专利名称：采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方法
技术领域：
本发明涉及一种生命工程技术领域的分离方法，特别是一种采用超声强化荷电 超滤改善蛋白质分离行为的方法。
背景技术：
超滤是以压力为驱动力的膜过滤技术，能在较低的操作费用下实现高处理能力 的一种分离过程，已广泛用于蛋白质、酶、干扰素、类毒素、抗毒素、血液制剂等 的分离、浓縮、精制及洗滤等。但膜的低选择性和污染问题严重制约了超滤技术在 蛋白质分离过程中的应用，是目前仍不能替代其它高附加值蛋白质分离的最主要原 因。传统的超滤是基于物理筛分原理实现溶质分离的过程。超滤膜的高选择性必然 是以牺牲膜的通量为代价的，若要获得较高的产物收率，则必须选择较小孔径的 膜，但较小的膜孔径必然造成膜的透过系数减小，从而影响了产物的分离速度。因 此在实际分离过程中必须权衡膜的选择性和透过通量之间的取舍关系，这最终限制 了产物的分离速度和收率。由膜污染引起的透过系数的减少是制约超滤在蛋白质分离中更广泛应用的另一 关键问题。预处理料液、选用改性膜、优化操作条件和清洗膜是目前控制、减少膜 污染的主要措施。不少研究显示湍流促进器、涡流混合、不稳态流、气喷流等技术 也能有效减少膜污染并得到了一定的发展。近年来，利用外力场来强化超滤、减少 膜污染的研究已引起越来越多的关注。外加电场强化超滤的相关研究报道较多，但 由于处理的对象(需带荷电)有限，电极表面易电解，料液中离子的复杂性和高过 程能耗等使之工业化应用推广受到限制。利用超声在流体传递过程中产生的空化作 用、声冲流，辐射压力以及溶质的分散、凝集和变化等特性，超声技术已在悬浮分 离、细胞破碎提取、萃取、结晶、乳化和破乳、超声清洗等各工业过程得到了广泛 应用。己有研究表明利用外加超声场作用的强化超滤可减缓污染层的形成速度，同时对已形成的污染层进行自动、及时、在线地清洗，有效地提高超滤速度。针对蛋 白质超滤分离中膜的低选择性和污染两大问题，目前的措施基本上只侧重于利用超 声强化作用来提高单一蛋白质的通量，而未对选择性和通量进行协同考虑。经对现有技术文献的检索发现，S. Muthukumaran等人在Mechanisms for the ultrasonic enhancement of dairy沐hey ultrafiltration (超声强化乳清超 滤的机理) 一文中(发表在Journal of Membrane Science《膜科学杂志》， 2005， 258: 106—114)采用聚砜超滤膜，在室温(22 — 25。C)条件下超滤分子量 约为24000 g/mol的浓度为6%的乳清，加载超声波(超声频率50 kHz,超声强度 0.02W/cm2) 4小时后发现，膜通量比未加载超声波的同样条件下的超滤过程提高了 50%左右。但文章中并未涉及两种蛋白质分离的过程及分离选择性问题，只对超声 可提高单一蛋白质超滤通量进行了考察。发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种采用超声强化荷电超滤改善 蛋白质分离行为的方法，使其能实现蛋白质的分离速度和收率同时提高的方法，可 有效地提高蛋白质的分离选择性，减少膜污染，自动、及时、在线地清除膜污染并 有效提高膜通量。从而实现分子量相近、高附加值蛋白质的分离，膜的使用寿命的 延长和整个分离过程费用的减少。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤-第一步，在传统的利用筛分原理实现分离的超滤膜上，采用荷电改性技术使膜 成为荷电超滤膜，由待分离蛋白质的分子量大小、等电点和荷电超滤膜的电量确定 待分离蛋白质溶液的环境条件，这样可充分利用荷电超滤膜和蛋白质之间的静电相 互作用，有效地提高蛋白质的分离选择性和产品蛋白质的收率，亦可能实现分子量 相近的蛋白质之间的有效分离。所述采用荷电改性技术使膜成为荷电超滤膜，可以采用现有技术实现，如表面 化学反应、表面涂覆、表面吸附、化学接枝、表面光接枝聚合改性法、等离子体技 术和电子束辐射接枝法等，使膜成为荷电超滤膜。