专利名称：：结合gla结构域的人fvⅱ单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新型抗FVII抗体，其在测定样品中正确折叠且完整的FVII的数量上以及在纯化和工艺优化上的应用。
背景技术：
：对于蛋白的工业生产，能够以方便且容易的检测法来测定样品中FVII多肽的浓度是令人期待的。进行这一测定的一种方法是通过特异性抗体，该特异性抗体将结合到FVII多肽上并且随后能够通过结合酶的酶促反应而一皮量化。用这一酶联免疫吸附测定法(ELISA)才全测样品中的特定蛋白是本领域众所周知的。"夹心"ELISA对于更准确地测定抗原浓度非常有用，在该测定中，样品中抗原的绝对数量将被测定并且可以得到抗原标准。为利用这一检测法，将一种抗体("捕捉"抗体)纯化并且结合到固相上。然后抗原被加入并被允许与该结合的抗体相络合。然后通过洗涤除去未结合的产物，并且使得标记的二抗("检测"抗体)与抗原结合，从而完成了"夹心"。然后使用比色底物，通过测量结合到基质上的标记的二抗数量来量化该检测。这一技术的主要优点在于抗原不需要在使用前被纯化，并且这些检测也是非常特异性的。然而，并非所有抗体都可以一皮使用。单克隆抗体的组合必须符合"配对，，，这意味着它们可以识别抗原上的分开的表位。该夹心ELISA的灵敏度取决于四种因素结合到固相上的一抗的分子数；一抗对抗原的亲和性；二抗对抗原的亲和性；二抗的比活性。尤其是，抗体对抗原的亲和性只可以通过#皮其它抗体的替而改变。因此，对于特定FVII多肽具有强亲和性的抗体是理想的。许多蛋白为了被活化而需要翻译后修饰。这些修饰包括前肽的切割以及成熟多肽的正确4斤叠。一个特殊的蛋白家族4皮特有的才莫块化组织(characteristicmodularorganization)所识别并且其生物合成需要维生素K。氨基末端的膜结合结构域含有Y-羧基化谷氨酸(GLA)残基，在依赖维生素K的反应中，由羧化酶翻译后修饰。这些蛋白的Y-羧化影响其正确的折叠并且因此也影响其活性。在生产属于该家族的蛋白时，有时需要通过利用免疫亲和柱以非常高效的方式纯化培养液。另外，为了优化培养物中活性FVII多肽的产量，需要更好地控制培养工艺。通过高效单克隆抗体的鉴定以及测定培养物中目的活性蛋白(被正确加工的导致形成结构表位的y-羧化)与FVII多肽总量的比率的简易快速的检测法达到了这一目的。因此，该过程可以被监测并被调节到最佳条件，例如允许在培养的最佳时间收获培养物。
发明内容在诸如钓的二价阳离子存在时，对FVII的GLA结构域具有高亲和性的特异性单克隆抗体现在已经被鉴定。这些抗体可以—皮用于对FVII多肽的有效绝对浓度的测定方法中，并且进一步地，当这些高亲和性抗体与识别暴露于FVII多肽上的不同表位的抗体相结合时，产生了一种能够测定样品中被正确加工的FVII多肽与总FVII多肽的比率的方法。这一方法可以一皮用于在生产时优化活性FVII多肽的产率。另外，当钙存在时，这些对GLA结构域具有高亲和性的新型特异因此，在广义方面，本发明涉及抗野生型人类Fvn的高效单克隆抗体的鉴定。本发明的第一方面涉及单克隆抗体，其只在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整r羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合。本发明的第二方面涉及核酸分子，其编码单克隆抗体，该单克隆抗体只在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合。再一方面，本发明涉及一种载体，其包括编码单克隆抗体的核酸分子，该单克隆抗体只在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合。再一方面，本发明涉及一种细胞，其包括含有编码单克隆抗体的核酸分子的载体，该单克隆抗体只在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合。再一方面，本发明涉及测定样品中包括完整GLA结构域的FVII多肽量的方法，该方法包括下述步骤a)在至少0.05mM二价阳离子存在时，将样品与第一单克隆抗体相接触，该第一单克隆抗体只在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，b)使得存在于样品中的任何FVII多肽与第一单克隆抗体相结合以形成第一抗体复合物，c)将第一抗体复合物与对存在于FVII多肽上的第二表位特异的可检测的第二单克隆抗体相接触，该第二表位和第一单克隆抗体的表位不同，d)使得第一抗体复合物与可检测的第二单克隆抗体相结合以形成第二抗体复合物，和e)通过检测存在于第二抗体复合物中的第二单克隆抗体的量来检测第二抗体复合物的量。再一方面，本发明涉及测定样品中包括完整GLA结构域的FVII多肽量的方法，该方法包括下述步骤a)将样品与对存在于FVII多肽上的表位特异的第二单克隆抗体相接触，该表位与由下述单克隆抗体所筌定的表位不同，该单克隆抗体只在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，b)使得存在于样品中的任何FVII多肽与笫二单克隆抗体相结合以形成第一抗体复合物，c)在至少0.05mM二价阳离子存在时，将第一抗体复合物与可枱r测的第一单克隆抗体相接触，该第一单克隆抗体只在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，d)使得笫一抗体复合物与可检测的第一单克隆抗体相结合以形成第二抗体复合物，和e)通过检测存在于第二抗体复合物中的第一单克隆抗体量来检测第二抗体复合物的量。再一方面，本发明涉及测定样品中包括完整GLA结构域的FVII多肽与FVII多肽总量的比率的方法，包括下述步骤a)通过使用才艮据本发明的方法测定包括完整GLA结构域的FVII多肽的量；和b)测定样品中存在的FVII多肽的总量。多肽的产量上的应用。再一方面，本发明涉及从样品中纯化包括完整GLA结构域的FVII多肽的方法，该方法包括下述步骤(a)将单克隆抗体与免疫亲和纯化柱偶联，该单克隆抗体仅在至少0.05mM二价阳离子存在时，与野生型人FVII完整y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，(b)在至少0.05mM二价阳离子存在时，将该样品加入到柱中，(c)通过从柱中除去二价阳离子而从柱中洗脱包括完整GLA结构域的FVII多肽。参考附图，下面具体说明本发明，其中图1显示了天然人类凝血因子VII的全长氨基酸序列(SEQIDN0:1)。图2显示了根据本发明的示例性抗体的成熟的轻链可变(VL)和重链可变(VH)区的核苷酸序列和氨基酸序列。图3显示了所述ELISA岸全测的典型的标准曲线。图5显示了对不同培养法，作为时间(天)的函数的CDI。发明具体说明本发明在广义方面涉及抗FVII的GLA结构域的新型特异性抗体的鉴定。这些特异性的单克隆抗体在诸如钙的二价阳离子存在时，具有针对FVII的GLA结构域的高度亲和性。该抗体可以一皮用于对具有完整GLA结构域的FVII多肽的有效绝对浓度(goodabsoluteconcentration)测定的方法中，并且进一步地，当这些高亲和性抗体与识别暴露于Fvn多肽上的不同表位的抗体相结合时，产生了一种能够测定样品中^皮正确加工的FVII多肽与总FVII多肽的比率的方法。这一方法可以净皮用于在生产时优化活性FVII多肽的产率。另外，这些在诸如钙的二价阳离子存在时，对GLA结构域具有高在本发明的一个方面，根据本发明的抗体被用于测定具有完整GLA结构域的FVII多肽的量。这典型地通过诸如ELISA纟全测的方法而完成，其中第一抗体，捕捉抗体被附着到固体支持物上，随后在给定的适当条件下使抗体结合FVII多肽。进行洗涤步骤之后，FVII多肽将被保留到固体支持物上。未结合的产物通过冲洗而被除去，而标记的二抗("检测，，抗体)被允许结合到FVII多肽上，FVII多肽从而完成了"夹心"。然后通过测量结合到基质上的标记了的二抗数量来量化抗原的数量。如果检测抗体连接到酶上，可以进行比色检测并测定颜色变化。有了已知浓度的FVII多肽的适当标准后，样品中存在的FVII多肽的绝对数量可以一皮测定。在本发明的一个实施方式中，当检测抗体被酶联时，本发明的方法涉及夹心ELISA法。在本发明中，术语"捕l足抗体"指在緩冲液中浮皮稀释的夹心ELISA的一抗，其在孵育时一皮动地连接到固相上。也可以^吏用主动连接，例如，使用被加入到链霉亲和素(streptavidme)包覆的固相上的生物素化抗体。在本发明中，术语"检测抗体"指在緩沖液中被稀释的夹心ELISA的二抗，其在抗原后被加入。二抗可以像直接ELISA中一样一皮缀合或者是经典夹心ELISA中的抗-物种缀合物(anti-speciesconjugate)。该抗-物种缀合物与血清的物种结合，二抗从所述血清中被制备。人类血浆FVII由四个不连续的结构域所组成氨基末端(N-末端)y-羧基谷氨酸(GLA)结构域(氨基酸1~38),两个表皮生长因子(EGF)样结构域，和丝氨酸蛋白酶结构域。通过在Argl52后面的特异性切割产生活性的双链酶(Hagenetal.,ProcNatlAcadSciUSA,1986;83:2412-2416)。N-末端GLA结构域结合到磷脂表面；C-末端丝氨酸蛋白酶结构域赋予酶活性；在它们之间是两个EGF样结构域间隔区；所有的四个结构域促进与组织因子(TF)的相互作用。鈣离子结合FVII的三个结构域(Banneretal.,Nature1996;380:41-46)。没有钩离子，FVII实质际上没有生物活性。7个钙位点定位于GLA结构域上，并且它们需要被占据以便使FVII结合到细胞膜上(PersonandPetersen,EurJBiochem1995;234:293-300),并且也为了与TF的正确的相互作用。对培养物样品中具有和不具有完整GLA结构域的FVII分子的敏感度和乂人而对绝对含量和浓度的有效测定(gooddeterminations)取决于对其耙抗原具有高亲和性的有效抗体(goodantibodies)等因素。在一个具体实施方式中，用于测定具有完整GLA结构域的FVII分子数量的本发明的抗体被选择为在诸如Ca"的二价阳离子存在下，对多肽具有非常高的亲和性的抗体。对抗FVII多肽上除了GLA结构域以外的不同表位的其它高亲和抗体也可以;故用于这些方法。用于有效测定具有或者不具有完整GLA结构域的FVII分子绝对数量以及浓度的抗体应优选地识别不管抗原是否一皮正确折叠或者活化而总存在于抗原上的表位。在VIIa因子中，在EGF样结构域中发现的表位尤其适于这一目的。如本文所4吏用，术语"VII因子多肽"或者"FVII多肽"指任何包括野生型人Vila因子的氨基酸序列1~406的蛋白(即具有如美国专利4，784,950所公开的氨基酸序列的多肽)，其变异体以及VII因子书f生物和Vn因子的缀合物。其包括相对于野生型人类Vila因子，显示出基本上相同或者增强的生物学活性的FVII变异体，VII因子衍生物及VII因子缀合物。VII因子的这些变异体可以显示出与人类VII因子不同的特性，包括稳定性，磷脂结合，改变了的比活性等。术语"vn因子"或者"Fvn"指未切割(酶原)形式的vn因子多肽。典型地，VII因子在残基152和153之间41切开以产生Vila因子。"野生型人类FVII"是未切割酶原形式的野生型人类FVIIa的功能性生物活性形式。