专利名称：：用于定量分析的质量标签的制作方法用于定量分析的质量标签相关申请本申请是2006年2月15日提交的美国申请No.ll/355，904的继续申请，所述美国申请No.ll/355，904是2005年7月11日提交的美国申请No.11/179，060的部分继续申请，所述美国申请No.ll/179，060要求2005年5月9日提交的美国申请No.60/679，183和2004年7月12日提交的美国申请No.60/587，138的优先权。上述申请的全部教导在此通过引用并入本文。一般技术人员应当理解下述附图仅用于举例说明的目的。所述附图并非旨在以任何方式限制本发明教导的范围。附图1A-1H显示一组8个同量异位的(isobaric)质量标签(masstag)的结构式，每个质量标签的分子量相同但是当向其施加解离能水平(dissociativeenergylevel)时其将断裂得到不同分子量的信号离子。图2A是用质量标签(32)烷基化的SEQIDNo.:l的QTRAPTM2000MS分析。图2B是用质量标签(32)烷基化的SEQIDNo.:2的QTRAPTM2000MS分析。图3A是用质量标签(32)烷基化的SEQIDNo.:l的QTRAPTM2000MS/MS分析。图3B是用质量标签(32)烷基化的SEQIDNo.:2的QTRAPTM2000MS/MS分析。图4A是利用4700蛋白质组分析仪进行的对用质量标签(32)烷基化的SEQIDNo.:l的MS分析。图4B是利用4700蛋白质组分析仪进行的对用质量标签(32)烷基化的SEQIDNo.:3的MS分析。图5A是利用4700蛋白质组分析仪进行的对用质量标签(32)烷基化的SEQIDNo.:l的MS/MS分析。图5B是利用4700蛋白质组分析仪进行的对用质量标签(32)烷基化的SEQIDNo.:3的MS/MS分析。图6A显示在两个样品的QTRAPTM2000上进行的MRM试验，其中一个样品已经用质量标签(32)烷基化，另一个已经用质量标签(33)烷基化，其中用质量标签(32)标记的样品与用质量标签(33)标记的样品的比是1:0.05。图6B显示在两个样品的QTRAPTM2000上进行的MRM试验，其中一个样品已经用质量标签(32)烷基化，另一个已经用质量标签(33)烷基化，其中用质量标签(32)标记的样品与用质量标签(33)标记的样品的比是l:l。图6C显示在两个样品的QTRAP2000上进行的MRM试验，其中一个样品已经用质量标签(32)烷基化，另一个已经用质量标签(33)烷基化，其中用质量标签(32)标记的样品与用质量标签(33)标记的样品的比是1:10。图7A-1和图7A-2是利用4700蛋白质组分析仪进行的图6A中样品的MS/MS模式的质i普。图7B-1和图7B-2是利用4700蛋白质组分析仪进行的图6B中样品的MS/MS模式的质镨。图7C-1和图7C-2是利用4700蛋白质组分析仪进行的图6C中样品的MS/MS模式的质i普。图8以图示方式说明活性酯的醇基或硫醇基的离去基团(LG)的示例性结构式，其中G各自独立地是O或S,典型地是O。图9A-9B以图示方式说明在一些实施方案中可包含于LK基团中的/-;dv部分。图10以图示方式说明用于胺的酰基化以在质量标签上形成反应活性基团的方案I和II。图11以图示方式说明质量标签(2)的合成。图12以图示方式说明质量标签(3)的合成。图13以图示方式说明质量标签(4)和(5)。图14以图示方式说明质量标签(6)、(7)和(8)的合成。图15以图示方式说明质量标签(9)、(10)和(11)的合成。图16以图示方式说明质量标签(12)的合成。图17以图示方式说明质量标签(14)和(15)。图18以图示方式说明合成质量标签(16)、(17)、(18)、(19)和(20)的一般方案。图19以图示方式说明质量标签(21)、(22)、(23)和(24)的合成。图20以图示方式说明质量标签(25)的合成。图21以图示方式说明质量标签(26)的合成。图22以图示方式说明质量标签(27)的合成。图23以图示方式说明质量标签(28)的合成。图24以图示方式说明FmocGly-Ser(Bzl-13C6)(29)的合成。图25以图示方式说明树脂结合的质量标签(30)、(31)和(32)的合成。图26以图示方式说明含有胸腺嘧啶核苷碱基的标记试剂/质量标签(XX)((37a))的合成。图27A以图示方式说明合成6-甲基尿嘧咬的公知步骤，可由所述6-曱基尿嘧咬制备含有6-甲基尿嘧咬核苷碱基的标记试剂(质量标签)((37b))。图27B以图示方式说明可用于制备同位素富集形式的6-甲基尿嘧啶的多种可从商业渠道得到的同位素取代形式的乙酰乙酸乙酯。图27C以图示方式说明可用于制备同位素富集形式的6-甲基尿嘧啶中的多种可从商业渠道得到的同位素取代形式的脲。图28A和28B以图示方式说明可利用图27B和27C中所示化合物与图27A中所示步骤相组合进行制备的多种同位素富集形式的6-甲基尿嘧啶。用*标记的原子是重原子同位素。