条件为基础的。图9是一种表，表示了用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶进行的全2'-OMe转录(100。/。2'-OMeA、U、C、G)过程中核苷插入、缺失和^f又代作用与^f吏用Y639F/K378R突变体T7RNA聚合酶进行的所有的RNA或2'-OMe转录作用相比较的分析结果。在表中，(1)表示了来自Burmeister等人的文献"控制2'-0-甲基适体体外筛选VEGF"(2005)化学和生物，12:25-33的数据，其中使用FART7突变体聚合酶完成转录作用，和(2)表示了使用LART7突变体聚合酶完成的转录作用。图10是一种表，表示了使用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶进行了一4仑全2，-OMe转录之前和之后，对目前的全2，-OMe转录产物(100%2'-OMeA、T、C、G)核苷28组合物的分析，在使用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶进行全2，-OMe转录之后进行DNase治疗、反转录作用、夹才反连4妾和PCR扩增。图11是一种示意图，以5'到3'的方向表示了在3'末端(深色的3求)具有封端的最小化的MNA抗IgE适体。图12是一种示意图，表示了最小化的MNA抗IgE适体，最小化的MNA。抗IgE适体具有两个脱氧取代作用，最小化的MNA抗IgE适体具有一个脱氧取代作用和一个石克代磷酸耳又代作用，分别以5'到3'的方向表示出来，且都在其3'末端(黑色球)具有一种封端。图13是描述各种各样的PEG化策略的示意图，表示了通过PEG化作用进行的标准单PEG化作用、多PEG化作用和二聚作用。具体实施例方式本发明一个或一个以上详细的实施方案已经在这里结合下面的描述进行了阐明。尽管任何与这里描述的相似或相等方法和材料可以用来实现或才全马t本发明，<旦这里描述的是优选的方法和材料。根据说明书的描述，本发明的其他特点，目的和优势变得显而易见。在说明书中，单数形式也包括复数意义，除非上下文另有明确描述。除非另有指名，这里使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常的理解相同的含义。如果出现矛盾的话，以本"i兌明书的解释为准。指数级富集的配体系统进化:技术(SELEX)用于生产适体的优选的方法是使用指数级富集的配体系统进化:技术(SELEXTM)，指凄t级富集的配体系统进化才支术(SELEX)主要在图1中进行了描述，且被认为是一种体外筛选方法。指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)是一种用于体外进化对靶分子具有高度特异结合型的核酸分子的方法，这种方法在例如1990年6月11日递交的，目前力丈弃的美国专利申请第07/536,428号、名为"核酸配体"的美国专利第5,475,096号和名为"核酸配体"的美国专利第5,270,163(国际7>布号为WO91/19813)号中进行了描述。通过进行重复筛选和扩增，指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)可以被用于获得具有任意理想輩a分子结合亲合性水平的适体，所述适体在这里也叫寸故"核酸配体"。指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)以一种独特的见解为基础，这种独特的见解是核酸具有足够的能力来形成多种多样的二维-或三维结构，且其单体具有足够的化学多样性，能够对实际上4壬何化学化合物，无i仑是单体还是聚合物，起到配体(即，形成特异性结合对)作用。任意大小的分子或组合物都可以作为輩巴分子。指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)以结合靶分子的能力为基础。因此，通过指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)获得的适体具有靶分子结合性质。但是，单纯的靶分子结合不会对功能性作用提供任何信息，如果有的话，这些信息会通过适体结合作用被施加在靶分子上。靶分子性质的改变需要适体结合靶分子上的特定位点，从而使适体的性质发生改变。理论上讲，指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)能够识别很多种适体，其中，每种适体结合乾分子上的不同位点。在实际过程中，适体-輩巴分子结合相互作用通常发生在輩巴分子的一个或一小部分相关的优选结合位点上，这些结合位点能够为相互作用提供稳定的和易接近的结构接触面。进一步讲，当对一种生理学上的靶分子进行指数级富集的配体系统进化4支术(SELEX)时，本领域4支术人员通常不能控制适体对耙分子的位点。因此，耙分子上的适体结合位点可能或不可能位于那些可能带来理想效果的潜在的结合位点，也不可能接近于那些可能带来理想效果的潜在的结合位点，或者不会对靶分子带来任何作用。即4吏由于适体对耙分子的结合能力而发现这种适体具有一些作用，但仍不可能预计这种作用的存在或事先了解究竟是什么作用。在进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)实-验时，4艮可能得到对于一种草巴分子的适体，在此基础上，本领域技术人员只能非常确定的知道适体具有靶分子结合性质。如果希望一些确定的适体在与把分子相结合之外还能对把分子发生作用的话，可以进4亍指凄t级富集的配体系统进4匕4支术(SELEXTM),4旦这是不确定的。指凄t级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)在开始的时候依赖于一种大的单链寡聚核苷酸文库或序列库，这种大的单链寡聚核香酸文库或序列库包括随机序列。这种寡聚核苷酸可以是<奮饰或未<奮饰的DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。在一些实施例中，序列库包括100%的退化或部分退化的寡聚核苷酸。在其他实施例中，序列库包括退化的和部分退化的寡聚核苷酸，这种寡聚核普酸包括整合入随才几序列中的至少一个固定序列和/或保守序列。在其他的实施例中，序列库包括退化的和部分退化的寡聚核苷酸，这种寡聚核苷酸在其5，和/或3'末端包括至少一个固定序列和/或保守序列，这种固定序列和/或保守序列可能包括与寡聚核苷酸序列库所有的分子相同的序列。固定序列是寡聚核苷酸序列库中的常见序列，是为了实现预先确定的目的而引入的，所述固定序列例如，下面进一步要描迷到的CpG部分、PCR引物的杂交作用位点、RNA聚合酶(例如，T3、T4、T7和SP6)的启动子序列、限制性位点、或共聚序列例如聚A化或聚T化、催化核心、亲合柱选择性结合位点、促进转录作用的先导序列和其他促进目标寡聚核苷酸克隆和/或排序的序列。保守序列与之前描述的固定序列不同，结合相同靶分子的适体分享相同的保守序列。序列库的寡聚核苷酸优选地包4舌一种退化序列部分和固定序列，这种退化序列部分和固定序列对于有效扩增势必需的。一般地，起始序列库的寡聚核苷酸包含固定的5，和3'末端序列，这种固定的5，和3'末端序列从侧面与30-40个P逭才几核香的内部区域相连。退化核苷可以按照多种方法制备，包括化学合成和从随机开裂的细胞核酸中进行大d、选择。在重复筛选/扩增步骤之前或当中，可以通过突变过程引入或增加在测试核酸中的序列变化。寡聚核苦酸的退化序列部分可以是任意长度的，且可以包括核糖核苷和脱氧核纟瞎核苷，还可以包4t修饰的或非天然的核苷或核苷类似物。参见，例如，美国专利第5,958,691号、美国专利第5,660,985号、美国专利第5,958,691号、美国专利第5,698,687号、美国专利第5,817,635号、美国专利第5,672,695号和PCT申请国际/>开号WO92/07065。4吏用本领i或内已知的固相寡聚核苷酸合成技术可以从磷酸二酯键连接的核苷中合成4寻到退^^的寡聚4亥普&吏。参见，例^口Froehleretah,Nucl.AcidRes.14:5399-5467C1986)和Froehleretal,Tet.Lett.27:5575-5578(1986)。随机寡聚核苦酸还可以使用溶液相方法合成，例如，三酯合成法。参见，例4。Soodetal,Nucl.AcidRes.4:2557(1977)和Hiroseetal,Tet.Lett.,28:2449(1978)。发生在自动4空制的DNA合成仪器中的典型的合成过程能够产生1016-1017个单独得分子，这一数量对于大多数指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)仪来讲是足够的。在序列设计中足够大区i或的退化序列增加了每个合成的分子可能代表一种独特的序列的可能性。寡聚核苷酸的起始序列文库可以通过在一种DNA合成仪中进行自动的化学合成反应来生产。为了合成退化序列，在合成过程的每个核苷加入步骤中加入所有四种核苷的混合物，允许核苷随机的整合。如上所述，在一个实施方案中，随才几寡聚核苷酸包括完全的退化序列；4旦是，在另一个实施方案中，退化的寡聚核苷酸可以包括一,殳非随才几的或部分随才几的序列。通过在每个添加步骤加入不同摩尔比率的四种核苦可以产生部分随机的序列。当RNA文库用作起始序列时，该文库通常是通过合成DNA文库、任选地PCR扩增、然后使用T7RNA聚合酶或一种修饰的T7RNA聚合酶体外转录DNA文库、和纯化转录的文库而产生的。随后，在适于结合的条件下将RNA或DNA文库混合在一起，然后使用相同的筛选方案不断重复结合、分离和扩增步骤，从而达到任何理想的结合亲合性和选择性标准。更具体的，从包含核酸起始文库的混合物开始，指数级富集的配体系统进化^支术(SELEX)包括以下步骤(a)在适合结合的情况下将混合物与靶分子相结合；(b)从这些对靶分子具有结合特异性的核酸中分离未结合的核酸；(c)可操作的溶解核酸-靶分子复合物；(d)从核酸靶分子复合物中扩增溶解的核酸，从而产生一种配体富集的核酸混合物；和(e)重复结合、分离、溶解和扩增步骤足够多次直到获得具有高特异性、高亲和性的对于靶分子的核酸配体。当选择RNA适体时，指数级富集的配体系统进化技33术(SELEXTM)还包括步骤(i)在步骤(d)扩增之前，从核酸-覃巴分子复合物中反转录溶解的核酸；和(ii)在重新开始该过程之前转录步骤(d)扩增的核酸。在包含很多可能的序列和结构的核酸混合物中，对一种给定的耙分子存在各种各样的结合亲合性。一种核酸混合物包^^,例如，一种具有20个核苦的随才几化片,殳可以具有4种4矣选可能性。对靶分子具有较高亲合性(较低的电离常数)的片4殳4艮可能与靶分子结合。在分离、解离和扩增之后，产生了一种第二核酸混合物，这种第二核酸混合物被富集作为具有更高的结合亲合性的候选物。对最佳配体进行更多轮篩选直到产生的核酸混合物主要由单独一个或一些序列《且成。然后这些序列作为配体或适体被克隆、测序并分别检验其l)靶分子结合亲合性；和2)影响靶分子功能的能力。重复筛选和扩增循环直到达到所需的目标。在大多凄t情况下，持续筛选/扩增过程直到结合强度没有随着循环重复没有进一步改进为止。本方法通常能用于大约IO"种不同的核酸种类中，更可以用于大约1018种不同的核酸种类中。通常，在5到20个循环步骤中可以选择到核酸适体分子，在一个实施方案中，只在最初的筛选步骤中引入不均匀性不会在整个复制过程中发生。在指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)的一个实施方案中，所述分离过程在分离对选择的靶分子具有最强结合力的核酸配体方面是十分有效的，以至于只需要一个筛选和扩增周期。如此有效的筛选过程可能发生在，例如，一种色谦图解型过程中，其中核酸与固定在色谱柱上的輩巴分子以某种方式结合，这种结合方式使色谱柱具有足够的能力将具有最高结合亲合性的核酸配体分开并分离。在很多情况下，没有必要重复进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)直到识别出单一的核酸配体。靶分子乾分子-特异性核酸配体溶液可以包4舌一种核酸结构或核酸基序家族，这种核酸结构或基序具有许多保守序列和许多可以被取代或添加的序列，这些序列的取代或添加不会显著地影响核酸配体对靶分子的亲合性。通过在完成之前终止指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)过程，有可能确定许多核酸配体溶液族成员的序列。已知许多核酸存在一级、二级和三乡及结构。这种结构或基序通常与非沃森-克里克型相互作用有关，可以是发夹环、对称的和不对称的鼓出部分、假纽结和无数种这些结构的结合。这种基序几乎所有的已知的情况-说明他们可以在具有不大于30个核苷的核酸序列中形成。因此，经常建议，Y吏用邻近随机片賴:的指l史级富集的配体系统进化才支术(SELEXTM)开始于包含大约20到大约50个核苷的随才几片l殳的核酸序列，且在一些实施方案中，开始于包含大约30到大约40个核苷的随4几片,殳的核酸序列。在一个实施例中，5'端固定随机3'端固定序列包括大约30到大约40个核苦的随才几序列。核心指数级富集的配体系统进化才支术(SELEXTM)已经被修饰从而实现许多特定的目的。例如，美国专利第5,707，796号描述了利用指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)结合凝^I交电泳来选才奪具有特异性结构特性，例如弯曲DNA的核酸分子。美国专利第5,763,177号描述了以指凄t级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)为基础的方法，用于选择核酸配体，所述核酸配体包含光活性基团，所述光活性基团能够结合一种靶分子和/或与草巴分子进4亍光交4关和/或光4屯化作用。美国专利第5,567,588号和美国专利第5,861,254号描述了以指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)为基础的方法，该方法实现了包括对耙分子具有高和低亲合性的寡聚核苷酸之间的分离。美国专利第5,496,938号描述了在完成了指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)之后，用于获得改进的核酸配体的方法。美国专利第5，705,337号描述了用于将一种配体与它的靶分子共1^介连"^妻的方法。指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)还可以用来获得结合乾分子上一个以上位点的核酸配体，和用来获得包括能够与靶分子在特异性位点上结合的非核酸种类的核酸配体。指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)提供了一种分离并识别核酸配体的途径，所述核酸配体能够与^f壬意可一见的輩巴分子结合，所述革巴分子包4舌大的和小的生物分子，例如核酸-结合蛋白和未知能够与核酸结合作为其生物功能部分和辅助因子的蛋白质及其他小分子。例如，美国专利第5，580,737号7>开了通过指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)识别的核酸序列，这种核酸序列能够以很高的亲合性结合咖啡因及其密切相关的类似物，3-二曱基黄噤呤。反-指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)是一种通过排除对一个或一个以上非輩巴分子具有交叉反应活性的核酸配体序列，用于改进核酸配体对輩巴分子的特异性的方法。反-指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)由以下步骤组成(a)制备一种核酸的候选混合物；(b)将此候选混合物与靶分子相接触，其中，相对于候选混合物，对靶分子具有增加的亲合性的核酸祐^人其余的4美选混合物中分离出来；(c)乂人其余的候选混合物中分离增加亲合性的核酸；(d)从靶分子中任选地分离具有增加的亲合性的核酸；(e)将具有增加的亲合性的核酸与一个或一个以上非耙分子相接处，从而除去对非靶分子具有特异性亲合性的核酸配体；并(f)扩增只对靶分子具有特异性亲合性的核酸从而产生一种核酸混合物，这种核酸混合物富集了对靶分子具有相对高的结合亲合性和特异性的核酸序列。如上所述，对于指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm),才艮据需要重复筛选和扩增循环直到实现理想的目标。当核酸用作治疗剂和疫苗时会遇到一个潜在的问题，即在体液中，以其磷酸二酯盐形式存在的寡聚核苷在显示其理想的作用之前，可以快速的#:细月包内和细月包外的酶，例如核酸内切酶和核酸外切酶降解。因此，指l丈级富集的配体系统进化4支术(SELEXtm)包括高亲合性核酸配体的识别，所述高亲合性核酸配体包括修饰的核香，从而赋予配体改进的性质，例如改进的体内稳定性或改进的运输性质。这些修饰作用的实施例包括在糖基位点和/或磷酸基位点和/或碱基位点的化学取代。指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)识别的核酸配体鲍克修饰的核苷，这种核酸配体在例如美国专利第5,660,985号中进行了描述，该专利描述了在核糖的2，-位点、嘧啶的5-位点和嘌呤的8-位点包含化学f务饰的核酸书f生物的寡聚纟亥苷酸，这种核酸配体还在美国专利第5,756,703号中进4亍了描述，该专利描述了包括各种各样2'-修饰的嘧啶的寡聚核苷酸，这种核酸配体还在美国专利第5,580,737号中进行了描述，该专利描述了包括一个或一个以上用2'_氨基(2，-NH2)、2'—氟基(2'-F)、和/或2，_O-曱基(2，-OMe)取代基修饰的核苷的核酸配体。本发明包括的核酸配体的修饰包括，但不仅限于，能够提供其他化学基团的修饰，所述化学基团能够向核酸配基或核酸配体整体中整合入其他的附加电荷、极性、疏水性、氢键、静电作用和fluxionality。产生对核酸酶有抵抗作用的寡聚核苷酸的修饰作用包括一种或一种以上:f又代的核苷酸间连4妄4建、改变的糖基、改变的碱基或其结合。这些修饰包括但不仅限于，2，-位点上的糖基》f饰、5-位点上的嘧咬<多饰、8-位点上的嘌呤-修饰、外环胺的修饰、4-硫尿核香、5-溴或5-碘代-尿嘧啶的取代、骨架修饰、硫代磷酸化或烷基磷酸化修饰、甲基化作用和非正常的碱基-配对结合，例如等基线异胞嘧，定和异鸟嘌呤。修饰作用还包4舌3，和5M多饰，例4。去于端。〗夢饰作用还包4舌3，和5，修饰，例如封端，例如3'-3'-dT封端，从而增加对核酸外切酶的抵抗力(参见，例如，美国专利第5,674,685号；第5,668,264号；第6,207,816号和第6,229,002号，这些专利通过引证在此全部并入本文)。在一个实施方案中，提供了一种寡聚核苷酸，在这种寡聚核苷酸中P(O)O基团被P(O)S("硫代")、P(S)S"二硫代"、P(O)NR2("酰胺化，，)、P(O)R、P(O)OR:CO或CH2("formacetal")或3，-氨基(-NH-CH2-CH2-)，其中，每个R或R，分别是H或取代的或未纟皮取代的烷基。连接基团可以通过—O-、-N-、或-S-连4妄4建与核苷附着或相连。在寡聚核苷酸中不要求所有的连接键都是一致的。在进一步的实施方案中，寡聚核苷酸包括修饰的糖基基团，例如，一种或一种以上的氢氧基基团被卤素、脂肪族基团取代或功能化为酯或者胺。在一个实施方案中，2，-位点的呋喃糖残基被O-曱基、O-烷基、O-烯基、S-烷基、S-烯基或卤素基团所取^。在例4口文献Sproat,etat,Nucl.AcidRes.19:733-738(1991);Cotten，efa/"Nucl.AcidRes.19:2629-2635(1991);和Hobbs,etat,Biochemistry12:5138-5145(1973)中描述了2，-修饰糖基的合成方法。其他的修饰作用对本领域技术人员来讲是已知的。这种修饰可以是前指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)修饰或后指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)<务饰(对前面识别的未〗多饰的配体的》多饰)，或者可以通过整合入指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)来修饰。前指凄t级富集的配体系统进化:技术(SELEXTM)修、饰或通过整合指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)而进行的修饰作用产生对指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)覃巴分子具有特异性和改进的稳、定性，例如，体内稳、定性的核S臾配体。后指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)对核苷的》务饰作用(例如对之前识别的核酸配体进行切段、删除、取代或添加核酸<奮饰作用，之前识別的核酸配体具有纟皮前指H级富集的配体系统进化技术(SELEX)修饰作用整合的核苷)能够产生改进的稳定性，例如，体内稳定性，同时不引起对核酸配体结合能力的副作用。任选的，通过前指数级富集的配体系统进化才支术(SELEX)修饰作用整合入修饰的核苷的适体可以进一步被后指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)修饰作用(即，在指数级富集的配体系统进化4支术(SELEXtm)之后进4亍的一种后指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)修饰作用)修饰。