术语"VIIa因子"或者"FVIIa"指VII因子多肽，其已经一皮蛋白酶水解加工以产生其各自的功能性生物活性形式。如本文所使用，"野生型人FVIIa"是具有如美国专利4,784，950所公开的氨基酸序列的多肽的功能性生物活性形式。如本文所使用的术语"VII因子衍生物"意指相对于野生型VII因子，显示出基本上相同或者增强的生物活性的FVII多肽，其中初始肽的一个或多个氨基酸序列一皮遗传地和/或化学地和/或酶修饰，例如通过烷基化、糖基化、PEG化、酰基化、酯形成或者胺形成等。这包括但不限于PEG化的人VIIa因子，半胱氨酸-PEG化的人Vila因子及其变异。VII因子衍生物的非限制性实例包括如专利申请WO03/31464和美国专利申请US20040043446,US20040063911,US20040142856,US20040137557以及US20040132640(NeoseTechnologies,Inc.)所公开的糖聚乙二醇化的FVII书亍生物；如专利申请WO01/04287,美国专利申请20030165996，专利申请WO01/58935,WO03/93465(MaxygenApS)和WO02/02764,美国专利申i青20030211094(UniversityofMinnesota)所公开的FVII缀合物(conjugate)。术语"增强的生物学活性"指i)和重组的野生型人Vila因子相比，具有基本上相同或增强的蛋白水解活性的FVII多肽或者ii)和重组的野生型人Vila因子相比，具有基本上相同或增强的TF结合活性的FVII多肽或者ill)和重组的野生型人Vila因子相比，具有基本上相同或增强的血浆半衰期的FVII多肽。术语"PEG化人Vila因子"指人类Vila因子，具有与人Vila因子多肽相缀合的PEG分子。应该理解的是，PEG分子可以一皮连接到Vila因子多肽的任何部位，包括Vila因子多肽的任何氨基酸残基或糖基部分。术语"半胱氨酸PEG化人类Vila因子"指具有引入到人Vila因子中的与半胱氨酸巯基相结合的PEG分子的Vila因子。与重组野生型人Vila因子相比，具有基本上相同或者增强的蛋白水解活性的VII因子变异体的非限制性实例包括S52A-FVIIa,S60A-FVIIa(Lmoetal.,Arch.Biochem.Biophys.352:182-192,1998);如美国专利5，580,560所公开的显示出增强的蛋白水解稳定性的FVIIa变异体；在残基290和291之间或者在残基315和316之间被蛋白水解切开的Vila因子(Mollerupetal.,Biotechnol.Bioeng.48:501-505,1995);Vila因子的氧化形式(Kornfeltetal.,Arch.Biochem.Biophys.363:43-54,1999);如专利申请PCT/DK02/00189(对应于WO02/077218)所公开的FVII变异体；和如专利申请WO02/38162(ScnppsResearchInstitute)所公开的显示出增强的蛋白水解稳定性的FVII变异体；如专利申请WO99/20767,美国专利US6017882和US6747003,美国专利申请20030100506(UniversityofMinnesota)和专利申请WO00/66753，美国专利申请US20010018414，US2004220106和US200131005,美国专利US6762286和US6693075(UniversityofMinnesota)所乂>开的具有修饰的Gla-结构域并且显示出增强的膜结合的FVII变异体；以及如专利申请WO01/58935，美国专利US6806063,美国专利申请20030096338(MaxygenApS),专利申请WO03/93465(MaxygenApS),WO04/02卯91(MaxygenApS),WO04/083361(MaxygenApS)和WO所公开的FVII变异体。与野生型Vila因子相比，具有增强的生物活性的FVII变异体的非限制性实例包括如专利申请WO01/83725,WO02/22776,WO02/077218，PCT/DK02/00635(对应于WO03/027147),丹麦专利申请PA200201423(对应于WO04/029090)，丹麦专利申请PA200101627(对应于WO03/027147)所公开的FVII变异体；专利申请WO02/38162(ScnppsResearchInstitute);以及如日本专利JP2001061479(Chemo-Sero-TherapeuticResInst.)所公开的具有增强活性的FVIIa变异体。VII因子变异体的实例包括但不限于L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII,L305I-FVII,L305T-FVII,F374P-FVII,V158T/M298Q-FVII,V158D/E296V/M298Q-FVII,K337A-FVII,M298Q-FVII,V158D/M298Q-FVII,L305V/K337A陽FVI1，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVI1，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A隱FVn,K157A-FVII,E296V-FVII,E296V/M298Q-FVII,V158D/E296V-FVI1，V158D/M298K-FVII,和S336G-FVII,L305V/K337A-FVII,L305V/V158D-FVII,L305V/E296V-FVII,L305V/M298Q-FVII,L305V/V158T-FVII,L305V/K337A/V158T陽FVI1，L305V/K337A/M298Q-FVII,L305V/K337A/E296V陽FVn，L305V/K337A/V158D陽FVI1，L305V/V158D/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII,L305V/V158T/E296V-FVII,L305V/E296V/M298QFVI1，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/K337A/M298QFVI1，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/K337A/M298Q-FVI1，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/K316H-FVII,S314E/K316Q-FVII,S314E/L305V-FVI1，S314E/K337A-FVII,S314E/V158D-FVII,S314E/E296V-FVII,S314E/M298Q-FVII,S314E/V158T-FVI1，K316H/L305V-FVII,K316H/K337A-FVI1，K316H/V158D-FVII,K316H/E296VFVI1，K316H/M298Q-FVI1，K316H/V158TFVI1，K316Q/L305V-FVII,K316Q/K337AFVI1，K316Q/V158D-FVII,K316Q/E296V-FVII,K316Q/M298QFVI1，K316Q/V158TFVII,S314E/L305V/K337A-FVII,S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII,S314E/L305V/M298Q-FVI1，S314E/L305V/V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/V158T-FVII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII,S314E/L305V/K337A/E296V-FVII,S314E/L305V/K337A/V158D-FVII,S314E/L305V/V158D/M298QFVn，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII,S314E/L305V/V158T/M298QFVI1,S314E/L305V/V158T/E296V-FVII,S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/K337A/M298QFVn，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/K337A/M298GFVn,S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,S314E/L305V/V158DZE296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,K316H/L305VZK337A-FVII,K316H/L305V/V158D-FVII,K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T-FVII,K316H/L305V/K337A/V158T-FVII,K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII,K316H/L305V/K337A/E296V-FVII,K316H/L305V/K337A/V158D-FVII,K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V-FVII,K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V-FVII,K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/K337A—FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,K316Q/L305V/K337A-FVII,K316Q/L305V/V158D-FVII,K316Q/L305V/E296V-FVII,K316Q/L305V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T-FVII,K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII,K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII,K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII,K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII,K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII,K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A—FVII,K