在改性过程中，还可根据不同改 性条件，获得具有不同荷电量的膜。所述荷电超滤膜可以是正电膜也可以是负电膜，其形状可以是平板式，巻式， 中空纤维式或管式。所述待分离蛋白质溶液的环境条件，具体为pH值2 — 11，离子强度lmM-满0mM。第二步，将制备的荷电超滤膜置于超滤装置上，并对超滤装置加载超声波。在 超声环境下的超滤过程中，超声在荷电超滤膜表面附近产生的空化现象以及超声波 在传播过程中使液体产生更高流速形成声流共同作用的结果，可减少浓差极化和膜 污染，达到强化超滤的作用；利用超声在流体传递过程中产生的空化作用和声冲流 等特性，能够有效地减少污染物在膜表面的沉积和膜孔内的吸附，有效提高膜通量 和延长膜的寿命；另外，即使污染物在膜表面沉积和膜孔内吸附，利用超声在流体 传递过程中产生的空化作用和声冲流等特性，可实现自动、及时、在线地除去膜表 面污染物，甚至进入膜孔内去除污染物，从而有效提高膜通量和延长膜的寿命。上述步骤中，可以根据需要选择合适的超声加载方式、超声参数以及超滤过程 操作参数，确保超声在强化超滤，提高蛋白质分离速度和选择性的同时，不造成对 蛋白质和膜材料不可逆的破坏。这里超声加载方式包括将整个超滤装置置于超声波 发生器水浴中，超声波发生器直接贴于膜组件表面，或超声发生器棒作为搅拌棒。 超声参数具体为超声强度为0. 01W/cm2 -30W/cm2，频率为10kHz-2000kHz，超声 发声位置为膜分离表面的上侧、下侧、左侧或右侧，超声加载时间为10min到 24hr。超声加载可以是连续、间歇或脉冲式的。超滤跨膜压差为0.05 MPa-O. 5 MPa，超滤温度为20°C到85°C。超滤方式可以死端或错流操作方式。本发明有效地将荷电超滤膜提高膜的选择性和外加超声场提高膜的通量各自的 优势结合起来，形成了超声强化荷电超滤膜超滤新技术，实现了膜的选择性和通量 的协同提高。本发明公开了一种方便、可行、经济的，在一定程度上同时解决了超 滤在蛋白质分离过程应用中的两大瓶颈问题膜的低选择性和污染问题的分离方 法。对于荷电超滤膜的获取，本发明采用化学反应的方法，即在商业用再生纤维素 超滤膜上，通过与适合的化学试剂进行不同时间的反应，使膜带上不同电量的正电 或负电。这种获得荷电改性超滤膜的方法简单、易行。对于超声技术的实现，只需 将整个超滤装置置于超声波发生器水浴中，或超声波发生器直接贴于膜组件表面，或超声发生器棒作为搅拌棒，无需额外添加复杂设备，操作相当方便。总之，本发 明提供了一种有效改善蛋白质分离行为的方法，能同时提高膜的选择性和通量，同 时提高产品蛋白质的收率和分离速度，在较低的操作费用下实现高处理能力。本发 明能非常有效地减缓膜表面或膜孔内污染层的形成速度，同时可对已形成的污染层 进行自动、及时、在线地清洗，有效地提高超滤速度，延长膜的使用寿命，降低操 作费用。针对待分离的蛋白质体系，通过合理选择荷电超滤膜、溶液环境、超声参 数和超滤过程的操作条件，还可实现传统超滤无法实现的相近分子量蛋白质的有效 分离。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进 行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下 述的实施例。本发明的实施例以牛血清蛋白和D—色氨酸为分离对象。 实施例1(1) 选取截留分子量为100kDa的平板式再生纤维素膜，其表面zeta电位为 一0.8V。采用表面化学反应的改性方法，使该膜与磺酸类物质反应12小时后获得 zeta电位为一10.4V的改性荷负电超滤膜。根据步骤(1)中选取pH值和离子强度 的依据，最终选取待分离的蛋白质溶解在pH=7.0和离子强度为10mM的溶液中， 这样可充分利用荷电超滤膜和蛋白质之间的静电相互作用，有效地提高牛血清蛋白 和D—色氨酸的分离选择性，提高牛血清蛋白的收率。(2) 将步骤(1)获得的荷电超滤膜置于死端超滤装置上，并将整个超滤系 统置于超声波水浴20°C中。