图29A-E以图示方式说明可利用图26、27A、27B、27C中所示步骤和可从商业渠道得到的化合物以及图28A和28B中所示同位素取代的6-甲基尿嘧啶进行制备的多种同位素编码的标记试剂。图30以图示方式说明质量标签标记的Glu-Fib肽(38)和(39)的化学结构。图31以图示方式i兌明质量标签标记的Glu-Fib肽(40)的化学结构。图32以图示方式说明质量标签标记的Glu-Fib肽(41)的合成。图33以图示方式说明质量标签标记的Glu-Fib肽(42)的合成。图34以图示方式说明质量标签标记的Glu-Fib肽(43)的合成。图35以图示方式说明质量标签(44)和(45)的合成。图36以图示方式+兌明质量标签标记的Glu-Fib肽(46)的合成。图37以图示方式说明质量标签标记的Glu-Fib肽(47)和质量标签(48)的化学结构。图38以图示方式说明质量标签标记的Glu-Fib肽(49)的合成。1引言本发明涉及利用质量分析测定一种或多种分析物的方法、混合物、试剂盒和/或组合物。分析物可以是任何感兴趣的分子。分析物的非限制性实例包括但不限于蛋白质、肽、寡核苷酸、碳水化合物、脂质、类固醇、氨基酸和小于1500道尔顿的小分子。标记试剂和被标记分析物可表示为下述通式化合物或其盐形式和/或水合物形式RP-X-LK-Y-RGS'rS'tIw其中RG可以是与分析物反应的反应活性基团或所述反应活性基团与所述分析物的反应产物。因此，被标记分析物可具有下述通式RP-X-LK-Y-分析物所述化合物可附着到固相栽体上或用于通过s，将其连接到固相载体的结构部分上。在下文中更详细地描述变量RG、RP、X、LK、S，、r、t和Y。同分异构或同量异位的标记试剂组可用于标记两个或更多个不同样品的分析物，其中对于每种不同的样品而言，所述标记试剂可以不同并且其中所述标记试剂可包含独特的报告物"RP"，所述报告物"RP"可与被标记分析物所来源的样品相关联。因此，即使是通过对混合标记不同样品得到的反应产物而获得的被标记分析物的复杂混合物进行分析，也能将比如报告基团的存在和/或量的信息可与样品中分析物的存在和/或量(通常以浓度和/或量表示)关联起来。可以下面的方式进行这些复杂样品混合物的分析允许以多重方式测定相同样品或多种样品中的一种或多种分析物。因此，本发明的方法、混合物、试剂盒和/或组合物特别适合于复杂样品混合物的多重分析。例如，它们可用于蛋白质组'〃究中。2.定义Af;^^本说^并^^^，摔炎^7"迷定义,'W卓炎^眉^Mi语A摔逸舍复炎，并jg义之丼^。^任命T迷定乂^任^T岸它Jt妖f逸括为摩有军W时任辨遽过參孝并入本Jt时义嵌J々戎廢时'，况下，摔"T迷定乂^^:本文所用的"分析物"指可测定的任何目标分子。分析物的非限制性实例可包括但不限于蛋白质、肽、核苷酸、寡核苷酸(DNA或RNA)、碳水化合物、脂质、类固醇、氨基酸和/或分子量小于1500道尔顿的其它小分子。分析物来源或含有分析物的样品不受限制，因为它可来自任何来源。分析物可以是天然的或合成的。分析物来源或含有分析物的样品的非限定性实例包括但不限于细胞或组织、或其培养物(或传代培养物)。分析物来源的非限定性实例包括但不限于粗细胞裂解物或处理过的细胞裂解物(包括全细胞裂解物)、体液、组织提取物或细胞提取物。分析物来源的其它非限定性实例还包括但不限于来自分离方法(比如色语分离或电泳分离)的级分。体液包括但不限于血液、尿、粪便、脊髄液、脑液、羊水、淋巴液或来自腺分泌的流体。就处理的细胞裂解物而言，我们意指除了裂解细胞所需的处理外还处理细胞裂解物，从而对收集的物质进行其它处理。例如，样品可以是含有一种或多种分析物的细胞裂解物，所述分析物是利用蛋白水解酶处理粗细胞裂解物的总蛋白质成分从而消化一种或多种前体蛋白质而形成的肽。为避免疑惑，术语分析物可包括初始的分析物和由此得到的化合物，除非根据上下文旨在表示清楚相反的含义。例如，在一些实施方案中，术语分析物可用于蛋白质以及通过消化所述蛋白质而由此得到的肽。本文所用的"断裂，，指共价键的断裂。本文所用的"片私断裂"("fragment")指断裂产物(名词)或引起裂解的操作(动词)。公认的是原子或分子的质量可以通常近似到最接近的整数原子质量单位或最接近的原子质量单位的十分之一或百分之一。本文所用的"总质量"指一定范围内的绝对质量以及近似质量，其中使用的不同原子类型的同位素在质量上;(艮接近，从而在平衡才艮告物(r印orter)和/或连接物(linker)部分的质量方面它们在功能上是等价的(因此在同量异位或同分异构标记试剂的组或试剂盒中报告物/连接物组合的总质量相同)，而不论所用的不同同位素类型在质量上非常小的差异是否可被检测到。例如，氧的常见同位素的总质量是16.0(实际质量15.9949)和18.0(实际质量17.9992)，碳的常见同位素的总质量是12.0(实际质量12.00000)和13.0(实际质量13.00336)，氮的常见同位素的总质量是14.0(实际质量14.0031)和15.0(实际质量15.0001)。