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A—FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/K337A-FVII,F374Y/V158D-FVII,F374Y/E296V-FVII,F374Y/M298Q-FVII,F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVI1,F374Y/L305V-FVII,F374Y/L305V/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158D-FVII,F374Y/L305V/E296V-FVII,F374Y、L305V/M298Q-FVH,F374Y/L305V/V158T-FVII,F374Y/L305V/S314E-FVII,F374Y/K337A/S314E-FVII,F374Y/K337A/V158T-FVII,F374Y/K337A/M298Q-FVn,F374Y/K337A/E296V-FVII,F374Y/K337A/V158D國FVn,F374Y/V158D/S314E-FVII,F374Y/V158D/M298Q-FVII,F374Y/V158D/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E-FVII,F374Y/V158T/M298Q-FVII,F374Y/V158T/E296V-FVII,F374Y/E296V/S314E-FVII,F374Y/S314E/M298Q-FVII,F374Y/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII,F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII,F374Y/L305V/K337A/M298Q隱FVn，F374Y/L305V/K337A/V158T画FVI1，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII,F374Y/L305V/E296V/S314E隱FVn,F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII,F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII,F374Y/K337A/S314E/V158T-FVI1，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVI1，F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVI1，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII,F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII,F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVI1，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII,F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII,F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII,F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII,F374Y/V158D/M2980/E296V-FVII,F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII,F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII,F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII,F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII,F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVn，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E陽FVn,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A匿FVn,F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E陽FVI1，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVn，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVI1，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T7E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII,F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E陽FVn,F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVI1，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVn，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVI1，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII,F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298q/K337A/S314E-FVn，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVn，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A隱FVn,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S3]4E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVn,S52A陽VI1因子，S60A-VII因子；R152E-VII因子，S344A-VII因子，T106N-FVI1，K143N/N145T-FVII,V253N-FVII,R290N/A292T-FVII,G291N-FVII,R315N/V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII以及在氨基酸序列233Thr240Asn之间具有置换、添加或缺失的FVII;在氨基酸序列304Arg329Cys之间具有置换、添加或缺失的FVII;和在氨基酸序列15311e223Arg之间具有置换、添加或缺失的FVII。用于测定具有完整GLA结构域的FVII分子浓度的抗体识别GLA结构域上的表位。在GLA结构域上优选的一种表位是包括SEQIDN0:1中的氨基酸残基Phe4，Leu5,Gla6,Gla7,Leu8,ProlO，Glyll，Glal4,Argl5,Glal6，Cysl7,Glal9,Gla20,Cys22,Gla25,Gla26,Ala27,Gla29,Phe31，Lys32,Gla35中的一个或多个的表位。本文所使用的短语"完整的GLA结构域"意指具有二^L键的GLA结构域，该二硫键与人FVII在cys17~cys22之间的二石危一建相对应。本文所使用的短语"包括完整GLA结构域的FVII多肽"意指FVII多肽，其中完整的GLA结构域共价连接到FVII分子的其余部分。在本发明的上下文中，术语抗体"结合"决定簇指抗体特异性地和/或亲和性地结合决定簇。"特异性的结合"或者"特异性"指抗体或其它因子的可检测地结合到存在于抗原，例如FVII多肽，上的表位上的能力，而与其它蛋白或结构具有相对小的可检测反应性。如本文其它地方所描述，特异性可以使用例如Biacore仪器通过结合或竟争性结合检测法而被相对测定。特异性可以通过以下而表现出来与非特异性结合到其它不相关分子(在此情况下，特异性抗原是FVII多肽)相比，与特异性抗原相结合的亲和性/活动性的比率为例如大约10:1,大约2(h1,大约50:1,大约100:1,10000:1或更大。"表位"是抗原上与抗原-结合肽(例如抗体)特异地结合的部位或区域。蛋白表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基(也被称作表位的免疫显性组分)以及不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换言之，该氨基酸残基在特异抗原结合肽的"足迹"之中)。本文的术语表位包括与抗-FVII抗体特异性结合的Fvn多肽的任何特殊区域中的全部两种类型的氨基酸。fvii多肽可以包括许多不同的表位，其可以包括但不限于(1)线性肽抗原决定簇，(2)构象性的抗原决定簇，其由成熟fvii多肽构象中相互临近定位的一个或多个非相邻的氨基酸所组成；和(3)翻译后抗原决定簇，其或者全部或者部分由共价连接到fvii多肽上的分子结构所组成，例如糖基。短语一抗"基本上"或"至少部分地"结合与二抗相同的表位指一抗的表位结合位点包含抗原上组成二抗表位结合位点的氨基酸残基中的至少10%，20%,30%,40%,50%,60%,70%,,80%,90%或者更多的氨基酸残基。另外，如上所述，一抗基本上或至少部分地结合与二抗相同的表位指一抗和二抗竟争结合到抗原上。因此，术语和单克隆抗体FVII-3F3A4"基本上结合相同的表位或决定簇"指抗体与FVII-3F3A4"竟争"。通常，与目的单克隆抗体(例如FVII-3F3A4,FVII-3F20A1,FVII-3F11A3)"基本上结合相同的表位或决定簇"的抗体指该抗体与目的抗体"竟争"结合一种或多种FVII多肽。术语"线性肽抗原决定簇"被定义为由氨基酸线性序列(一级结构)上连续的氨基酸残基所组成的表位。术语"构象性抗原决定簇"被定义为由不完全连续的氨基酸残基组成的表位，并且因此表示通过分子折叠(二级，三级和/或四级结构)而相互接近的氨基酸线性序列的分离的部分。构象表位取决于三维结构。因此；经常将术语"构象的"与"结构的"互换使用。在一个实施方式中，本发明涉及单克隆抗体，其只在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，其中该表位包括序列SEQIDN0:1的Phe4,Leu5,Gla6，Gla7，Leu8,ProlO,Glyll,Glal4,Argl5,Glal6,Cysl7,Glal9,Gla20,Cys22，Gla25，Gla26,Ala27,Gla29，Phe31,Lys32，Gla35的一个或多个氨基酸残基。