指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)包括将选择的寡聚核苷酸与其他选择的寡聚核苷酸和非寡聚核苷酸的功能性单元相结合，如在美国专利第5，637，459号和美国专利第5,683,867号中描述的。指数级富集的配体系统进化^支术(SELEXtm)进一步包括将选择的核酸配体与位于诊断性或治疗性复合物中的其他选择的亲脂性和非免疫原性的高分子量化合物相结合，如在美国专利第6,011,020号、美国专利第6,051,698号和PCT申请第WO98/18480号中所描述的。这些专利和申请教导了广泛性形状和其他性质的结合，以及寡聚核苦酸有效扩增作用和复制性质，和其他分子的理想性质。同时研究了通过指数级富集的配体系统进^^支术(SELEXtm)对小的、柔性肽的核酸配体的识别。小肽具有柔性结构，且通常在溶液中以多种构象的平纟釺体存在，因此，最初认为结合亲合性被与柔性肽结合时的构象熵损失所限制。然而，美国专利第5，648，214号描述了溶液中识别对小肽的核酸配体的可能性，在本专利中，识别了对P物质有高亲合性的RNA核酸配体，其中P物质是一种具有11个氨基酸的肽。作为指数级富集的配体系统进化:技术(SELEX)的一部分，被选择结合靶分子的序列随后任选地最小化，从而确定具有理想的结合亲合性的最小序列。选择的序列和/或最小化序列一皮序列的随才几突变或控制突变任选地<夢饰，乂人而，例如，增加结合亲合性或者作为选才奪，确定序列中哪个位点对结合活性是必不可少的。2'_》多饰的指邀:级富集的配体系统进化:汰术(SELEXTM)为了使适体适合于用作治疗剂和/或为了特殊类型的诊断剂，优选廉〗介的合成方法，且优选在体内是安全和稳定的。由于它们对核酸酶降解作用的壽丈感性，野生型RNA和DNA适体一般在体内不稳定。通过在2'-位点结合修饰的基团可以极大地增加对核酸酶降解作用的耐受性。2'-氟代和2'-氨基基团已经被成功地引入寡聚核苷酸序列库中，随后乂人此寡聚核苷酸序列库中选择适体。然而，这种修饰作用极大地增加了所得适体的合成成本，且在某些情况下，由于々务饰的可以通过》务饰寡聚核苷酸的降解作用和随后的核苷作为底物用于DNA合成/人而再循环进入宿主DNA中的可能性，这种修饰作用可能引入安全问题。这里提供的包含2，-0画曱基("2'-OMe")核苷的适体克服了这些缺陷。包含2'-OMe核苷的寡聚核苷酸是核酸酶-耐受性的核苷且合成成本低。尽管2'-OMe核苷是生物学体系中普遍存在的，^f旦是在生理条件下，天然聚合酶不4妄受2，-OMeNTP作为底物，因》匕不用考虑2，-OMe4亥苷再4盾环进入宿主DNA中的安全问题。用于产生2'-修饰的适体的指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)在，例如2002年12月3号递交的美国临时专利申^青第60/430,761号中、2003年7月15日递交的美国临时专利申i青第60/487,474号、2003年11月4日递交的美国临时专利申i青第60/517,039号、2003年12月3号递交的美国专利申请第10/729,581号和2004年6月21日递交的名为"体外筛选2，-O-甲基取代核酸的方法"的美国专利申请第10/873,856中进行了描述，这些专利通过引证在这里全部并入本文。本发明包括能够结合并调节适体靶分子功能的适体，所述适体包含修饰的核苷(例如，在2'-位点具有修饰的核苷)，从而使寡聚核苷酸比未修饰的寡聚核苷酸对酶催化降解和化学降解以及热降解和物理降解更加稳、定。尽管在文献中有一些包含2，-OMe的适体的实施例(参见，例3口，Ruckmanetat.,J.Biol.Chem，1998273,20556-20567-695)，这通过体夕卜筛选修饰转录产物文库而产生，在Y多饰的转录产物文库中，C和U残基是2'-氟基(2'-F)取代的的而A和G残基是2，-OH取代的。一旦识别到功能性序列，然后测定每个A和G残基对2，-OMe取代作用的耐受性，重新合成适体，-使该适体中所有忍受2，-OMe取代作用的A和G残基作为2，-OMe残基。尽管平均大约20%的残基不可以，^f旦是大部分在这种两步法中产生的适体的A和G残基可以耐受2，-OMe残基的取代作用。因此，使用这种方法产生的适体能包含2个到4个2，-OH残基，且具有折中的稳定性和合成成本。通过将修饰核苷并入能够产生稳定寡聚核苷酸的转录反应，本发明的方法排除了通过再合成具有2'-OMe修饰核苷的适体寡聚核香酸来稳定选择的适体寡聚核苷酸的必要性，其中，产生的稳定寡聚核苦酸被用于寡聚核苷酸序列库中，从此寡41聚核苷酸序列库中使用指数级富集的配体系统进化才支术(SELEX)(和/或任何它的变化和改进，包4舌这里所描述的)筛选并富集适体。在一个实施方案中，本发明提供了一种适体，这种适体包4舌2'-OH、2,國F、2'画脱氧、和2'-OMe^f,饰的三石粦酸腺苷、三磷酸鸟苦、三磷酸胞苷、胸苷三石粦酸和三磷酸尿苷核苷。在另一实施方案中，本发明提供了一种适体，该适体包括2，-OH,2，-F,2，-脱氧，2，-OMe,2，-NH2,和2'-甲氧乙基修饰的三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷、胸苷三磷酸、和三磷酸尿苷核香。在一种优选的实施方案中，本发明4是供一种适体，这种尸体包括所有的或基本上所有的2，-OMe修饰的三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷、胸苷三磷酸和/或三磷酸尿苷核苷。修饰的聚合酶本发明2'-修饰的适体是使用修饰的聚合酶制造的，例如，一种^务饰的T7聚合酶，该^修饰的聚合酶结合在吹喃寿唐2'位点上具有大取代基的修饰核普的速率比野生型聚合酶的结合速率高。例如，一种在639位点上的酪氨酸残基已经转变为苯基丙氨酸(Y639F)的突变体T7聚合酶，该聚合酶容易利用2'脱氧、2'氨基、和2'氟基核苷三石舞酸盐(NTPs)作为底物，并在多种应用中广泛的用于合成^f多饰的RNA。然而，据才艮道，这种突变体T7聚合酶不能容易地利用(即，并入)带有大的2'-取代基的NTP,例如带有2'-OMe或2'-叠氮基(2'-N3)取代基的NTP。为了结合大的2'取代基，Y639F突变之外在784位点的组氨酸转变为丙氨酸残基突变体T7聚合酶已经;陂描述了(Y639F/H784A),且已经被用于限制并入修饰的嘧啶NTP中的情况。参见Padilla，R.andSo謹，R.，NucleicAcidsRes"2002,30(24):138.在639位点的酪氨酸残基转变为苯基丙氨酸、在784位点的组氨酸残基转变为丙氨酸、在378位点的赖氨酸转变为精氨酸的突变体T7RNA聚合酶(Y639F/H784A/K378R)已经被用于限制并入》务饰的嘌p令和嘧"定NTP的情况，例如2，-OMeNTP，但是这包括用于转录作用的2，-OH三磷酸鸟苷。参见Burmeisteret.al，(2005)ChemistryandBiology,12:25-33.^1夸2，-OH三磷酸鸟苷包含于转录作用中可能产生不完全2，-OMe取代的适体而是取决于2'-OH三磷酸鸟苷的存在。Padillaetal,NucleicAcidsResearch,2002,30:138还描述了在784位点的组氨酸转变为丙氨酸残基(H784A)的突变体T7聚合酶。在Y639F/H784A突变体和H784A突变体T7聚合酶中，向一种较小的氨基酸残基，例如丙氨酸的转变允许大的核苷底物，例如，2，-OMe耳又代的核苷的整合。参见Chelliserry，K.andEllington,A.D.,(2004)NatureBiotech,9:1155画60。在T7RNA聚合酶的活性部位带有突变的其他T7RNA聚合酶也#皮描述，其中在T7RNA聚合酶的活性部位带有的突变更加容易整合大的2'4'务饰的底物，例如，639位点上的酪氨酸残基转变为亮氨酸的突变体T7RNA聚合酶(Y639L)。然而这种突变常常使基质专一性增加而牺牲活性，导致低的转录产物产量。参见PadillaRandSousa，R.，(1999)NucleicAcidsRes"27(6):1561.已经描述了T7RNA聚合酶突变体P266L能够促进启动子间距(Guillerezetal.(2005)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,102(17)5958)。聚合酶造成从起始构造到伸展构造的转变，在起始构造中，该转变与启动子相连，在伸展构造中，该转变不与启动子相连。没有纟艮道上述突变体聚合酶能够产生全2，-OMe转录产物。本发明提供了用于增加低聚核苷酸转录作用产量的材料和方法。在一个实施方案中，本发明提供了使用修饰的T7RNA聚合酶将修饰的核普酶催化整合入低聚核苷酸中的方法和情况。在一种优选的实施方案中，本发明转录方法所^吏用的^务饰的T7RNA聚合酶不需要2，-OHGTP的存在。在一种优选的实施方案中，修饰的聚合酶是一种在639位点上的酪氨酸残基转变为亮氨酸残基和在784位点上的组氨酸残基转变为一种丙氨酸残基的突变体T7RNA聚合酶(Y639L/H784A)。在另一个优选的实施方案中，〗奮饰的聚合酶是一种在639位点的酪氨酸残基转变为亮氨酸残基、在784位点上的组氨酸残基转变为丙氨酸残基、且在378位点上的赖氨酸残基转变为4青氨酸残基的突变体T7RNA聚合酶(Y639L/H784A/K378R)。在另一实施方案中，本发明方法所使用的l奮饰的聚合酶是一种在639位点的酪氨酸残基转变为亮氨酸(Y639L)的突变体T7RNA聚合酶，而在另一实施方案中，该突变体T7RNA聚合酶在639位点上的酪氨酸残基转变为亮氨酸残基且在378位点上的赖氨酸残基转变为精氨酸残基(Y639L/K378R)。尽管不希望被人和理论所束缚，K378R突变不能在聚合酶的活性部位附近，因此K378R突变^皮认为是一种静态突变。在另一实施方案中，本发明方法所使用的修饰的聚合酶是在266位点的脯氨酸残基转变为亮氨酸、639位点的酪氨酸残基转变为亮氨酸且784位点上的组氨酸残基转变为丙氨酸残基的突变体T7RNA聚合酶，(P266L/Y639L/H784A),而在另一实施方案中，突变体T7RNA聚合酶在266位点上的脯氨酸残基4争变为亮氨酸、在639位点上的酪氨酸残基转变为亮氨酸、在784位点上的组氨酸残基转变为丙氨酸残基且在378位点上的赖氨酸残基转变为精氨酸残基(P266L/Y639L/H784A/K378R)。突变体T7RNA聚合酶的氨基酸序列如下所示Y639I7H784A(SEQEDNO1):MNTINIAKNDFSD旧LAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNAAAKPLITTLLPKMIARINDWFEEV隨RGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYmKTTLACLTSADNTTVQAVASAIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKIWEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEAD認曙SKGLLGGEAWSSWHKEDSIHVGVRC旧MUESTGMVSLHRQNAGWGQDSET旧LAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCVVPPKPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITKWKHCPVED1PAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANHKAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLK1HGANCAGVDKVPFPERIKF尼ENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQHFSAMLRDB/GGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVN日LQADA1NGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTKALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLIWESVSVTVVAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAV瞎VTPDGFPVWQEYKKPIQTRLNLMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTWWAHEKYG旧SFALIHDSFGTIPADAANLF隨RETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFAY639L/H784A/K378R(SEQIDNO2):MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNAMKPLI丌LLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVASAIGRA旧DEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHKEDSIHVGVRaEMUESTGMVSLHRQNAGVVGQDSET旧LAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCWPPKPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKI隨VLAVANVITKWKHCPVEDIPA旧REELPMKPEDIDMNPEALTAWRRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANHKAIWFPY刚DWRGRVYAVSMFNPQGNDIWTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPERIKF旧ENHENIMAGAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQHFSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQD1YGIVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTKALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLIWESVSVTWAAVEAMNWLKSMKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLNLMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTWWAHEKYG旧SFALIHDSFGTIPADAANLF隨RETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFAY639L(SEQEDNO100):MNT,KNDFSDIELAA1PFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNAAAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYmKTTLACLTSADNTTVQAVASAIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHKEDSIHVGVRC旧MUESTGMVSLHRQNAGWGQDSET旧LAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCWPPKPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKA隨QNTAWKI隨VLAVANVITKWKHCPVEDIPA旧REELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAAAVYRKDKARKSRFUSLEFMLEQANKFANHKAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPERIKHEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQHFSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVN日LQADAINGTDNEWTVTDENTGEISE隨LGTKALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLA:LGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLIWESVSVTWAAVEAM隨LKSAAKLLAAEVKDKKTG日LRKRCAVHWVTPDGFP謂QEYKKPIQTRLNLMFLGQFRLQPTI翻KDS日DAHKQESGIAPNFVHSQDGSHLRKTVVWAHEKYG旧SFALIHDSFGTIPADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFAY639L/K378R(SEQIDNO101):MNmNIAKNDFSD旧LAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNAAAKPLITTLLP隨ARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVASAIGRA旧DEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHKEDSIHVGVRC旧ML旧STGMVSLHRQNAGVVGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCWPPKPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKA瞧QNTAWKI隨VLAVA,TKWKHCPVEDIPA旧REELPMKPEDIDMNPEALTAWRRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANHKAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPERIKF旧ENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQHFSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAK薩EILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTKALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLIWESVSVTWAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFP雨QEYKKPIQTRLNLMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVHSQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTIPADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFAP266L/Y639L/H784A(SEQIDNO102)MNTINIAKNDFSD尼LAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNA雇PLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQElKPEAVAYmKTTLACLTSADNTTVQAVASAIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQWEADMLSKGLLGGEAWSSWHKEDSIHVGVRC旧MLIESTGMVSLHRQNAGWGQDSET旧LAPEYAEAIATRAGALAGISLMFQPCVVPPKPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKA隐QNTAWKI隨VLAVANVITKWKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANHKAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPERIK闩EENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQHFSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTKALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLIWESVSVTWAAVEAM隨LKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLNLMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTWWAHEKYG旧SFALIHDSFGTIPADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFAP266L/Y639L/H784A/K378R(SEQE)NO103)MNTINIAKNDFSD旧LAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNAAAKPUTTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVASAIGRA旧DEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQVVEADMLSKGLLGGEAWSSWHKEDSIHVGVRC旧MLIESTGMVSLHRQNAGWGQDSE"HELAPEYAEAIATRAGALAGIS'LMFQPCWPPKPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKIN隨LAVANVITKWKHCPVEDIPAIEREELPMKPED隨NPEALTAWRRAAAAVYRKD隨KSRRISLEFMLEQANKFANHKAlWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPiGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPERIKF旧ENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQHFSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEWTVTDENTGEISEKVKLGTKALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLALGSKEFGFRQQVLEDT1QPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKUWESVSVTWAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFP雨QEYKKPIQTRLNLMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVASQDGSHLRKTWWAHEKYG旧SFALIHDSFGTIPADAANLF隨RETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA在适合聚合酶接受2'-修饰的NTP的条件下使用Y639F、Y639F/K378R、Y639F/H784A、Y639F/H784A/K378R、Y639L/H784A、Y639L/H784A/K378R、Y639L、Y639L/K378R、P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶生产2'-<奮饰的(例如，2，-OMe)RNA專争录产物。一种优选的聚合酶是Y639L/H784A突变体T7RNA聚合酶。另一个优选的聚合酶是Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶。本发明另一个优选的聚合酶是P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶。其他T7RNA聚合酶，尤其是对大的2'-取代基显示高耐受性的T7RNA聚合酶可以同时用于本发明的方法中。在这里/>开的条件下，当#皮用于模板-直接聚合过程时，Y639L/H784A、Y639L/H784A/K378R、P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶可以用来整合所有的2，-OMeNTP,包括2，-OMe三石粦酸鸟苦，这与通过4吏用Y639F、Y639F/K378R、Y639F/H784A、Y639F/H784A/K378R、Y639L、或Y639L/K378R突变体T7RNA聚合酶获得的转录产物产量相比具有较高的转录产物产量。可以使用Y639L/H784A、Y639L/H784A/K378R、P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶但不需要2'-OH三磷酸鸟苷就可以获得高产量的包含2'-修饰的，例如，2'-OMe的寡聚核香酸。在一种优选的实施方案中，本发明的Y639L/H784A或Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶与一种MNA转录混合物一起使用，从而促进较高的全2'-OMe转录产物产量。在一些实施方案中，Y639L/H784A或Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合^^T以与rRmY、dRmY、rGmH、fGmH、dGmH、dAmB、rRdY、dRdY或rN转录混合物一起使用。这里4吏用的，一种只包含2，-OMeA、G、C和U三磷酸盐的转录混合物称为一种MNA混合物，从此选择出来的适体称为MNA适体，MNA适体只包含2，-0-甲基核香。包含2，-47OMeC和U和2，-OHA和G的转录混合物称为一种"rRmY"混合物，从其中选择的适体称为"rRmY"适体。包含脱氧A和G及2，-OMeU和C的转录混合物称为"dRmY"混合物，乂人此中选择的适体称为"dRmY"适体。包含2，-OMeA、C和U,及2，-OHG的转录混合物称为"rGmH"混合物，从其中选4奪的适体称为"rGmH"适体。交替地包含2，-OMeA、C、U和G及2，-OMeA、U和C与2，-FG的转录混合物称为"交替混合物"，从其中选择的适体称为"交替混合物"适体。包含2，-OMeA、U、和C，和2，-FG的4争录混合物称为"fGmH"混合物，乂人其中选才奪的适体称为"fGmH"适体。包含2，-OMeA、U、和C，以及脱氧G的转录混合物称为"dGmH"混合物，从其中选择的适体称为"dGmH"适体。包含脱氧A和2，-OMeC、G和U的转录混合物称为"dAmB"混合物，从其中选择的适体称为"dAmB"适体。包含2，-OHA和2，-OMeC、GU的转录混合物称为"rAmB"混合物，从其中选择的适体称为"rAmB"适体。包含2，-OH三石粦酸腺苷和三石粦酸鸟苷，以及脱氧三石粦酸胞苷和脱氧三石粦酸胸苷的转录混合物称为rRdY混合物，从其中选择的适体称为"rRdY"适体。包含全部2'-OH核苷的转录混合物称为"rN"混合物，,人其中选才爭的适体称为"rN"、"rRrY"或RNA适体，包含全部脱氧核苷的转录混合物称为"dN"混合物，从其中选择的适体称为"dN"或"dRdY"或DNA适体。2'-修饰的寡聚核苷酸可以完全由<奮饰核苷或1务饰核苷的子集合成。所有的核苷可以是修饰的，且所有都可以包含相同的》务饰。所有的核苷可以是》务饰，^旦包含不同的》多饰，例如，所有的包含相同的碱基的核苷可以具有一种类型的修饰，而包含其他石威基的核苦可以包含不同类型的{务饰。所有的嘌呤核苷酸可以具有一种修饰(或是未修饰的)，而所有的嘧啶核苷酸具有另一种不同类型的^务饰(或是未^多饰的)。在此方法中，<吏用4壬4可一种》务饰的结合，包4舌例如，核并唐核苦酸(2，-OH)、脱氧核4唐核苷酸(2'-脱氧)、2'-F、和2'-OMe核苷产生转录产物或转录产物序列库。其他-修饰的寡聚核苷酸可以包含同时带有一个以上修_饰的核苷，例如，在核苷酸间连4建处的纟务饰(例如，石危^/粦酸)和在糖基(例如2'-OMe)处的修饰和碱基(例如次黄嘌呤核苷)处的修4争。转录条件已经确定了i午多因素对2'-修饰的指#:级富集的配体系统进化技术(SELEX)的转录条件十分重要，这些因素也适用于下面描述的末端区域指凄t级富集的配体系统进化才支术(SELEX)。例如，当4吏用一种特殊的先导序列/突变体聚合酶结合物时，在一些条件下可以观察到修饰的转录产物产量的增加。先导序列可以被引入DNA转录模板5'端固定序列的3'末端的序列。先导序列的长度通常是6-15个核苷，且可以由预定的核苷组合物组成，例如可以是所有的噤呤、或嘌呤核苷酸和嘧。定核苷酸的特歹木混合物。可以与本发明突变体聚合酶和转录条件一起4吏用，尤其是与Y639L/H784A、Y639L/H784A/K378R、P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R联合使用的才莫板的实施例是ARC2118(SEQIDNO3)、ARC2119(SEQIDNO4)、和ARC3428GGGAGACAAGAATAAAGCGAGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAGATGCTTAGCTAG(SEQIDNO137)。另外，通常2，-OHGTP的存在是获得整合入修饰核苷的转录产物一个重要因素。转录作用可以被分成两个阶段第49一阶4殳是启动作用，在此期间向GTP(或其他取代鸟嘌呤)的3'-末端添加一种NTP，从而产生一种二核苷酸，此后此二核苷酸延长到大约IO-12个核苷酸；第二阶段是伸展阶段，在此期间进行转录作用加入超过大约10-12个第一核苷。之前已经发现，向包含Y639F/K378R突变体或Y639F/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶的混合物中加入小量的2'-OHGTP,和过量的2'-OMeGTP足够使聚合酶使用2'-OHGTP开始转录过程(并获得比没有2'-OHGTP存在时更高的包含2'-OMeGTP的转录产物产量)，但是一旦转录过程进入延长阶段，2'-OMeGTP和2'-OHGTP之间降低的区别以及相对于2'-OHGTP过量的2'-OMeGTP导致主要引入2'-OMeGTP。本发明提供了突变体T7RNA聚合酶，例如Y639L/H784A,Y639L/H784A/K378R,P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R,这些突变体T7RNA聚合酶不需要转录混合物种存在2'-OHGTP才能产生高产量的2'-OMeGTP转录产物。在一个实施方案中，高产量意味着平均每个输入的转录模板产生至少一个转录产物。将2'-OMe取代的核香整合如转录产物的另一个因素是在转录混合物中使用二价镁离子和锰离子(Mn2+)。已经发现氯化镁与氯化锰之间的不同的结合浓度能够影响2'-O-曱基化转录产物的产量，最优的氯化镁和氯化锰的浓度依赖于转录反应混合物中NTP的浓度，其中，这里的NTP复合有二价的金属离子。为了获得最大产量的全2'-O-曱基化的转录产物(即，全2，-OMeA、C、U和G核苷)，当每种NTP的浓度是O.5mM时，优选大约5mM的氯化4美和1.5mM的氯化锰。当每种NTP的浓度是1.0mM时，优选大约6.5mM的氯化4美和2.0mM的氯化锰。当每种NTP的浓度是1.5mM时，优选大约8mM的氯化镁和2.5mM的氯化锰。当每种NTP的浓度是2.0mM时，优选大约9.5mM的氯化镁和3.0mM的氯化锰。在很多情况下，使用这些浓度两倍以上的浓度仍然可以得到足够量的修饰的转录产物。用2'-OHGMP、鸟嘌呤或其他除了2'—OH糖基位点以外的其他位点进行取代的2'-OH鸟嘌呤作为转录过程的底物对不包含2'-OHGTP的转录混合物而言也是十分重要的。这一作用是聚合酶对起始核苷特异性的结果。因此，在这种模式下产生的转录产物的5，-末端核苷可能是2'-OHG。优选的GMP(或鸟噤呤)的浓度是0.5mM,更优选的是1mM。还发现，在转录反应中PEG,优选PEG-8000对最大限度整合修饰的核苷是十分有用的。为了最大限度的向转录产物中整合入2'-OMeATP(100%)，2'—OMeUTP(100%),T—OMeCTP(100%)和2'—OMeGTP(100%)("MNA")，可以使用以下条件HEPES緩沖液200mM,二碌u苏糖醇40mM,亚精胺2mM，PEG-800010%(w/v),TritonX-1000.01%(w/v),MgCl28mM，MnC122.5mM,2'-OMeNTP(每种)1.5mM,2'國OHGMP1mM,pH7.5,Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶200nM,无才几焦石岸酸酶5units/ml，和一种DNA才莫板。在一些实施方案中，DNA模板优选以大约5到500nM的浓度存在。任选的，在上述转录条件下使用的DNA模板包括一种全是嘌呤的先导序列，当两种模板在相同的条件下转录时，包括这种先导序列的模板相对于不包括这种先导序列的模板能够增加转录产物产量。在另一实施方案中，先导序列是嘌呤和嘧啶的混合物，当两种模板在相同的条件下转录时，包括这种先导序列的模板相对于不包括这种先导序列的模板能够增加转录产物产量。如在这里所使用的，一个单位的无机焦磷酸酶的定义是在pH值为7.2，25。C条件51下每分钟释力文l.O摩尔无才凡正石岸酸盐的酶的量。该反应可以进4亍大约1到24小时。在每种情况下，转录产物可以》文入指凄t级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)中用于识別适体和/或确定对给定的靶分子具有结合特异性的保守序列。所得序列是已经被稳定的，从后指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)修饰过程中删除这一步骤，得到一种高度稳定的适体。如下所述，在不同于前面描述条件的条件下可以获得有效的全整合入2，取代的核苷的转录产物产量。例如，上述转录条件的变形包括HEPES緩冲液浓度可以在0到1M范围内。本发明还预见了其他緩沖液的使用，例如，三(羟曱基)氨基曱烷，这些纟爰冲液的pKa^f直在5到10之间。二石克苏糖醇浓度可以在0到400mM范围内。本发明的方法还提供了其他还原剂的使用，这些还原剂包括，例如，巯基乙醇。亚精胺和精胺的浓度在0到20mM范围内。PEG_8000的;农度在0到50%(w/v)范围内。本发明的方法还提供了其他亲水性聚合物的^f吏用，包括，例如，其他分子量的PEG或其他聚烯基醇。-100的浓度在0到0.1%(w/v)范围内。本发明的方法还提供了其他非离子型去污剂的使用，这些去污剂包括例如，包括其他TritonX去污剂的其他的去污剂。MgCl2的;农度在0.5mM到50mM范围内。MnCl2的浓度在0.15mM到15mM范围内。MgCl2和MnCl2必须在这里所描述的范围内存在，且在优选的实施方案中MgCl2:MnCl2的比率是大约10:3，优选的，该比率是大约3-5:1,更优选的，该比率是大约3-4:1。2，-OMeNTP(每种)的浓度在5fiM到5mM范围内。2，-OHGTP的浓度在0jaM到300fiM范围内。在一种优选的实施方案中，在不存在2，-OHGTP(OjiM)时发生转录作用。2，-OHGMP、鸟噤呤或除了2'-OH糖基位点以外的其他位点进行耳又代的2'-OHG的浓度可以在0到5mM范围内。在不存在2，-OHGTP的反应中，需要2，-OHGMP,其范围在5到5mM范围内。DNA模板的浓度可以在5nM到5jxM范围内。突变体聚合酶浓度可以在2nM到20(iM范围内。无才几焦石粦酸酶的浓度在0到100units/ml范围内。pH<直可以在6到9范围内。本发明的方法可以在大多数能够整合修饰的核苷的聚合酶有活性的pH范围内实施。允许转录反应进4于一'j、时到几周，优选进行1到大约24小时。另外，在转录反应条件中，本发明的方法提供了任选的鳌合剂的使用，这些鳌合剂包括，例如，二乙胺四乙酸、乙二醇双(2-氨乙基醚)四乙酸和二好u苏糖醇。末端区指凄t级富集的配体系统进化:技术(SELEX)用于发现在一些实施方案中用来i殳计才莫4反-指导的核苷三磷酸聚合作用的核酸转录作用模板序列，增加转录产物产量的方法是指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)的变形，叫做末端区指数级富集的配体系统进化技术(TR-SELEXtm)。本发明提供一种用于识别核酸转录才莫4反组成序列，例如先导序列的方法，当被用于设计;漢板-直接聚合作用时，利用该方法能够增加使用末端区指数级富集的配体系统进化技术(TR-SELEXtm)荻得的转录产物产量，尤其是包含2'-修饰核苷(例如，2'-OMe核苦酸)的转录产物产量。为了选择能够促进包含2'-修饰核苷的转录产物产量的先导序列，产生了一种寡聚核苷酸转录模板的候选文库，该寡聚核苷酸转录模板的候选文库包含一种启动子序列，该启动子序列允许转录作用以模板依赖型方式进行，第一固定区域在3'^殳附近包括大于一个固定核香酸，7使启动子能够发生夹^反连4妻，从而通过延长连接模板引物结合位点上结合的引物实现扩增作用；先导序列选自一种退化区域；且在3'末端存在一种固定序列从而允许扩增作用。在一种优选的实施方案中，模板文库的退化区域4妾近5'-末端,人而减少5'固定序列的长度。转录一莫斧反文库进^^f壬选地PCR扩增，然后在这里7>开的情况下，使用转录反应混合物用于进行转录作用，其中转录反应混合物包括一种聚合酶、(包括但不仅限于，一种突变体T7RNA聚合酶)、核苦三-岸酸盐(NTP)(包括〃f旦不〗又限于一个或一个以上2'-修饰的NTP)、和镁离子。反转录产生的转录产物混合物/人而获得cDNA序列的候选混合物，然后cDNA序列与编码T7启动子的DNA序列相连。任选地，产生的转录产物混合物首先进行连接反应，然后进行反转录。然后通过PCR扩增编码砵争录产物的cDNA，并只于克隆产物进4亍凝月交^^斤i式验、專争录产量。用这样的方式扩增的转录才莫4反如果必要的话可以〗壬选i也用来进行进一步的末端区指数级富集的配体系统进化技术(TR-SELEXTM)，从而获得更大的转录产物产量(参见图2)。分析扩增转录产物的克隆序列从而识别允许转录作用(包括f旦不^f义限于并入一个或一个以上2'一务饰核苷的转录作用)的5'-先导序列元素。这些5'先导序列成分被用于设计寡聚核苷酸转录模板的候选文库从而促进包含2'-修饰核苷的核酸转录产物产量的增加，其中所述寡聚核苷酸转录模板被用于指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)。下面描述使用这里公开的条件下使用的DNA转录作用模板优选文库的实施例，其中，所述转录作用模板能够并入末端区指数级富集的配体系统进化技术(TR-SELEX)识别出的5'-先导序列元素并促进包含2'-修饰核普，例如2，-OMe核苷的转录产物产量的提高。对于下面列出的每个DNA转录4莫4反文库序列，下划线表示了5'-先导序列元素，所有的序列以5'-3'方向表示。ARC2118(SEQIDNO3)CTAGCATCGATGARC2119(SEQIDN04)CTAGCATCGATGARC2120(SEQIDNO5)CTAGCATCGATGARC2121(SEQ]DN06)CTAGCATCGATG为了产生2'画修饰的(例如，2'-OMe)RNA转录混合物，在可以接受2'-修饰的NTP的聚合酶的情况下，可以将Y639F、Y639F/K378R、Y639F/H784A、Y639F/H784A/K378R、Y639L/H784A、Y639L/H784A/K378R、P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶与通过本发明识别的5'-先导序列仪器使用。与本发明5'先导序列一起使用的优选的聚合酶是之前描述的Y639L/H784A突变RNA聚合酶，能够产生最高产量的包含2'-修饰核苷的核酸转录产物。与本发明5'先导序列一起使用的另一个优选的聚合酶是Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶。本发明还可以使用其他T7RNA聚合酶，尤其是能够对大的2'-取代基显示高耐受性的T7RNA聚合酶。除了将先导序列整合入候选文库和能够促进包含2'j奮饰核苷的核酸转录产物产量增加的突变体聚合酶(例如，Y639L/H784A和Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶)之外，4艮多已经确定对转录条件十分重要的上面描述的因素可以被用于进一步增加包含2'-修饰核苷的转录产物的产量。在这里所描述的条4牛下，识别的先导序列和Y639F/H784A、Y639F/H784A/K378R、Y639L、Y639L/K378R、Y639L/H874A、Y639L/H874A/K378R、P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶可净皮用于指数纟及富集的配体系统进^^支术(SELEX)乂人而产生包招H壬^f可一种2'画》务饰核苷结合的适体，其中2'"i务饰核苷例如，2，-OH、2，-F、2'-脱氧、2，-OMe,和2，-NH2修饰的三磷酸腺苷、三磷酸鸟苦、三磷酸胞苷、胸苷三^粦酸和三;粦酸尿苷。并入的2'4务饰核苦优选是2，-0-曱基核苦。优选包括一个或一个以上2，-0-曱基核苷的适体组合物，更优选除了起始核苷之外包括100%2，-o-甲基噤呤和嘧啶的适体组合物。