当这些值为近似值时，本领域技术人员应当理解，如果在組中的一个报告物中使用180同位素，则在含有"0的组的不同报告物中，另外的2个质量单位(超过总质量为16.0的氧同位素的值)可通过例如在报告物中的其它地方引入两个碳13C原子代替两个12C原子、两个15N原子代替两个"N原子或甚至一个13C原子和一个15N原子代替12C和14N以补偿180而得到补偿。这样，所述組的两个不同报告物是功能质量上是相等同的(即具有相同的总质量)，因为在所述组或试剂盒的所有标记中，使用两个"C原子(代替两个"C原子)、两个"N原子(代替两个"N原子)、一个13C和一个15N(代替12C和"N)或一个180原子(代替一个160原子)实现质量增加2个道尔顿，它们之间极小的实际质量差异并不会对本分析性质造成妨碍。这可参照图1A-1H进行说明。在图1A中，报告物/连接物组合(图1A，不包括反应活性碘基团；化学式d^CsH2。N15！^06)具有2个15N原子和5个"C原子，总理论质量为357.2213。相比较而言，图1C中所示的报告物/连接物同量异位物(isobar)(化学式C1Q13C6H2QN215N06)具有1个"N原子和6个13C原子，总理论质量为357.2279。图1A和C中的化合物是除了重原子同位素含量以外在结构上和化学上不能区别的同量异位物，尽管具有微小的绝对质量差异(分别为质量357.2213与质量357.2279)。然而，为了本发明的目的，图IA和IC中化合物的总质量记为357.2，因为不论质谙仪是否足够灵敏而检测到图1A和1C中同量异位物绝对质量的这种小差异，这都不会妨碍分析。由图1A-1H可以清楚地得知，结构内相同重原子同位素的分布并不是建立同分异构和/或同量异位的标记试剂组的唯一考虑因素。可将重原子同位素类型混合以获得所期望总质量的同分异构体或同量异位物。这样，重原子同位素的选择(组合)及其分布均可考虑用于制备可用于本发明实施方案的同分异构和/或同量异位的标记试剂。本文所用的"同位素富集"指已经通过合成富集了一种或多种重原子同位素(例如稳定的同位素比如氘、13C、15N、180、"Cl或"Br)的化合物(例如标记试剂)。由于同位素富集并非100%有效，所以可存在这些化合物的富集程度更低些的杂质，它们的质量较小些。同样，由于过量富集(不期望的富集)和天然的同位素丰度，可存在质量更高些的杂质。在一些实施方案中，每种被引入的重原子同位素可以至少80%的同位素纯度存在。在一些实施方案中，每种被引入的重原子同位素可以至少93%的同位素纯度存在。在一些实施方案中，每种被引入的重原子同位素可以至少96%的同位素纯度存在。本文所用的"同位素化形式"("isotopologue")化合物具有相同的化学组成，但在同位素组成(同位素取代数目)上不同，例如甲烷同位素化形式CH4、CH3D和CH;jD2。本文所用的"同量异位的同位素化形式"化合物是具有相同化学组成、同位素组成不同但通过质谱仪检测具有相同总质量的那些物质(例如对于甲烷的同量异位同位素化形式"CH4、13CH3D和CH;tD2来说，每种的总质量为18个原子质量单位)。一些实施方案是可具有至少两种同位素富集原子的同位素富集化合物。在多个实施方案中，所述同位素富集化合物可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个同位素富集原子。化合物的化学结构可由任何前述式来表示，其中变量如通常以及在本文所述的类和亚类中所定义。本文所用的"标记试剂"指适于标记待检测的分析物的结构部分。术语标记(label)与术语标签(tag)和标志(mark)以及其它等价的术语和短语是同义的。例如，被标记分析物还可以指被标签分析物或被标志分析物。因此，术语"标记，，("label")、"标签"("tag")、"标志，，("mark")以及这些术语的衍生词是可互换的并且指适于标记或已经标记了待检测分析物的结构部分。本文所用的"质量标签，，指可通过将具有特定总质量的基团添加到分析物上而用于标记或标志分析物的标记试剂。质量标签組包括两个或多个质量标签，每个质量标签将具有相同质量的基团添加到被标记的分析物上。然而，当将解离能施加到来自所述組中其它质量标签的具有不同质量的信号离子时，质量标签组中的每个质量标签都将断裂。为本^兌明书起见，质量标签和标记试剂是等同的术语。因此，质量标签组是标记试剂组的等同物。本文所用的"栽体"、"固相支持物"、"固相栽体"指标记试剂或分析物可被固定于其上的任何固相材料。固定可例如用于标记分析物或用于制备标记试剂，而不管标记是否发生在载体上。固相载体包括术语比如"树脂"、"合成载体"、"固相"、"表面"、"膜"和/或"载体"。固相载体可由有机聚合物组成，比如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯(polyethyleneoxy)和聚丙烯酰胺以及其共聚物和接枝物。固相载体还可以是无机的，比如玻璃、二氧化珪、可控多孔玻璃(CPG)、或反相二氧化硅。固相载体的结构可以是珠、球、粒子、颗粒、凝胶、膜或表面的形式。