在一个实施方式中，本发明涉及单克隆抗体，其只在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，该单克隆抗体与下述抗体竟争，该抗体包括(a)轻链可变区，包括SEQIDNO:3的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDN0:5的氨基酸序列；(b)轻《连可变区，包括SEQIDN0:7的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDN0:9的氨基酸序列；或者(c)轻链可变区，包括SEQIDNO:ll的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDNO:13的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明涉及单克隆抗体，其只在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，该单克隆抗体包括(a)轻链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列第24~34残基的氨基酸序列，轻链CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列第50~56残基的氨基酸序列，轻链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列第89~95残基的氨基酸序列，以及重链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:5的氨基酸序列第33~35残基的氨基酸序列，重《连CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:5的氨基酸序列第50~64残基的氨基酸序列，重链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:5的氨基酸序列第99-112残基的氨基酸序列；(b)轻链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:7的氨基酸序列第2434残基的氨基酸序列，轻链CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:7的氨基酸序列笫50~56残基的氨基酸序列，轻链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:7的氨基酸序列第89~95残基的氨基酸序列，以及重链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:9的氨基酸序列第33~35残基的氨基酸序列，重《连CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:9的氨基酸序列笫50~64残基的氨基酸序列，重链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:9的氨基酸序列第99-112残基的氨基酸序列；或(c)轻链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:ll的氨基酸序列第24~34残基的氨基酸序列，轻链CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:11的氨基酸序列第50~56残基的氨基酸序列，轻链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:ll的氨基酸序列第89~95残基的氨基酸序列，以及重链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:13的氨基酸序列第33~35残基的氨基酸序列，重链CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:13的氨基酸序列第50~64残基的氨基酸序列，重链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:13的氨基酸序列第99~112残基的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明涉及单克隆抗体，其只在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整r羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，该单克隆抗体包括(a)轻链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:3相同的氨基酸序列，和重链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:5相同氨基酸序列；(b)轻链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:7相同的氨基酸序列，和重链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:9相同的氨基酸序列；或(c)轻链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:ll相同的氨基酸序列，和重链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:13相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明涉及单克隆抗体，其只在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整r羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，该单克隆抗体包括(a)轻链可变区，包括SEQIDNO:3的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDNO:5的氨基酸序列；(b)轻《连可变区，包才舌SEQIDNO:7的氨基酸序列，和重《连可变区，包括SEQIDNO:9的氨基酸序列；或(c)轻链可变区，包括SEQIDNO:ll的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDNO:13的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明涉及单克隆抗体，其只在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整r羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，该单克隆抗体是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一个实施方式中，本发明涉及单克隆抗体，其只在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，该单克隆抗体是IgG4抗体。在一个实施方式中，本发明涉及测定样品中包括完整GLA结构域的FVII多肽量的方法，该方法包括下述步骤a)在至少0.05mM的二价阳离子存在时，将样品与第一单克隆抗体相接触，该第一单克隆抗体只在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域相结合，b)使得存在于样品中的任何FVII多肽与第一单克隆抗体相结合以形成第一抗体复合物，c)将第一抗体复合物与对存在于FVII多肽上的第二表位特异的可检测的第二单克隆抗体相接触，该第二表位和第一单克隆抗体表位不同，d)使得第一抗体复合物与可检测的第二单克隆抗体相结合以形成第二抗体复合物，和e)通过检测存在于第二抗体复合物中的第二单克隆抗体量来检测第二抗体复合物的量，其中第二表位存在于FVII多肽的EGF-样结构域1或EGF-样结构域2上。在一个实施方式中，本发明涉及测定样品中包括完整GLA结构域的FVn多肽量的方法，该方法包括下述步骤a)在至少0.05mM的二价阳离子存在时，将样品与第一单克隆抗体相接触，该单克隆抗体仅在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整？羧基谷氨酸(GLA)结构域上表位相结合，b)使得存在于样品中的任何FVII多肽与第一单克隆抗体相结合以形成第一抗体复合物，c)将第一抗体复合物与对存在于FVII多肽的第二表位特异的可检测的第二单克隆抗体相接触，该第二表位和第一单克隆抗体表位不同，d)使得第一抗体复合物与可检测的第二单克隆抗体相结合以形成第二抗体复合物，和e)通过检测存在于第二抗体复合物中的第二单克隆抗体量来检测第二抗体复合物的量，其中二价阳离子是Ca^，其存在的范围是大约0.05mM~大约50mM,例如大约0.1mM~大约30mM，例如大约1mM~大约20mM,例如大约5mM~大约10mM。在一个实施方式中，本发明涉及测定样品中包括完整GLA结构域的FVII多肽量的方法，该方法包括下述步骤a)在至少0.05mM的二价阳离子存在时，将样品与第一单克隆抗体相接触，该单克隆抗体仅在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整？羧基谷氨酸(GLA)结构域上表位相结合，b)使得存在于样品中的任何FVII多肽与第一单克隆抗体相结合以形成第一抗体复合物，c)将第一抗体复合物与对存在于FVII多肽的第二表位特异的可检测的第二单克隆抗体相接触，该第二表位和第一单克隆抗体表位不同，d)使得第一抗体复合物与可检测的第二单克隆抗体相结合以形成第二抗体复合物，和e)通过检测存在于第二抗体复合物中的第二单克隆抗体量来检测第二抗体复合物的量，其中利用选自ELISA,表面等离子体共振以及压电生物传感器(piesoelectricbiosensors)的方法对可才全测的抗体进行才全测。在一个实施方式中，本发明涉及测定样品中包括完整GLA结构域的FVII多肽量的方法，该方法包括下述步骤a)将样品与对存在于FVII多肽上的表位特异的第二单克隆抗体相接触，该表位与由单克隆抗体所鉴定的表位不同，该单克隆抗体仅在至少0.05mM的二i^介阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，b)使得存在于样品中的任何FVII多肽与第二单克隆抗体相结合以形成第一抗体复合物，c)在至少0.05mM的二价阳离子存在时，将第一抗体复合物与可才企测的第二单克隆抗体相接触，该第一单克隆抗体只在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合，d)使得第一抗体复合物与可检测的第一单克隆抗体相结合以形成第二抗体复合物，和e)通过检测存在于第二抗体复合物中的第一单克隆抗体量来检测第二抗体复合物的量，其中第二表位存在于FVII多肽的EGF-样结构域1或EGF-样结构域2上。