超滤过程中的跨膜压差为0.07 MPa，超声强度为 2W/cm2，频率为28kHz，超声发声位置在膜分离表面的下侧10cm，超声发声时间为 60min且连续加载。在此超滤系统和操作参数下进行的超声强化荷电超滤，膜通量 为1.2x10—4m/s，较使用未改性再生纤维素超滤膜和未加载超声超滤过程的通量提 高了 44%; D—色氨酸和牛血清蛋白的分离因子(即D —色氨酸和牛血清蛋白的透 过率之比)为135，较使用未改性再生纤维素超滤膜和未加载超声超滤过程的分离 因子提高了 4. 1倍。实施例2(1) 选取截留分子量为100kDa的平板式再生纤维素膜，其表面zeta电位为 一0.8V。采用表面化学反应的改性方法，使该膜与磺酸类物质反应48小时后获得 zeta电位为—16.8V的改性荷负电超滤膜。根据步骤(1)中选取pH值和离子强度 的依据，最终选取待分离的蛋白质溶解在pH=7.0和离子强度为10mM的溶液中， 这样可充分利用荷电超滤膜和蛋白质之间的静电相互作用，有效地提高牛血清蛋白 和D —色氨酸的分离选择性，提高牛血清蛋白的收率。(2) 将步骤(1)获得的荷电超滤膜置于死端超滤装置上，并将整个超滤系 统置于超声波水浴20°C中。超滤过程中的跨膜压差为0.07 MPa，超声强度为 2W/cm2，频率为28kHz，超声发声位置在膜分离表面的下侧10cm，超声发声时间为 60min且连续加载。在此超滤系统和操作参数下进行的超声强化荷电超滤，膜通量 为1.16xl(T4m/S，较使用未改性再生纤维素超滤膜和未加载超声超滤过程的通量提 高了 40%; D —色氨酸和牛血清蛋白的分离因子为146，较使用未改性再生纤维素 超滤膜和未加载超声超滤过程的分离因子提高了 4. 6倍。实施例3(1) 选取截留分子量为100kDa的平板式再生纤维素膜,其表面zeta电位为 一0.8V。采用表面化学反应的改性方法，使该膜与磺酸类物质反应12小时后获得 zeta电位为一10.4V的改性荷负电超滤膜。根据步骤(1)中选取pH值和离子强度 的依据，最终选取待分离的蛋白质溶解在pH=7.0和离子强度为10mM的溶液中， 这样可充分利用荷电超滤膜和蛋白质之间的静电相互作用，有效地提高牛血清蛋白 和D —色氨酸的分离选择性，提高牛血清蛋白的收率。(2) 将步骤(1)获得的荷电超滤膜置于死端超滤装置上，并将整个超滤系 统置于超声波水浴20°C中。超滤过程中的跨膜压差为0.07 MPa，超声强度为 2W/cm2，频率为45kHz，超声发声位置在膜分离表面的下侧lOcm，超声发声时间为 60min且连续加载。在此超滤系统和操作参数下进行的超声强化荷电超滤，膜通量 为1. 1x10—4m/s，较使用未改性再生纤维素超滤膜和未加载超声超滤过程的通量提高了 33%; D —色氨酸和牛血清蛋白的分离因子为130，较使用未改性再生纤维素 超滤膜和未加载超声超滤过程的分离因子提高了 4. 0倍。实施例4(1) 选取截留分子量为100kDa的平板式再生纤维素膜,其表面zeta电位为 —0.8V。采用表面化学反应的改性方法，使该膜与磺酸类物质反应12小时后获得 zeta电位为—10.4V的改性荷负电超滤膜。根据步骤(1)中选取pH值和离子强度 的依据，最终选取待分离的蛋白质溶解在pH=7.0和离子强度为lOraM的溶液中， 这样可充分利用荷电超滤膜和蛋白质之间的静电相互作用，有效地提高牛血清蛋白 和D —色氨酸的分离选择性，提高牛血清蛋白的收率。(2) 将步骤(1)获得的荷电超滤膜置于死端超滤装置上，并将整个超滤系 统置于超声波水浴20°C中。超滤过程中的跨膜压差为0.07 MPa，超声强度为 2W/cm2，频率为28kHz，超声发声位置在膜分离表面的下侧10cm，超声加载时间为 间歇式地(每隔5分钟加载一次且一次加载时间为5分钟)。在此超滤系统和操作 参数下进行的超声强化荷电超滤，膜通量为1. 15x10—4m/s，较使用未改性再生纤维 素超滤膜和未加载超声超滤过程的通量提高了 35%; D —色氨酸和牛血清蛋白的分 离因子(即D —色氨酸和牛血清蛋白的透过率之比)为130，较使用未改性再生纤 维素超滤膜和未加载超声超滤过程的分离因子提高了 3. 9倍。