表面可以是平面的、基本平面的或非平面的。固相载体可以是多孔的或非多孔的，并且可具有膨胀特性或非膨胀特性。固相载体可以以孔(well)、坑(depression)或其它容器、器皿、结构特征(feature)或位置(location)的形式而构建。多个固相栽体可以设置为处于阵列的不同位置，对试剂的自动递送是可寻址的，或通过检测方法和/或设备寻址。本文所用的"库，，是多种不同的化合物(例如标记试剂、质量标签、被标记分析物等)，通常是5、10、25、50、100、250或更多种不同的化合物。通常构建库以便于顺序、随机、和/或平行取得其中一个、多个和/或全部的所迷不同化合物。例如，多种不同化合物库可以在相同的瓶中，或可被固定到一种或多种固相栽体上等。通常，库可具有至少两种不同的化合物，所述化合物被固定在例如物理上不同的栽体(例如珠、球、粒子、颗粒等)的不同位置上或被固定在相同载体上的可寻址位置上(例如以随机或规则阵列形式被固定到固相载体上)。库中的不同化合物可与其它化合物(例如一种或多种分析物可与标记试剂库进行反应)相接触或可被分析(例如被标记分析物的库可被分析)等。例如，在一些实施方案中，库可包含多种不同的标记试剂，其中每种不同的标26记试剂可以以规则阵列的形式被固定到固相载体的已知地址上。通过分别将分析物样品点滴(接触)到每种不同的被固定的标记试剂中，所述库可用于利用特定标记试剂标记多种单独的分析物样品，从而产生多种被标记分析物。在另一个实例中，标记试剂的库可具有被固定到多种固体粒子中每种上的不同标记试剂。可通过使每种固体粒子与不同分析物样品相接触而使用库，从而将多种被标记分析物固定到固体粒子上。本文所用的"亲和配体"指作为分子鉴别系统的成员的分子。本文所用的"分子鉴别系统"指至少两种分子或复合物的系统，所述分子或复合物彼此具有高的分子鉴别能力和高的彼此特异性结合的能力。在一些实施方案中，所述结合是特异性的，并且所述亲和配体是结合对的一部分。除非明确指明为共价键，术语"结合"包括共价和非共价结合。本文所用的"特异性结合"指当分子鉴别系统的亲和配体与一种或多种其它分子或复合物结合时，具有足以区分所述分子或复合物与样品的其它成分或杂质的特异性。用于本发明的分子鉴别系统是常规的并且未在本文中详细描述。用于制备和利用这样的系统的技术是本领域众所周知的,并且被示例在Tijssen，P.,的出版物"LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiologyPracticeandTheoriesofEnzymeImmunoassays"(1988)，eds.BurdonandKnippenberg,NewYork:Elsevier中，其全部教导被并入本文。分子鉴别系统的实例包括例如抗原/抗体、抗原/抗体片段、抗生物素蛋白/生物素、链霉抗生物素蛋白/生物素、蛋白质A/Ig或凝集素/碳水化合物。本文所用的"天然同位素丰度"指基于自然界中一种或多种同位素的天然显著水平，在化合物中发现的一种或多种同位素的含量(或分布)。例如，从活的植物材料中得到的天然化合物通常可含有约1.08%的"C(相对于"C而言)。本文所用的"絲酸"指由-NH-CHR、C(0)-所代表的基团，其中议#是氢、氘、脂脉波基团、取代的脂肪旒基团、芳香族基团或取代的芳香a团。"天然氨基酸"是在自然界中发现的。实例包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸。在一些实施方案中，R"可以是天然氨基酸的侧链。天然氨基酸侧链的实例包括甲基(丙氨酸)、异丙基(缬氨酸)、叔丁基(异亮氨酸)、-CH2CH(-CH3)2(亮氨酸)、苄基(苯丙氨酸)、对羟基千基(酪氨酸)、-CH2-OH(丝氨酸)、-CHOHCH3(苏氨酸)、-CHr3-丐l咮基(色氨酸)、-012<:0011(天冬氨酸)、-(:112(:112<:0011(谷氨酸)、-CH2C(0)NH2(天冬酖胺)、-CH2CH2C(0)NH2(谷氨酰胺)、-CH2SH(半胱氨酸)、-CH2CH2SCH3(蛋氨酸)、-(CH2)4NH2(赖氨酸)、-(CH2)3NH2(鸟氨酸)、-{(CH)2}4NHC(=NH)NH2(精氨酸)和-CHr3-咪唑基(组氨酸)。其它天然氨基酸的侧链包括含有杂原子的官能团，例如醇(丝氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸和苏氨酸)、胺(赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸和精氨酸)、硫醇(半胱氨酸)或羧酸(天冬氨酸和谷氨酸)。当含杂原子的官能团被修饰成包含保护基时，所述侧链指氨基酸的"被保护的侧链"。在一些实施方案中，RW是M酸的被保护的侧链。合适的保护基的选择取决于被保护的官能团、保护基所暴露的条件以及可存在于分子中的其它官能团。