在一个实施方式中，本发明涉及测定样品中包括完整GLA结构域的FVII多肽量的方法，该方法包括下述步骤a)将样品与对存在于FVII多肽的表位特异的第二单克隆抗体相接触，该表位与由单克隆抗体所筌定的表位不同，该单克隆抗体仅在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上表位相结合，b)使得存在于样品中的任何FVII多肽与第二单克隆抗体相结合以形成第一抗体复合物，c)在至少0.05mM的二价阳离子存在时，将第一抗体复合物与可才企测的第一单克隆抗体相接触，该第一单克隆抗体仅在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整r羧基谷氨酸(GLA)结构域上表位相结合，d)使得第一抗体复合物与可检测的第一单克隆抗体相结合以形成第二抗体复合物，和e)通过检测存在于第二抗体复合物中的第一单克隆抗体量来检测第二抗体复合物的量，其中二价阳离子是Ca2、其存在的范围是大约0.05mM~大约50mM,例如大约0.1mM~大约30mM,例如大约1mM~大约20mM,例如大约5mM~大约10mM。在一个实施方式中，本发明涉及测定样品中包括完整GLA结构域的FVII多肽量的方法，该方法包括下述步骤a)将样品与对存在于FVII多肽的表位特异的第二单克隆抗体相接触，该表位与由单克隆抗体所鉴定的表位不同，该单克隆抗体仅在至少0.05mM的二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整^羧基谷氨酸(GLA)结构域上表位相结合，b)使得存在于样品中的任何FVII多肽与第二单克隆抗体相结合以形成第一抗体复合物，c)在至少0.05mM二〗介阳离子存在时，将第一抗体复合物与可斗企测的第一单克隆抗体相接触，该第一单克隆抗体仅在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上表位相结合，d)使得第一抗体复合物与可检测的第一单克隆抗体相结合以形成第二抗体复合物，和e)通过检测存在于第二抗体复合物中的第一单克隆抗体量来检测第二抗体复合物的量，其中利用选自ELISA，表面等离子体共振以及压电生物传感器的方法对可4全测的抗体进行4全测。在一个实施方式中，本发明涉及从样品中纯化包括完整GLA结构域的FVII多肽的方法，该方法包括下述步骤(a)将只在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人FVII完整Y-羧基谷氨酸(GLA)结构域上的表位相结合的单克隆抗体与免疫亲和纯化柱相偶联，(b)在至少0.05mM二价阳离子存在时，将该样品加入到柱中，(c)通过从柱中除去二价阳离子而从柱中洗脱包括完整GLA结构域的FVII多肽，其中二价阳离子是Ca2+,其存在的范围是大约0.05mM大约50mM,例如大约0.1mM~大约30mM，例如大约1mM~大约20mM,例如大约5mM~大约10mM。如本文所使用的术语"EGF-样结构域l"指SEQIDNO:l第46~82的氨基酸序列。术语EGF-样结构域2"指SEQIDNO:l第87~128的氨基酸序列。FVII的正确折叠和活性依赖于钙的存在，并且现已发现FVII上的某些表位仅仅在诸如钙离子的二价阳离子存在时才被暴露。金属离子的存在对于被本发明的抗体所识别的GLA结构域中表位的形成和暴露至关重要。在一个实施方式中，二价阳离子是金属离子。在一个实施方式中，二l介阳离子选自由Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+和Uo2+组成的列表。在一个实施方式中，二价阳离子是钙。在一个实施方式中，二价阳离子是Zn"。在一个实施方式中，二价阳离子是Mg2、二价阳离子的恰当量可以被技术人员容易地确定，然而，离子浓度通常应该至少是0.05mM,例如至少O.lmM,例如至少lmM。在一个具体实施方式中，二价阳离子以大于0.05mM的量存在，例如大于O.lmM,例如大于0.6mM,例如大于lmM,例如大于5mM。在一个具体实施方式中，二^介阳离子以大约0.05mM~大约50mM的量存在，例如大约0.1mM~大约30mM,例如大约0.6mM~大约30mM,例如大约ImM~大约20mM,例如大约5mM~大约10mM。在一个具体实施方式中，Ca^以大约0.05mM~大约50mM的量存在，例如大约0.1mM~大约30mM,例如大约0.6mM~大约30mM,例如大约ImM~大约20mM,例如大约5mM~大约10mM。抗体本发明提供了新型抗体及其片段或衍生物，其将与抗原的结构域上存在的表位高亲和性地结合，不论是否正确折叠，以及抗体，其结合到暴露在正确加工的抗原/多肽上的表位。这些后面的抗体在4丐存在下识别暴露的表位。如本文所使用，术语"抗体"指多克隆和单克隆抗体。取决于重链中恒定结构域的类型，抗体被分成五种主要类型IgA,IgD,IgE,IgG和IgM。它们中的一些一皮进一步分成亚类或同型物，例如IgGl,IgG2，IgG3,IgG4等。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称作"a","S"，"s"，'Y，，'>"。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维结构构型是众所周知的。IgG和/或IgM是本发明优选使用的抗体类型，因为它们是生理状态下最普遍的抗体并且因为它们在实验室环境下最容易制备。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。本发明的抗体可以通过各种本领域已知的4支术而生产。典型地，用包括fvii多肽的抗原免疫接种非-人类动物，优选小鼠而生产。或者，特异性抗体可以表示为重组蛋白。本发明的特异性抗体是作为适宜的抗体的实例并且可以由可变区，尤其是名为互补决定区(CDR)的高可变区的特异序列所生产。如同在实施例中所说明，技术人员将能够从CDR-区的序列中重组表达完整的单克隆抗体。Fvn多肽可以包括全长序列，或者其片段或衍生物，典型地，是免疫原性片段，即包括暴露的表位的Fvn多肽的一部分。用抗原免疫非-人类哺乳动物的步骤可以任何本领域公知的方式进行以刺激在小鼠中产生抗体(参见，例如，E.HarlowandD.Lane，Antibodies:ALaboratoryManual.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1988))。然后将免疫原在缓冲液中悬浮或溶解，可选择地使用佐剂，例如完全弗氏佐剂。用于测定免疫原数量、緩冲液类型和佐剂的量的方法是本领域技术人员所公知的并且不以任何方式限制本发明。对于不同的免疫原，这些参数可以不同，但容易被说明。类似地，足以刺激产生抗体的免疫接种的位置和频率也是本领域公知的。在一种典型的免疫接种方法中，在第一天向非-人类动物腹腔注射抗原，并且在大约一周后再次注射。随后在大约第20天，再次注射抗原，可选择地使用佐剂，例如不完全弗氏佐剂。该再次注射于静脉进行并且可以连续重复若干天。然后在第40天进行或者静脉或者腹腔的加强注射，典型地不用佐剂。这一方法导致在大约40天后产生抗原-特异性抗体-生成B细胞。也可以利用其它方法，只要它们导致产生B细胞，其表达针对于免疫接种所使用的抗原的抗体。对于制备多克隆抗体，从免疫的非-人类动物获得血清，利用公知技术分离存在于其中的抗体。使用任何与固体支持物相连的前述免疫原可以亲和纯化该血清以便获得与FVII多肽，尤其是与Vila因子反应的抗体。在一个变化的实施方式中，来自未免疫的非-人类哺乳动物的淋巴细胞被分离，在体外生长，然后在细胞培养物中暴露于免疫原。然后收集该-淋巴细胞并进行下述融合步骤。对于单克隆抗体，接下来的步骤是从免疫的非-人类哺乳动物中分离脾细胞，随后这些脾细胞与永生细胞融合以便形成抗体-生成杂交瘤。,人非_人类哺乳动物中分离脾细胞是本领域公知的并且典型地包括从被麻醉的非-人类哺乳动物中取下脾，将其切成小片并从脾被膜中挤压脾细胞并通过细胞过滤器的尼龙筛到适宜的緩沖液中以便产生单细胞悬浮液。冲洗细胞，离心并在溶解了任何血红细胞的緩冲液中重悬浮。再次将溶液离心并且最终将所保留的淋巴细胞在新鲜的緩冲液中重悬浮。淋巴细胞一旦被分离并且存在于单细胞悬浮液中，它们将融合成永生细胞系。尽管本领域已知许多其它用于产生杂交瘤的永生细^^手、，其典型地是小鼠骨髓瘤细胞系。优选的骨髓瘤细胞系包括但不限于衍生自MOPC-21和MPC画ll小鼠肺瘤的细胞系，其获得自SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.U.S.A.,X63Ag8653和SP-2细胞，其获得自美国典型樣i生物菌种保藏中心AmencanTypeCultureCollection,Rockville，MarylandU.S.A。该融合#皮4吏用聚乙二醇等所影响。然后，生成的杂交瘤在选择培养基中生长，该培养基含有一种或多种抑制生长或使未融合的亲代骨髓瘤细胞存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),杂交瘤的培养基典型地将包括次黄噤呤，氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，该物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。杂交瘤典型地生长于巨噬细胞饲养层上。该巨噬细胞优选来自用于分离脾细胞的同窝出生的非-人类哺乳动并且典型地在将杂交瘤铺板的几天前用不完全弗氏佐剂等培养。融合方法描述于(Godmg，"MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,"pp.59-103(AcademicPress,1986))。细胞被允许在选择培养基中生长充足的时间以形成菌落并生成抗体。这通常是714天。然后检测杂交瘤菌落与FVII多肽特异结合的抗体生成。这一检测典型地是比色ELISA-型检测，尽管可以使用任何适合于杂交瘤所生长的小孔的检测法。其它检测法包括免疫沉淀和放射性免疫测定。产生目的抗体的阳性小孔被检测以确定是否存在一种或多种不同的菌落。如果存在一种以上的菌落，细胞可以被重克隆并且生长以保证只有单一的细胞产生该生成目的抗体的菌落。具有单一显性菌落的阳性小孔典型地被重克隆和重检测以保证只有一种单克隆抗体一皮检测和生产。例如，如Ward等(Nature341(1989)544)所^>开，也可以通过对免疫球蛋白的组合文库的选择产生抗体。重组生产使用标准技术，利用在诸如酵母的单细胞生物中；或者在细菌细胞培养物(例如在大肠杆菌中)；或者在原核细胞培养物(例如在哺乳动物细胞培养物中)中的重组表达也可以制备抗体。因此，根据一个变化的实施方式，编码抗FVII抗体的重链和轻链的DNA被从本发明的杂交瘤中分离并且放到适宜的表达载体中用于转染适宜的宿主。然后将该宿主用于重组生产抗体，或其变异体，例如该单克隆抗体的人源化形式，该抗体的活性片段，或者含有该抗体的抗原识别部分的嵌合抗体。使用常规方法(例如，使用能与编码鼠科动物或人抗体的重链或轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，将编码本发明单克隆抗体的DNA轻易地分离并测序。