一种含有糖链的白蛋白、其制备方法及其用途的制作方法

专利名称：：一种含有糖链的白蛋白、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种在特定的氨基酸残基上选择性添加了糖链的新型含職连的白蛋白蛋白质，其制备方法及其用途。更具体地，本发明涉及包含可通过宿主细胞进行^l连修饰的部分氨基酸的变异型白蛋白的该部分氨基酸上选择性地附加了糖链的、含糖链的白蛋白。编码该变异型白蛋白的DNA，通过培养含有该DNA的真核细胞制备该含糖链的白蛋白蛋白质的方法，及该蛋白质作为药物载体的用途。
背景技术：
：人血清白蛋白(以下称为"HSA")广泛分布于体内血液及细胞间液中。其一级结构是由585个氨基酸组成的，不具有结构，且分子量大约为66.5kDa的单纯蛋白质。该蛋白质在肝脏中的作用主要是负责维持血流中的正常渗透压、及维持血液中的液体含量。因此，在多种临床状况下，例如外科手术、休克、烧伤、浮肿引起的低蛋白血症等，存在血管液体损失的状态中，常用HSA进行治疗。此外，HSA起到了作为多种血清分子载体的机能，由于安全性、生物适应性、生物分解性、血中滞留性强，因此在动态特性方面存在问题的药物给药系统(DDS)中可以作为伏选载体。目前存在舰HSA与药物不可逆结合的DDS，禾佣HSA的较长半衰期来提高结合的药物在血中滞留性的方法、以及使用HSA修饰体作为主动输送系统的载体的方法等。在前者中，已经尝试通过基因融合技术使半衰期较短的蛋白质及生理活性肽等作为杂合体表达。另一方面，在后者中，尝试深入研究了阴离子化、阳离子化等调节HSA的物理化学性质的方法，以及通过导入糖结构、肽等存在于细胞表面的受体的识别元ft(装置)，实现精密的动态控制及细胞特异鹏E定(非专利文献1至6)。在肝脏中己知存在识别糖残基及负电荷等的受体。利用这种性质，与琥珀酸及半乳糖、甘露糖等结合的白蛋白可用于对肝脏靶向。然而，在对HSA进行化学1斷布时，了解至lj其具有(1)劇隙合了非常多的糖残基，否则无法识别肝脏；半孚L糖修饰的白蛋白除一瞎每个白蛋白分子上结合10个以上的半乳糖，否则无法识别肝脏(参见非专利文献5)。(2)对肝脏非实质细胞群的细胞特异性劍氐甘露糖及岩藻糖修饰的白蛋白已知可被肝内皮细胞及肝巨噬细胞两种细胞吸收(参见非专利文献6)。(3)!艮难制备均一的结合体，必须找到适当的结合^f牛；等等的问题。因此，强烈希望开发出一种使用非化学手段修饰HSA的方法。非专利文献l:LeeYC等人，Biochemisty15:3956-3963，1976非专禾U文献2:OpanasopitP等人，Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.280:879-889，2001非专利文献3:TakakuraY等人，Int.J.Pharm.105:19-29，1994非专利文献4:YamasakiY等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.301:467477，2002非专禾!j文献5:NishikawaM等人，Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.268:G849-G856,1995非专利文献6:HiguchiY等人，Int.J.Pharm.287:147-154，2004本发明的目的是提供一种可在肝脏、尤其是肝巨噬细胞中特异性移动的、均一的含糖链的白蛋白，更具体是提供血清白蛋白，还提供一种适用于递送至肝脏的DDS的药物载体。本发明人为了达成上述目的，进行锐意研究，得到以下结果禾U用定点诱变法，将N结合型Hf连的共有序列(Asn-X-Thr/Ser)导Ali码HSA的DNA中，il31培养经含有编码所获得的变异型HSA的DNA的表达载,化的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastons)，成功制备了肝脏转移性较高的、在该共有序列的Asn残基上添加添加了高甘露糖型糖链的含糖链的HSA，由此完成了本发明。
发明内容艮P，本发明提供了(1)包含可通过宿主细胞进fi^l修饰的部分氨基酸的变异型白蛋白的该部分氨基酸Jl^择性地附加了糖链的、含m连的白蛋白；(2)，(1)所述的蛋白质，其中糖链是高甘露糖型糖链；(3)上述(1)或(2)所述的蛋白质，其中该部分氨基酸序列至少一个是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是涉及遗传编码的任意氨基酸)；(4)上述(3)所述的蛋白质，该部分氨基酸序列全部是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是涉^it传编码的任EM基酸)；(5)上述(1)-(4)任一项所述的蛋白质，该白蛋白是人血清白蛋白。(6)上述(5)所述的蛋白质，具有与序列号2所示的氨基酸序列中序号1-585所示的氨基酸序列同一的或基本上同一的氨基酸序歹lj，氨基号63所示的氮基酸是Asn和/或氨基,号320所示的氨基酸是Thr或Ser禾口/或氮基lW号494所示的氨基酸是Asn;(7)上述(6)所述的蛋白质，至少氨基酸序号494所示的氨基酸是Asn;(8)—种编码变异型白蛋白的DNA，其中所述的变异型白蛋白含有ffl31真核细胞进fi^ll连修饰的1个以上的部分氨基SW列；(9)一种表达载体，其含有位于宿主真核细胞的功能性启动子的控制下的上述(8)所述的DNA;(10)—种转化体，其通过在宿主真核细胞中导入上述(9)所述的表达载体而获得；(11)上述(10)所述的转化体，其中所述宿主真核细胞是酵母；(12)，(11)所述的转化体，其中所述酵母是毕赤(f*7)属酵母；(13)上述(1)所述的蛋白质的制备方法，包括在培养基中培养上述(10)-(12)任一项所述的转化体，从得到的培养物回收含有的白蛋白；(14)药物，其含有如上述(1)-(7)任一项所述的蛋白质；(15)药物载体，其含有如上述(1)-(7)任一项所述的蛋白质的递皿至肝脏；(16)上述(15)所述的载体，其中耙细胞是肝巨噬细胞；以及(17)药物组合物，其含有能递送至肝脏的医药化合物及上述(15)或(16)所述的载体。本发明的含有糖链的白蛋白可被肝脏、尤其是肝脏的非实质细胞，更具体的是肝巨噬细胞中特异性吸收，因此可用作针对该种细胞的药物载体。例如，可以预见，如果针对肝虚血再灌流障碍的疾病给药在本发明的含有糖f连的白蛋白上结合了抗氧化剂及氧化氮等的产品将具有良好的治疗效果。此外，由于肝脏即使对一条糖链也有强烈的识别作用，因此可以在不对白蛋白本身的结构、机能产生影响的情况下使用。并且，由于是来自基因重组的蛋白质，因此无需担心混入未知病毒等来自血液的制齐啲特有问题，故可安全地施用于人体等。图1示出根据试验例1的、本发明的含有糖链的人血清白蛋白递送至血浆(上)及肝脏(下)的移动性时效变化图。纵轴表示相对于给药量的比例(％)，横轴表示给药后的时间(分)。图2示出在给小鼠的静脉内施用的、mIn标记的琥珀酸修饰(Suo)的牛血清白蛋白(BSA)向血衆(上)、肝脏(中)及肾脏(下)的移动性图(参见非专利文献3)。Suc。-BSA中的n表示在BSA上结合的琥珀酸的数目。參表示0.1mg/kg的BSA给药量，〇表示lmg/kg的BSA给药量，T表示10mg/kg的BSA给药量，V表示20mg/kg的BSA给药量。提示的数据是从非专利文献3摘录的必要内容，追加于纵轴所得。发明详述本发明的白蛋白可列举出血清白蛋白、卵清白蛋白等，血清白蛋白。白蛋白的来源没有特别限制，可举出例如来自人或其它恒温动物(例如牛、猴、猪、马、羊、山羊、狗、猫、兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、鸡、鹌鹑等)的白蛋白，但是考虑到用作药物或药物化合物的载体，优选人白蛋白，更优选AJl清白蛋白(HSA)。以下，虽然是以HAS为例对本发明进行详细描述，但是本领域技术人员基于本说明书所述的内容及公知的其它白蛋白序列信息，能够同样地制得含有糖链的其他白蛋白并加以利用。本发明的含有糖链的白蛋白是包含可ffiil宿主细M^WI修饰的部分氨基酸的变异型白蛋白的该部分氨基酸±^择性地附加了糖链所得的。作为"通过真核细M行IH连修饰的部分氨基酸序列"(以下，也称为"葡糖基化序列")例如N结合型糖链共有序列的Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是所示的遗传编码的氨基酸；在Asn残基上添加糖链)(以下，全部简称为"Asn-Xaa-Thr/Ser")、O结合型内O结合型岩藻糖共有序列的Cys-Xaa-Xaa-Gly-Gly-TMSer(Xaa与如上的定义相同；在Thr/Ser残基上添加糖链)、O结合型葡糖共有序列的Cys-Xaa-Ser-Xaa-Pro-Cys(Xaa与如上的定义相同；在Ser残基上添加MI连添加)等，但是不限于战物质。雌N结合型糖链共有序列Asn-Xaa-Thr/Ser。葡糖基化序列可以是1个也可以是2个以上。虽然糖^l数多的话可改善向肝脏、尤其是肝巨噬细胞的靶向效率，但是如果考虑到保持白蛋白自身的生理机旨扱抗原性问题，添加的擗连数较少时比较有利。正如以下描述的，肝脏的靶向机能并不是单纯地取决于添加的糖链数，由于添加的位置同样很重要，因此M31在大的部位导入葡糖基化序列，就能以较少的数获得优异的耙向效率。由于天然(野生型)白蛋白是单纯白蛋白，因此不具有由真核细胞产生的受到^l连修饰的部分氨基酸序列。因此，本发明的含有糖链的白蛋白由含有上述葡糖基化序列的变异型氨基酸序列构成。