上述官能团的合适保护基是本领域^的，并且许多实例被描述在Greene和Wuts的"ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis",JohnWiley&Sons(1991)中。仅仅利用常规的试验，普通技术人员可选择合适的保护基用于公开的合成中(包括除了下述保护基以外的保护基)以及用于应用和除去保护基的条件。本文所用的"肽"指含有两个或多个通过酰胺(肽)键连接在一起的氨基酸的聚合物。本文所用的术语"任选地取代的"和"取代的或未取代的"是等价的。本文所用的卤素基团指-F、-Cl、-Br、或-I。本文所用的术语"烷基"指完全饱和的直链或支链的Q-C2。烃或环状CVC20烃。当在本文中使用时，术语"烷基"指可被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，烷基可以完全饱和的是直链或支链d-Q烃或环状QrC6烃。本文所用的术语"亚烷基"指直链或支链的烷基链或者环状烷基，其任选地被取代，并且具有至少两个与至少两个结构部分相连接的连接点(例如(-CHr，亚甲基}、-{CH2CH2-，亚乙基}、、、\等，其中括号表示连接点)。当在本文中使用时，术语"亚烷基"指可被取代或未取代的基团。本文所用的"烯基"指具有一个或多个双键的直链或支链的C2-C2。烃或环状C3-C2。烃。当在本文中使用时，术语"烯基"指可被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，烯基可以是具有一个或多个双键的直链或支链的<:2-<:6烃或环状<:3-<:6烃。本文所用的术语"亚烯基"指具有与至少两个结构部分相连接的两个连接点的烯基。当在本文中使用时，术语"亚烯基"指可被取代或未取代的基团。本文所用的"g，，指具有一个或多个巻键的直链或支链的C2-C2Q烃或环状CVC2o烃。当在本文中使用时，术语";fe^"指可被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，生基可以是具有一个或多个巻键的的直链或支链的C2-C6烃或环状C3-C6烃。本文所用的术语"亚g"指具有与至少两个结构部分相连接的两个连接点的M。当在本文中使用时，术语"亚炔基，，指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"脂肪族"指上述定义的任何直链、支链、或环状烷基、烯基、和M部分。当在本文中使用时，术语"脂肪族"指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"杂烷基，，指其中烷基链中的一个或多个亚甲基被杂原子比如-O-、-S-和-NR-替代的烷基。R可以是氢、氘、烷基、芳基、芳基烷基、烯基、炔基、杂芳基、杂芳基烷基、或杂环烷基。当在本文中使用时，术语"杂烷基"指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"杂亚烷基，，指具有式-K亚烷基-X，)r-亚烷基卜的基团，其中对于每次出现，X，是-O-、-NR-或-S-;r是l10的整数。当在本文中使用时，术语"杂亚M"指可被取代或未取代的基团。在一些实施方案中，r可以是l5的整数。本文所用的术语"氮杂亚:^，，指其中至少一个X，是-NR-的杂亚烷基。当在本文中使用时，术语"氮杂亚烷基，，指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"芳基"单独使用或作为另一结构部分(例如芳基烷基等)的一部分使用，指碳环芳基比如苯基。芳基还包括稠合多环芳香环系，其中碳环芳香环被稠合到另一个碳环芳香环(例如l-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基等)上或其中碳环芳香环被稠合到一个或多个碳环非芳香环(例如四氢亚萘、茚满等)上。本文所用的术语"芳基，，指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"亚芳基"指具有与至少两个结构部分相连接的至少两个连接点的芳基(例如亚苯基等)。稠合到碳环非芳香环的亚芳基的连接点可以是芳香环、非芳香环。本文所用的术语"亚芳基"指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"芳基烷基"指通过亚烷基连接子与另一个结构部分连接的芳基。本文所用的术语"芳基烷基"指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"芳基亚烷基"指具有至少两个与至少两个结构部分相连接的连接点的芳基烷基。第二个连接点可以在芳香环或亚烷基上。本文所用的术语"芳基亚^4，，指可被取代或未取代的基团，当芳基亚烷基被取代时，取代基可以在所述芳基亚烷基的芳香环或亚烷基部分或同时在芳香环和亚烷基部分。本文所用的术语"杂芳基"指含有l、2、3或4个杂原子的芳香杂环，所述杂原子独立地选自氮、硫和氧。