一旦4皮分离，DNA可以4皮方文入表达载体中，然后转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，例如E.coli细胞，猴COS细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。编码该抗体片段的DNA在细菌中的重组表达是本领域众所周知的(参见，例如，Skerraetal.,Curr.OpinionmImmunol.,5,pp.256(1993);和Pluckthun，Immunol.Revs.130,pp.151(1992))。另夕卜，从已知的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),以及人类恒定区重组生产抗体已经一皮描述，例如Ruker等(AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences.1991;646:212-219),其报道了人类单克隆抗-HIV-l抗体在CHO细胞中的表达；Bianchi等(BiotechnologyandBioengmeermg.2003;84:439-444),其描述了使用反式互补表达载体高水平表达全长抗体，NoSooKim等(Biotechnol.Prog.2001;17:69-75),其描述了在二氪叶酸还原酶介导的基因扩增时，在CHO细胞的人化抗体表达中出现克隆变异的关键因素;Kmg等(BiochemicalJournal.1992;281:317-323)，其报道了小鼠-人嵌合抗体和嵌合Fab，片段的表达，纯化和表征；专利申请WO2003064606,其描述了包括人类重《连和人类轻链可变区的已分离的人单克隆抗体，其都包括FRl,CDR1,FR2，CDR2，FR3,CDR3和FR4序列；以及专利申请WO2003040170，其描述了嵌编码人IgG恒定区的全部cDNA序列可以在于2005年1月6日访问的下述GenBank条目中得到，其每一项被整体引用作为参考人IgGl重链恒定区人lgG2重链恒定区人lgG3重链恒定区人lgG4重链恒定区GenBank登陆号存J00228GenBank登陆号^J00230GenBank登陆号^X04646GenBank登陆号弁K01316人kappa轻链恒定区GenBank登陆号存J00241。如上所讨论，适合用于根据本发明的某些方法的抗体需要以"配对"被使用，意味着两种抗体识别并结合FVII多肽的不同表位。使用多种免疫筛选检测法中的任何一种可以对特异性抗体是否结合到不同表位的判断容易地确定，其中可以评估抗体竟争。所有这些检测法是本领域常规的(参见，例如，美国专利No.5,660,827,1997年8月26日授权)。根据上述技术，一些特异性单克隆抗体已经被分离并检测(对这些抗体表达的详情参见实施例和序列表)，而且三种单克隆抗体FVII-3F11A3，FVII-3F3A4和FVII-3F20A1已经显示出对FVII多肽的GLA结构域这一靶结构域具有非常高的亲和性。这些抗体依赖于钙离子而识别存在于多肽上的表位，并且被称作钙依赖型结合。在本发明的一个实施方式中，使用任何FVII-3F3A4,FVII-3F11A3和FVII-3F20A1作为对存在于GLA结构域上的表位特异的单克隆抗体进^"测定具有完整GLA结构域的FVII多肽量的方法。SEQIDNO:3给出了抗体FVII-3F3A4的轻链可变区(VL)的氨基酸序列。SEQIDNO:5给出了抗体FVII-3F3A4的重链可变区(HL)的氨基酸序列。SEQIDNO:7给出了抗体FVII-3F20A1的轻链可变区(VL)的氨基酸序列。SEQIDNO:9给出了抗体FVII-3F20A1的重链可变区(HL)的氨基酸序列。SEQIDNO:11给出了抗体FVII-3F11A3的轻链可变区(VL)的氨基酸序列。SEQIDNO:13给出了抗体FVII-3F11A3的重链可变区(HL)的氨基酸序列。已经发现了在培养生产多肽的宿主时，本发明的方法对于获得产品FVII多肽质量快速且可靠的测量非常便利。通过使用本发明的方法，可以测定功能性FVII多肽的量，这在本文中意味着包括完整Y-羧化的GLA结构域的正确加工的FVII多肽，以及存在于培养液中的FVII多肽的总量。因此，在一个实施方式中，本发明涉及测定样品中正确加工的FVII多肽与FVII多肽总量之间的比率的方法，其包括下述步骤a)测定包括Y-羧化的GLA结构域的FVII多肽的量，该结构域在cysl7和cys22之间具有二石克键；b)测定存在于样品中的FVII多肽的总量。因此可以计算样品中正确加工的多肽与总FVII多肽的比率，并且该比率在本发明中被定义为4丐依赖指数(CDI)。包括Y-羧化结构域，GLA结构域的多肽的正确加工，可以是正确折叠，已经显示出依赖于钓。当鈣存在时，所诱导的这一构象变化可以暴露折叠了的多肽中的表位，该表位不存在于FVII多肽的前肽形式，GLA结构域-缺乏形式或者非i-羧化形式中。在一个实施方式中，通过特异性抗体与多肽中不同结构域的结合以及对检测抗体数量的检测来完成对FVII多肽不同形式的测定。用于;^测抗体与革巴抗原结合的不同检测体系是本领域众所周知的并且包括，例如结合酶(ELISA)和荧光抗体。在又一个实施方式中，本发明因此涉及测定样品中正确加工的FVII多肽与FVII多肽总量间的比率的方法，其中，分别通过检测在Ca2+#在下，特异性检测抗体与FVII多肽中正确加工的GLA-结构域上暴露的表位的结合，以及通过^r测针对于FVII多肽中不同结构域上任何其它表位的另一特异性;险测抗体的结合来测定存在于样品中的包括正确加工的GLA-结构域的FVII多肽的量，以及FVII多肽的总量。如果使用"夹心"技术，其中捕捉抗体或者固定在固体支持物上的抗体与检测抗体或抗体一起使用，可以设想若干可能的抗体组合。的抗体并且该抗体将结合所有或者大部分形式的FVII多肽。例如，该抗体可以结合到FVII多肽EGF-样结构域的表位上。然后检测抗体能够识别所存在的不同形式并且4全测抗体之一应该是在Ca^存在下，对GLA结构域上暴露的表位所特异的，而另一检测抗体应该是对在非GLA结构域的结构域上的表位所特异的且该非GLA-结构域上的表位与被捕捉抗体所识别的表位不同。当使用夹心ELISA技术时，该情况是在两种单独的样品中对4企测抗体的结合进行方便的检测，其测量被正确加工的或者总的抗原，然而，可以设想在相同样品上进行全部检测抗体的检测，此情况下直接测量检测抗体上的荧光分子。其因而需要使用两种不同的激发波长。另一方面，当在方法中使用两种不同的捕捉抗体时，通常使用两种单独的样品。在此情况下，两种捕捉抗体中的一种是对在Ca^存在下暴露于GLA结构域上的表位所特异的捕捉抗体而另一种是对在非GLA-结构域的结构域中第一表位所特异的捕捉抗体，并且检测抗体是对非GLA-结构域的结构域中第二表位所特异的抗体，其中第二表位与第一表位不同。作为实例，一个实施方式可以是F1和F9作为捕4足抗体而F7作为检测抗体。如上所述，一种对检测抗体的结合进行检测的方法是ELISA,其中ELISA是夹心ELISA。然而，也可以使用其它用于检测抗体结合的方法。一种众所周知的监测生物分子相互作用的技术是表面等离子共振(SPR)。表面等离子共振是当光线反射离开金属薄膜时发生的一种现象。以锐角限定的角度折射的光能的一部分可以与金属膜(等离子体)上的离域电子相互作用从而减少反射光强。发生这一现象的准确的入射角由许多因素所确定，但是在PharmaciaBIAcore仪器上，主要的决定因素是折射率与金属膜背景相接近，靶分子通过沿流动细胞运动的流动相中的配体被固定并牵引(address)到其上。如果在固定化耙位发生结合，局部的反射率改变，导致SPR角度改变，这可以通过检测反射光强的变化而实时监测，产生sensorgram。SPR信号变化率可以一皮分析以产生反应的结合及解离相的表观速率常数。这些数值的比率得到表观平衡常数(亲和性)。SPR信号改变的大小与^^固定的质量成正比并且可以因此按照相互作用的化学计量被粗略地说明。从亚-微克级的材料可以容易地获得信号。因为SPR信号仅取决于与未固定的模板的结合，也可以从提取物的分子中研究结合现象，即不需要具有高度纯化的组分。改变了在倏逝波(evanescentwave)渗透范围内的反射率。产生SPR现象所需的入射角(SPR角)因此^^皮改变且这一变化作为反应信号^t测量。SPR因此提供了质量检测器，其基本上独立于相互作用物的性质。这一冲支术不需要才示记。其它适于检测抗体和抗原之间相互作用的可能的方法是通过压电生物传感器，其中测量的参数是电阻，电流或电压。靶物质，FVII多肽在压电电阻器中被用搭架(built)固定到悬臂上，而检测抗体的结合将导致弯曲，该弯曲限制压电电阻器并且因此改变电阻器的数值。其它可能的检测方法可以被技术人员容易地想到，例如，SAW(声表面波)-生物传感器等。因此在一个实施方式中，利用ELISA、表面等离子共振、压电生物传感器或SAW-生物传感器对检测抗体/抗体的结合进行检测。对任何具有GLA结构域的蛋白，本发明的CDI可以;故测定，该蛋白的正确加工与蛋白活性相关并且其中的正确折叠^f皮钙的存在所影响。该蛋白包括VII，Vila,IX，IXa，X，Xa因子、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨钙素、基质GLA-蛋白、富含脯氨酸的GLa蛋白1和2。计算CDI的方法具有优点，在普通夹心ELISA中将被检测的不需要的多肽形式，例如，Vila因子，例如GLA结构域缺乏的FVII，前-FVII，非-Y-羧化-FVII和具有退化的GLA结构域的其它形式的FVII可以被识别并因此可以获得培养物的质量指标。出人意料地，已经发现在了在生产FVII时的CDI指数在培养期中在很大程度上变化，因此为了获得最佳产率，对CDI的理解很重要。本发明的第二方面因此涉及本发明的方法在生产中优化功能性FVII多肽产量上的应用。实施例实施例1、抗体的重组生产在一个示例性实施方式中，可以使用下述方法乂人FVII抗体的VH和VL序列中生产重组mAb。步骤1-3描述了从杂交瘤或其它生产单克隆FVII抗体的细胞中得到VH和VL区。或者，使用成熟的合成cDNA片段的技术，从图2提供的序列信息中可以制备用于步骤4的编码FVII抗体VH和VL序歹ll的cDNA。所期望的抗体的VH和VL片4史或其突变体或衍生物，也可以被克隆到在科学文献中所描述的多种表达载体或市售可得的表达载体中的任一种之中，其中含有目的Ig亚类的恒定区，以便表达全长抗体。另外，目的抗体的VH和VL片段，或其突变体或衍生物可以-波克隆到编码截短恒定区的载体中以表达抗体片段(例如，Fab片段)。市售可得的载体的一个实例是pASK84,获得自ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心，目录号87094)。(1)从杂交瘤细胞中分离总RNA:利用来自Qiagen的RNeasyMiniKit,根据制造商的说明，4xl06分泌抗FVII抗体的杂交瘤细胞被用于分离总RNA,在此概述将细胞在1000rpm离心5分钟压成团并加入350|il含有10pl/mlp-巯基乙醇的RLT缓冲液使其破坏。将裂解物转移到来自Qmgen的QIAshredder柱中并以最大速度离心2分钟。用等体积的70%的乙醇混合流穿物。向每个RNeasyspincolumn(Qmgen)中力口入高达700fil的才羊品并在14000rpm离心，丟弃流穿物。向每个柱中加入700^1RW1緩冲液，其以14000rpm离心15s以沖洗柱。