本发明的变异型的白蛋白多肽虽然无论由任何方法得到的都可以，但是为了在该多肽中的葡糖基化序列Jl^择性添加糖链，优选ffiil培养含有其编码DNA的真核细胞来提供。虽然含有编码变异型白蛋白的DNA的真核细胞可根据，例如对内在产生白蛋白的细胞(例如肝细胞等)进行自然或人为地(例如EMS等变异诱导剂处理、UV处理等)诱导变异，然后筛选产生含有葡糖基化序列的变异型白蛋白的细胞来获得，但是，可以通过克隆编码白蛋白的DNA，通过基因操作在该DNA内部导入编码葡糖基化序列的MS序列，将得到的变异DNA插入至晗有在适当的宿主真核细胞中能行使功能的启动子的载体中，使之位于该启动子的控制下，利用得到的变异白蛋白表达载^^专化该宿主真核细胞而制得。编码白蛋白的DNA可举出来自人或其它其它恒温动物的基因组DNA、来自的白蛋白产生细胞(例如肝细胞等)的cDNA、合成DNA等。编码白蛋白的基因组DNA及cDNA可从以其产生细胞或组织(例如肝脏等)制备的基因组DNA组分及总RNA或mRNA组分作为模板的聚合,式反应(以下简称为"PCR法")及逆转录膝PCR(以下简称为"RT-PCR法")直接扩增获得。此外，编码白蛋白的基因组DNA和cDNA也可这样克隆，艮P，将上i^人细胞、组织制备的基因组DNA和总RNA或者mRNA的片段插入到适当的载体中制备成基因组DNA文库禾口cDNA文库，通过菌落或者噬斑杂交法或者PCR法，分别进行克隆。文库中使用的载体，可使用噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等中的任一种。作为编码白蛋白的DNA，可以列举出例如含有编码与序列号4所示的氨基酸序列中氨基酸序号1-585所示的氨基酸序列(野生型成熟HSA)同一或基本上同一的氨基酸序列的《序列的DNA等。"与序列号4所示的氨基酸序列中氨基酸序号1-585所示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列"可歹U举出与序列号4所示的氨基酸序列中氨基酸序号1-585所示的氨基酸序歹惧有约80%以上，优选约90%以上，更优选约95%以上，特别伏选约98%以上的同源性的氨基酸序列等。"同源性"是指，应用该
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中公知的数学算法对比2个氨基酸序列时，最适的排列(优选，为了得到最适的排列，该算法在序列的一方或两方导入间隔(gap))中，针对重叠区的所有氨基酸残基的同一氨基酸及其类似氨基酸残基的比率(％)。"對以氨基酸"是指物理化学性质类似的氨基酸，例如芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、月旨肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、极性氨基酸(Gln、Asn)、碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)、侧链小的氨基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等属于同一类的氨基酸。预领赃这些类似的氨基酸间进行置换不会改变蛋白质的表型(即，保守的氨基酸置换)。保守氨基酸置换的具体例在该
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是众所周知的，各种文献中已有记载(例如，参照Bowie等，Science,247:1306-1310(1990))。本说明书中氨基酸序列的同源性，可应用同源性计算算法NCBIBLAST(NationalCenterforBiotechnologyInformationBasicLocalAlignmentSearchTool),按以下条件(期待值=10;允许间隔；阵列(7卜y夕"=BLOSUM62;过滤(7O夕U>夕"))OFF)进行计算。用于确定氨基酸序列同源性的其它算跑括，例如Karlin等，Proc.Natl.AcadSci.US入90:5873-5877(1993)中描述的算法[该算法纳入到NBLAST及XBLAST程序中(2.0版)(Altschul等,NucleicAcidsRes.，25:3389-3402(1997))]、Needleman等,J.Mol.Biol.,48:444-453(1970)中描述的算法[该算法纳入到GCG软件包中的GAP程序中]、Myers和Miller,CABIOS,4:11-17(1988)中描述的算法[该算法纳入到属于CGC序列对比软件包一部分的ALIGN禾辨中(2.0版)]、Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448(1988)中描述的算法[该算法纳入到GCG软件包中的FASTA禾聘，它们同样雌j細。更tti^地是，与序列号4所示的氨基li^列中氨基酸序号1-585所示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列是与序列号4所示的氨基酸序列中氨基,号1-585所示的氨基酸序列具有约80%以上、优选约90%以上，更优选约95%以上、特另iJ鶴约98。/。以上的同一性的氨基,列。所谓含有与序列号4所示的氨基酸序列中氨基酸序号1-585所示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的蛋白质，指的是含有与，序列号4所示的氨基,列中氨基,号L585所示的氨基,列基本上同一的氨基鹏列，并且与含有序列号4所示的氨基酸序列中氮基酸序号1-585所示的氨基酸序列的蛋白质及具有实质上相同活性的蛋白质。对于实质上相同的活性例如白蛋白(尤其是血清白蛋白)的生理机能，例如作为血清分子的载体的机能、维持血浆胶质渗透压的机能等。"实质上同质"指的是这些机能定性地相同。因此，虽然作为血清舒载体的机能等是同等的，但是其程度、蛋白质分子量等量的要素可以是不同的。此外，在编码白蛋白的DNA中，含有例如，(1)序列号4所示的氨基酸序列中氨基酸序号1-585所示的氨基酸序列内缺失了1或2个以上(优选1-30个左右，更4继1-10左右，特别4腿l-fHX2、3、4或5)个)的氨基酸的氨基列；(2)在序列号4所示的氨基,列中氨基辦号1-585所示的氨基列中添加了1或2个以上(ite1-30个左右，更雌1-10个左右，特别优选1-数^(2、3、4或5)个)的氨基酸是的氨基酸序列；(3)在序列号4所示的氨基酸序列中氨基酸序号1-585所示的氨基酸序列中插入了1或2个以上(优选1-30个左右，更iM1-10个左右，特别4腿l-数啊2、3、4或5)个)的氨基酸的氨基,列；(4)游列号4所示的氨基列中氨基号1-585所示的氨基列中1或2个以上(优选1-30个左右，更优选1-10个左右，特另||1-数啊2、3、4或5)个)的氨基酸被其它氨基酸取代了的氨基,列；或者(5)编码含有这些氮基酸序列的组合的蛋白质的DNA等。上述氨基酸序列发生插入、缺失或者置换时，其发生插入、缺失或者置换的位置无特殊限定，只要保持蛋白质的活性即可。到m地是，编码白蛋白(尤其是HSA)的DNA，可以列举含有序列号3所示的碱基序列中MS序号73-1827所示的MS序列的DNA、或含有与序列号3表示的碱基序列在严紧条件下杂交的m序列，且编码与含有J^序列号4所示的氨基酸序列中氨基酸序列号1-585所示的氨基酸序列的蛋白质具有实质上同质活性(例如血清肝的载体机能等)的蛋白质的DNA等。作为与序列号3所示的碱基序列可以在严紧条件下杂交的DNA，可以使用例如与是含有序列号3所示的m序列中碱基序号73-1827所示的碱基序列，在重合领域中具有约80%以上、优选90%以上、更优选95。/。以上同源性的碱基序列的DNA等。本说明书中碱基序列的同源性，可应用同源性计算算法NCBIBLAST(NationalCenterforBiotechnologyInformationBasicLocalAlignmentSearchToo1)，按以下条件(期待值=10;允许间隔；过滤(7O夕U>夕')=ON;匹配值(77f"义-7)=1;错配值($义77*7-7)=國3)进行计算。用于确定氨基酸序列同源性的其它算法，上述氨基酸序列同源性的算法同样适用。杂交可按照公知的方法或基于公知方法的方法，例如，分子克隆MdecularCloning)第2版(J.Sambrooketal.,ColdSpringHarborLab.Press,1989)中描述的方法进行。使用商品化的文库时，杂交可按照使用说明中描述的方法进行。杂交雌在严格餅下进行。高度严格^j牛包括，例如，6XSSC(氯化锹柠檬酸钠)中于45。C进行杂交反应后，在0.2XSSC/0.1%SDS中65。C洗涤一次以上等。本领域技术人员可3131适当改交溶液的盐浓度、杂交反应的温度、探针浓度、探针长度、错配数目、杂交反应的时间、洗涤液的盐浓度、洗涤的温度等，很容易地达到预期的严格程度。编码白蛋白的DNA，可应用具有编码白蛋白(尤其是HSA)的碱基序列的一部分的合成DNA引物，MPCR法进行扩增，或者^l繊入到适当的表达载体中的DNA，与标记的编码白蛋白的一部分或者整个区域的DNA片段或者合成DNA进行杂交，进行克隆。在作为向编码如上所述得到的白蛋白(尤其是HSA)的DNA中，导入编码葡糖基化序列的序列的方法，可以列举例如公知的位点特异性诱变诱导法(例如参见下述实施例的)等。葡糖基化序列编码序列虽然可在编码白蛋白的DNA任意部分中导入，但是在〗OTPCR法的位点特异性诱变诱导情况中，例如当导入编码N结合型HI连的共有序列Asn-Xaa-Thr/Ser的碱基序列时，优选在编码白蛋白的DNA的Asn残基的编码部分或Thr或Ser残基编码部分导入。