本文所用的术语"杂芳基"指可被取代或未取fC的基团。杂芳基可被稠合到一个或两个环上，比如环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。杂芳基与分子的连接点可以在杂芳基、环烷基、杂环烷基或芳基环上，并且杂芳基可以通过碳或杂原子相连接。杂芳基可以30是被取代的或未取代的。杂芳基的实例包括咪唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、"恶唑基、瘗唑基、异嗜、唑基、异噱哇基、瘗二喳基、嗝二喳基、吡咬基、嘧咬基、吡漆基、歧嚷基、壹啉基、异壹啉基、吲唑基、苯并^恶唑基、苯并异嚅哇基、苯并呋喃基、苯并噢哇基、中氮茚基(indolizinyl)、咪唑并吡咬基、吡哇基、三峻基、异噢喳基、嚅喳基、四唑基、苯并咪唑基、苯并瘗哇基、苯并异噻哇基、苯并噻二哇基、苯并哺二哇基、吲咮基、四氢吲^^基、氮杂吲啡:基、咪唑并吡U、喹唑啉基、嘌呤基、吡咯并2，3嘧^、吡咯并[3,41嘧^或苯并(b)蓬吩基，其中每个基团任选地被取代。本文所用的术语"杂亚芳基"指具有至少两个与至少两个结构部分相连接的连接点的杂芳基。本文所用的术语"杂亚芳基"指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"氮杂亚芳基，，指其中一个杂原子是氮的杂亚芳基。氮杂亚芳基&可包含1、2或3个非氮杂原子，比如S和O。本文所用的术语"氮杂亚芳基"指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"杂芳基烷基"指通过亚烷基连接子与另一个结构部分相连接的杂芳基。本文所用的术语"杂芳基烷基"指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"杂芳基亚烷基，，指具有与至少两个结构部分相连接的至少两个连接点的杂芳基烷基。第二个连接点可以在杂芳环或亚烷基上。本文所用的术语"杂芳基亚烷基"指可被取代或未取代的基团。当杂芳基亚烷基被取代时，取代基可以在所述杂芳基亚烷基的杂芳环或亚烷基部分上或同时在杂芳环和亚烷基部分上。本文所用的术语"杂环烷基"指含有一个或多个氧、氮或硫的非芳香环(例如吗啉、哌啶、哌嚷、吡咯烷和硫代吗啉)。本文所用的术语"杂环烷基"指可被取代或未取代的基团。本文所用的术语"杂环亚烷基"指具有至少两个与至少两个结构部分相连接的连接点的杂环烷基。本文所用的术语"杂环亚烷基"指可祐^取代或未取^的基团。本文所用的术语"氮杂环亚烷基，，指其中一个杂原子是氮的杂环亚烷基。氮杂环亚烷^Ji可包含l、2或3个非氮杂原子，比如S和O。本文所用的术语"氮杂环亚烷基"指可被取代或未取代的基团。烷基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂烷基、杂亚烷基、氮杂亚烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、氮杂环亚烷基、芳基、亚芳基、芳基烷基、芳基亚烷基、杂芳基、杂亚芳基、氮杂亚芳基、杂芳基烷基和杂芳基亚烷基的合适取代基包括在用于以本发明的质量标签标记分析物的反应条件下稳定的任何取代基。烷基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂烷基、杂亚烷基、氮杂亚烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、氮杂环亚烷基、芳基、亚芳基、芳基烷基、芳基亚烷基、杂芳基、杂亚芳基、氮杂亚芳基、杂芳基烷基和杂芳基亚烷基的取代基实例包氘、芳基(例如苯基)、芳基烷基(例如卡基)、硝基、氰基、卤素(例如氟、氯、溴和碘)、烷基(例如曱基、乙基、异丙基、环己基等)、卤代烷基(例如三氟甲基)、烷氧基(例如曱氧基、乙緣等)、羟基、-NRWRW、-NRwC(0)R°、-C(0)NRwRw、-C(0)Rw、-C(0)ORw，其中每个ir独立地是氢、氘、烷基、芳基或芳基烷基，并且每次出现的R。独立地;lj^基、芳基或芳基烷基。此外，芳基、亚芳基、杂芳基或杂亚芳基的取代基可以是包含亲和配体的基团或包含固相栽体的基团。此外，烷基、亚烷基、杂烷基、杂亚烷基、氮杂亚烷基、杂环烷基、杂环亚烷基、氮杂环亚烷基、以及烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、芳基烷基、芳基亚烷基、杂芳基烷基和杂芳基亚烷基的任何饱和部分还可被=0、=S、N-RW取代。当杂环烷基、杂环亚烷基、杂芳基、杂亚芳基、杂芳基烷基、或杂芳基亚烷基含有氮原子时，其可以是取代或未取代的。当杂芳基的芳香环中的氮原子具有取代基时，所述氮可以是季氮。脂肪族、非芳香杂环基、千基、芳基环碳和杂芳基环碳的合适取代基是那些基本上不影响所7〉开化合物的>^应活性基团的标记^^应的基团。