用500plRPE緩冲液洗柱两次并在14000rpm离心15s。为了干燥柱，另外以14000rpm离心2分钟。将柱转移到新的收集管中并用50jil不含核酸酶的水洗脱RNA并在14000rpm离心1分钟。通过OD=260nm的吸光度测量RNA浓度。RNA被储存于-80。C直到需要使用时。(2)cDNA合成使用来自Clontech的SMARTRACEcDNAAmplificationKit,用1吗RNA合成第一链cDNA。为了制备5，-RACE-ReadycDNA,制备含有如上所分离的RNA，反向引物5，-CDSprimerback,和SMARTIIAoligo的反应混合物，并将该混合物在72°C孵育大约2分钟，然后在加入lxFirst-Strand緩冲液，DTT(20mM),dNTP(10mM)以及PowerScript反转录酶之前，在水上冷却大约2分钟。将反应混合物在42。C孵育1.5小时并加入Tricme-EDTA緩沖液并在72。C孵育7分钟。此时，样品可以被储存于-20。C。(3)人可变轻链(VL)和人可变重《连(VH)的PCR扩增和克隆建立了含有1xAdvantageHF2PCR緩冲液，dNTP(10mM)以及lxAdvantageHF2polymerasemix的PCR(聚合酶链式反应)反应混合物以从如上所制备的cDNA中分别扩增VL和VH的可变区。使用下述引物扩增VL:UPM(UniversalPrimerMix):T-3，(SEQIDNO:14)5，-CTAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQIDNO:15)VKRACE2:5,-GCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC-3'(SEQIDNO:16)使用下述引物扩增VH:UPM(UniversalPrimerMix):T-3，(SEQIDNO:17)5，画CTAATACGACTCACTATAGGG-3，(SEQIDNO:18)AB90RACE:5，-GTGCCAGGGGGAAGACCGATGGG-3'(SEQIDNO:19)进行3轮PCR。第一轮94。C,5s和72。C,3min,进行5个PCR循环。第二轮94。C,5s,70。C,10s和72。C，lmin,进行5个PCR循环。第三轮94。C,5s,68。C,10s和72。C，1mm,进行28个PCR循环。利用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并使用来自Qiagen的QIAEXllagarosegelextractionkit从凝月交中纯化DNA。使用来自Invitrogen的TOPOTACloningkit将纯化的PCR产物导入到PCR4-TOPO载体中并用于转化TOP10感受态细胞。使用Taq聚合酶，lxT叫聚合酶緩冲液，dNTP(10mM)以及下述引物和PCR程序，通过菌落PCR分析适当量的菌落M13正向引物5,-GTAAAACGACGGCCAG-3，(SEQIDNO:20)M13反向引物5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3,(SEQIDNO:21)PCR程序940C，30s,550C,30s以及72。C,1mm,进行25个循环。^吏用上面列出的M13正向引物和M13反向引物，/人分别包括VL和VH插入片革殳的克隆中提取质粒DNA并测序。在FVIImAb的情况中，编码重链和轻链可变区的序列如图2所示。(4)抗体基因亚克隆到哺乳细胞表达载体基于编码mAb重链和轻链可变区的cDNAs的序列资料，分别设计用于扩增轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因的引物。利用PCR编排可变区以包括Kozak序列，前导序列和独特的限制性酶切位点。对于VL,其完成是通过设计5，PCR引物引入HmdIII位点，Kozak序列并使之与轻链可变区前导序列5，末端同源。3，引物与可变区3'末端同源并且在可变区的3，边界引入BsiWI位点。以类似的方式产生VH区，除了分别在5，和3，端引入Notl和Nhel位点代替HmdIII和BsiWI。使用标准技术将扩增的基因产物各自克隆到含有轻链和重链恒定区的真核表达载体中。VLDNA片段被HmdIII和BsiWI消化并连接到含有编码氨千青霉素抗性的(3-内酰胺酶基因和大肠杆菌复制起点(pUC)的真核表达载体中；得到的质粒被命名为VLCL。VHDNA片段被Notl和Nhel消化并被导入到通过导入如上所述的VL片段而得到的VLCL载体中。生成的质粒在相同质粒上包含了编码抗体重链和轻链的功能性表达盒。该连接的质粒被用于转化大肠杆菌。从这些抗氨千青霉素的细菌种群中制备质粒DNA并用于转染中国仓鼠卵巢细胞，或其它哺乳动物细胞系。例如，使用如Sambrook等在"MolecularClonmg"中所描述的标准方法完成转染和细胞培养。结果是转染的细胞系稳定表达并且分泌目的抗体分子，例如FVIImAb或包括FVIIAb的VH和VL区的mAb。抗体的变异体可以被容易地产生。例如通过将编码目的Ab的VL和VH的cDNA亚克隆到含有编码kappa轻链恒定区以及IgGl或IgG2或IgG3恒定区的质粒中，可以获得与诸如FVII-3F11A3，FVII-3F3A4和FVII-3F20A1具有完全相同的特异性，但与IgG4是不同同种型的抗本领域常规:汰术进行同种型交换。该技术包括使用直接重组技术(参见，例如，美国专利4，816,397),细月包-细J包融合4支术(参见，例如，美国专利5,916，771),和本领域已知的其它的适宜冲支术。因此，为了包括治疗的各种用途，相对于亲代抗体的同种型，本发明所提供的抗体效应功能可以通过同种型交换被"改变"成例如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgD,IgA,IgE或IgM抗体。实施例2、利用夹心ELISA测定样品中总Vila因子的浓度样品中总VII因子的浓度的测定可以通过使用任意两种对抗两种不同表位的单克隆抗体，例如抗-EGF结构域抗体，利用夹心ELISA而确定将每孔100pL包一皮緩冲液(0.1MNaHC03,pH9.8)的96孔微孔板(来自NalgeneNuncInternational的C96maxisorpNunc-Immunoplate)用1(ig单克隆F9抗-FVII(—抗)在4。C过夜包被。孵育后，用350)iL洗涤緩冲液(20mMHepes,100mMNaCl，10mMCaCl2,0.02%Tween80,pH7.4)洗板4次。洗涤以后，使用350封闭緩沖液(20mMHepes,pH7.4，0.1MNaCl,10mMCaCl2,1%BSA,0.02%Tween80)将孔封闭2.5小时。使用振荡台在室温进行封闭。将与过氧化物酶结合的100^L,lpg/ml单克隆F7抗-FV11(二抗)加入到每个孔中。在稀释緩冲液(20mMHepes,pH7.4,O.lMNaCl,10mMCaCl2,2mg/mlBSA,0.02%Tween80)中，将样品稀释到大约20ngFVII/ml并将20pL上样到各孔中。两套(doubles)0，5,10,20,30和50ng/ml的标准系列以及许多对照也被加入。上样以后，在室温下将板在振荡台上孵育2小时。樣支孔板展示如下表1.ELISA板展示Stdxx=标准xxng/ml，。=对照，U=样品<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>孵育以后，使用350(iL洗涤缓冲液(20mMHepes,100mMNaCl,10mMCaCl2，0.02%Tween80,pH7.4)将板冲洗5次。向每孔加入100pL底物(100mMOPD(邻苯二胺)，溶于50mMNaAc的lmMH202，ImMCaCl2，pH5.2)并于室温下将板放到振荡台上显像，一旦高对照达到OD大约1.2,加入1.25MH2S04停止显像。使用492nm的滤光，用酶标^义读取平一反。使用图3所显示的标准曲线来测定单个孔中FVII的浓度。实施例3、生产活性Vila因子的生产参数的控制使用实施例2所描述的标准FVIIELISA,可以监测一批或者连续的细胞培养物中其产生的总FVII。该具体含量和因此包括完整GLA结构域的FVII的产生可以被使用下述夹心ELISA检测法测定，其基于抗GLA结构域的抗体和抗FVII另一表位的抗体。将每孔lOOpL包浮皮緩冲液(50jig/mlF1A2i20mMHepes，100mMNaCl,10mMCaCl2,pH7.4)的96孔农i孔寿反(来自NalgeneNuncInternational的C96maxisorpNunc-Immunoplate)用5(ig单克隆Fl抗-FVII(—抗)在4°C过夜包被。孵育后，用350洗涤緩冲液(20mMHepes,pH7.4,0.1MNaCl，10mMCaCl2,0.02%Tween80)洗板4次。洗涤以后，使用350iuL封闭緩冲液(20mMHepes，pH7.4,0.1MNaCl，10mMCaCl2,1%BSA，0.02%Tween80)将孔封闭2.5小时。封闭进行2.5小时并且使用振荡台在室温下进行。将与过氧化物酶结合的100(iL，lug/ml单克隆F7抗-FVII(二抗)力口入至']#+孑匕中。在稀释緩沖液(20mMHepes，pH7.4,O.lMNaCl,10mMCaCl2,2mg/mlBSA,0.02%Tween80)中将样品稀l奪到大约75ngFVII/ml并将20^L上样到各孔中。两套O,20，30,50,80,100和130ng/ml的标准系列以及许多对照也^皮加入。上样以后，在室温下将板在振荡台上孵育2小时。微孔板展示如下表2.ELISA板展示Stdxx=标准xxng/ml，C二对照，11=样品<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>孵育以后，使用350(iL洗涤緩冲液(20mMHepes,pH7.4，0.1MNaCl,10mMCaCl2，0.02%Tween80)将板冲洗5次。向每个孔中加入100(iL底物(100mMOPD(邻苯二胺)，溶于50mMNaAc的lmMH202，lmMCaCl2，pH5.2)并于室温下将板放到才上显像，一旦高温对照达到OD大约1.2,加入1.25MH2S04停止显像。使用492nm的滤光，用酶标仪读取平板。使用图4所显示的标准曲线来测定单个孔中FVII的浓度。实施例4、CDI在监控FVII培养上的应用钙依赖指数(CDI)被定义为在使用至少一种GLA结构域特异性抗体(例如，FVII-3F11A3，FVII陽3F3A4或FVII-3F20A1)的ELISA中相应的FVII和在使用任何其它抗体，例如抗EGF(例如F7或F9)的ELISA中相应的FVI之间的比率。实施例5、抗体在免疫亲和纯化上的应用在20mM的Ca^存在时，进4亍免疫亲和纯4匕。通过加入鈣至浓度为10mMCa^以及通过加入tris緩沖液至浓度为lOmM,随后用HC1调至pH8来稳定1000ml的BHK-21培养物上清液，将该上清液通过.45微米的死端过滤器进行过滤。稳定的培养物上清液被上样到用Ca^-依赖型单克隆抗体FVI1-3F3A4封装，固定到PharmaciaSepharose4B的柱中(1.6cm内径xl0cm长=20mlCV)。