也就是说，以编码白蛋白的DNA作为模板，以(1)与包括编码白蛋白中任意的Asn-Xaal-Xaa2部分的碱基序列的区域互补的寡核苷酸(但是，对应于Xaa2的密码子被编码Thr或Ser的密码子密码子取代)，或者(2)与包括编码白蛋白中任意的Xaal-Xaa2-Thr/Ser部分的碱基序列的区域互补的寡核苷酸(但是，对应于Xaal的密码子被编码Asn的密码子取代)中任意一种作为引物，通过实施PCR，能导Ai扁码N结合型糖链的共有序列的碱基序列。不仅可以ilil如上所述的氨基酸取代，而且也可以通过利用相同的方法，在编码白蛋白的DNA中插入编码氨基酸(或氨基酸序列)的m序列或使编码氨基酸(或氨基酸序列)的碱基序列从该DNA上缺失，使葡糖基化序列存在于该DNA中。例如，在HSA的情况中，更^m的是，ffl31将序列号4所示的氨基,列中氨基酸序号494所示的Asp残代为Asn(Asn^)残基来导入N结合型^连的共有序列(参见序列号2)。在Asn^上添加了糖链的含有辦连的HSA，尽管舒内IH连数是1个，但可以与根据之前公知的化学修饰得至啲含有辦连的白蛋白(具有多个糖链)以相同或以上的效率靶向肝脏。在其它优选的方式中，可通过将序列号4所示的氨基列中氨基号63所示的Asp残代为Asn残基(Asn63)或者M将氨基酸序号320所示的Ala残代为Thr或Ser残基(Thr/Se严)来导入N结合型糖连的共有序列(参见序列号2)。特别优选的实施方式中，本发明的含有^l连的HSA可含有添加在Asn^上的1个以上的葡糖基化序列，优选是N结合型糖链共有序列Asn-Xaa-Thr/Ser。此夕卜，作为IH连添加部位，可举出Jl^的Asn63禾口/^述Thr/Se严的取代结果所产生的Asn318。将由上述克隆获得的、编码含有能通过真核细Wt行職连修饰的一个以上的部分氨基鹏列的变异型白蛋白的DNA，禾鹏限制酶或DNA连接酶连接到适当的表达载体中的启动子下游，由此制备含有，DNA的表达载体。表达载体可以使用来自大肠菌的质粒(例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来自枯草杆菌的质粒(例如pUB110、pTP5、pC194)、来自酵母的质粒(例如pSH19、pSH15)、入噬菌体等噬菌体、逆转录病毒、痘病毒、杆)l满毒等动物(昆虫)病毒、pAl-ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。所述的启动子可以是适用于表达基因的宿主的任意启动子。在本发明中可用作宿主细胞的细胞，只要是具有可以在本发明的变异型白蛋白中的葡糖基化序列上添加糖链的辦连修饰机制的细胞，贝殿有特别柳蹄ij，可以列举以哺乳动物为代表的动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞、真菌细胞等各种真核细胞、或者转基因动植物或昆虫等。例如，在宿主是酵母的情况中，优选PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。在宿主是动物细胞的情况中，可使用来自巨细胞病毒(CMV)的启动子(例如CMV前期启动子)、来自人免疫缺陷病毒(fflV)的启动子(例如HIVLTR)、来自Rous肉瘤病毒(RSV)的启动子(例如RSVLTR)、来自小鼠乳癌病毒(MMTV)的启动子(例如MMTVLTR)、来自猴子小鼠白血病病毒(MoMLV)的启动子(例如MMTVLTR)、来自单纯疱疹病毒(HSV)的启动子(例如HSV胸苷激斷TK)启动子)、来自SV40的启动子(例如SV40初期启动子)、来自EB病毒(EBV)的启动子、来自腺伴随病毒(AAV)的启动子(例如AAVp5启动子)、来自腺病毒(AdV)的启动子(Ad2或Ad5主要后期启动子)等。在宿主是昆虫细胞时，优选多角体蛋白启动子、pl0启动子。作为表达载体，除上述之外，根据需要，还可以使用含有增强子、剪切信号、PdyA添加信号、选择标记、SV40复制起点等的载体。选择标记例如二氢叶酸还原酶(dhfr)基因[氮甲蝶呤(MTX)抗性抗性]、氨节青霉素抗性(AmpO基因、新霉素抗性(NeoO基因(G418抗性)等。特别是，在使用缺失dhfr基因的中国仓鼠(CHO-dhfr)细胞并使用dhfr基因作为选择标记的情况中，还可1不含有胸腺嘧啶核苷的培养基:择目的基因。此外，在插入的DNA不含有起始密码子及终止密码子的情况中，使用在启动子区域的下游及终止子的上游区域上分别含有起始密码子(ATG或GTG)及终止密码子(TAG、TGA、TAA)的载体。此外，必要的话，可在编码变异型白蛋白的DNA的5'末端侧添加编码适合宿主的信号序列的碱基序列(信号密码子)。例如，在宿主是酵母时，可使用MFot信号序列、SUC2信号序列等，但是在宿主是动物细胞时，贝何分别使用胰岛素信号序列、a-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。然而，由于已知5HSA的天然prepro序列(序列号4所示的氨基|列中氨基|号-24至-1所示的氨基酸序列)在大部分异种真核细胞中具有分泌信号的机能，因此，可在表达载体中直SI菌/i扁码preproHSA的DNA。如上所述，宿主可以使用例如酵母、昆虫细胞、昆虫、动物细胞、动物等。酵母可以4顿例如酿i鹏母(Saccharomycescerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B曙12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)NCYC1913、NCYC2036等。例如在病毒是AcNPV的情况中，昆虫细胞可以是来自夜盗蛾幼虫的株化细胞(spodopterafrugiperdacell;Sf细胞)、来自粉纹夜蛾(Trichoplusiani)中肠的MG1细胞、来自粉纹夜蛾卵的HighFive，细胞、来自甘蓝灯蛾(Mamestrabrassicae)的细胞、来自Estigmenaacrea的细胞等。在病毒是BmNPV的情况中，昆虫细胞可以使用来自蚕的株化细胞(BombyxmonN细胞；BmN细胞)等。该Sf细胞可以使用例如Sf9细胞(ATCCCRL1711)、Sf21细胞(以上，Vaughn,J.L.等，InVivo，13，213-217(1977))等。昆虫可以使用例如蚕幼虫等。动物细胞可以使用例如来自猴的细胞(例如COS-l、COS-7、CV-1、Vero)、来自仓鼠的细胞(例如BHK、CHO、CH0-K1、CHO-dhfr)、来自小鼠的细胞(例如:N1H3T3、L、L929、CTLL-2、AtT腸20)、来自大鼠的细胞(例如:H4HE、PC-12、3Y1、NBT-II)、来自人的细胞(例如HEK293、A549、HeLa、HepG2、HL-60、Jurkat、U937)等。可根据宿主的种类，按照公知方法进行转化。可根据例如MethodsinEnzymology,194,182-187(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.US入75,1929(1978)等记载的方法进行酵母的转化。可根据例如BioATechnology,6,47-55(1988)等记载的方法进行昆虫细胞及昆虫的转化。可根据例如细胞工学别册8新细胞工学实验操作手册，263-267(1995)(秀润社发行)、Virology,52，456(1973)中记载的方法进行动物细胞的转化。可根据宿主的种类按照公知方法进行转化体的培养。培养S^，是液体培养基。此外，培养基tt^含有对转化体繁殖所必需的碳源、氮源、无机物等。其中，碳源，可以列剩列如葡糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等；氮源，可以列举例如铵盐类、硝酸盐类、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、大豆饼、马铃薯提取液等有机或有机物；无机物，例如氯化药、磷酸二氢钠、氯化镁等。此外，还可在培养基中添加酵母提取物、维生素类、生长舰因子等。培养基的pHl腿是约5-8。作为培养宿主是酵母的转化体时的培养基例如Burkholder基本培养基、含有0.5%酪蛋白氨基酸的SD培养基等。培养基的pH^i^约5-8。培养通常在约2(TC-35t:的温度中进行约24-72小时。必要的话，还可通气拌。作为培养宿主是昆虫细胞或昆虫的转化体时的培养基，可以使用例如在Grace'sInsectMedium中适当地加入失活的、10%牛血清等添加物的培养基等。培养基的pH优选是约6.2-6.4。i咅养通常在约27。C的温度中进行约3-5天。必要的话，还可通气并搅拌等。作为培养宿主是动物细胞转化体时的培养基，可以使用例如含有约5-20%的胎儿牛血清的极限必须培养S(MEM)、Dullbecco极限必需培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基等。培养基的pH，是约6-8。培养通常在30tM(TC的温度中进行约15-60小时。必要的话，还可通气拌等。如上所述可以使含有糖链的白蛋白在转化体的细胞内或细胞外生成。本发明的含有糖链的白蛋白由于优选用作向肝脏、尤其是肝巨噬细胞特异性移动的载体分子，因此更优选添加了与该细胞表面的受体亲和性高的高甘露糖型糖链白蛋白。其中，"高甘露糖型"指的是在核心糖链(含有3分子的甘露糖)上添加了l个以上、4腿2个以上、更j继3个以上、特别5个以上甘露糖分子的糖链。从这种观点出发，较之于可以进行高甘露糖型、复合型及混合型的不同的糖链修饰的动物细胞及昆虫细胞、可以只添加高甘露糖型糖链，且与动物细胞等相比，添加含有多个甘露糖分子的超甘露糖型糖链的酵母作为宿主细胞更为优选。