权利要求
1、一种采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方法，其特征在于包括如下步骤第一步，采用荷电改性技术使超滤膜成为荷电超滤膜，由待分离蛋白质的分子量大小、等电点和荷电超滤膜的电量确定待分离蛋白质溶液的环境条件，利用荷电超滤膜和蛋白质之间的静电相互作用提高蛋白质的分离选择性和产品蛋白质的收率；第二步，将制备的荷电超滤膜置于超滤装置上，并对超滤装置加载超声波，在超声环境下的超滤过程中，超声在荷电超滤膜表面附近产生空化现象且超声波在传播过程中使液体产生更高流速形成声流，利用它们的共同作用除去膜表面污染物，从而进一步提高蛋白质的分离质量和分离速度。
2、 如权利要求1所述的采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方法， 其特征是，所述荷电超滤膜是正电膜，或是负电膜，其形状是平板式、巻式、中空 纤维式或管式。
3、 如权利要求1所述的采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方法， 其特征是，所述待分离蛋白质溶液的环境条件，具体为PH值2—11，离子强度 lmM-lOOOraM。
4、 如权利要求1所述的采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方法， 其特征是，所述加载超声波，将整个超滤装置置于超声波发生器水浴中，或超声波 发生器直接贴于膜组件表面，或超声发生器棒作为搅拌棒。
5、 如权利要求1或4所述的采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方 法，其特征是，所述加载超声波，其时间为10rain - 24hr。
6、 如权利要求1或4所述的采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方 法，其特征是，所述加载超声波，其加载是连续、间歇或脉冲式的。
7、 如权利要求1所述的采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方法， 其特征是，所述超声，其参数为超声强度为0. 01W/cm2 _30W/cm2,频率为10kHz-2000kHz。
8、 如权利要求1或7所述的采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方 法，其特征是，所述超声，其发声位置为膜分离表面的上侧、下侧、左侧或右侧。
9、 如权利要求1所述的采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方法， 其特征是，所述超滤，其跨膜压差为0. 05 MPa-O. 5 MPa，温度为20°C到85°C。
10、 如权利要求1或9所述的采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方 法，其特征是，所述超滤，其方式为死端或错流操作方式。
全文摘要
本发明公开了一种采用超声强化荷电超滤改善蛋白质分离行为的方法，采用荷电改性技术使膜成为荷电超滤膜，由待分离蛋白质的分子量大小、等电点和荷电超滤膜的电量确定待分离蛋白质溶液的环境条件，利用荷电超滤膜和蛋白质之间的静电相互作用提高蛋白质的分离选择性和产品蛋白质的收率；将制备的荷电超滤膜置于超滤装置上，并对超滤装置加载超声波。本发明能有效地将超声强化提高膜通量和荷电超滤膜超滤提高膜的选择性各自的优势有机结合起来，实现蛋白质的分离速度和收率的同时提高，有效地同时解决了制约超滤技术在蛋白质分离过程应用中的两大瓶颈问题膜的低选择性和污染问题。
文档编号C07K1/00GK101215320SQ200710173278
公开日2008年7月9日 申请日期2007年12月27日 优先权日2007年12月27日
发明者何义亮, 王来欢, 邵嘉慧, 强 靳 申请人:上海交通大学