在上样之前，用5CV的10mMCaCl2,10mMtns,pH8平^f该柱。上样以后，用10CV的2MNaCl，10mMCaCl2,lOmMtris,pH8冲洗该柱。用10CV的30mMEDTA,50mMtris,pH8洗脱结合的FVII。在整个纯化过程中使用12CV/h的流速和5。C的温度。通过加入氯化钾至终浓度50mM来迅速稳定洗脱物。权利要求1、一种单克隆抗体，其只在至少0.05mM二价阳离子存在时，与存在于野生型人类FVII的完整γ-羧基谷氨酸结构域上的表位相结合。2、根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述表位包括SEQIDN0:1的氨基酸残基Phe4,Leu5，Gla6,Gla7，Leu8，ProlO,Glyll,Glal4,Argl5,Glal6,Cysl7，Glal9,Gla20，Cys22,Gla25，Gla26，Ala27，Gla29,Phe31,Lys32，Gla35中的一个或多个。3、根据权利要求1-2中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与下述抗体竟争，该抗体包括(a)轻链可变区，包括SEQIDN0:3的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDNO:5的氨基酸序列；(b)轻链可变区，包括SEQIDNO:7的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDNO:9的氨基酸序列；或者(c)轻链可变区，包括SEQIDNO:ll的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDNO:13的氨基酸序列。4、根据权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括(a)轻链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列第24~34残基的氨基酸序列，轻链CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列第50-56残基的氨基酸序列，轻链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:3的氨基酸序列第89~95残基的氨基酸序列，以及重链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:5的氨基酸序列第33~35残基的氨基酸序列，重链CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:5的氨基酸序列第50-64残基的氨基酸序列，重链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:5的氨基酸序列第99~112残基的氨基酸序列；(b)轻链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:7的氨基酸序列第2434残基的氨基酸序列，轻链CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:7的氨基酸序列第50~56残基的氨基酸序列，轻链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:7的氨基酸序列第89~95残基的氨基酸序列，以及重链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:9的氨基酸序列第33~35残基的氨基酸序列，重链CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:9的氨基酸序列第50~64残基的氨基酸序列，重链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:9的氨基酸序列第99-112残基的氨基酸序列；或(c)轻链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:11的氨基酸序列第24~34残基的氨基酸序列，轻链CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:ll的氨基酸序列笫5056残基的氨基酸序列，轻链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:ll的氨基酸序列第89~95残基的氨基酸序列，以及重链CDR1可变区，包括对应于SEQIDNO:13的氨基酸序列第33~35残基的氨基酸序列，重链CDR2可变区，包括对应于SEQIDNO:13的氨基酸序列第50~64残基的氨基酸序列，重链CDR3可变区，包括对应于SEQIDNO:13的氨基酸序列第99~112残基的氨基酸序列。5、根据权利要求1-4中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包4舌(a)轻链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:3相同的氨基酸序列，和重链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:5相同的氨基酸序列；(b)轻链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:7相同的氨基酸序列，和重链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:9相同的氨基酸序列；或(c)轻链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:11相同的氨基酸序列，和重链可变区，包括至少50%与SEQIDNO:13相同的氨基酸序列。6、根据权利要求1-5中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括(a)轻链可变区，包括SEQIDNO:3的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDNO:5的氨基酸序列；(b)轻链可变区，包括SEQIDNO:7的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDNO:9的氨基酸序列；或者(c)轻链可变区，包括SEQIDNO:ll的氨基酸序列，和重链可变区，包括SEQIDNO:13的氨基酸序列。7、根据权利要求1-5中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是IgGl，IgG2，IgG3或IgG4抗体。8、根据权利要求1-5中任意一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是IgG4抗体。9、一种核酸分子，其编码如上述任意一项权利要求所述的单克隆抗体。10、一种载体，包括如权利要求9所述的核酸分子。11、一种细胞，包括如权利要求10所述的载体。12、一种测定样品中包括完整Y-羧基谷氨酸结构域的FVII多肽的数量的方法，所述方法包括下述步骤(a)在至少0.05mM二价阳离子存在时，将样品与权利要求1-8任意一项所述的第一单克隆抗体相接触；(b)使得存在于样品中的任何FVII多肽与所述第一单克隆抗体相结合以形成第一抗体复合物；(c)将所述第一抗体复合物与对存在于所述FVII多肽上的第二表位特异的可检测的第二单克隆抗体相接触，所述第二表位和所述第一单克隆抗体的表位不同；(d)使得所述第一抗体复合物与所述可检测的第二单克隆抗体相结合以形成第二抗体复合物；和(e)通过检测存在于第二抗体复合物中的第二单克隆抗体的量来检测所述第二抗体复合物的量。13、一种测定样品中包括完整Y-羧基谷氨酸结构域的FVII多肽的数量的方法，所述方法包括下述步骤(a)将样品与对存在于所述FVII多肽上的表位特异的第二单克隆抗体相接触，所述表位与由权利要求l-8任意一项所述的单克隆抗体所鉴定的表位不同；(b)使得存在于样品中的任何FVII多肽与所述第二单克隆抗体相结合以形成第一抗体复合物；(c)在至少0.05mM二1^介阳离子存在时，将所述第一抗体复合物与权利要求1-8任意一项所述的可检测的第一单克隆抗体相接触；(d)使得所述第一抗体复合物与所述可检测的第一单克隆抗体相结合以形成第二抗体复合物；和(e)通过检测存在于第二抗体复合物中的所述第一单克隆抗体的量来检测所述第二抗体复合物的量。14、根据权利要求12或13中任意一项所述的方法，其中所述第二表位存在于所述FVII多肽的EGF-样结构域1或EGF-样结构域2中。15、根据权利要求12-14中任意一项所述的方法，其中所述二价阳离子选自由Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、N^+、Cd2+、Hg2+、Sm2+和Uo2+所组成的组。16、根据权利要求15所述的方法，其中所述二价阳离子是Ca^。.17、根据权利要求15-16中任意一项所述的方法，其中所述二价阳离子以大于0.05mM的量存在，例如大于0.1mM，例如大于0.6mM,例J(口大于lmM,例々口大于5mM。18、根据权利要求15-17中任意一项所述的方法，其中所述二价阳离子以大约0.05mM~大约50mM的量存在，例如大约0.1mM~大约30mM,例如大约0.6mM~大约30mM，例如大约lmM~大约20mM,例如大约5mM~大约10mM。19、根据权利要求12-18中任意一项所述的方法，其中进行所述可片全测抗体的检测的方法选自ELISA,表面等离子体共振以及压电生物传感器。20、一种测定样品中包括完整y-羧基谷氨酸结构域的FVII多肽与FVII多肽总量的比率的方法，包括下述步骤a)通过使用根据权利要求12-19中任意一项所述的方法测定包括完整y-羧基谷氨酸结构域的FVII多肽的量；和b)测定样品中存在的FVII多肽的总量。21、根据权利要求12-20中任意一项所述的方法在生产时优化功能性FVII多肽的产率上的应用。22、、一种从样品中纯化包括完整丫-羧基谷氨酸结构域的FVII多肽的方法，所述方法包括下述步骤(a)将根据权利要求1-8中任意一项所述的抗体与免疫亲和纯化柱偶联；(b)在至少0.05mM二^f介阳离子存在时，将所述样品加入到所述柱中，(c)通过从柱中除去二价阳离子而从柱中洗脱所述包括完整了-羧基谷氨酸结构域的FVII多肽。23、根据权利要求22所述的方法，其中所述二价阳离子是Ca2+,其以大约0.05mM~大约50mM的量存在，例如大约0.1mM~大约30mM，例如大约0.6mM~大约30mM，例如大约lmM大约20mM,例如大约5mM~大约10mM。全文摘要本发明涉及抗FVII的新型抗体，其在测定样品中正确折叠并且完整的FVII的数量上，以及在纯化和工艺优化上的应用。文档编号C07K16/00GK101253197SQ200680031312公开日2008年8月27日申请日期2006年8月31日优先权日2005年8月31日发明者E·M·尼科拉森,H·K·平格尔,J·克拉鲁普申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司