其中，毕赤酵母(Pichia)属酵母可能以甲醇作为唯一碳源进行增殖、一旦使之在甲醇中繁殖，发现对甲醇及其代谢中间体的处理所必需的酶被解除抑制。已知如果利用这种甲醇同化途径，异种蛋白质的分泌量大大超过酵母菌属酵母。实际上，利用这种系统的HSA制备已经进入实用化阶段(例如参照特开平6-22784号专利公报)，在lL的培养基中肖蹄幌10g量级的HSA。以下，作为本发明特别优选的实施方式中的1个，对使用毕赤属酵母作为宿主细胞的本发明的含有糖链的白蛋白的制备方法进fiH兑明。所用的载体无特殊限制，只要能在毕赤酵母属酵母菌体内进行自我复制，舰重组至鹏母基因组内能维持基因的稳定性即可。能进行自我复制的载体包括，例如YEp载体、YRp载体、YCp载体等。另外，能重组至lj酵母基因组内的的载体包括YIp载体、YRp载体。育^在毕赤酵母属酵母中能够发挥作用的启动子包括，酵母来源的启动子，例如，酿酒酵母来源的PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等、巴斯德毕赤酵母来源的乙醇氧化酶(AOX)1启动子、AOX2启动子、二羟丙酮合酶启动子、P40启动子、ADH启动子、叶酸脱氢酶启动子等。另外，，酵母来源的启动子，也可是为了提高基因表达效率而经过修饰的变异型启动子，例如突变型AOX2(mAOX2)启动子[Ohietal.,Mol.Gen.Genet.,243,489499(1994);特开平4-299984号公报]等。优选，该启动子是为了利用毕赤酵母属酵母的甲醇代谢体系、甲醇或者其代谢中间体的处理所必要的因的启动子，例如、A0X1启动子和mAOX2启动子等、更优选AOXl启动子。本发明的包含编码变异型白蛋白的DNA的表达载体，tt^包含能在毕赤酵母属酵母中发挥功能的转录终止序列(终止子)(例如、AOX1终止子等)、增强子序列、能用于酵母筛选的标记基因(营养缺陷型基因，例如，巴斯德毕赤酵母或者酿酒酵母来源的HIS4、LEU2、ARG4、URA3基因等、或者抗生素抗性基因、例如、针对放线菌酮、G—418、氯霉素、博莱霉素、潮霉素等的抗性基因等)等，还可包含预期的能在酵母中发挥作用的可复制单位。为了大量制备载体，更包含能在大肠杆菌中发挥功能的复制单位和用于大肠杆菌筛选的筛选标记基因(例如、氨节青霉素和四环素的抗性基因等)。当表达载体是重组到酵母基因组内的载体类型时，期望该载体还包含与有必要进行同源重组的酵母基因组同源的序歹i」。这些同源序列包括上述营养缺陷型基因的序列。因此，在的一个实施方式中，本发明的表达载体是在营养缺陷型基因内插入了，变异型白蛋白的表达盒(本说明书中"表达盒"是指可能进行基因表达的单位，是在启动子的调控下配置了蛋白质编码序列的最小单位，优选是由启动子_蛋白质编石紫貢域一终止子构成的单位)。可应用公知的转化技术，例如、感受态细胞法、原生质体法、磷酸钙共沉淀法、聚乙二醇法、锂法、电穿孔法、显微注射法、月旨质体融合法、粒子枪法等、将如上所得表达载体导入到目的毕赤酵母属酵母菌体内。本发明中应用的毕赤酵母属酵母无特殊限定，包括例如、巴斯德毕赤酵母、金合欢毕赤酵母(尸;C/^)、安格斯毕赤酵母(尸/c/^朋gZ^to)、异常毕赤酵母(尸/c/zz'a""oma/")、尸/c/z/"ca/75^/a/a、西弗毕赤酵母(尸/c/zz'ac^/^rz7)、i矣切尔氏毕赤酵母(尸z'c/n'aefc/e〃w7)、尸/c/z/"y^//am7、^b、状毕赤酵母(尸z'c/z/aT^f〃力cwa)、季也蒙氏毕赤酵母(尸/c/z/agwz'〃/ermowd//)、尸/c/n'(2z'wcwYovora、尸/c/z&7'(3(i/w7、甲酉享毕赤酵母(尸/c/z/ame/^awo/Zca)、拥P威毕赤酵母(尸/c/zz'(3won^ge"w^)、尸z'c/z/a(/wwae"w's、丰公毕赤氏酵母(尸/c/^'ap/"船)等。优选巴斯德毕赤酵母中的营养缺陷型突变巴斯德毕赤酵母株(例如、巴斯德毕赤酵母GTS115株(HIS4-)[NNRLY_15851]、巴斯德毕赤酵母GS190株(ARG4-)[NNRLY—18014]、巴斯德毕赤酵母PPF1(HIS4-，URA4-)[NNRLY—18017]等)。转化后的毕赤属酵母，通过使用本
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通常使用的方法培养，可产生含有糖f连的白蛋白。所应用的培养基必须至少包含宿主细胞生长必要的碳源和无机或者有机氮源。作为碳源，有甲醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、可溶性淀粉等。另外，作为无机或者有机氮源，有铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、酵母提取物、大豆粕、马铃薯("'^^)3)提取液等。还可包含预期的其它营养元素，例如，氯化辛丐、磷酸二氢钠、氯化f美等无机盐，生物素等维生素类以及抗生素等。所应用的培养基包括，例如，通常的天然培养基(例如，YPD培养基、YPM培养基、YPG培养基等)或者合成培养基。培养基的pH和培养、皿，可采用适于酵母增殖和人血红蛋白产生的pH和温度，但优选，例如、pH约5约8、培养纟鹏约20约3(TC。另外，必要时，可进4彌气搅拌。通常进行大约48120小时的培养。例如、当毕赤酵母属酵母菌体内发挥作用的启动子使用AOX1启动子、mAOX2启动子等能通过甲醇诱导表达的启动子时，最优选的示例是，应用含甘油作为菌体增殖的碳源、包含白蛋白的表达诱导因子甲醇、pH控制在大约6.0的天然培养基进行液体通气搅拌培养的方法。当白蛋白的表达对菌体的生长不利时，更优选，首先用甲醇以外的碳源增加菌体量，然后添加甲醇诱导白蛋白的表达的培养方法。另外，用罐发麟的培养中，高密度培养法是适于人血红蛋白产生的方法。培养可用分批培养、流加培养、连续培养任一种方式进行，但优选流加培养法。即，一定期间内，在含有适于宿主菌体增殖的碳能源(例如葡萄糖等)和/或者营养源的培养基(初期培养基)中培养宿主菌体，根据情况，从某个时间点向该培养基中追加供给支配白蛋白表达的基质(即甲醇)，一直到培养终了时也不将人血红蛋白分离出体系外的方法(例如、参照特开平3—83595号公报)。可将培养终了后的培养物进行离心和/或者过滤，回收酵母菌体，接下来，按照公知的方法从菌体中进行分离纯化培养物中产生的人血红蛋白。这些方法，可应用盐析和溶剂沉淀法等利用溶解度的方法；透析法、超滤法、凝胶过滤法、和SDS—聚丙烯,安凝胶电泳法等为主的禾,分子量差的方法；离子交换色谱等利用电荷差的方法；亲和色谱等利用特异亲和性的方法；逆相高速液体色谱等利用疏水性差异的方法；等电点电泳法等利用等电点差异的方法等。这些方法也可ia纟于适当组合使用。分离纯化出的人血红蛋白的验证方法，包括公知WesternBlotting法和活性测定法等。此外，还可ilil氨基酸分析、N末端氨基酸测序、一级结构分析、^f连分析等方法分析纯化的含有糖f连的白蛋白的结构。这样获得的含有糖链的白蛋白由于是向变异型白蛋白的糖基化序列选择性添加了糖链，优选高甘露糖型糖链的均一的糖蛋白质，因此向肝脏的非实质细胞、尤其是肝巨噬细胞的移动性较高。因此，本发明还提供了一种含有如上所述的本发明的含有辦连的白蛋白的向肝脏超老的药物载体。以本发明的含有糖链的白蛋白(尤其是HSA)为主要成分的本发明的药物载体可以传送至肝脏，肝脏的非实质细胞、尤其是肝巨噬细胞，可用于将预防和/或治疗上有效的任意医药化合物耙向于娜器或细胞。这种医药化合物例如抗氧化物(例N-乙酰半胱氨酸、抗坏血酸等)、氧化氮等。使该药物化合物结合到本发明的含有糖链的白蛋白上的制剂可用于肝虚血再灌流障碍的治疗。此外，作为其它医药化合物，还可举出肝纤维症治疗药OK432等肝脏药物等。并且，白蛋白这种物质由于其本身具有抗氧化作用，因此可用作抗氧化作用的医药品。含有擗连的白蛋白与医药化合物的结合形式没有特别限制，但例如共价结合、氢结合、疏水结合等，优选共价结合。使白蛋白与医药化合物的结合方法是公知的，例如可参见《给药系统》(1986年，CMC发行)。医药化合[含有糖链的白蛋白结合体可fflil公知方法(超滤、除菌过滤、分注、冻干等)制成制剂。具体以列举，含有5-25%该结合物，pH在6.4-7.4左右的范围，渗透压为1左右的液状制剂。该制齐咖果必要的话可加入作为稳定剂的乙酰色氨酸或其盐(例如，钠盐)及辛酸钠。稳定剂的、添加量，可以列举例如是0.01-0.2M，优选0.02-0.5M左右。此外，钠含量可以列举3.7mg/ml以下。可在超滤、除菌过滤、分注、冻干等处理前添加该稳定剂。虽然上述方法得到的本发明的医用制剂受到各种微生物污染的可能性很低，但是还可进行无菌填充后的加热处理(巴氏灭菌法)来使夹杂的微生物失活作为积极地确保制剂无菌性的手段。力口热处理是将与给药单位相当的向容器中填充的制剂填充到任意的容器中的处理，例如约50-约7(TC(iM约60。C)的7]C浴中保J转勺30併中以上，使夹杂的微生物彻底地失活。加热时间，是约30分钟-约2小时。该医药制齐,如可作为注射剂给药给人或其它哺乳动物等。该制剂的给药量根据医药化合物的种类、给药途径、病情的严重程度、给药对象的物种、给药对象的药物接受性、体重、年龄等而不同，例如在含有氧化氮作为有效成分的肝虚血再灌流障碍治疗剂的情况中，通常，成人每天，在约5-约10ml溶液中含有0.1-30ug/kg氧化氮量、优选0.5-3ug/kg，含有约0.1-30mg/kg糖链的白蛋白量、优选0.5-3mg/kg的范围，缓慢地静脉内注射或点滴静脉内给药。