在一个优选的实施方案中，在这里描述的条件下，使用识别的先导序列中的一个和Y639L/H874A、Y639L/H784A/K378R、P266L/Y639L/H784A或P266L/Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶产生高产量的包括全2'-OMe核香的适体转录产物。为了最大限度的整合2，-OMe三磷酸腺苷(100%)、三石粦酸尿普(100%)、三石粦酸月包苷(100%)和鸟苷三石粦酸(1000/。)("MNA")进入转录产物，优选以下条件HEPES緩沖液200mM，二硫苏糖醇40mM,亚精胺2mM,PEG-800010%(w/v)，TritonX-1000.01%(w/v),MgCl28mM,MnCl22.5mM,2'-OMeNTP(每种)1.5mM,2'國OHGMP1mM,pH7.5,Y639L/H784A/K378RT7RNA聚合酶200nM,无机焦磷酸酶5units/ml,和在衍生转录条件下能够增加转录产量的先导序列。在一个实施方案中，先导序列是全嘌呤先导序列。在另一实施方案中，先导序列是噤呤和嘧p定的混合物。这里4吏用的一个单位的无机焦磷酸酶的定义是在pH值为7.2,25"C条件下每分钟释放l.O摩尔无机正磷酸盐的酶的量。适体药物^f匕学—旦确认出结合理想靶分子的适体，可以任选地进行一些4支术从而进一步的增加确定的适体序列的结合和/或功能特性。通过指lt级富集的配体系统进化才支术(SELEXtm)(例如，2，-修饰的指数级富集的配体系统进化技术(SELEX))识别的与理想耙分子相结合的适体，例如MNA适体可以任选地被切断从而获得最小适体序列(在这里还叫做"最小构建物")，这种最小适体序列具有理想的结合和/或功能性质。完成这一步骤需要通过4吏用折叠程序和序列分析(例如，才交准筛选所得的克隆序列，乂人而寻4戈其<呆守基序和/或共变)的方法，/人而4口道最小4b构建物的设计。还可以进行生物化学探针试验来确定适体序列的5，和3，边界，从而知道最小化构建物的设计。随后，化学合成最小化构建物，检测其结合和功能性质，并与将其衍生出来的非最小化序列进4亍比4交。包含一系列5'、3，和/或中间缺失的适体序列变体比较检测结合和/或功能性质。另外，可以4吏用掺杂重筛选来纟笨索单一活性适体序列的序列需要，其中所述单一活性适体序列例如一种MNA适体(即，通过指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)(例如，2'-修饰的指数级富集的配体系统进化技术(SELEX))识别的与理想耙分子相结合的适体)或单一最小化适体序列。-使用一种合成的、退化序列库进行掺杂重筛选，所述序列库是根据重要的单一序列设计的。退化水平通常在野生型核苷酸，即重要的单一序列的70%到85%之间变化。通常，使用这种掺杂重筛选过程能够确认出带有中度突变的序列，但在许多情况下，序列改变能够带来亲和性的改进。随后使用从掺杂重筛选确定的克隆4朱中获得的复合序列信息来确定药物化学作用中的最小结合基序和目标。使用指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)确定的适体序列，例如MNA适体(包括2，-修饰的指数级富集的配体系统进化4支术(SELEX)和掺杂重筛选)和/或最小化适体序列，可以任选地使用适体药物化学进行后指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选从而使序列进行随机突变或定向突变，来增加结合亲合性和/或功能特性，或者作为选#^,来确定序列中那个位点对于结合活性和/或功能特性是必须的。适体药物化学是一种适体改进才支术，在此4支术中i牛多变体适体被化学合成。这些适体通常由于一种单一取代基的引入而与母体适体不同，且由于该取代基引入位点不同而相互区58别。随后相互比较这些变体，且将这些变体与母体相比。在特性上的改进具有^艮大的影响，乂人而只需插入一种单一取^基就可以达到一种特定的治疗标准。作为选择，从这种单一突变体中收集的信息可以用于"i殳计进一步的突变体，在进一步的突变体中同时引入了一个以上的取代基。在一种设计方案中，排列所有的单一期代基变体，选捧头4个突变体，合成并分析这4种单一取代基变体的所有可能的双(6)、三(4)和四(1)结合体。在第二种设计方案中，将最佳单一取代变体当作新的母体，合成并分析包括这一最高为单一取变体的所有可能的双耳又^变体。还可以<吏用其它的i殳计方案，这些i殳计方案可以纟皮重复利用，乂人而当继续确i人进一步文进的变体时，取^C基的凄t目依次增加。适体药物〗匕学可以,皮特别用作一种纟笨索局部，而不是整体取代基引入的方法。由于适体是在转录过程产生的文库中发现的，在指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)中引入的任何取代基必须是整体引入的。例如，如果需要在核苷间引入石危代石粦酸连接4建，则只可以在每个A(或每个G、C、T、U等等)处都引入(整体取代)。只在某些A(或每个G、C、T、U等等)处需要石克代磷酸4建而其他A处不需要的适体(局部取代)不能通过这一过程实现。可以被适体药物化学过程利用的取代基只受到作为固相合成试剂产生他们的能力和将他们引入低聚物合成方案的能力的限制。这一过程当然不受核苷酸本身影响。适体药物化学方案可以包4舌一种取^基，这种取^基可以引入空间体积、發u7K性、亲水性、亲油性、疏油性、正电荷、负电荷、中性电荷、两性离子、极性、核酸酶抵抗性、构象硬度、蛋白结合特性、分子59量等等。适体药物化学方案可能包括碱基修饰、糖修饰或磷酸二酯4建纟务饰。当考虑到根据治疗性适体内容可能是有益的取代基的种类时，理想的是引入属于以下一种或一种以上种类的取J戈基(1)已经存在于体内的取代基，例如，2'匪脱氧、2，画核苷、2，-O-甲基嘌呤或嘧t定或5-甲基胞嘧嚏。(2)已经是被接受的治疗剂的一部分的取代基，例如，硫代磷酸连4妄的寡聚核香酸。(3)能够被水解或降解成上述两种类型的取代基，例如，甲基磷酸酯连接的寡聚核苷酸。(4)本发明的适体包括通过这里描述的适体药物化学技术开发的适体。本发明适体的革巴分子结合亲合性可以通过一系列适体和靶分子(例如，一种蛋白质)之间的结合反应进行评估，在结合反应中，32P-标记的适体与稀释的靶分子在緩冲培养基中一起培养，然后使用真空过滤技术进行硝化纤维过滤分析。这里涉及的是一种斑点杂交结合试-验，此方法使用一种三层过滤介质，(/人上倒下)包括硝化纤维、尼龙滤膜和凝胶斑点纸。与革巴分子相结合的RNA被捕获在硝化纤维膜上，而没有与靶分子相结合的RNA被捕获在尼龙膜上。凝胶斑点纸是作为上面两种膜的支持而存在的。过滤作用之后，分离滤膜，干燥并暴露在一种磷屏上，使用磷成像系统从其中定量。定量的结果可以用来绘制适体结合曲线，并由适体结合曲线计算解离常数(KD)。在一种优选地实施方案中，用来进行结合反应的缓沖介质是IXDulbecco'sPBS(含有Ca++和Mg++)力口0.1mg/mLBSA。通常，^吏用体外和体内才莫型可以评估适体调节把分子功能活性，即适体功能活性的能力，此能力4艮大程度上依赖于靶分子的生物功能。在一些实施方案中，本发明的适体可以抑制耙分子的一种抑制的生物功能，而在另一个实施方案中，本发明适体可以刺激耙分子的一种已知的生物功能。爿使用能够测定适体靶分子已知功能的体外和体内模型本发明适体的生物活性。根据任何本领域技术人员使用的技术，本发明的适体可以被常规地调节从而具有诊断目的。诊断使用包括体内或体外的诊断应用。诊断试剂需要只能够允许使用者识别给定的靶分子在特定的位点和浓度存在。仅仅与靶分子形成结合对的能力已经足够激起一种正信号用于诊断目的。本领域普通技术人员还能够使用本领域内已知的步骤调整适体从而整合入用于追踪这种配体存在的标记签。这种标签可以在多种诊断过程中4吏用。具有免疫刺激基序的适体脊推动物免疫系统对细菌DNA的识别是以特殊序列中("CpG基序")非曱基化CG二核苷酸的识别为基础的。识别这种基序的一个受体是Toll-样受体9("TLR9"),Toll-样受体9是To11-样受体族成员之一(10个成员)，能够参与不同微生物成份识别的先天免疫应答。Toll-样受体9以一种序列特异性方式结合未甲基化的低聚脱氧核苷酸("ODN")CpG序列。CpG基序的识别引发防御机制，从而导致先天和最终获得的免疫应答。例如，小鼠体内Toll-样受体9的活化导致抗原呈递细力包的活化，上调MHCI类和II类分子和重要共刺^t分子和细胞因子的表达，其中，细胞因子包括IL-12(重组人白介素-12)和IL-23(重组人白介素-23)。这种活化直接或间接的才是高了B和T细胞的应答，包括THI—细胞因子efn—y。CpG序列全部的反应导致抵抗炎症性疾病、纟是高对疫苗的免疫反应、对哮喘的有效反应和改进的抗体依赖性细胞介导的细胞毒素。因此，CpGONN可以抵抗炎症性疾病，起到免疫助剂或癌症治疗剂(单一治疗或与mAb或其他疗法结合治疗)，且能够降低哮喘和过每丈反应。本发明的适体，例如，MNA适体可以包括一种或一种以上CpG或其他免疫刺激序列。这种适体可以使用多种方法，例如这里描述的指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)进4亍识別或生产。通常，这些方法可以^皮分为两《且，在第一《且中，该方法直4妾识别或生产包4舌CpG基序或其他免疫刺激序列以及靶分子结合位点的适体，其中靶分子(下称"非-CpG靶分子")是除了已知能够识别CpG或其他免疫刺激序列和已知能够刺激结合CpG基序的免疫反应的靶分子之外的靶分子。本组第一种方法包括4吏用一种寡核苷酸库作为固定区域或固定区域一部分，进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)获得对特异性非CpG靶分子的适体，其中该寡核苦酸库中的每个成员都整合入CpG基序，例如，在一些实施方案中，序列库成员的随才几区域包括一种具有整合入CpG基序的固定区域，第一种方法还识别包括CpG基序的适体。本组的第二种方法包括进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)获得对特异性非CpG靶分子，优选一种靶分子的适体，随后的筛选将CpG基序添加到5，和/或3'末端或将CpG基序构建到适体的一个区域，优选一种非必需区域。本组的第三种方法包括进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)获得对特异性非CpG靶分子的适体，其中，在序列库的合成过程中，不同核苷酸的摩尔比例在一个或一个以上核香酸添加步艰《中是有偏差的，乂人而随机产生富集CpG基序序列库的每个成员，并识别包4舌CpG基序的适体。本组的第四种方法包括进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)获得对特异性非CpG靶分子的适体，并识别包括CpG基序的适体。本组的第五种方法包括进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)获得对特异性非CpG耙分子的适体，并识别一种适体，这种适体在结合后刺激免疫应答但不包括CpG基序。在第二组，这些方法识别或产生包4舌CpG基序和/或其他与CpG基序的受体(例如Toll样受体9或其他Toll样受体)相结合并在结合后刺激免疫反应的序列。本组第一种方法包括，使用一种寡居核苷酸序列库进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)从而获得一种适体，该适体是已知能够结合CpG基序或其他免疫刺激序列且在结合后能够刺激一种免疫反应的靶分子的适体，所述寡聚核苷酸序列库中每个成员都整合入CpG基序作为固定区i或或者作为固定区i或的一部分，例3口，在一些实施方案中，序列库成员的随机区域包括一种整合有CpG基序的固定区域，该方法还包括识别包括CpG基序的适体。本组的第二种方法包括进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)从而获得一种适体，该适体是已知能够结合CpG基序或其他免疫刺激序列且在结合后能够刺激一种免疫反应的靶分子的适体，随后将CpG基序添加到5，和/或3，末端或将CpG基序构建到适体的一个区域，优选一种适体的非必需区i或。本组的第三种方法包括进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)从而获得一种适体，该适体是已知能够结合CpG基序或其他免疫刺激序列且在结合后能够刺激一种免疫反应的靶分子的适体，其中，在序列库的合成过程中，不同核苷酸的摩尔比例在一个或一个以上核香酸添加步艰《中是有偏差的，/人而序列库的每一个成员的随机区域都富集CpG基序，本方法还包括识别包括CpG基序的适体。本组第四种方法包括进行指数级富集的配体系统进化4支63术(SELEXTM)从而获得一种适体，该适体是已知能够结合CpG基序或其他免疫刺激序列且在结合后能够刺激一种免疫反应的耙分子的适体，本方法还包括识别包括CpG基序的适体。本组的第五种方法包括进行指数级富集的配体系统进化技术(SELEXTM)从而获得一种适体，该适体是已知能够结合CpG基序或其他免疫刺激序列的革巴分子的适体，本方法还包括识别一种适体，该适体在结合之后，能够刺激免疫反应但是不包括CpG基序。已经识別出许多不同种类的CpG基序，每个都来自不同等级的事件的识别过程，细胞毒素和其他分子的释放，以及确定的细胞型的活化，参见，例如"细菌DNA中的CpG基序以及它钉]的免疫4乍用，，，Rev.Immunol.2002,20:709-760，i亥文献通过引用在这里并入本文。其他的免疫刺激基序在下面的美国专利中进行了公开，这些专利通过引证在这里全部并入本文美国专利第6,207,646号;美国专利第6,239,116号;美国专利第6,429,199号；美国专利第6,214,806号；美国专利第6,653,292号；美国专利第6,426,434号；美国专利第6，514，948号和美国专利第6,498,148号。这些CpG或其他免疫刺激基序中的任意一个可以4皮整合入适体中。才艮据-皮治疗的疾病或不适来选择适体。优选的免疫刺激基序包括(从左到右表示5，到3，端)，其中"r"代表一种噪呤，"y"^表一种嘧^定，"X"4<表任意核苷酸AACGTTCGAG(SEQIDNO:136);AACGTT;ACGT,rCGy;rrCGyy，XCGX,XXCGXX,和X!x2cGY!Y2，其中，X,是鸟嘌P令或I^噤呤，X2不是胞嗜啶，Yi不是鸟嘌呤，Y2优选胸腺嘧，定。CpG基序^皮整合入一种适体，这种适体与一种特异性耙分子结合，而不与已知能够结合CpG基序且在结合后刺激免疫反应的靶分子结合(一种"非-CpG靶分子")，在这种情况下，CpG优选位于适体的非必须区域。适体的非必需区域可以;故定点突变作用、删除分析和/或取代分析识别。4旦是，可以使用不会对适体结合非-CpG靶分子的能力有显著干扰的任何位点，除了^皮包4舌在适体序列中，CpG基序可以;故悬挂在5，和3，的两端或其中之一端，或者附着与适体上。只要适体与非-CpG靶分子结合的能力没有受到显著的影响，可以使用任何附着位点或附着方式。如这里所述的"免疫反应的刺激作用"既意p木着(1)一种特异性应答的引入(例如，Thl应答的引入)或确定的分子产物的引入，或(2)特异性响应的禁止或抑制(例如，Th2响应的禁止或抑制)或特定分子的禁止或抑制。适体治疗剂的药代动力学调节和生物分布定制所有寡聚核苷酸基治疗剂，包括适体的药代动力学性质从而配合理想的药物应用对所有寡聚核苷酸基治疗剂，包括适体来讲是十分重要的。尽管直接针对胞外靶分子的适体不会遭受与胞内传递相关的困难(这是反义和RNAi基治疗剂会遇到的问题)，这些适体仍然必须能够分布到靶点器官和组织上，且必须在体内(未》务饰的)维持一定时间与理想的给药方案相协调。因此，本发明提供了能够影响适体组合物药代动力学性质的材料和方法，以及，尤其4是供了调整适体药代动力学的能力。适体药代动力学的调整能力(即，调节的能力)是通过将修饰的基团(例如聚乙二醇聚合物)与适体相结合和/或整合入修饰的核苷酸(例如，2，-氟代或2，-0-甲基取代)调整核酸的化学组合物来实现的。调整适体药代动力学的能力被用于改进已经存在的治疗应用中，或者，作为选择，被用于新型治疗应用的发展过程中。例如，在一些治疗应用中，例如，在抗胂瘤或紧急护理设施中，需要快速的药物清除率或消除率，因此需要降^氐适体在循环过程中的存在时间。作为选择，在其^f也的治疗应用中，例如，在维持治疗中，需要系统的治疗环境，因此可能需要增加适体在循环中的存在时间。另外，适体药代动力学的调节能力^皮用于调整患者体内的适体生物分布。例如，在一些治疗应用中，可能需要改变适体治疗剂的生物分布，从而获得靶向特定类型的组织或一种特定的器官(或一组器官)的作用。在这些应用过程中，适体治疗剂优选地在特定的组织或器官处积累。在其他治疗应用中，可能需要靶向组织展示一种胞内标记物或与给定的疾病有关的症状，月包内损伤或其他不正常的病症，乂人而适体治疗剂优选地在受到影响的组织处积累。例如，在2004年3月5日递交的名为"适体治疗剂的药代动力学和生物分布的控制调节作用"的美国临时专利申i青系列号第60/550790号所述，和2005年3月7日递交的名为"适体治疗剂的药代动力学和生物分布的控制调节作用"的非临时申请的美国系列第10/—，一号中所述，适体治疗剂的聚乙二醇化(例如，用20kDa的聚乙二醇聚合物进行)被用于靶向发炎的组织，因此聚乙二醇化的适体治疗剂优选积累在发炎的组织中。为了确定适体治疗剂(例如适体结合物或具有改变的化学物质，例如<*饰的核苷酸的适体)的药代动力学和生物分布曲线，检测了许多参数。这些参数包括适体组合物的半衰期(t1/2)、血浆清除率(CL)、分布容积(Vss)、浓度-时间曲线下的面积(AUC)、可观察到血清或血浆的最高浓度(Cmax)、平均滞留时间(MRT)。如这里所使用的术语"AUC"是指适体治疗剂的血浆浓度对适体给药后时间的曲线下面积。AUC值用来估计生物利用率(即，适体给药后循环中给药的适体治疗剂的百分比)和/或给定的适体治疗剂的总清除率(CL)(即，适体治疗剂从循环中除去的速率)。分布体积将适体治疗剂的血浆浓度与体内存在的适体的量联系起来。Vss值越大，在血浆外发现的治疗剂越多(即，溢出越多)。本发明提供了材料和方法，这些材料和方法用于以控制的方式通过将适体，例如MNA适体与调节基团，例如小分子、肽、或聚合物末端基团结合，或者通过将修饰的核苷酸整合入适体中来体内调节稳定的适体组合物，例如，MNA适体。如这里所描述的，》务饰基团的结合和/或核苷酸化学组合物的改变改变了适体在循环中的4亭留时间和在组织中分布的基本方面。除了核酸酶的清除作用，寡聚核苦酸治疗剂还要一皮肾过滤消除。因此，局部l争脉给药核酸酶耐受性寡聚核苷酸表现出的体内半衰期<10分4中，除非过滤作用受阻。这一过禾呈可以通过加速血液流外向组织中的快速分布或增加寡聚核苷酸的外观分子量，使其大约被切断用于肾小球过滤的有效尺寸来实现。下面描述的小治疗剂与聚乙二醇聚合物的结合(聚乙二醇化)可以显著的延长适体在循环中的停留时间，因此，降低给药频率和提高对于血管靶点的效力。适体可以与多种》务饰的基团连4妄，例如，高分子量聚合物，例如，聚乙二醇；肽，例如Tat(HIVTat蛋白的一种具有13个氨基酸的片断(Vives,etal.(1997),J.Biol.Chem.272(25):16010-7))、Ant(果蝇触角足突变同源异型蛋白(Pietersz，etal.(2001),Vaccine19(11-12):1397-405)的三螺^走书f生出来的含有16个氨基酸的序列)和Arg7(—种短小的、带有正电荷的细胞渗透性肽，由聚精氨酸(Arg7)组成(Rothbard,etal.(2000),Nat.Med.6(11):1253-7;Rothbard,Jetal.(2002),J.Med.Chem.45(17):3612画8));和小分子，例如，亲脂性化合物，例如胆固醇。在这里描述的这些结合物种，与聚乙二醇基团的复合作用使适体的体内性质改变最多。例如，混合地2，F和2，-OMe》务饰的适体治疗剂与20KDa的聚乙二醇聚合物的复合作用妨碍了肾过滤作用且促进了适体向健康的和发炎的组织的分布。而且，20KDa聚乙二醇聚合物-适体结合物在阻止适体肾过滤方面与40KDa的聚乙二醇聚合物一样有效。尽管聚乙二醇化的一个作用是对适体清除率的影响，由于20KDa基团的存在延长了系统暴露时间，还促进了适体到组织中的分布，尤其是向那些高灌注器官和发炎位点的分布。适体-20KDa聚乙二醇共聚物指导适体向发炎位点分布，乂人而4吏聚乙二醇化的适体优选地积累在发炎组织中。在一些情况下，20KDa的聚乙二醇化的适体共聚物能够进入细月包内部，例如，进入肾细i包内部。〗多饰的核苷酸还可以用来调整适体的血浆清除率。例如，一种包括2，F和2'-OMe稳定化学物质的未结合的适体，这种适体是典型的目前产生的适体，能够在体内和体外表现出4艮高的核酸酶耐受性，与未修饰的适体相比表现出快速的血浆流失(即，快速的血浆清除率)和快速的组织分布，主要是向肾的分布。聚乙二醇书f生的核酸如上所述，带有高分子量非免疫性聚合物的核酸的衍生作用具有改变核酸药代动力学和药效性质的能力，使核酸成为更有^:的治疗剂。活性的理想的改变包^fe增加^f核酸酶降解作用的抵抗力、降低肾的过滤作用、降低向免疫系统的暴露和改变的治疗剂向全身的分布。本发明的适体组合物可以用聚烯基二醇("PAG")基团衍生。PAG_衍生的核酸的实施例可以在2003年11月2168日递交的美国专利申请系列第10/718,833号中发现，该专利通过引证在此并入本文。本发明使用的典型的聚合物包括聚乙二醇("PEG"),也叫做聚氧化乙烯("PEO")和聚丙二醇(包括聚异丙基乙二醇)。另外，在4艮多应用中可以-使用不同氧化烯基(例如氧化乙烯和氧化丙烯)的随机或固定共聚物。