合适的取代基的实例可包括氘、-OH、卣素(-F、-Cl、-Br、-1)、-CN、-N02、-ORa、-C(0)Ra、-OC(0)Ra、-C(0)ORa、-SRa、-C(S)Ra、-OC(S)Ra、-C(S)ORa、-C(0)SRa、-C(S)SRa、-S(0)Ra、-S02Ra、-S03Ra、-P02RaRb、-P03RaRb、-OP03RaRb、-N(RaRb)、-C(0)N(RaRb)、-C(0)NRaNRbS02Rc、-C(0)NRaS02Rc、-C(0)NRaCN、-S02N(RaRb)、-NRaS02Rc、-NRcC(0)Ra、-NRcC(0)ORa、-NRcC(0)N(RaRb)、-C(NRc)-N(RaRb)、-NRd-C(NRc)-N(RaRb)、-NRaN(RaRb)、-CRc=CRaRb、-C三CR3、=0、=S、=CRaRb、=NRa、=NORa、=NNRa、任选地取代的烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的脂肪族、任选地取代的环脂肪族、任选地取4戈的非芳香杂环、任选地取代的节基、任选地取代的芳基以及任选地取代的杂芳基，其中Ra-Rd各自独立地是-H、氘(D)、或任选地取代的脂肪族、任选地取代的环脂肪族、任选地取代的非芳香杂环、任选地取代的爷基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基，优选烷基、节M苯基。此外，-N(RaRb)作为一个整体可以是任选地被取代的杂环基。非芳香杂环基、节基或芳基还可具有脂肪族基团或取代的脂肪族基团作为取代基。取代的脂肪族基团还可具有非芳香族杂环、取代的非芳香族杂环、千基、取代的千基、芳基或取代的芳基作为取代基。取代的脂肪族、非芳香族杂环基团、取代的芳基或取代的节基可具有一个以上的取代基。具有与其它杂芳基环原子形成的三个共价键的杂芳基环氮原子的合适取代基包括-OH和低级烷氡基(优选Cl-C4烷氡基)。具有与其它杂芳基环原子形成的三个共价键的取代的杂芳基环氮原子是带正电荷的，其可收良阴离子如氯离子、溴离子、甲酸根、乙酸根等平衡。其它合适的反阴离子的实例在下面涉及可药用盐的部分中提供。具有与其它原子形成的两个共价键的氮原子(例如具有与其它环原子形成的两个共价键的杂芳基环氮原子)的合适取代基包括例如任选地取代的烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的脂肪族、任选地取代的环脂肪族、任选地取代的杂环、任选地取代的千基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、隱CN、-N02、-ORa、-C(0)Ra、-OC(O)R3、-C(0)ORa、-SRa、-S(0)Ra、-S02Ra、-S03Ra、-N(RaRb)、-C(0)N(RaRb)、-C(0)NRaNRbS02Rc、-C(0)NRaS02Rc、-C(0)NRaCN、-S02N(RaRb)、S02N(RaRb)、-NRcC(0)Ra、-NRcC(0)ORa、-NRCC(O)N(RaRb)等。更典型地，具有与其它原子形成的两个共价键的氮原子的取>[<基可以是烷基、取代的烷基(包括卣代烷基)、苯基、取代的苯基、-S(O)H烷基)、-S(O)rNH(烷基)和-S(0)rNH(烷基)2。含氮的杂芳基或非芳香杂环可被氧取代而形成N-氧化物，例如作为吡免基N-氧化物、哌免基N-氧化物等。本文所用的术语"盐形式"包括化合物(标记试剂)的盐、或化合物的盐的混合物。此外，化合物的两性离子形式也包括在术语"盐形式"中。具有胺或其它碱性基团的质量标签的盐可例如通过与合适的有机酸或无机酸(比如氯化氢、溴化氢、乙酸、高氯酸等)>^应而得到。含有季铵基团的化合物还可包含反阴离子比如氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根、高氯酸根等。具有羧酸官能团或其它酸性官能团的化合物的盐可通过使所述化合物与合适的碱(例如氢氧化物碱)反应而制得。因此，酸性官能团的盐可具有反阳离子，比如钠离子、钾离子、镁离子、钙离子等。术语"水合物形式"包含化合物的任何水合状态或化合物的一种以上水合状态的混合物。例如，本发明的质量标签可以是半水合物、单水合物、二水合物等。3.