白蛋白(尤其是HSA)本身作为医药可适用于例如主要是休克时的急速血浆增量、补充循环血流量、改善低蛋白血症、维持胶质渗透压等目的。具体的效育扱效果是对白蛋白损失(热伤、肾病症候群等)及白蛋白合成低下(肝硬化等)的低白蛋白血症、出血性休克等有效。因此，本发明的含有糖链的白蛋白还可用作改善这些疾病和状态的医药。这种情况与，相同可将其制成注射剂的剂型。白蛋白制齐啲给药量根据给药途径、病情严重度、给药对象及物种、给药对象的药物受容性、体重、年龄等不同而不同，通常成人一次给药HSA25。/o溶液20-25ml(HSA5-12.5g)，缓慢地静脉内注射或点滴静脉内给药。虽然根据以下实施例将更具体地说明本发明，但是本发明不受到这些实施例的限制。(1)白蛋白基因的变异在质粒pPIC9中导入人血清白蛋白基因所得的质粒作为(以下为pPIC9-HSA)模板，用序歹ij号5(5，-GAGTCAGCTGAAAATTGTAACAAATCACTTCATACCC-3，)的D63N有义引物，列号6(5'-GGGTArGAAGTGATTTGTTACAATTTTCAGCTGACTC-3')的D63N反义弓卿作为合成弓l物制备含有Asi^结合型辦连的白蛋白；用序列号7(5'-GGATGTTTGCAAAAACTATACTGAGGCAAAGG-3')的A320T有义引物及序列号8(5'-CCTTTGCCTCAGTATAGTTTTTGCAAACATCC-3')的A320T反义弓嫩作为合成弓胸制备含有Asn318结合型擗连的白蛋白；用序列号9(5，-GCTCTGGAAGTCAATGAAACATACGTTCCC-3')的D494N有义引物及序列号10(5'-GGGAACGTATGTTTCATTGACTTCCAGAGC-3，)的D494N反义弓胸作为合成弓吻制备含有Asn，结合型^f连的白蛋白，由ltbiS行N结合型糖链的共有序列的变异(QuikChangeXLSite-DirectedMutagenesisKit、Stratagene)。作为变异的反应条件，是将DNA在95'C时处理30秒后，变性(95。C、30秒)、退火(55°C、1么H中)及延伸(68°C、10分钟)的反应循环进行12次。反应后，用DpnI消化了的模板的质粒，将得到的pPIC9-HSA(D63N)、pPIC9-HSA(A320T)、及pPIC9-HSA(D494N)分别导入XL-10-Goldultracompetentcell中进行转化。导入了目的质粒pPIC9-HSA(D63N)、pPIC9-HSA(A320T)、及pPIC9-HSA(D494N)的转化体在添加了氨苄青霉素的培养基中进行筛选，从得到转化体中纯化质粒(QIAprepSpinMiniprepKit、QIAGEN制)。采用ABIPnsm310基因分析仪(AppliedBiosystems)，用序列号11(5'-GAAAATTTCGACGCCTTGGTGTTGATTGCC-3，)的D63N测序引物对pPIC9-HSA(D63N)进行变异确认；用序列号12(5'-GGCGGACCTTGCCGACTATATCTGTGA-3')的A320T测序引物对pPIC9-HSA实施例(A320T)进行变异确认；以及用序列号13(5'-GGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGG-3')的D494N测序引物对pPIC9-HSA(D494N)进行变异确认。此外，将以上制得的pPIC9-HSA(D63N)作为模板、将序列号7的A320T有义引物及序列号8的A320T反义引物作为合成引物，同样地，进行N结合型IB连的共有序列的变异(QuikChangeXLSite-DirectedMutagenesisKit、Stratagene)制备Asn63、Asn318、Asn柳的三部位上全部结合糖链的人血清白蛋白。将这样制得的pPIC9-HSA(D63N/A320T)作为模板，将序列号9的D494N有义引物及序列号10的D494N反义引物作为合成引物，与上相同:ttt行变异(QuikChangeXLSite-DirectedMutagenesisKit、Stratagene)，制得pPIC9-HSA(D63N/A320T/D494N)。(2)含有糖链的AiftL清白蛋白的表达pPIC9-HSA(D63N)、pPIC9-HSA(A320T)、pPIC9-HSA(D494N)及pPIC9-HSA(D63N/A320T/D494N)分别用限制酶SalI消化、苯酚提取、乙醇沉淀纯化后，用电穿孔装置(GenePulsernElectroporationSystem、BIO-RAD制)M与毕赤酵母酵母(GS115株)的HIS4基因座同源重组而进行的转化。得至啲转化條BMMY液体培养基中培养，确认表达白蛋白后，用甘油储存。(3)含有^f连的白蛋白的纯化转化的毕赤酵母酵母在BMGY液体培养基中培养48小时，随后在BMMY士咅养基中在每隔12小时添加1%甲醇的同时培养96小时。离心分离(6000X106H中)分离酵母后，用200mM醋酸缓冲M"培养的上清、Mfi^析。随后，使白蛋白结合到BlueSepharoseCL-6B柱(77、>气厶"<才寸工>;^社制)上，用0—3MNaCl浓度梯度洗脱白蛋白。然后，在0.65M硫酸铵/100mM磷勝内缓冲液(pH7.0)中透析洗脱液后，JI)lHiTrapPhenylHP柱(77、>气厶"1才廿4工>》社制)，回收未吸附部分。进行活性炭脱脂。对照例l不含有糖链的(野生型)人血清白蛋白的制备除了不进行N结合型糖链的共有序列的变异之外进行与实施例相同的步骤，在毕赤酵母酵母中表达不含有糖链的人血清白蛋白，得到人血清白蛋白(HSA)。(4)微例l将以与实施例同样方式制备的含有糖链的白蛋白，用放射性同位素铟(mIn)标记，制得含有mIn糖链的白蛋白(D63N、A320T、D494N及D63N/A320T/D494N)。将含有'"In糖链的白蛋白经小鼠的尾静脉给药(给药量lmg/kg)，给药后每隔一段时间取血及肝脏，用放射线量测定仪器测定白蛋白浓度及肝脏移动性。将作为对照的对照例1得到的AJl清白蛋白用mIn标记，将minAl&清白蛋白给药小鼠，进行相同测定。图l示出了血浆及肝脏中含有糖f连的白蛋白相对于给药后经过的时间与给药量的浓度比例，也就是向肝脏的移动性(肝积累(Hepaticaccumulation)(%剂量))。根据图1的结果可以看出，含有糖链的白蛋白，尤其是D494N及D63N/A320T/D494N从血中迅速消失，活跃地被吸收到肝脏内。此外由于D63N、A320T及D494N之间在体内动态显著不同，因此，示出含有糖链的白蛋白的向肝脏移动性除了依赖于分子表面的糖密度，还很大程度依赖于糖链的结合部位。(5)微例2用laserelectrophoresis-zatapotentialanalyzer(LEZA-500T)来评j介实施例的含有川In^!连的白蛋白(D63N、A320T、D494N及D63N/A320T/D494N)及对照例1的人血清白蛋白的电荷状态。如表1所示与不含有糖链的白蛋白(HSA)相比，本次制得的变异体在电荷上未见有明显的差别。因此，S31真核细胞受至赚链修饰的白蛋白相较于没有受到糖链修饰的白蛋白来说，在蛋白质电荷上的区别很小，完全保持了原本蛋白质盼性质。另一方面，从图1读取60併中时的向肝脏的移动性(肝积累(％剂量))的情况中(表1)，与不含有糖链的白蛋白(HSA)相比，含有糖链的白蛋白是其6-65倍。也就是说，在保持了白蛋白蛋白质性质的同时还很大地提高了向肝脏的移动性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>序列表<110〉NiproCorporation<120>含^H链的白蛋白、其讳恪方扱其用途<130〉A7649<160>13<170〉Pat,entlnversion3.3<210〉<211><212><213〉11827DNA人工的<220><223〉编码具有糖基化位点的突变HSA的DNA<220><221><222>CDS(1)..(1827)<220〉<221><222>sig—肽(l)..(54)<220><221><222>ma.tj太(73)..(1827)<400〉1atga.agt,gggtaaccttta.ttteccttctttttetctttagetcggetMetLysTrpValThrPhelieSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAla-20-15-1048tatteca,ggggt,gtgtttcgtcgagatgcacacaagagtgaggttgetTyrSerArgGlyValPheArgArgAspAlaHisLysSerGluValAla_5-l1596ca.teggttta.aagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtgttgHisArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeu101520144attgcctttgetcagtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgtalieAlaPheAlaGinTyrLeuGinGinCysProPheGluAspHisVal25303540192aaattagtga,atLysLeuValAsngaagta,GluVal45actgaatttgcaThrGluPheAla50aaaacatgtLysThrCysgttgetValAla55gatAsp240gagteagetgaaaattgtGluSerAlaGluAsnCys60racaaateacttcataccctttttggagacXaaLysSerLeuHisThrLeuPheGlyAsp6570288a,aattat,gcLysLeuCys75a,ca,ThrgttValAlaactcttThrLeu80cgtg犯Glua_ccThrtatggtTyrGly85gaaatgGluMetgetAla336AsptgcCys90tgtCysgcaAlaaaaLyscaaGingaacctGluPro95gagGluagaArgAsng肌tgcGluCys100ttcPhettgLeucaaGin384cacHis105LysgatAspAsp肌cAsncca_Pro110aacetcAsnLeucccProttgLeu115gtgaga.ValArgccaProgagGlugttVal120432gat,AspgtgValMettgcCysactgetThrAla125tttcatPheHisga,cAspa,atAsn130gaaGlugagacaGluThrtttPhettgLeu135aaaLys480aaalyst￡lCTyrttaLeutatTyr140ga^attgccagaGlulieAlaArg卿145catHiscctProta,ctttTyrPhetatTyr150gCGAlaccgPro528gaaetccttttctttgetaaaaggtataaagetgettttacagaatgtGluLeuUuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCys155160165576tgccaagetgetgataaagetgcctgcctgttgccaaagetcgatgaaCysGinAlaAlaAspLysAla.AlaCysLeuLeuProLysLeuAspGlu170175180624cttegggat,gaaggga,agget.tegt.ctgccaaacagagaetcaagtgtLeuArgAspGluGlyLysAlaSerSerAla,LysGinArgLeuLysCys185190195200672gccagtetccaaaaatttggagaaaga,getttcaaagcatgggcagta,AlaSerLeuGinLysPheGlyGluArgAlaPheLysAlaTrpAlaVal205210215720getAlacgcctgLeuageSer220cagagatttcccGinArgPheProaaaLys225getAlagagGlutttgcaPheAlaGlu230gttValtecSer768aagt.tagtgLysLeuVal235aca,gatThrAspcttaccLeuThr肌a,Lys240gtcValca.cacgHisThrgeta,GlutgcCys245tgcCyscatHisGly816gatctgcttAspLeuLeu250gaatgtGluCysgetgatAlaAsp255gacAspArggcggacAlaAspcttLeu260gccAlaaagLystatTyratelie864tgtgaaaatCysGluAsn265GinAsptegateSerlie270tecSerSeraaactgLysLeu275LysGlutgcCystgtCysgaaGlu280912aaacctLysProLeuttgLeugaaGlu285aaatecLysSerHistgcCyslie290gccAlag肌GlugtgValGluAsn295gatAsp960gagatgGluMetcctProgetAla300AspttgLeucctProteaSerLeu305getAlagetAlagatAsptttPhegttVal310GluagtSer1008aa,ggatLysAspgttVal315tgcCysa.aaLysAsntatTyrret320gagGlugcaAla鄉LysgatAspgtcVal325ttcPhectgLeuGly1056atgt,ttMet,Phe330ttgLeutat,TyrGlutat,丁yrgca.Ala335卿agg/Vrgcat,HiscctProgat,Asp340TyrtctSergtcValgtgVal1104ctgctgLeuLeu345ctgLeu卿ArgcttLeugccAla350LysThrtatTyrg肌GluaceThr355actThretaLeugagGluaagLystgcCys3601152tgtgccCysAlagetAlagcaAlagatAsp365cctProcatHisGlutgcCystatTyr370gccAlaLysgtgValttcPhegatAsp375g犯Glu12001.11aa.a.PheLyscctProctt.Leu380gtgValgaaGlugagGlucctProGin385AsnttaLeuatelieLysGin390aatAsntgtCys1248gagcttGluLeutttPhe395gagGlucagGincttLeuggaGlygagGlu400tacTyraa,aLysttcPheGinaat,Asn405gcgAlaetaLeuttaLeu1296gttcgtValArg410Tyra,ccThr呵LysLysgta.Val415cccProGingtgValteaSeract,Thr420CC3ProactThrcttLeuVal1344gaggtcteaagaaacetaggaaaagtgggcageaaatgttgtaaacat1392GluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHis425430435440cctProg肌gcaaaaGluAlaLysa.ga.atgArgMet445cccProtgtCysgca,AlagaagacGluAsp450ta,tTyretaLeutecSerVal455gtcVal1440ctgLeuAsncagttaGinLeu460tgtgtgCysValttgLeucatHisgagGlu465aaa,acgLysThrccaProgtaValagtSer470AspArg1488gtcValaccThraaatgcLysCys475tgcacaCysThrgaaGlutecSer480ttgLeugtgVal肌cAsnaggArgcga485ProtgcCystttPhe1536teaSergetAla490ctggaaLeuGlugtcratValXaag肌Glu495ThrtacTyrgttValcccProL>ys500gagGlutttPhe肌tAsngetAla1584gaaGlu505acaThrttcaccPheThrttccatgcaPheHisAla510gatAspatalietgcCysacaThr515cttLeutctSergagGlu肪ggagGlu5201632agaArgGinat,caa.glieLysaaacaaa.ct,LysGinThr525gca.AlacttLeugttVal530gagGluetcLeugtgValaaaLyscacHis535aagLys1680cccPro呵Lysgca,a,caAlaThr540aaagagcaaLysGluGinctgLeuLys545getAlagttValatgMetgatAspgatAsp550ttcgcaPheAla1728getAlatttPhegtagagValGlu555aagtgctgcLysCysCys肌gLys560getAlagacAspgatAspaagLysgagGlu565accThrtgctttCysPhe1776gccAlagagGlu570gagggtGluGlya.aa.aaacttLysLysLeu575gttValgetAlagcaAlaagtSercaaGin580getAlagccAlattaggcLeuGly1824ttaLeu5851827<210>2<211〉609<212>PRT<213>人工的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage28</image>GluMetProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPheValGluSer300305310LysAspValCysLysAsnTyrXaaGluAlaLysAspValPheLeuGly315320325Met,PheLeuTyrGluTyrAla.ArgArgHisProAspTyrSerValVal330335340LeuLeuLeuArgLeuAlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCys345350355360CysAlaAlaAlaAspProHisGluCysTyrAlaLysValPheAspGlu365370375PheLysProLeuValGluGluProGinAsnLeulieLysGinAsnCys380385390GluLeuPheGluGinLeuGlyGluTyrLysPheGinAsnAlaLeuLeu395400405ValArgTyrThrLysLysValProGinValSerThrProThrLeuVal410415420GluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHis425430435440ProGluAlaLysArgMetProCysAlaGluAspTyrLeuSerValVal445450455LeuAsnGinLeuCysValLeuHisGluLysThrProValSerAspArg460465470ValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPhe475480485SerAlaLeuGluValXaaGluThrTyrValProLysGluPheAsnAla490495500GluThrPheThrPheHisAlaAsplieCysThrLeuSerGluLysGlu505510515520ArgGinlieLysLysGinThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLys525530535ProLysAla.ThrLysGluGinLeuLysAla.Va.lMetAspAspPheAla.540545550Ala,PheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPhe555560565AlaGluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGinAlaAlaLeuGly570575580Leu585<210>3<211>1827<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220〉<221>CDS<222>(1)..(1827)<220><221>sigj太<222>(1)..(54)<220><221>mat—肽<222>(73)..(1827)<■>3atgaagtgggtaa.cct.tta,ttteccttctttttetctttagetegget48MetLysTrpValThrPhelieSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAla-20—15—10tatTyrtecSeraggArgggtGly一5gtgVa.ltttPhecgtArgcgaArg—1gat,Asp1gcaAlacacHisaagLysagtSer5gagGlugttValgetAla96catHiseggArg10tttPheLysgatAspttgLeuggaGly15gaaGlugaaGluAsnttcPheLys20gccAlattgLeugtgValttgLeu144attlie25gccAlatttPhegetAla.cagGintatTyr30cttLeucagGincagGintgtCysccaPro35tttPhegaaGlugatAspcatHisgtaVal40192aaaLysttaLeugtgVa.lAsng朋.Glu45gtaValactThrga.a.GluPhegcaAla50LysacaThrtgtCysgttValgetAla55gatAsp240gagGluteaSergetAlagaaGlu60aa.tAsntgtCysgacAspaaa.LysteaSer65cttLeucat,HisaccThrcttLeutttPhe70ggaGlygacAsp288a,a.alysttaLeutgcCys75acaThrgttValgca.AlaactThrcttLeu80cgtgaaGluThrtatTyrggtGly85GluMetgetAla336ga,cAspt,gcCys90tgtCysAlaaaaLyscaaGingaaGlu95cctProgagGlu卿ArgAsnGlu100tgcCysttcPhettgLeucaaGin384cacHis105aaaLysgatAspga'cAspAsnPro110aa^cAsnetcLeucccProcgaArgttgLeu115gtgVal鄉ArgccaProgagGlugttVal120432gat,AspgtgValatgMetCysact丁hr125getAlatttPhecatHisAspAsn130gaaGlugagGlua.ca_ThrtttPhettgLeu135aB3Lys柳aaaLysTyrtta,LeutatTyr140g肌GluattliegccAla卿a,gaArg145cat.HiscctProtacTyrtttPhetatTyr150gccAlaccgPro528gaaGluetcLeucttLeu155ttcPhetttPhegetAlaaaaLysArg160tatTyraaaLysgetAlagetAlatt.tPhe165acaThrgaaGlutgtCys576tgccaagetgetgataaagetgcctgcctgttgccaaagetcgatgaaCysGinAla.AlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGlu624170175180ctteggLeuArg185gatAspgaaGlugggaagGlyLys190gettegAla,SertctgccaaaSerAlaLys195GinetcaagArgLeuLystgtCys200672gccagtAlaSeretcLeuca,a,GinaaatttLysPhe205ggagaaGlyGluagagetttcArgAlaPhe210aaaLysgcatgggcaAlaTrpAla215gtaVal720getcgcAla,ArgctgLeuageSer220cagGin卿tttPhecccProa'aagetgagLysAlaGlu225tttPhegca_gaagttAlaGluVal230tecSer768aagttaLysLeugtgVal235ThrgatAspcttLeuThraaaLys240gtcValca_cHisThrGlutgcCys245tgccatCysHisggaGly816gatctgAspLeu250cttLeuGlutgtCysgetAlagatAsp255gacAspArggcgAlaAspcttgccLeuAla260肌gtatLysTyratelie864tgtg肌CysGlu265a,a.t,Asnca,a.Gingat,AsptegSer270a_tclietecSer叫tSeraaaLysctgLeu275a,a,ggaaLysGlutgctgtCysCysgaaGlu280912aaacctLysProctgLeuttgLeuGlu285aaaLystecSercacHistgcCyslie290gccAlagaa,gtgGluValgaaaatGluAsn295gatAsp960gagatgGluMetcctProgetAla300gacAspttgLeucctProteaSerttaLeu305getAlagetAlagattttAspPhegttgaaValGlu310Ser1008aaggatLysAspgttVal315tgcCysaaaLysAsntatTyrgetAla320gagGluAla鄉LysgatgtcAspVal325ttcctgPheLeuggcGly1056atgtttMetPhe330ttgLeutatTyrGlutatTyrgca,Ala.335Argaggcat.HiscctProgattacAspTyr340tctgtcSerValgtgVal1104ctgctgLeuLeu345ctgLeua'ga,cttLeugccAla350aagLysThrtatTyrgaaGlua,ccThr355actetaThrLeugagaagGluLystgcCys3601152tgtgccCysAlagetAlagcaAlagatAsp365cctProcatHisg朋GlutgcCystatTyr370gccAlaaaagtgLysValttcgatPheAsp375Glu1200t,ttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaateaaacaaaattgt1248PheLysProLeuValGluGluProGinAsnLeulieLysGinAsnCys380385390gagctt,tttgagca,gcttggagagtacaaa.ttccaga,atgcgetatta1296GluLeuPheGluGinLeuGlyGluTyrLysPheGinAsnAlaLeuLeu395400405gttcgt,t,a,caccaa.gaaagta.cccca,agtgtea.actccaactcttgta1344ValArgTyrThrLysLysValProGinVa,lSerThrProThrLeuVal410415420gaggtcteaaga,aacetaggaaaagtgggcageaaatgttgtaaacat1392GluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHis425430435440cctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatetatecgtggtc1440ProGluAlaLysArgMetProCysAlaGluAspTyrLeuSerValVal445450455ctgaacca.gttatgtgtgttgcatgaga,aa,acgccagtaagtgacaga1488LeuAsnGinLeuCysValLeuHisGluLysThrProValSerAspArg460465470gtcaccaaatgctgcacagaatecttggtgaacaggcgaccatgctt,t.1536ValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPhe475480485teagetctggaagtcgatgaaa,catacgttcccaaagagtttaatget1584SerAlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAla490495500ga.aacattcaccttccatgcagatatatgcacactt,tctgagaaggag1632GluThrPheThrPheHisAlaAsplieCysThrLeuSerGluLysGlu505510515520agacaaateaaga.a.acaaactgcacttgttga,getcgtgaaacacaag1680ArgGinlieLysLysGinThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLys525530535cccaaggcaacaaa.agagcaactgaa,agetgtt,a,tgga;tgat,ttcgca1728ProLysAlaThrLysGluGinLeuLysAlaValMetAspAspPheAla540545550getttt,gtagaga.agtgctgcaaggetgacgataaggagacctgcttt1776Ala.PheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPhe555560565gccgaggagggtaaaaaacttgttgetgcaagtcaagetgccttaggc1824AlaGluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGinAlaAlaLeuGly570575580tta1827Leu585<210〉4<211>609<212>PRT<213>人<400>4MetLysTrpValThrPhelieSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAla-20-15-IOTyrSerArgGlyValPheArgArgAspAlaHisLysSerGluValAla一5-l15HisArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeu101520lieAlaPheAlaGinTyrLeuGinGinCysProPheGluAspHisVal25303540LysLeuValAsnGluValThrGluPheAlaLysThrCysValAlaAsp455055GluSerAla.GluAsnCysAspLysSerLeuHisThrLeuPheGlyAsp606570LysLeuCysThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMetAla758085AspCysCysAlaLysGinGluProGluArgAsnGluCysPheLeuGin9095100HisLysAspAspAsnProAsnLeuProArgLeuValArgProGluVal105110115120AspValMetCysThrAlaPheHisAspAsnGluGluThrPheLeuLys125130135LysTyrLeuTyrGlulieAlaArgArgHisProTyrPheTyrAlaPro140145150GluLeuLeuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCys155160165CysGinAlaAlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGlu170175180LeuArgAspGluGlyLysAlaSerSerAlaLysGinArgLeuLysCys185190195200AlaSerLeuGinLysPheGlyGluArgAlaPheLysAlaTrpAlaVal205210215AlaArgLeuSerGinArgPheProLysAlaGluPheAlaGluValSer220225230LysLeuValThrAspLeuThrLysValHisThrGluCysCysHisGly235240245AspLeuLeuGluCysAlaAspAspArgAlaAspLeuAlaLysTyrlie250255260CysGluAsnGinAspSerlieSerSerLysLeuLysGluCysCysGlu265270275280LysProLeuLeuGluLysSerHisCyslieAlaGluValGluAsnAsp285290295GluMetProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPheValGluSer30030531035<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage37</image><210>7<211>32<212〉DNA<213〉人工的<220><223>引物<■>7ggatgtttgca,a.a,aa.ct,at,actgaggcaaagg32<210〉8<211>32<212〉DNA<213>人工的<220><223>引物<400〉8ccttt,gcct,ca.gta.tagtt,t,ttgcaaacat,cc32<210>9<211>30<212〉DNA<213〉人工的<220><223>引物<400>9gctctgga邻tcaatgaaacatacgttccc30<210>10<211>30<212>丽<213〉人工的<220><223>引物<400>10gggaa.cgta.tgt.ttcattga.cttccaga.gc30<210>11<211>30<212>DNA<213〉人工的<220><223>引物<400〉11gaaaatttcgacgccttggt,gt,tga.ttgcc30<210〉12<211〉27<212>DNA<213〉人工的<220><223>引物<■〉12ggcgga.ccttgccga.ctata.tctgtga27<210>13<211>27<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>13ggtctca邻aaacctaggaaaagtggg2739权利要求1.含糖链的白蛋白，其是包含可通过宿主细胞进行糖链修饰的部分氨基酸的变异型白蛋白的该部分氨基酸上选择性地附加了糖链的、含糖链的白蛋白。2.如权利要求l所述的蛋白质，其中，所述的糖链是高甘露糖型的糖链。3.如权禾腰求l或2所述的蛋白质，其中，所述的部分氨基,列的至少一个是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是用于ifi传编码的任意氨基酸)。4.如权利要求3所述的蛋白质，其中，所述的部分氨基酸序列全部是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser(Xaa是用于遗传编码的任皿基酸)。5.如权利要求l"4任一项所述的蛋白质，其中该白蛋白是人血清白蛋白。6.如权利要求5所述的蛋白质，其具有与序列号2所示的氨基,列中序列号1-585所示的氨基酸序列同一的或基本上同一的氨基酸序列，且氨基酸序号63所示的氨基酸是Asn，禾n/或氨基,号320所示的氨基酸是Thr或Ser和/或氨基,号494所示的氨基酸是Asn。7.如权利要求6所述的蛋白质，其中至少氨基,号494所示的氨基酸是Asn。8.—禾中DNA，其编码含有可通过真核细胞进行^l连fi1:布的1个以上的部分氨基酸序列的变异型白蛋白。9.一种含有权利要求8所述的DNA的表达载体，所述DNA处于在宿主真核细胞中具有功能的启动子的控制下。10.—种转化体，其ffi)l向宿主真核细胞中导入丰又利要求9的表达载体而获得。11.如权利要求10所述的转化体，其中宿主真核细胞是酵母。12.如权利要求ll所述的转化体，其中酵母是毕赤酵母属酵母。13.如木又利要求1所述的蛋白质的制备方法，包括在培养基中培养权利要求10-12任一项所述的转化体，从得至啲培养物回收含有糖连的白蛋白。14.药物，其含有如权利要求l-7任一项所述的蛋白质。15.m至肝脏的药物载体，其含有如权利要求l-7任一项所述的蛋白质。16.如权利要求15所述的载体，其中，所述的靶细胞是肝巨噬细胞。17.药物组合物，其含有待鹏至岍脏的医药化合物及权禾腰求15或16所述的载体。全文摘要本发明提供了一种用作以肝脏(尤其是肝巨噬细胞)为靶的DDS的药物载体的、含有糖链的白蛋白，其通过下述方式来提供变异编码白蛋白的DNA，使其成为编码包含可通过真核细胞进行糖链修饰的部分氨基酸序列，优选是编码含有N结合型糖链的共有序列的变异型白蛋白；在宿主真核细胞、优选是可以添加高甘露糖型糖链的宿主细胞中导入含有该变异DNA的表达载体，从通过培养获得的转化体得到的培养物中回收含有糖链的白蛋白蛋白质。文档编号C07K14/435GK101429240SQ20071030511公开日2009年5月13日申请日期2007年11月6日优先权日2007年11月6日发明者中城圭介,小田切优树,片山直久,甲斐俊哉申请人:尼普洛株式会社