在其最常见的形式中，聚埽基二醇，例如PEG是一种线性聚合物，在其每个末端用氢氧基基团佳于端HO-CH2CH20-(CH2CH20)nCH2CH2-0H。该聚合物，a-、w-二氢氧基聚乙二醇，可以用HO-PEG-OH来代表，其中，应该理解-PEG-符号代表如下结构单元-CH2CH20-(CH2CH20)nCH2CH2-,其中n通常在大约4到大约10,000范围内。如图所示，聚乙二醇分子是双功能性的，有时也叫做"双羟基聚乙二醇"。聚乙二醇分子的末端部分是相对无反应性羟基基团，-OH基团可以被活化或转化成功能基团，用于将聚乙二醇与其他化合物在化合物的反应位点上相附着。这种活化的双羟基聚乙二醇在这里^皮叫估文双活化的聚乙二醇。例如，双羟基聚乙二醇的末端基团通过用来自N-羟基琥珀酰亚胺的琥珀酰亚胺活性酯基团耳又代相对无反应活性的氢氧基基团#皮功能化为活性碳酸酯，用于选择性的与氨基基团发生反应。在许多应用中，需要用一种基本上无反应性的基团封住聚乙二醇分子的一端，从而这种聚乙二醇分子成为单功能性分子(或单活化的分子)。就通常对活化的聚乙二醇显示多重反应位点的蛋白质治疗剂来说，双功能性活化的聚乙二醇导致大范围的交联，产生缺乏功能的聚集物。为了产生单活化的聚乙二醇，通常用无反应性的曱氧基末端基团，-OCH3来取代双功能性聚乙二醇分子末端的一个羟基基团，聚乙二醇分子未封端的末端通常变为反应端基团，可以4皮活化用于附着在表面或例如蛋白质的分子的活性位点。聚烯基二醇是一种聚合物，该聚合物通常具有在水和许多有机溶剂中易溶、缺乏毒性和缺乏免疫原性的性质。聚烯基二醇的一个应用是将该聚合物与不溶物分子相附着，/人而产生可溶性聚烯基二醇-分子"结合物"。例如，已经证明不溶于水的药物紫杉醇当与聚乙二醇系在一起时变成水可溶'l"生。Greenwald,etal，J.Org.Chem.,60:331-336(1995)。聚蹄基二醇结合物不只通常^皮用于提高可溶性和稳定性，还用于延长分子的血液循环半衰期。本发明的多烷基化化合物大小一般在5到80KDa之间，然而可以使用任意一种大小，具体的选择依赖于适体和应用。本发明其他聚烯基二醇化合物的尺寸在10到80KDa之间。本发明另外的聚烯基二醇化合物的大小在10到60kDa之间。例如，一种聚烯基二醇聚合物的大小可以是至少10、20、30、40、50、60、或80kDa。这种聚合物可以是线性的或含支链的，在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇。与生物学表达的蛋白治疗剂相反，核酸治疗剂通常是由活化单体核苦酸中化学合成的。聚乙二醇-核酸结合物可以通过使用相同的重复单体合成法并入聚乙二醇来制得。例如，通过转变成亚石粦酰胺形成活化的聚乙二醇能够一皮引入固相寡聚核苷酸合成过程。做为选择，寡聚核苷酸合成可以通过反应性聚乙二醇附着位点的定点特异性结合来完成。最通常，这一过程通过在5'-末端添加游离伯胺(在固相合成最后的耦合步骤^f吏用调节剂亚磷酰胺并入)来实现。-使用这种方法，反应性聚乙二醇(例如，被活化以便其能与胺起作用并形成化学4建的反应性聚乙二醇)与纯化的寡聚核香酸结合，且耦合反应在溶液中进行。聚乙二醇结合作用改变治疗剂生物分布的能力与i午多因素有关，这些因素包括结合物的表观尺寸(例如，根据流体动力学半径测;彈)。已知大的结合物(〉10KDa)能够更加有岁文的阻断肾的过滤作用并因此增加小高分子(例如，肽、反义寡聚核苷酸)的血浆半衰期。聚乙二醇结合物阻挡过滤的能力已经i正明能够随着聚乙二醇尺寸增加到大约50kDa而增加(聚乙二醇尺寸进一步增加的有益影响4艮小，由于随后半衰期由巨噬细胞调节新陈代谢作用而不是通过肾的排出来决定)。高分子量聚乙二醇(〉10KDa)的生产是困难、低效且昂贵的。作为一种高分子量聚乙二醇-核酸结合物合成途径，前面的工作重要针对的是产生高分子量活化的聚乙二醇。用于产生这种分子的一个方法包括形成一种含有支链的活化聚乙二醇，其中两个或两个以上聚乙二醇附着于中心核心传送活化基团。这些高分子量聚乙二醇分子的末端部分，那就是i兌，相对无反应性的羟基(-OH)基团可以被活化或变为功能性基团，用于将一个或一个以上聚乙二醇与其他4匕合物在化合物的活性部位上相附着。含有支《连的活化的聚乙二醇具有两个以上末端，且如果两个或两个以上末端已经被活化的话，这种活化的高分子量聚乙二醇分子在这里叫做多活化聚乙二醇。有时，并不是所有含支链的聚乙二醇分子的末端都被活化。如果含有分支的聚乙二醇分子的任意两个末端被活化，这种聚乙二醇分子称为双活化的聚乙二醇。有时含有分支的聚乙二醇分子中只有一个末端被活化，这种聚乙二醇分子称为单活化的聚乙二醇分子。作为这种方法的实施例，已经描述了由两个单甲氧基聚乙二醇与随后被活化用于反应的赖氨酸核心相附着而制得的活化的聚乙二醇(Harrisetal,Nature,vol.2:214-221,2003)。本发明提供了另一种经济合算的合成高分子量聚乙二醇-核酸(优选，适体)结合物的方法，其中所述聚乙二醇-核酸结合物包括多重聚乙二醇化的核酸。本发明还包4舌聚乙二醇连接的多体寡聚核苦酸，例如，二聚适体。本发明还涉及高分子量组合物，在此高分子量组合物中聚乙二醇稳定基团是一种连接体，将适体的不同部分区别开来，例如，聚乙二醇结合在单一适体序列之内，因此高分子量适体组合物的直线排列是，例如，核酸-聚乙二醇-核酸(-聚乙二醇-核酸)n，其中，n大于或等于l。本发明的高分子量组合物具有至少10kDa的分子量。组合物通常的分子量在10到80kDa之间。本发明的高分子量纟且合物的大小至少是10、20,30、40、50、60、或80kDa。稳定基团是一种分子或分子的一部分，它能够改进本发明高分子量适体组合物的药代动力学和药效性质。有时，稳定基团是一种分子或分子的一部分，它能够^吏两个或两个以上适体或适体区域相互靠近，或提供降低本发明高分子量适体组合物的全旋转游离度。稳定基团可以是一种聚亚烷基二醇，例如聚乙二醇，聚亚烷基二醇可以是直链的或是含有支链的(PNA)。寡聚核苷酸也可以是稳定基团；这种寡聚核苷酸可以包括z修饰的核苷、和/或修饰的连接体，例如疏代磷酸连接体。稳定基团是适体组合物不可分割的一部分，那就是说，稳定基团与适体共价结合。本发明的组合物包4舌高分子量适体组合物，其中，两个或两个以上核酸基团与至少一个聚亚烷基二醇基团共价结合。聚亚烷基二醇基团作为稳定基团。在聚亚烷基二醇基团共价结合在适体任一端的组合物中，聚亚烷基二醇连接核酸基团，一起成为一个分子，聚亚烷基二醇被认为是连接基团。在这种組合物中，共^介分子的一级结构包括直线排列的核酸-聚烯基二醇-核酸。一个实施例是一种具有核酸-聚乙二醇-核酸一级结构的组合物。另一个实施例是一种直线排列的核酸-聚乙二醇-核酸-聚乙二醇-核酸。为了生产核酸-聚乙二醇-核酸结合物，初步合成核酸使其具有一种单一活性位点(例如，它是单活化的)，在一种优选的实施方案中，这些活性位点是一种氨基基团，这种氨基基团是在寡聚核苷酸固相合成的最后一步，通过在5，-末端添加一种调节剂亚石粦酰胺而引入的。继对-修饰的寡聚核苷酸进4亍去蛋白和纯化作用之后，将其在能够最小化活化聚乙二醇自发水解的溶液中以高浓度重新组成。在一种优选的实施方案中，寡聚核苷酸的浓度是1mM,重新组成的溶液包含200mMNaHC03-緩冲液，pH值为8.3。通过緩慢逐步地加入高纯化的双功能性聚乙二醇开始进行结合物的合成。在一种优选的实施方案中，双功能性聚乙二醇在两端通过与琥珀酰亚胺丙酸盐进行书f生来活化。反应之后，用凝月交电泳或液相色i普纯化聚乙二醇-核酸结合物，来分离完全结合的、部分结合的和非结合的种类。可以将多重聚烯基二醇分子连接体(例如，作为随机的或嵌段共聚物)或较小聚烯基二醇链连接以达到各种各样的长度(或分子量)。在不同长度的聚烯基二醇链之间可以<吏用非聚烯基二醇连4妄体。2'-0-甲基、2'-氟代及其他修饰的核香修饰作用能够稳定适体4氐抗核酸酶并增加适体体内半衰期。3'-3'-dT封端还增加了核酸外切酶耐受性。参见，例如，美国专利第5，674,685号；第5,668,264号；第6,207,816号；和第6,229,002号，这些专利通过引"i正在此全部并入本文。反应性核酸的聚烯基二醇-衍生作用可以通过单功能性活化的聚乙二醇与包含一个以上活性位点的核酸发生反应，来生产高分子量聚烯基二醇-核酸-聚烯基二醇结合物。在一个实施方案中，该核酸是双反应性的，或双活4b的，且包含两个活性位点通过常身见的亚^粦酰胺合成法将5'-氨基基团和3'-氨基基团引入寡聚核苷酸，例如图13所示的3'-5'-二-聚乙二醇化。在可供选择的实施方案中，可以在内部位置引入活性位点，使用例如嘧啶的5-位点、嘌呤的8-位点、或核糖的2'-位点作为伯胺的附着位点。在这种实施方案中，斥亥f臾可以具有一些活7f匕的或活性4立点，且可以^皮多重活^f匕。继合成和纯化作用之后，在能够促进与寡聚核苷酸活性位点进行选择性反应同时能够最小化自发水解的情况下，修饰的寡聚核苷酸与单活化的聚乙二醇结合。在优选的实施方案中，用琥珀酰亚胺丙酸盐活化单甲氧基-聚乙二醇，在pH为8.3时进行耦合反应。为了推动双取代的聚乙二醇的合成，提供相对于寡聚核苷酸化学当量过多的聚乙二醇。继反应之后，4吏用凝胶电泳或液相色i普纯化聚乙二醇-核酸结合物，来分离完全结合的、部分结合的和非结合的种类。在连接区域可以附着有一个或一个以上聚亚烷基二醇基团。这种聚烯基二醇可以具有不同长度且可以#1用于适当的结合物从而获得所需的组合物分子量。特定连接体的作用可以受其化学成分和长度的影响。太长、太短或与靶分子形成相反的立体和/或离子相互作用的连接体将会妨碍适体和靶分子之间形成复合物。如果连接体的长度大于覆盖核酸之间的距离所必需的长度，则可能由于减少了配体的有效浓度而减少结合稳定性。因此，常常需要优化连接体成分和长度从而最大化适体与靶分子的亲合性。这里引用的所有的出版物和专利文件通过引证在此并入本文，正如这里引用的每个出版物或文献被具体地、分别地进行了介绍，/人而通过引i正在此全部并入本文。这些出片反物和专利文件的引用并不代表承认其是相关的先有技术，也不代表承认其内容和公开日期。目前本发明通过所著的说明书进行了描述，本领域普通技术人员应当承认，本发明可以在许多实施方案中实施，且之前的描述和以下的实施例是起到示意作用，并不是对随后的权利要求书的限制。这里引用的所有的出版物和专利文件通过引证在此并入本文，正如这里引用的每个出版物或文献^皮具体地、分别地进4亍了介绍，乂人而通过引i正在此全部并入本文。这些出X反物和专利文件的引用并不代表承认其是相关的先有技术，也不代表承认其内容和公开日期。目前本发明通过所著的说明书进行了描述，本领域普通技术人员应当承认，本发明可以在许多实施方案中实施，且之前的描述和以下的实施例是起到示意作用，并不是对随后的权利要求书的限制。实施例实施例1:使用指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)进行的5，-先导序列的确认具有如下设计的退化的DNA文库(乂人5'端到3，端的方向表示)用下列序列合成T7启动子/G4/退化的20个核苷/3'-固定序列5TAATACGACTCACTATAGGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCT3,(ARC1140,SEQIDNO7》.用3，—引物AGCTAGCTTACTGCATCGAC(SEQIDNO104)和5'—引物TAATACGACTCACTATAG(SEQIDNO105)扩增该文库。然后4吏用IX转录混合物(HEPES200mM,二石克苏冲唐醇40mM，亚4青胺2mM，TritonX-1000.01%)在37°C下转录双链文库，在以下条件下反应过夜2'-OMe三磷酸腺苷、三石粦酸力包苦、三;粦酸尿苦、三^粦酸尿苦各1mM,2'-OH三-粦酸尿苦30^M、MgCl2、6.5mM、MnCl22.0mM、10%w/vPEG—8000、1mMGMP,无才几焦石寿酸酶0.5单位每100juL反应，和Y639F/H784A/K378RT7RNA聚合酶200nM。随后;兄淀(异丙醇、氯4匕钠、乙二胺四乙酸)所4寻混合物，并进行凝胶过滤(10%聚丙烯酰胺凝胶)，切离并从凝胶中提耳又出来，用DNase(RQl,Promega，MadisonWI)处理，4吏用PCR时4吏用的3，-引物在65。C下反转录(Thermoscript,Invitrogen,Carlsbad,CA)并直接稀释到夹板结和反应中，与下列寡聚核苷酸反应编码一种T7启动子的5'磷酸化的寡聚核苷酸(其中p代表5，一磷酸化作用)pTATAGTGAGTCGTATTA3'(SEQIDNO8),结合作用夹4反5'TAATACGACTCACTATAGGGG3'(SEQIDNO9)。对这种混合物进行热处理-变性，退火，然后添加T4DNA连4妄酶(NEB，BeverleyMA)随后在16。C条件下培养过夜。在连接反应步骤之后，直接稀释反应与引物进行PCR，所述引物是之前描述的用于扩增转录序列输入下一轮指数级富集的配体系统进化技术(SELEX)的引物。本方案在图2中有所表示o在三轮末端区域指数级富集的配体系统进化技术(TR-SELEX)之后，使用TOPOTA克隆试剂盒，按照厂家的使用说明(Invitrogen,Carlsbad,CA)克隆所得文库，测序并分析发生在退化区域的核苷统计lt值。通过聚丙烯酰胺凝月交分4斤评估单独的克隆体作为高浓度转录产物的转录模板的能力，然后使用能够产生最高产量的转录产物的序列，设计文库，并对文库中的序列一次进行凝胶分析，试验他们作为高浓度转录产物的转录模板的能力。图3显示了三轮末端区域指数级富集的配体系统进化技术(TR-SELEX)筛选之前或之后二十个退化位置区域的核苷组合物的平均百分比。如图3所示，在转录产物中的位点5到13,非常优选转录鸟噤呤核苷，此后，没有优选转录的核苷。在3轮末端区域指数级富集的配体系统进化技术(TR-SELEXtm)之后，通过测序发现的序列被聚丙烯酰胺凝月交分析筛选用于分析他们使用200nM模板、IX转录緩冲液(HEPES200mM、二石克苏寿唐醇40mM、亚4青胺2mM、TritonX-1000.01%)、2，-OMe三磷酸l^苦、三-寿酸胞苷、三磷酸尿苷、三石粦酸鸟苷、每个都是1mM、2，-OH三磷酸鸟苦30jaM、MgCl26.5mM、MnCl22mM、10%w/v聚乙二醇-8000、1mM鸟"票呤核香酸、无才几焦石粦酸酶0.5单位每100pL反应和Y639F/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶200nM在37。C条件下过夜，转录2'-OMe核普的能力。通过聚丙烯酰胺凝胶试验目测检验，将来自第0轮和来自3轮筛选后的克隆林相比较，来自3轮筛选后的克隆4朱的一个实施例，克隆抹AMX411.D6产生非常多的MNA转录产物。来自34仑筛选后的克隆4朱的DNA序列列在下表中(所有序列按照5'-3'方向列出)SEQIDNO10>AMX(411)—AlARC1140Rd3—411-AlSEQIDNO11>AMX(411)_B1ARC1140Rd3—411-BlSEQIDNO12>AMX(411)—CIARC1140Rd3一41l-ClSEQIDNO13>AMX(411)_D1ARC1140Rd3_411-D1SEQIDNO14>AMX(41l)一ElARC1140Rd3_411-ElSEQIDNO15>AMX(411)—F1ARC1140Rd3_411-FlSEQIDNO16>AMX(41l)一GlARC1140Rd3—411-GlTAATACGACTCACTATAOGGGGA(3。。GGTGCTGACCNCAAACASEQIDNO17>AMX(411)_H1ARC1140Rd3—411-H1SEQIDNO18>AMX(4ll)_A2ARC1140Rd3—411-A278SEQIDNO19>AMX(411)_B2ARC1140Rd3_411-B2SEQIDNO20>AMX(411)_C》ARC1140Rd3一411-C2GCTSEQIDNO21>AMX(411)_D2ARC1140Rd3—411-D2SEQIDNO22>AMX(411)一E2ARC1140Rd3—411-E2TAATACGACTCACTATAGGGGGGCd5C3AGAATGTTATATAGTTACGGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQIDNO23>AMX(411)JF2ARC1140Rd3—411-F2TAA丁ACGACTCACTATAGGGGAAAGGGGCGGTATGGTACACACGTAACAGGTTAAACCCGGGTCGATGCAOTAAGCTAGCTSEQIDNO24>AMX(4l1)_G2ARC1140Rd3—411-G2SEQIDNO25>AMX(411)—H2ARC1140Rd3—411-H2SEQIDNO26>AMX(411)一A3ARC1140Rd3—411-A3SBQIDNO27>AMX(411)_B3ARC1140Rd3—411-B3TSEQIDNO28>AMX(411)_C3ARC1140Rd3—411-C3TAATACGACTCACTATAGGGGGGGCATACGAGTTTAGGTGGAGACGTAACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQIDNO29>AMX(411)_D3ARC1140Rd3_411-D3SEQIDNO30>AMX(411)—E3ARC1140Rd3—411-E3SEQIDNO31>AMX(411)—G3ARC1140Rd3—411-G3GGCGASEQIDNO32>AMX(411)一H3ARC1140Rd3—411-H3CT79SEQIDNO33>AMX(411)一A4ARC1140Rd3—411-A4TAATACGACTCACTATAGGGGGGTTfbTCTCAAGTGAAGCAGAACGTAACCGGTTAATCCCGGGTCGATGCAOTAAGCTAGCSEQIDNO34>AMX(411)—B4ARC1140Rd3—411-B4CTSEQIDNO35>AMX(411)—C4ARC1140Rd3—411-C4SEQIDNO36>AMX(411)—D4ARC1140Rd3—411-D4SEQIDNO37>AMX(411)—E4ARC1140Rd3_411-E4TSEQEDNO38>AMX(411)—F4ARC1140Rd3—411-F4SEQIDNO39>AMX(411)_G4ARC1140Rd3—411-G4AGCTSEQIDNO40>AMX(411)一H4ARC1140Rd3—411-H4TAATACGACTCACTATAGGGGGGTGGGGGCACGGTACTGAGTTACGTTACCGGTTAAACCCGGGTCGATGCAGT八AGCTAGCTSEQIDNO41>AMX(411)_A5ARC1140Rd3_411-A5SEQIDNO42>AMX(411)JB5ARC1140Rd3—411-B5SEQIDNO43>AMX(411)—C5ARC1140Rd3—411-C5SEQIDNO44>AMX(411)—D5ARC1140Rd3—411-D5TAATACNACTCACTATAGGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQIDNO45>AMX(411)—E5ARC1140Rd3一411-E5SEQIDNO46>AMX(411)—F5ARC1140Rd3—411-F5SEQIDNO47>AMX(411)_G5ARC1140Rd3_411-G5CTSEQIDNO48>AMX(411)一H5ARC1140Rd3—411-H5TAATACGACTCACTATAGGGGTrTGd^AATCGAACGTGGAACGCAACCGGTTTAACCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQIDNO49>AMX(411)—A6ARC1140Rd3—411-A6SEQIDNO50>AMX(411)—B6ARC1140Rd3_411-B6SEQIDNO51>AMX(411)一C6AUC1140Rd3—411-C6SEQIDNO52>AMX(411)—D6ARC1140Rd3—411-D6SEQIDNO53>AMX(411)一E6ARC1140Rd3—411-E6SEQIDNO54>AMX(411)—F6ARC1140Rd3—411-F6TSEQIDNO55>AMX(411)一G6ARC1140Rd3—411-G6SEQIDNO56>AMX(411)一H6ARC1140Rd3—411-H6TAATACGACTCACTATAGGGGAGTGGGGGCTTCTCGTTGCCACGTAACCGCTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSBQIDNO57>AMX(423)_A7ARC1140R3_423-A7SEQIDNO58>AMX(423)_B7ARC1140R3一423-B7SEQIDNO59>AMX(423)—C7ARC1140R3—423-C7SEQIDNO60>AMX(423)—D7ARC1140R3一423-D7SEQIDNO61>AMX(423)_B7ARC1140R3一423墨E7ctSEQIDNO62〉AMX(423)一F7ARC1140R3_423-F7ctagctSEQEDNO63>AMX(423)_G7ARC1140R3—423-G7SEQIDNO64>AMX(423)_H7ARC1140R3_423-H7SEQIDNO65>AMX(423)—B8ARC1140R3—423-B8SEQIDNO66>AMX(423)_C8ARC1140R3—423-C8SEQIDNO67>AMX(423)—D8ARC1140R3—423-D8SEQIDNO68〉AMX(423)一E8ARC1140R3_423-E8taatacgactcactataggggtcgaFgcagtaagctagct_SEQIDNO69>AMX(423)_F8ARC1140R3—423-F8gctSEQIDNO70>AMX(423)_G8ARC1140R3—423-G8tSEQIDNO71>AMX(423)_H8ARC1140R3—423-H8tSEQIDNO72>AMX(423)_A9ARC1140R3_423-A9SEQIDNO73〉AMX(423)一B9ARC1140R3一423-B9SEQIDNO74>AMX(423)—C9ARC1140R3—423-C9丁SEQIDNO75>AMX(423)_D9ARC1140R3一423-D9AGCTSEQIDNO76>AMX(423)—F9ARC1140R3一423-F9SEQIDNO77〉AMX(423)一H9ARC1140R3—423-H9SEQIDNO78>AMX(423)—A10ARC1140R3—423-A10CTSEQIDNO79〉AMX(423)一B10ARC1140R3—423-B10SEQIDNO80>AMX(423)_C10ARC1140R3—423-C10SEQIDNO81>AMX(423)—D10ARC1140R3—423-D10AGCTAGCTSEQIDNO82>AMX(423)_E10ARC1140R3—423-E10TAATACGACTCACTATAGGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQIDNO83>AMX(423)_F10ARC1140R3_423-F10SEQIDNO84>AMX(423)_G10ARC1140R3_423-G10SBQIDNO85>AMX(423)_H10ARC1140R3—423-H10NAATNNGACTCACAANAGGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQIDNO86>AMX(423)_AllARC1140R3—423:A11CT:TAGCTSEQIDNO87>AMX(423)_B11ARC1140R3—423-BllTAATACQACTCACTATAGGGGAGGGACAGACACmGTAGACGT八ACCAGTTAAACCCGGGTCGATGCAGTAAGCTAGCTSEQIDNO88〉AMX(423)一C11ARC1140R3一423-C11TSEQIDNO89>AMX(423)_DllARC1140R3—423-DllAGCTSEQIDNO90〉雄X(423)一E11ARC1140R3一423-E11GCTSEQIDNO91〉AMX(423)一F11ARC1140R3一423-F11SEQIDNO92>AMX(423)_Gl1ARC1140R3—423-G11SEQIDNO93>AMX(423)_H11ARC1140R3—423-HllSEQIDNO94〉AMX(423)一A12ARC1140R3—423-A12SEQIDNO95〉AMX(423)一B12ARC1140R3—423-B12TAATACGACTCACTATAGGGGTGGGGAOGACCACTTAGATAACGTCACCGGTTAAACCCGGG丁CGATGCAGTAAGCTAGCTSEQIDNO96>AMX(423)—C12ARC1140R3—423-C12SEQIDNO97>AMX(423)—E12ARC1140R3_423-E12TSEQIDNO98>AMX(423)_F12ARC1140R3—423-F12SEQIDNO99>AMX(423)_G12ARC1140R3—423-G12AGCT实施例2:末端区域指凄t级富集的配体系统进化^支术(TR-SELEXTM)识别的整合文库的先导序歹'J从使用如实施例1所述的末端区域指数级富集的配体系统进化二技术(TR-SELEXTM)识别的高2'」修饰转录产物产生的克隆抹中识别的5'-先导序列成分(退化区域的头IO个核苷酸)被用来i殳计文库，该文库将先导序列成分并入5'-固定区域，乂人而实现促进2'-修饰的核苷转录产物产量的目标。在一个实施方案中，i殳计策略并入识别克隆才朱(包4舌5'固定区域的4个鸟噤p令加上退化区域的头IO个核苷酸)的头14个核苦酸作为5'-先导序列，随后加入6到8个固定的核普酸/人而促进随后的PCR扩增，随后紧*接着是一种长度在30-40个核苷酸之间的退化区域，随后紧接着是一种3'-固定区域，从而进一步促进随后的PCR扩增。设计并入识别的先导序列成分的文库的DNA序列的实施例如下所示。对于下面列出的DNA4争录才莫^反文库的序列，带下划线的表示的是5'-先导序列成分，且所有的序列都是以5'-3'方向表示的。AJRC2118(SEQIDN03)CTAGCATCGATGARC2119(SEQIDN04)CTAGCATCGATGARC2120(SEQIDNO5)CTAGCATCGATGARC2121(SEQIDN06)CTAGCATCGATG一种参照的没有并入先导序列的DNA转录才莫纟反如下所示，且所有的序列都是以5'-3'方向表示的。NNNNTNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG(ARC2117,SEQIDNO106)为了检验新设计的文库是否能够促进包含2，-0-甲基核苷酸转录产物产量的增加，4吏用两个不同^f务饰的T7RNA聚合酶，Y639F/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶和Y639L/H784A/K378R突变体聚合酶转录该文库，进行对比(使用不包括聚合酶的转录反应混合物作为阴性对照)，在包含200nM才莫板、IX转录纟爰沖液(HEPES200mM、二碌u苏泮唐醇40mM、亚精^2mM、TritonX-1000.01%)、2'画OMe三石舞酸&艮苦、三磷酸胞苷、三磷酸尿苷、三磷酸鸟苷、每个都是1mM、2，-0H三石岸酸鸟苦30^M、MgCl26.5mM、MnCl22mM、聚乙二醇-8000w/v10%、1mM鸟。票呤核苦酸、Y639F/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶或Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶200nM、无机焦磷酸酶5单位每mL的转录混合物中，在37。C条件下过夜。通过聚丙烯酰胺凝胶分析使用200pL反应混合物试验每种条件下产生的转录产物产量，使用ImageQuant5.2版软件(分子动力学)从聚丙烯酰胺凝胶分析的紫外阴影中测定每种条件下的转录产物产量。图4总结了聚丙烯酰胺凝月交分析的测定结果，图4显示Y639F/H784A/K378R("FAR")和Y639L/H784A/K378R("LAR")突变体T7RNA聚合酶的转录产物产量相对于没有聚合酶的阴性对照的转录产物产量呈佶H增加。如图4所示，当佳:用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶来转录并入新文库的新型先导序列成分时，与Y639F/H784A/K378R突变体聚合酶相比，可以观察到产量显著改进的包含2'-OMe转录产物。值得注意地是，当结合Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶时，与结合Y639F/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶相比，ARC2118、ARC2119、ARC2120能够得到相当高的包含2，-OMe转录产物产量。通过使用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶得到的增加的转录产物产量还可以^使用ARC2117得到，ARC2117是一种之前设计的文库，该文库缺少新识别的先导序列成分，ARC2117已知能够与Y639F/H794A/K378R突变体聚合酶在给定的条件下转录，作为参照物。这些结果表示，与使用Y639F/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶相比，使用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶可以增加包含2'-OMe-转录产物的产量。另外，当使用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶时，通过末端区域指凄t级富集的配体系统进化4支术(TR-SELEXtm)识别的并入一些新文库(ARC2118和ARC2119)的先导序列成分也能获得比参照文库ARC2117更高的包含2，-OMe转录产物的产量，这一结果表示利用Y639L/H784A/K378R突变体与本发明特定的新识别的先导序列结合能够获得改进产量的包含2'-OMe的專争录产物。实施例3:聚合酶表达和纯化在本发明方法中使用的突变体T7RNA聚合酶可以按照如下方法制备。对T7RNA聚合酶(分别在图5A和5B中表示的一亥卧复和氨基酸序列，且在Bull,JJetal.，丄Mol.Evol,57(3),241-248(2003)中进行了描述)进行突变产生LA突变体(Y639L/H784A)、LAR突变体(Y639L/H784A/K378R)、LLA突变体(P266L/Y639L/H784A)或LLAR突变体(P266L/Y639L/H784A/K378R)。T7RNA聚合酶可能被包括在一种表达载体中(T7RNA聚合酶表达载体的实施例在美国专利系列第5,869,320号中进行了描述，该专利通过引证在此全部并入本文)或者可以在突变形成之后被插入表达载体中。突变的T7RNA聚合酶可以被设计成任选地包括His-tag用于简化蛋白质纯化。87可以合成在639位点包括亮氨酸突变体的补充的寡聚核香酸(agtcatgacgctggctCTGgggtccaaagagttcg(SEQIDNO107)和gaactotttggacccCAGagccagcgtoa^act(SEQIDNO108))。可以合成用于P226突变体的补充的寡聚核苷酸序列(ggctggcatctctcTgatgttccaaccttgc(SEQIDNO109)和gcaaggttggaacatcAgagagatgccagcc(SEQIDNO110)。可以合成用于H784A突变体的补充的寡聚核苷酸序歹ll(cgctcctaactttgtaGCcagccaagacggtagc(SEQIDNOlll)和gctaccgtc%gctgGCtacaaagttaggagcg(SEQIDNO112))。可以合成用于K378R突变体的^卜充的寡聚冲亥苦酸序列(gctcteaccgcgtggaGacgtgctgccgctgct(SEQIDNO113)和agcagcggcagcacgOccacgcgg^agagc(SEQIDNO114))。使用QuikChange⑧定位突变试剂盒(Stratagene,LaJolla,CA)才艮据厂家提供了使用说明进行定点突变，产生编码具有上述指明的突变体结合的突变体聚合酶。所得的编码本发明突变体聚合酶的核酸序列可以4吏用标准一支术插入所需的表达载体中，用于表达和纯化。表达和纯化包括突变体T7聚合酶核酸序列的表达载体被转入BL21(DE3)感受态细胞(Stratagene,CA)中，并在水中培养20分钟。通过将试管在42。C下放置两小时进行热冲击。在冰中放置1分钟之后，假如1mlL液体培养基("LB")在37。C下摇床培养45分钟。ioo液体培养基被放置在LB+Amp琼脂平面上在37。C下培养过夜。从过夜i咅养的平氺反中才妄种单一菌落进入100mlLB-Amp+培养基中(150jag/ml)，37。C下培养过夜。第二天，准备两个4升的容量^f瓦，其中包含2升预先加热的LB+Amp，向此容量并瓦中倒入50ml过夜培养基，在37。C下生长知道OD600值达到0.6-0.8之间。向每2L最后浓度为100^M的细胞培养基中加入200pl的IMPTG,在37。C下另外培养3小时。通过在5000rpm条件下S走转IO分钟，将细胞制成丸状。将细胞重新悬浮在200ml溶菌緩冲液(溶菌緩冲液50mMTris-Cl,pH值为8.0,100mMNaCl,5%甘油，1mM咪唑、25危基乙醇("BME")5mM)中，然后分装到6个圓锥形的50ml的试管中。在功率大小8的条件下超声处理细胞每个试管30分钟，处理3次，然后在11,000rpm条件下旋转60分钟将细胞石f片旋下，用0.22nM过滤器过滤上清液。向滤液中添加咪唑直至最后浓度为10mM。用样品泵将所得滤液装入一种5mlNi-NTA柱(GE医疗生物科学，NJ)。该柱使用IO倍柱容积(CV)的包含20mM咪唑的緩沖液A(緩冲液A:50mMTris-Cl、pH值为8.0、100mMNaCl、5%甘油、10mM咪哇、2巯基乙醇10mM)浸湿。然后用10倍柱容积的纟爰沖液润湿该柱，所述緩沖液是包括咪哇线性梯度浓度从40mM变化倒70mM的緩沖液A。用6倍柱容积的緩冲液B(緩沖液B:50mMTris-Cl、pH值为8.0、100mMNaCl、5%甘油、250mM。米"坐、2梦u基乙醇10mM)洗^是蛋白质。在对收集部分的5pl样品用4-12%的聚丙烯酰胺凝月交电泳枱、睑之后，在1L透析纟爰沖液(透神斤緩沖液50mMTris-Cl、pH^直为7.9、100mMNaCl、50%甘油、0.1mM乙二胺四乙酸、0.1%TritonX-100、23危基乙醇10mM)中过夜结合并透析(透析试管光谱范围/por分子多孔膜(VWR)MWCO:12-14000)所有关心的方面。在12小时之后文变透对斤緩沖液，另外进行4小时透析。使用布拉福德试验测定T7RNA聚合酶的浓度，如文献Bradford,M.M.(1976)Anal.Biochem.72,248.中所述。实施例4:整合入100%2'-O-甲基核苷的转录作用实施例4A:不存在2'-OH三磷酸鸟芬的2'-O-甲基转录作用使用2，-OH三磷酸鸟苷滴定法进行实验检验Y639L/H784A/K378R突变体聚合酶X于于2'-OH三石粦酸鸟普浓度的壽文感性。ARC2118和ARC2119，两个通过末端区域指数级富集的配体系统进化4支术(TR-SELEXTM)(在实施例1中描述的)识别的整合文库的新先导序列成分被用来检验Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶的转录产物对2，-OH三-粦酸鸟苷浓度的壽丈感性。所述新先导序列成分当与Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶一起使用时，显示出高的转录产物产量(参见实施例2)。使用2，-OH三磷酸鸟香(0-160uM)滴定法与IX转录緩冲液(HEPES200mM、二石克苏糖醇40mM、亚精胺2mM、TritonX-1000.01%)、-200nM才莫4反、2，-OMe三磷酸腺苦、三石粦酸l包苷、三石粦酸尿苷、和三石粦酸鸟苦各lmM，MgCl26.5mM、MnCl22mM、10%w/v聚乙二醇-8000、1mM鸟。票呤核苷酸、无机焦磷酸酶5单位每1mL,Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶200nM，进行转录作用，在37。C条件下过夜。通过聚丙烯酰胺凝胶分析^使用200jiL反应混合物试验每种条件下产生的转录产物产量，使用ImageQuant5.2版软件(分子动力学)从聚丙烯酰胺凝胶分析的紫外阴影中测定每种条件下的转录产物产量。图4总结了聚丙烯酰胺凝胶分析的测定结果，图4显示了每种条件下转录产物产量与参照产量相比呈倍数的增加。如图7所示，用Y639L/H784A/K378R在所有条件下转录ARC2118和ARC2119,且条件中不包括2'-OH三磷酸鸟苦，将在没有2'-OH三磷酸鸟苷的情况下的产量与2'-OH三磷酸鸟苷被包括在反应混合物种的转录作用产量相比4交。这些结果表明Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶用于增加转录产物产量时，不需要2'-OH三磷酸鸟苷的存在，这一点与Y639F/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶相反，Y639F/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶需要2'-OH三磷酸鸟苷用于转录作用(数据没有显示)。随后进4亍一种实马全来确定当用于Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶结合通过末端区域指数级富集的配体系统进化技术(TR-SELEX)(在实施例1中描述的)识别的先导序列时的最佳转录作用条件。ARC2119,整合入一种文库的新型先导序列成分被用来才全-验不同2'-OMeNTP、镁和锰浓度对转录产物产量的影响，其中，所述先导序列成分是通过末端区域指数级富集的配体系统进化技术(TR-SELEXTM)识别的，在与Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶一起使用时显示相当高的转录产物产量(参见实施例2)。使用IX转录緩冲液(HEPES200mM、二;e克苏糖醇40mM、亚精胺2mM、TritonX-1000.01%)、-200nM模板、2'-OMe三磷酸腺苷、三^粦酸"包苷、三^粦酸尿苷、和三磷酸鸟苷(分别为0.5mM、1mM、1.5mM、和2mM)，MgCl2(分另'J为5mM、6.5mM、8mM、和9.5mM)，MnCl2(1.5mM、2mM、2.5mM、3mM)，10%w/v聚乙二醇-8000,1mM鸟嘌p令核苦酸、无机焦磷酸酶5单位每1mL，Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶200nM进行转录作用，在37。C条件下过夜。91通过聚丙烯酰胺凝胶分析使用200jaL反应混合物试-睑每种条件下产生的转录产物产量，4吏用ImageQuant5.2版專欠件(分子动力学)从聚丙烯酰胺凝胶分析的紫外阴影中测定每种条件下的转录产物产量。图8总结了聚丙烯酰胺凝月交分析的测定结果，图4显示了每种条件下转录产物产量与参照产量相比呈倍数的增加。根据2'-OMeNTP的成本和本实验的实验结果，确定每种2'-OMeNTP为1.5mM(和8mMMgCl2、2.5mMMnCl2)为优选条件，该条件与先导序列和本发明的Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶一起4吏用。实施例4B:使用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶进行MNA转录作用的精确度和偏差进行其他的实验来评估使用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶和非2'-OH三磷酸鸟苷的MNA转录作用的精确度和偏差。为了^r-险;晴确度，通过PCR方法扩增由末端区域指凄t级富集的配体系统进化4支术(TR-SELEX)(在实施例1中描述的)识别的单一克隆序列，并用于i殳计4吏用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶和非2，-OH三磷酸鸟苷的MNA转录作用，用聚丙烯酰胺纯^:,剩下的DNA才莫寺反用RQ1脱氧核糖核酸酶消化(然后通过PCR反应验证DNA模板的缺失)，^l寻寿争录所4寻才才泮+进4亍逆寿争录(Thermoscript,Invitrogen，Carlsbad,CA)然后用PCR方法扩增。对PCR产物进行测序，然后计算缺失、插入和耳又代作用的统计凄t值。在本实—验的1300个石咸基序列中，没有观察到缺失和插入，观察到了三个取代作用(参见图9)。这些数目说明，在30个核苷酸退化区域之内编码的序列信息具有93%的机会能被如实地传输到下一轮的指数级富集的配体系统进化技术(SELEXtm)中，这一数值远远高于野生型RNA测得的数值。为了4企-验核普酸偏差，在以下条件下转录文库ARC2118:HEPES200mM、二石氣苏寿唐醇40mM、亚^青胺2mM、TritonX-1000.01%，画200nM才莫斧反、2,-OMe三磷酸腺苦、三磷酸胞苷、三磷酸尿苷、和三磷酸鸟苷各1mM(不包括2，-OH三石粦酸鸟普)，MgCl2(6.5mM)、MnCl2(2mM)、10%w/v聚乙二醇-8000、1mM鸟噤呤核苦酸、无机焦磷酸酶5单位每1mL，Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶200nM，在37。C条件下过夜，使用聚丙烯酰胺纯化，剩下的DNA才莫玲反用RQ1脱氧核糖核酸酶消化(然后通过PCR反应-验证DNA才莫板的缺失)，将转录所得材料进行逆转录，然后用PCR方法在克隆和测序之前进4亍扩增。对来自扩增文库中的484朱克隆体和来自起始文库中的484朱克隆体进4亍测序。4企—验在退化区i或核苷酸出现的统计数值，来观察是否存在偏差。如图10所示，转录作用之后核苦酸组合物的百分比与起始文库的核苷酸组合物百分比完全相似，而在起始文库核普酸组合物中，每种核苦酸(A泉噤呤核苦、胸腺嘧咬核苦、胞嘧，定核苷和鸟噤呤核苷)的百分比是近似相等的，这说明当Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶^皮用于转录作用时没有核苷酸发生偏差。实施例4C:使用各种各样的先导序列所得的转录产物产量的比较模板1到4为了比较使用带有许多不同的先导序列的Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶进行的转录产物产量，使用不同的恒定区i或合成在先导序列(在以下SEQIDNOs126到129的位点1到14)中包括不同嘌呤与嘧咬比率的4种模板。使用ABIEXPEDITE(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)DNA合成器合成DNA模板，并用标准方法脱蛋白。所述序列如下所示(以5'端到3'端的方向表示)模板lCATATGTGCGTCTACATGGATCCTCA(SEQIDNO126)模板2GGGAGAGCGGAAGCCGTGCTGGGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATAACCCAGAGGTCGATGGATC(SEQIDNO127)模板3GGGAGAGACAAGCTTGGGTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGAAGAGAAAGAGAAGTTAATTAAGGATCCTCAG(SEQIDNO128)模板4GGGAGAATTCCGACCACAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATATGTGCGTCTACATGGATCCTCA(SEQIDNO129)如下所示，分別使用其各自的引物扩增该模板模板1:5，引物TAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAGCTT(SEQIDNO130)3，引物TGAGGATCCATGTAGACGCACATATG(SEQIDNO131)模板2:5，primerTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCCGTGCTGGGGCC(SEQIDNO149)3'primerGATCCATCGACCTCTGGGTTATG(SEQIDNO132)模板3:5'引物TAATACGACTCACTATAGGGAGAGACAAGCTTGGGTC(SEQIDNO133)3'引物CTGAGGATCCTTAATTAACTTCTCTTTCTCTTCT(SEQIDNO134)模板4:5'引物TAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCACAAG(SEQIDNO135)3'引物TGAGGATCCATGTAGACGCACATATG(SEQIDNO148)该模板与T7RNA聚合酶(Y639L/H784A/K378R)一起被用于一种15ml的体外转录反应中。使用HEPES200mM、二石危苏泮唐醇40mM、亚斗青胺2mM、TritonX-1000.01%，10%聚乙二醇画8000、8mMMgCl2、2.5mMMnCl2、1.5mMmCTP、1.5mMmUTP、1.5mMmGTP、1.5mMmATP、1mM鸟苦酸、0.01unitsL无机焦磷酸酶、和9pg/mlT7聚合酶(Y639L/H784A/K378R)和0.2才莫板DNA进行转录反应。沉淀RNA,用10%的变性聚丙烯酰胺纯化。在300mMNaOAc,20mM乙二胺四乙酸中从凝月交中洗提RNA过夜，用紫外4义沉淀并测定。四种被检验的先导序列之间的产量差距不大，在下面表1A中表示出来。表1A序列库产量(nmoles)序列库l18.7序列库217.4序列库320.2序列库427.8模板5到8如上述对才莫4反1到4所述，测定了许多不同的先导序列的转录产物产量。使用不同的恒定区域合成4种模板。使用ABIEXPEDITE(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)DNA合成器合成DNA模板，并用标准方法脱蛋白。所述序列如下所示(以5'端到3'端的方向表示)模板5GGGCCTTGTAGCGTGCATTCTTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTAACATACTCCGAATCTGTCGAA(SEQIDNO138)模板6GGAGCCTTCCTCCGGANNNNNNNNNNNNNHNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCCGGTTTCCCGAGCTT(SEQIDNO139)模板7TTCGACAGGAGGCTCACAACAGGC(SEQIDNO140)模板8CTAGCATCGATG(SEQIDNO150)如下所示，分别使用其各自的引物扩增该模板模板55'引物TAATACGACTCACTATAGGGCCTTGTAGCGTGCATTCTTG(SEQIDNO151)3'引物TTCGACAGATTCGGAGTATGTTAG(SEQIDNO141)模板65'引物TAATACGACTCACTATAGGAGCCTTCCTCCGGA(SEQIDNO142)3'primerAAGCTCGGGAAACCGGA(SEQIDNO143)模板75'引物TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA(SEQIDNO144)3'pi'imerGCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA(SEQIDNO145)模板85'引物TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACCAGACAT(SEQEDNO146)3,引物CATCGATGCTAGTCGTAACGATCC(SEQIDNO147)该模板与T7RNA聚合酶(Y639L/H784A/K378R)一起被用于一种0.5ml的体外转录反应中。使用HEPES200mM、二石危苏糖醇40mM、亚精胺2mM、TritonX-1000.01%，10%聚乙二醇-8000、8mMMgCl2、2.5mMMnCl2、1.5mMmCTP、1.5mMmUTP、1.5mMmGTP、1.5mMmATP、1mM鸟香酸、0.01units/VL无机焦磷酸酶、和9pg/mlT7聚合酶(Y639L/H784A/K378R)和0.2|_iM模板DNA进行转录反应。沉淀RNA，用10%的变性聚丙烯酰胺纯化。用紫外吸收使凝胶上的RNA显形。四种祐:4企-验的先导序列之间的产量差^巨不大，在下面表1B中表示出来(给出了相对的转录产物产率)。表1A序列库产率(相对于序列库4)序列库180%序列库288%序列库3130%序列库4100%在特定的实施方案中，上面识别的模板本用于本发明的转录方法和/或适体筛选方法中。实施例4D:使用P266L/Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶进4亍的MNA转录作用使用一下DNA模板和引物来进行聚合酶链式反应，来生产一种双链转录模4反。N表示一种退化位点，且是ATGC中的任意一个的几率相同，所有的序列都是按照5'端到3'端的方向表示的PCR模板(ARC2118)TAATACGACTCAC窗AGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCGTTACGACTAGCATCGATG(SEQEDNO3)0020615'-引物AATAACGTTCTCG(SEQIDNO115)f002073，-引物CATCGATGCTAGTCGTAACG(SEQIDNO116)97然后使用所得的双链转录模板设计如下每个样品的200jxL转录混合物HEPES(200mM)、二A乾苏一唐醇(40mM)、亚精胺(2mM)、TritonX-100(0.01%)、MgC12(8mM)、MnC12(2.5mM)、聚乙二醇-8000(10%w/v)、1.5mM每种2'-OMeNTP，鸟香酸lmM,100-200nM砵i录才莫^反，无4几焦石岸酸酶(单位)，pH值为7.5，T7突变体聚合酶P266L/Y639L/H784A/K378R按如下所示进行稀释。在37度下培养转录混合物过夜(16h)。在培养之后，用异丙醇沉淀混合物，溶解所得球粒并使用变性聚丙烯酰胺(12.5%丙烯酰胺)在25W条件下测定60分钟。通过紫外阴影在260nm下目测并测定样品。表2转录产物产量酶酶浓度标准化MNA转录产量K378R/Y639L/H784A2.1(xg/ml100P266L/K378R/Y639L/H784A11fig/ml130P266L/K378R/Y639L/H784A2.6(xg/ml65P266L/K378R/Y639L/H784A0.66(ig/ml13P266L/K378R/Y639L/H784A0.16吗/ml8.3实施例5:使用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶进行的适体筛选4吏用包含2'-OMe嘌p令和嘧咬核苷酸的序列库(此后用"MNA，，表示)进行筛选作用从而识别对人Ang2(此后用"h-Ang2"表示)的适体。该筛选方法产生对h-Ang2具有特异性的高亲合性适体。人Ang2从R&DSystems,Inc.(Minneapolis,MN)公司购得。将T7RNA聚合酶(Y639L/H784A/K378R)按照实施例3中所述的方法进4亍表达和纯化。2，-OMe噤呤和嗜，定核苷卧复乂人TriLinlcBioTechnologies(SanDiego,CA)处购4寻。Ang2适体的筛选序列库制备使用ABIEXPEDITETM(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)DNA合成器合成具有序列5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTSNNNNNNGGATCGITACGACTAGCArCGArGARC2118(SEQIDN03)的DNA模板，然后使用标准方法去蛋白。使用引物(5'ATAACGTTCTCG國3，)(SEQIDNO118)和(5'-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCC-3，)(SEQIDNO119)扩增才莫4反，然后用这些模4反和T7RNA聚合酶(Y639L/H784A/K378R)体外转录。200mMHepes,40mM二碌u苏4唐醇，2mM亚津青胺，0.01%TritonX-100,10%PEG-8000，8mMMgCl2,2.5mM，MnCl2，1.5mMmCTP，1.5mMmUTP,1.5mMmGTP,1.5mMmATP,1mMGMP,0.01units/^L无才几焦石舞酸酶，和9jig/mLT7聚合酶(Y639L/H784A/K378R)和0.5模板DNA进行转录，产生ARC2118mRmY序列库。筛选在室温条件下，在最终浓度为100pL的筛选緩冲液(IXDulbecco's磷酸緩冲液(DPBS))中,将330pmole(2xlO"个分子)MNAARC2118序列库与100pmole蛋白一起培养1小时，开始筛选过程。使用0.45微米的硝化纤维旋转柱(SchleicherandSchuell，Keene，NH)分离RNA-蛋白复合物和未结合的RNA分子。用KOH预处理该旋转柱(在1mL0.5MKOH中浸泡柱膜，15minRT;旋干。将柱膜浸泡在1mldH20中15minRT;旋干)，用IX磷酸緩冲液2x1ml洗涤，然后，向柱中加入包含序列库Ang2复合物的溶液在1500rpm下离心2分钟。用500DPBS洗涤滤力莫两次，,人而除去非特异性结合体。加入2x100jaL洗涤緩冲液(7M尿素，100mM醋酸钠，3mM乙二胺四乙酸，预力p热到95°C)洗^是RNA,然后用乙醇;咒〉定。<吏用ThermoScriptRT-PCRTM系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)，按照厂家提供的使用说明反转录RNA,使用SEQIDNO119作为引物。用PCR#支术在Tag聚合酶(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)存在的情况下按照厂家提供的使用说明使用SEQIDNO118和SEQIDNO119扩增所得cDNA。如上所述转录模板制备序列库并在变性的聚丙烯酰胺凝胶中纯化。按照第一轮的方法进行第二轮。在进行第三到十二轮时，将h-Ang2固定在一种疏7jc板上。通过在室温条件下，在100jaLIXDPBS中4夸20pmolesh—Ang2固定在NuncMaxisorp疏水板表面上一'J、时来开始每轮筛选过程。用120|xLDPBS洗涤疏水板5次，然后与封闭緩沖液(IXDPBS，和0.1mg/mLBSA)—起培养一'J、时。然后除去上清液，用120|aLDPBS洗涤小孔5次。在室温条件下，在空孔中培养序列库RNA—'J、时，然后在之前已经用100封闭緩沖液封闭的小孔中培养一小时。从第三轮开始，在阳性篩选步骤之前，用100pL封闭緩沖液(IXPBS,0.1mg/mLtRNA,0.1mg/mLssDNA和O.lmg/mLBSA)在室温条件下封闭靶分子固定的小孔一小时。在所有情况下，通过加入反转录("RT")混合物(3，引物，SEQIDNO119，和ThermoscriptRT,Invitrogen，Carlsbad,CA))4寻结合固定-Ang2的序列库RNA在筛选板上直接反转录，随后在65。C下培养1小时。所得cDNA用作PCR(Taq聚合酶，NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)反应的才莫;〖反，4要照第一4仑的方法转录。每轮转录过程的条件在表3中列出表3筛选循环总结<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>MNA适体结合实马全在整个筛选过程中进行斑点印迹结合实-验来才企测序列库的蛋白结合亲和力。痕量32P-标记的序列库RNA与h-Ang2结合，在室温条件下DPBS緩冲液中培养30分钟使其终体积、为30jiL。在J赶点印迹i式'3全4义(Minifold-lDotBlot,Acrylic,SchleicherandSchuell,Keene，NH)中4吏用该〉'昆合物，该扭王点印迹试-睑4义中(从上到下)组装有硝化纤维膜、尼龙膜和凝"交斑点膜。与蛋白结合的RNA被硝'化纤维月莫捕获；而没有结合蛋白的RNA被尼龙膜所捕获。在第9轮开始，可以观察到h-Ang2结合富集作用。在第9、10和12轮，使用TOPOTA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)按照厂家给出的使用说明克隆所得序列库模板，选4奪26种独特的克隆林用于化学合成并确定其解离常数(KD)。简单地讲，合成的RNA是5'端带有y-32PATP标记的RNA,且使用斑点印迹杂交试一验和IXDPBS(w/Ca2+和Mg2+)(Gibco,Catalog#14040,Invitrogen,Carlsbad,CA)緩冲液条件确定其KD值。估计Ko值，使其数值满足下列等式RNA结合分数=振幅*(((适体浓度+[h-Ang2]+KD)-SQRT((适体浓度+[h-Ang2]+KD)2-4(适体浓度*[11-Ang2])))/(2*适体浓度))+背景值。结果在下面的表4中进行了报道。在26种独特的序列中，有8种序列具有相似的部分，这8种序列具有相似的结合和抑制活性。这些序列纟皮定义为家力矣1。家族II包括两种序列，这两种序列具有共同的部分，且具有相似的结合和抑制活性。MNA适体功能试-验酶连4妻免疫吸附剂测定试-验在酶连接免疫吸附剂测定试验中4企测一些适体，所述酶连接免疫吸附剂测定试验被建立用来测量适体干扰Ang2与Tie2受体结合的能力。为了捕获Tie2受体，将位于100的磷酸》爰沖液中的150ng的Tie2—Fc(R&Dsystems313—TI一100-CF,Minneapolis,MN)倒入96孑LMaxisorb平寺反(NUNC#446612,Rochester,NY)中，在4。C下培养过j复。在捕获过程中，将50不同浓度的合成RNA与503.6nM的Ang2(200ng/mL)(R&Dsystems,623-AN-025/CF,Minneapolis,MN)(在带有0.2%BSA的磷酸緩冲液中)相混合，使Ang2在带有0.1%BSA的磷酸緩冲102液中的最终浓度为1.8nM(100ng/ml)，在室温条Y牛下i咅养1小时。在过夜培养之后除去捕获溶液，用200pLTBST(25mMTris-HClpH值为7.5，150mMNaCl和0.01%吐温20)溶液洗涤平板3次。然后在室温条件下用200fiL包含5%脱脂干牛奶的TBST封闭平板30分钟。在封闭之后，再用200pLTBST在室温条件下洗涤平板三次，将合成的RNA:Ang2混合物加入平斧反在室温条件下培养1小时。然后用200jaLTBST洗涤三次，加入100jaL生物酰化的目标抗_Ang2抗体(1:1000;R&DSystemsBAF623，Minneapolis,MN),在室温条件下培养1小时。在用200jiLTBST洗涤三次之后，加入100HRP连才妄的链霉亲和素(1:200;R&Dsystems#DY998,Minneapolis,MN)在室温条件下i咅养半小时。然后再用200|uLTBST洗涤平4反三次，加入100TMP溶液(Pierce,#34028)，在黑暗中室温条件下培养5分钟。包含2NH2S04的lOO(iL溶液^皮加入来4f止反应，用SpectroMax在450nm下扫描平板。下面表4的最后一栏给出了结果。FACS试验人脐静脉内皮细胞("HUVEC")(ATCC)和K293细胞，一种过表达人Tie2受体的细胞系被用来确定特异性MNAAng2适体的IC50,所述适体能够抑制Ang2与Tie2受体在细胞膜上的结合。简单地说，重组哺乳动物表达载体pCDNA3.1-Tie2被转染入293细胞(ATCC,Manassas，VA)，且在用G418(Invitrogen,Carlsbad,CA)筛选之后获得稳定的克隆体。流式细胞计显示Tie2蛋白质在HUVEC和K293细月包上的表达。Ang2滴定试-险进一步确定对HUVEC和K293细胞进行适体抑制试验时Ang2的用量，所述用量分别是1pg/mL和0.1jig/mL。在流式细胞计结合试验中，在V型底96孑L板中将HUVEC和K293细胞(2xl05个纟田胞/孑L)制粒，然后重新悬浮103并在MNA适体/Ang2溶液中培养2小时。通过将不同剂量的适体(100nM、33.3nM、11.1nm、3.7nM、1.2nM、0.411nM、0.137nM、和0.0456nM)与Ang2—起在FACs緩冲液(包含1%BSA,0.2%叠氮化钠的磷酸緩冲液)中在冰上预培养30分制备适体/Ang2溶液。之后用FACs緩冲液洗涤3次，将细月包与生物素4匕的4元人Ang2#元体(5jag/mL;R&DSystems,Minneapolis,MN)—起培养30分钟，然后另外与链霉亲和素磷脂酰乙醇胺(PE)(1:10;BDBiosciences,SanJose,CA)—起i咅养30分4中。<吏用FACScan(BDBiosciences,SanJose，CA)完成FACS分才斤。戶斤得结果在下面表4中进行了才艮道。表4抗-Ang2MNA适体的结合和功能结果总结<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>实施例6:使用Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶进行的适体筛选为了"i只别只十人IgE(下碎尔"h-IgE")的适体，<吏用由2'-OMe嘌呤和嘧p定核香酸(下称"mRmY")组成的序列库进4亍一种筛选。该篩选过程产生对h-IgE特异性和高亲合性的适体。从AthensResearch&Technology(Cat.#_16-16-090705Athens,GA)处购得人IgE。4安照上述实施例3所描述的方法表达并纯化T7RNA聚合酶(Y639L/H784A/K378R)。2，-OMe"票呤和嘧咬核苦酸从TriLinkBioTechiiologies(SanDiego,CA)处购得。IgE适体筛选序列库制备使用ABIEXPEDITE(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)DNA合成器合成具有序列5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAGTACAATAACGTTCTCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTSNNNNNNGGATCGTrACGACTAGCATCGATGARC2118(SEQIDNO3)的DNA才莫寺反，然后4吏用标准方法去蛋白。-使用引物(5'ATAACGTTCTCG-3，)(SEQIDNO118)和(5'-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCC-3，)(SEQIDNO119)扩增才莫4反，然后用这些模板和T7RNA聚合酶(Y639L/H784A/K378R)体外转录。使用50mMHepes,10mM二石克苏糖醇，0.5mM亚砵奇胺，0.0025%TritonX-100，10%PEG-8000,8mMMgCl2,2.5mM,MnCl2,1.5mMmCTP，1.5mMmUTP，1.5mMmGTP,1.5mMmATP,1mMGMP，0.01units/(xL无才几焦石粦酸酶，和9jig/mLT7聚合酶(Y639L/H784A/K378R)和0.3(iM才莫板DNA进4亍4t录，产生ARC2118MNA序列库。筛选在室温条件下，在最终浓度为100jaL的筛选緩冲液(IXDulbecco's磷酸緩沖液(DPBS))中，将330pmole(2x1014个分子)MNAARC2118序列库与24pmole与BSA封闭的疏水氺反(Maxisorpplate,Nunc,Rochester,NY)结合的蛋白一起i咅养1小时，开始篩选过禾呈。用120(iLDPBS洗涤小孑L四次，除去未非净争异性结合体，<吏用ThermoScriptRT-PCRTM系统(Invitrogen,Carlsbad,CA),按照厂家提供的使用说明洗提并反转录RNA，使用SEQIDNO119作为引物。用PCR技术在Tag聚合酶(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)存在的情况下按照厂家才是供的使用说明使用SEQIDNO118和SEQIDNO119扩增所得cDNA。如上所述转录模板制备序列库并在变性的聚丙烯酰胺凝胶中纯化。所有循环进行过程中，h-IgE固定在疏水平板上。通过在室温条件下，在IOOpLIXDPBS中将24pmolesh-IgE固定在NuncMaxisorp疏水4反表面上一小时来开始每4仑筛选过程。用120jaLDPBS洗涤疏水4反4次，然后与封闭i爰沖液(IXDPBS，和0.1mg/mLBSA)—起培养一小时。然后除去上清液，用120DPBS洗涤小孔4次。在第二轮开始，序列库RNA在室温条件下在空孔中培养l小时，然后在之前已经用IOOjaL封闭緩冲液封闭的小孔中培养一,J、时。,人第二寿仑开始，向阳性筛选步驶《中添加非特异性竟争剂(O.lmg/mLtRNA,和O.lmg/mLssDNA)。在所有情况下，通过加入反转录("RT")混合物(3'引物，SEQIDNO119,和ThermoscriptRT,Invitrogen,Carlsbad,CA))习寻结合固定的h-IgE的序列库RNA在筛选板上直接反转录，随后在65°C下培养1小时。所得cDNA用作PCR(Taq聚合酶，NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)反应的模板，按照第一轮的方法转录。每轮转录过程的条件在表5中列出。表5循环总结循环数序列库(nM)平台阴性緩沖液竟争剂洗涂靶分子13300平板无IXDPBS无4x120nL24pmoles2500平板疏水板；BSA板IXDPBSO.lmg/mLtRNAO.lmg/mLssDNA4x12024pmoles31000平板疏水板；BSA板IXDPBS0.1mg/mLtRNAO.lmg/mLssDNA4x12024pmoles4薩平板疏水板；BSA板IXDPBSO.lmg/mLtRNAO.lmg/mLssDNA4x12024pmoles107<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>MNA适体结合试-验在整个篩选过程中进行斑点印迹结合实验来检测序列库的蛋白结合亲和力。痕量32-标记的序列库RNA与h-IgE结合，在室温条件下DPBS緩沖液中培养30分钟使其终体积为30(aL。在J赶点印迹i式马全4义(Minifold-1DotBlot,Acrylic,SchleicherandSchuell,Keene，NH)中4吏用该混合物，该斑点印迹试驺M义中(从上到下)组装有硝化纤维膜、尼龙膜和凝胶斑点膜。与蛋白结合的RNA被硝化纤维膜捕获；而没有结合蛋白的RNA被尼龙膜所捕获。在第8,轮开始，可以观察到h-IgE结合富集作用。在第5、8和12寿仑，-使用TOPOTA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad:CA)按照厂家给出的使用说明克隆所得序列库模板。顺序测定数据显示第8轮序列库集中于包括59%序列总数的单一主要克隆柱。选择这种主要克隆林和三个可能的最小株用于化学合成和电离常数(KD)确定。简单的说，合成的RNA是5'端带有y-32PATP标记的RNA,且4吏用斑点印迹杂交试-验和IXDPBS(w/Ca2+和Mg2+)(Gibco,Catalog#14040，Invitrogen,Carlsbad,CA)纟爰沖液条件确定其KD值。估计KD值，使其数值满足下列等式RNA结合分数=振幅*(((适体浓度+[h-IgE]+KD)-SQRT((适体浓度+[h_IgE]+KD)2-4(适体浓度承[h-IgE])))/(2*适体浓度))+背景值。主要克隆林的KD值大约是800pM.最佳结合最小抹，也被用来监测结合猴子IgE(m-IgE)，但没有显示可交叉反应的结合猴子IgE蛋白质。这种交叉反应性的缺乏还可以通过酶4关免疫吸附测定确i人。在3'末端带有转化的dT的最小4朱^皮用作药物化学过程的母体分子。药物4b学改变一种IgE特异性MNA最小抹(图11)的^f匕学成分从而改进亲合性和效力同时维持化合物的等离子体稳定性。这一过程包括设计、合成并评价一系列最小化IgE适体衍生物，其饰作用，从而确定哪个残基能够忍受取代作用。第一类修饰作用是分别对于独特的2，-OMe核苦的脱氧核苷取代作用。在修饰作用的单独循环中，合成一系列衍生物，其中每种衍生物包括在不同的核苷内部连4妄体位置的单一石危代磷酸〗多饰作用。在修饰作用最初阶段产生的数据用来确定最小化适体的结构活性关系(SAR)。在〗务饰作用随后的步骤中，合成适体并用^f又代作用的组合检验，其中所述取代作用事根据最初的结构活性关系数据设计的。从组合取代作用的小组中识别一种3带有两个2'-OMe到2'-脱氧取代作用的9个核苷长度的适体，该适体被引入其组合物中。另外，识别出所得修饰的带有两个2，-OMe到2'-脱氧取代作用和四个磷酸酯到硫代磷酸酯取代作用的最小化适体，该最小化适体被引入其组合物中。如图12所示，这种脱氧/石危代磷酸酯^f奮饰的适体与最小化〗旦未经》务饰的母适体及带有两个2'-OMe到2'-脱氧取代作用的母体最小化适体相比，显示出增加的结合亲合性。血清稳定性对最小化的未修饰母体和脱氧/硫代磷酸酯修饰的适体进行实现确定他们在人血清、小鼠血清和猴血清内的稳定性。将每种适体加入到1ml的血清中，直到在90%的血清中最终浓度为5(iM。在37。C下摇床培养该适体，在第0、0.5、1、4、24、48、72、98小时时间点耳又出。在每个时间点，乂人i咅养才羊品中取出90nL样品，力口入到100.5M的乙二胺四乙酸中，在-20。C下冷冻，为之后的使用BIACORE2000系统进行稳定性分析,文准备。使用装备有研究级CM5生物传感器芯片(BIACOREInc.,Piscataway,NJ)的BIACORE2000在25°C下进4亍生物每文感结合测定。使用自动耦合化学法将纯化的重组人IgE(AthensResearch&Technology,Athens,GA)固定在生物4专感器表面。为了达到这一目的，首先^f吏用按比例为1:1混合的0.1MNHS(N-羟基丁二酰亚胺)和0.4MEDC(3-(N，N二曱胺)丙基—N-乙基碳二亚胺)活化两股流动的细胞表面7分钟，流速为5jal/min。在表面活化之后，一股流动细l包以10jil/min的速率注入50pl/ml的IgE中20分钟，从而允许活化的表面之间建立共价连接键。下一步，将1M盐酸氨基乙醇在pH值为8.5的条件下以5jxl/min的速度注入，-使剩余的酯4建失活。对于用作空白参照的细胞流，在没有蛋白注入的情况下，将lM盐酸氨基乙醇在pH值为8,5的条件下以5jal/min的速度注入，使剩余的酯4建失活。在分析所有的时间点之前，在制得的芯片上运行一组适体标准品，产生标准曲线。为了建立标准曲线，将适体逐《及稀释(乂人200nM到12.5nM)到HBS1￡沖液(10mMHEPESpH值为7.4，150mMNaCl,0.005%表面活性剂20)中，并补充4%的人血清和50mM乙二胺四乙S菱。将所有稀释的才羊品以20(il/min的速度注入Biacore2000中，结合五分钟并等4寺3分4中。为了再生该芯片，以30)ul/min的速度注入1NNaCl60秒。在结合过程结尾，绘制RU峰值反应对适体浓度的曲线，使用四元逻辑函数制备标准曲线。为了测定人血清、小鼠血清和猴血清中活性适体浓度，将不同时间点的样品在HBS-P中稀释22.5倍，使血清在注入Biacore2000之前的最终浓度为4%。通过使用上述产生的标准曲线将RU反应单元转化成浓度，可以计算出在血清培养时期内功能性适体的浓度。做为另外的质量控制测定，在实验结束时分别检测两种适体标准品，确保BIACORE-测得的浓度与标准的偏差小于20%。最小化的未j奮饰母体和脱氧/好u代-畴酸酯修饰的适体被确定在人血清、小鼠血清和猴血清中培养98小时后，有大于90%的活性。这里通过书面说明和实施例对本发明进行了描述，本领域普通技术人员应该寿义认，本发明可以以多种实施方式来实践，上述说明书和实施例只起到解释i兌明的目的，并不是对所附权利要求书的限制。m权利要求1.一种分离的T7RNA聚合酶，在639位点和784位点包括一种改变的氨基酸，其中，当在784位点的改变的氨基酸是丙氨酸时，在639位点的改变的氨基酸不是苯基丙氨酸。2.根据权利要求1所述的分离的T7RNA聚合酶，在378位点进一步包4舌一种改变的氨基酸。3.根据上述任意一项权利要求所述的分离的T7RNA聚合酶，在266位点进一步包括一种改变的氨基酸。4.根据上述任意一项权利要求所述的分离的T7RNA聚合酶，其中，在639位点的改变的氨基酸是亮氨酸，在784位点的改变的氨基酸是丙氨酸。5.根据上述任意一项权利要求所述的分离的T7RNA聚合酶，其中，在266位点的改变的氨基酸是亮氨酸。6.根据上述任意一项权利要求所述的分离的T7RNA聚合酶，其中，在378位点的改变的氨基酸是精氨酸。7.根据上述任意一项权利要求所述的分离的T7RNA聚合酶，其中，改变的氨基酸增加了由聚合酶在包括2'-OMe修饰核苦三》舞酸的转录反应中产生的包4舌2'-OMe》务饰作用的核酸的转录产量。8.根据权利要求8所述的分离的T7RNA聚合酶，其中，当转录作用在同一个转录条件下进行时，转录产量的增加与缺乏改变的氨基酸的T7RNA聚合酶有关。9.才艮据上述任意一项权利要求所迷的分离的T7RNA聚合酶，其中，改变的氨基酸减弱对2，-OMe核香三磷酸的识别能力。10.根据权利要求9所述的分离的T7RNA聚合酶，其中减弱的对2'-OMe核苷三磷酸的识别能力与缺乏改变的氨基酸的T7RNA聚合酶有关。11.根据权利要求8或10所述的分离的T7RNA聚合酶，其中，缺乏改变的氨基酸的T7RNA聚合酶是一种野生型T7RNA聚合酶，该野生型聚合酶在639位点上的氨基酸变为苯基丙氨酸且在784位点上的氨基酸改变为丙氨酸。12.—种分离的多肽，包括选自由SEQIDNO1,SEQIDNO2,SEQIDNO102和SEQIDNO103所组成的组的氨基酸。13.—种转录单链核酸的方法，包^"将前述任意一项4又利要求所述的聚合酶与一种模板核酸在足够产生转录作用的反应条件下一起培养。14.一种分离的冲亥酸，该#盡卧臾编石马前述<壬意一项斥又利要求所述的多肽。15.—种分离的核酸序列，选自由SEQIDNO122，SEQIDNO123,SEQIDNO124和SEQEDNO125所纟且成的纟且中。16.—种载体，包括权利要求14或15所述的分离的核酸序列。17.—种表达载体，包括与一种启动子可操作地连4妾的4又利要求14或15所述的分离的核酸。18.—种细胞，包括权利要求17所述的表达载体。19.根据权利要求18所述的细胞，其中突变体T7RNA聚合酶被该细胞表达。20.—种试剂盒，包括一种容器，该容器包括根据上述任意一项权利要求所述的T7RNA聚合酶。21.—种试剂盒，包括一种容器，该容器包括一种核酸，该核酸编码上述任意一项权利要求所述的T7RNA聚合酶。22.—种转录全2'-OMe核酸的方法，包括以下步骤a)在包括突变体RNA聚合酶、核酸转录一莫纟反和核苷三-粦酸的反应混合物中培养模板核酸，其中，核苷三磷酸是2'-OMe的，和b)转录该转录反应混合物足够的时间乂人而产生一种单链核酸，其中，该单链核酸中的所有核苷都是2，-OMe1"多饰的，除了转录产物的第一核苷可以是2，未修饰的。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述突变体RNA聚合酶是包括在639位点和784位点具有改变的氨基酸的突变体T7RNA聚合酶。24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述突变体RNA聚合酶是前述权利要求1到12中任意一项所述的突变体T7RNA聚合酶。25.根据权利要求22到24中任意一项所述的方法，其中，转录反应进一步包括镁离子。26.根据权利要求22到25中任意一项所述的方法，其中，转录反应进一步包招^孟离子。27.根据权利要求22到26中任意一项所述的方法，其中，转录反应进一步包括一种非2，-OMe鸟噤，冷非-三磷酸残基。28.根据权利要求22到27中任意一项所述的方法，其中，转录才莫4反包4舌一种T7RNA聚合酶启动子。29.根据权利要求22到28中任意一项所述的方法，其中，镁离子在转录反应中存在的浓度比锰离子大3.0-3.5倍。30.根据权利要求22到29中任意一项所述的方法，其中，每种核苷三石岸酸在转录反应中存在的浓度为1.0mM，4美离子在转录反应中存在的浓度是6.5mM,4孟离子在转录反应中存在的;农度是2.0mM。31.根据权利要求22到30中任意一项所述的方法，其中，每种核苷三石寿酸在转录反应中存在的浓度为1.5mM，4美离子在转录反应中存在的浓度是8mM,锰离子在转录反应中存在的浓度是2.5mM。32.根据权利要求22到31中任意一项所述的方法，其中，每种核苷三磷酸在转录反应中存在的浓度为2.0mM，镁离子在转录反应中存在的浓度是9.5mM,锰离子在转录反应中存在的浓度是3.0mM。33.根据权利要求22到32中任意一项所述的方法，其中，转录反应进一步包括聚乙二醇。34.根据权利要求22到33中任意一项所述的方法，其中，其中，所述非2'-OMe鸟噤呤非三石粦酸残基选自由鸟。票呤一磷酸盐、鸟噤呤二磷酸盐、2，氟代鸟噤呤一磷酸盐、2，氟代鸟噪呤二磷酸盐、2，氨基鸟嘌呤一磷酸盐、2，氨基鸟嘌呤二磷酸盐、2'脱氧鸟噤呤一-寿酸盐和2，脱氧鸟嘌呤二^粦酸盐。35.根据权利要求22到34中任意一项所述的方法，其中转录反应包括无才几焦磷酸酶。36.—种识别适体的方法，包括a)制备一种包括权利要求1到12中任意一项所述的突变体聚合酶和一种或一种以上核酸转录模板的转录反应混合物；b)转录该转录反应混合物从而得到单链核酸的候选混合物，其中，除了一个单链核酸的核苦之外，单链核酸上的所有核普都是2，修饰的，c)将候选混合物与耙分子相接触，d)相对于候选混合物的亲合性，乂人候选混合物中分离对把分子具有增加的亲合性的核酸，和e)扩增具有增加的亲合性的核酸乂人而产生一种富集适体的混合物，因此，识别包括除了适体第一核苦可以是2，-未修饰的之外全2，-修饰核苷的对于靶分子的适体。37.根据权利要求36所述的方法，其中该扩增步骤包括i)从靶分子中任选的分离具有增加的亲合性的核酸，ii)从核酸-靶分子复合物中反转录具有增加的亲合性的核酸，iii)扩增反转录的具有增加的亲合性的核酸；和(ii)制备包括扩增所;彈的反转录的具有增加的亲合性的核酸的转录混合物，作为转录过程的模板，转录该转录混合物。38.根据权利要求36到37中任意一项所述的方法，其中，转录反应中所有的核苷三磷酸都是2，-OMe修饰的。39.根据权利要求36到38中任意一项所述的方法，其中，一种或一种以上的核酸转录才莫板包4舌一种T7RNA聚合酶启动子和一种直接对于T7RNA聚合酶启动子3，端的先导序列。40.根据权利要求37到39中任意一项所述的方法，包括不断地重复步骤a)到e)。41.识别用于4是高转录作用的核酸才莫4反组成序列的方法，该方法包括a)制备转录模板候选物文库，其中，该模板包括一种启动子，一种接近启动子3，端的第一固定区域，一种接近第一固定区域3，端的退化区域和4妾近退化区i或的第二固定区域；b)在转录反应中转录该转录才莫^反候选物文库，乂人而得到具有一定转录产量的转录混合物；c)反转录该转录混合物/人而4寻到一种cDNA的4矣选混合物，其中，该cDNA才莫板包括一种5，和3'末端；d)在连接反应中将编码启动子的DNA序列与cDNA模板的3'末端相连；e)扩增cDNA才莫板从而产生一种转录模板候选物文库；和f)从转录模板候选物文库中识别核酸序列组分，乂人而4是高转录作用，其中，该核酸序列组分包4舌一种书f生自至少一部分退化区域的序列。42.根据权利要求45所述的方法，其中，步骤f)包4舌以下步骤i)将转录模板候选物文库克隆入单独的转录模板中；ii)在转录反应中转录单独的转录模板从而产生一定的转录产物产量；iii)评估单独的转录^^莫板的转录产物产量；和iv)在转录模板中识别能够产生预先希望的转录产物产量的核酸序列组分。43.根据权利要求42所述的方法，其中预先希望的转录产物产量是比步骤b)中通过转录该转录模板候选混合物所获得的转录产物产量更高的产量。44.根据权利要求41所述的方法，其中步骤f)包括分析转录模氺反候选物文库退化区域的石咸基组合物，和根据转录才莫4反候选物文库的平均碱基组合物识别核酸序列组分。45.根据权利要求41到44中任意一项所述的方法，其中，步骤b)进一步包4舌用DNase处理转录的转录产物。46.根据权利要求41到45中任意一项所述的方法，其中步骤进一步包括通过将转录的转录产物模板从转录反应的其他组分中分离出来，来纯化转录的转录产物混合物。47.根据权利要求46所述的方法，其中，纯化步骤包括将转录反应纟爰沖液改为<吏转录反应运4于穿过脱盐柱。48.才艮据权利要求41到47中任意一项所述的方法，本方法的步骤d)在步-骤c)之前完成。49.根据权利要求41到47中任意一项所述的方法，其中，连接反应是一种夹板连接反应，且该连接反应包括一种核酸夹4反和一种编码启动子的5'-单磷酸化的寡聚核苷酸。50.根据权利要求41到49中任意一项所述的方法，进一步包括在进行步骤f)之前重复步骤b)到步骤e)—次以上。51.根据权利要求41到50中任意一项所述的方法，所述的的转录反应包4舌一个或一个以上々务饰的核苷三;粦酸盐和一种突变聚合酶。52.根据权利要求51所述的方法，其中，一种或一种以上修饰的核苷三磷酸盐是一种2'-修饰的核苷三磷酸盐。53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述突变体聚合酶是一种突变的T7RNA聚合酶。54.根据权利要求51到53中任意一项所述的方法，修饰的核苷三磷酸盐是一种2，-OMe修饰的核苷三磷酸盐。55.根据权利要求51到54中任意一项所述的方法，其中转录反应包括1美离子和《孟离子。56.根据权利要求55所述的方法，其中突变体T7RNA聚合酶选自由SEQIDNO1,SEQIDNO2，SEQIDNO100，SEQIDNO101,SEQIDNO102和SEQIDNO103所组成的组。57.根据权利要求55到56中任意一项所述的方法，其中镁离子在转录反应过程中的浓度比锰离子在转录反应过程中的浓度大3.0》J3.5倍。58.根据权利要求55到56中任意一项所述的方法，其中每种核苷三石寿酸在转录反应中存在的浓度为1.0mM,4美离子在寿争录反应中存在的;农度为6.5mM,4孟离子在4争录反应中存在的;农度是2.0mM。59.根据权利要求55到56中任意一项所述的方法，其中每种核苷三磷酸在转录反应中存在的浓度为1.5mM，镁离子在转录反应中存在的浓度为8mM，锰离子在转录反应中存在的浓度是2.5mM。60.根据权利要求55到56中任意一项所述的方法，其中每种核苷三石岸酸在转录反应中存在的浓度为2.0mM,4美离子在转录反应中存在的浓度为9.5mM,锰离子在转录反应中存在的浓度是3.0mM。61.根据权利要求41到60中任意一项所述的方法，其中转录反应进一步包括一种聚烯基二醇。62.根据权利要求61所述的方法，其中，聚烯基二醇是聚乙二醇。63.根据权利要求41到61中任意一项所述的方法，其中转录反应进一步包^"一种鸟噤呤残基，这种鸟嘌p令残基选自由鸟噤呤一裤酸盐、鸟噪呤二;舞酸盐、2，氟代鸟嘌P令一磷酸盐、2，氟代鸟嘌呤二磷酸盐、2，氨基鸟嘌呤一磷酸盐、2，氨基鸟噤呤二确酸盐、2，脱氧鸟嘌呤一碌酸盐和2，脱氧鸟噪呤二石粦酸盐及其它l务饰得核苷所组成的组中。64.根据权利要求41到63中任意一项所述的方法，其中转录反应包括无机焦磷酸酶。65.根据权利要求41到64中任意一项所述的方法，其中，第一固定区由2个、3个、4个或5个鸟"票卩令残基会且成。66.才艮据4又利要求41到65中4壬意一项所述的方法，其中文库的退4匕区包4舌至少4个、至少10个、至少20个或至少30个核苦。67.才艮据4又利要求41到66中任意一项所述的方法，识别的核酸模板组成序列是一种先导序列。68.根据权利要求67所述的方法，其中，先导序列包括第一固定区域和一种来源于至少一部分转录才莫才反候选物退化区域t，^J^歹'J。69.由权利要求41到68中任意一项所描述的方法识别的先导序列。70.—种先导序列，包括选自由SEQIDNOs10到99所组成的组中的序列中从核苷22到核苷32的核酸序列。71.—种先导序列，包括选自由SEQIDNOs10到99所组成的组中的序列中乂人核苷18到核苷32的核酸序列。72.—种转录模板，包括权利要求70到71中任意一项所述的先导序列。73.—种寡聚核普酸转录沖莫一反，选自由SEQIDNO3到6和106戶斤纟且成的纟且中。全文摘要这里提供了生产其序列中整合入了全修饰的核苷三磷酸的适体治疗剂的材料和方法。文档编号C07K14/00GK101495504SQ200680031348公开日2009年7月29日申请日期2006年6月30日优先权日2005年6月30日发明者克里斯汀·汤普森,安东尼·多米尼克·克费,王春华,约翰·L·戴纳,莎伦·T·克洛德申请人:阿切埃米克斯有限公司