发明内容概要反应活性基团用于所述方法、混合物、试剂盒和/或组合物的实施方案中的一种或多种标记试剂的变量"RG，，可以是反应活性基团，例如能与样品的一种或多种JJI活性分析物进行反应的亲电基团或亲核基团，或所述反应活性基团与分析物的反应产物。所述反应活性基团可以^:预先存在的或其可在原位制备。在一些实施方案中，反应活性基团的原位制备可在不存在^^应活性分析物的情况下进行，在一些实施方案中，其可在存在反应活性分析物的情况下进行。例如，可利用水溶性的碳二亚胺(例如l-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；EDC)对羧酸基团进行原位修饰，从而制备可与亲核基团比如胺基进行反应的亲电基团。在一些实施方案中，用EDC对标记试剂的羧酸基团的活化可在存在含有胺(亲核基团)的分析物的情况下进4亍。在一些实施方案中，还可在与EDC进行初始反应后加入含有胺(亲核基团)的分析物。在一些实施方案中，可通过原位除去保护基而原位产生反应活，基团。因此，任何存在的或新'产生的可通过亲核，，和混合物、试剂盒和/或组合物的实施方案中。当标记试剂的反应活性基团是亲电基团时，其可与分析物的合适的亲核基团进行反应。当标记试剂的反应活性基团是亲核基团时，其可与分析物的合适的亲电基团进行反应。多个合适的亲核基团和亲电基团对是已知的并常用于化学和生物化学领域中。含有可被偶联到分析物(例如蛋白质、肽、核苷酸、碳水化合物、，脂质,、类固醇或其它小于1:00道尔顿的小例被描述于thePierceLifeScience&AnalyticalResearchProductsCatalog&Handbook(aPerstorpBiotecCompany),Rockford,IL61105，USA中。其它合适的试剂是本领域中众所周知的，并且可从许多其它供应商(比如Sigma-Aldrich)处购得。标记试剂的反应活性基团可以是胺反应活性基团。例如所述胺反应活性基团可以是活性酯。活性酯是肽合成中众所周知的，并且指在肽合成常用的务降下容易与氛基酸的N-ct胺进行反应的某些酯。胺反应活性酯可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-鞋基磺基琥珀酰亚胺酯、五氟苯酯、2-硝基苯酯、4-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯或2,4-二卣代苯酯。图8以图示方式说明活性酯的醇基或硫醇基的离去基团(LG)示例性通式，其中每个G独立地是O或S，但通常是O。所有这些基团是肽化学领域中公知的形成活性酯的醇基或硫醇基，其中所述醇基或硫醇基通过氨基酸的N-a胺与酯的g碳的反应而被置换。显然，本文所述的任何合适的标记试剂/标签试剂的活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)可利用众所周知的步骤进行制备(参见GregT.Hermanson(1996)."TheChemistryofReactiveGroups"in"BioconjugateTechniques"Chapter2pages137-165，AcademicPress,(NewYork);也参见InnovationAndPerspectivesInSolidPhaseSynthesis,Editor:RogerEpton，SPCC(UK)Ltd,Birmingham,19卯)。形成吗啉乙酸、喊咬乙酸、哌漆乙酸和N-取代哌溱乙酸化合物(是通式RP-X-LK-Y-RG的标记试剂的代表性实例)的活性酯的方法被描述于2004年1月27日提交的未决共有美国专利申请No.10/751,354中，为所有目的，该申请的全部教导在此通过引用并入本文。在一些实施方案中，标记试剂的反应活性基团可以是混合酸酐，因为已知混合酸酐能有效地与胺基反应从而形成酰胺键。标记试剂的反应活性基团可以是硫醇反应活性基团。例如，所述硫醇反应活性基团可以是马来酰亚胺、烷基卣化物、a-卣代-酰基的芳基卣化物(a.k.a.酰基离化物)。g化物和由素指氟、氯、溴或硖原子。在一些实施方案中，RG基团是I-(CH2)C(0)-。标记试剂的反应活性基团可以是羟基反应活性基团。例如，所述羟基反应活性基团可以是三苯曱基-卣化物或曱硅烷基-卣化物反应活性部分。所述三苯甲基-卣化物反应活性部分可以是取代的(例如Y-甲氡基三苯甲基、Y-二甲氧基三苯曱基、Y-三甲氧基三苯甲基等)或未取代的，其中Y在下文中定义。甲硅烷基反应活性部分可以是烷基取代的甲硅烷基卣化物，比如Y-二甲基甲硅烷基、Y-二三乙基甲硅烷基、Y-二丙基甲珪烷基、Y-二异丙基甲硅烷基等，其中Y在下文中定义。标记试剂的反应活性基团可以是亲核基团。在一些实施方案中，RG基团是胺基、羟基、硫醇基或-NH-NH2-基团，更典型地是胺基、羟基或硫醇基。反应活性基团可以是能与分析物上胍基反应的基团。在一些实施方案中，RG基团是v\。'。反应活性基团可以是光反应活性基团。在一些实施方案中，RG基在一些实施方案中，本发明的标记试剂包含2个或更多个RG基团。因此，提供了式RP-X-LK-(Y-RG)y的标记试剂，其中y是l-3。在一些实施方案中，y是2。报告物部分用于所述方法、混合物、试剂盒和/或组合物的实施方案中的一种或多种标记试剂的报告物部分是具有可被检测的独特质量(或质荷比)的基团。因此，组中的每个寺艮告物都可具有独特的总重量。不同的才艮告物可包含一种或多种重原子同位素以实现其独特的质量。例如，存在碳(12<:、13C和"C)、氮("N和"N)、氧(160和180)或氢(氢、氘和氚)的同位素并且可用于制备报告物部分的各种基团。稳定的重原子同位素的实例包括13C、15N、180和氘。通^免试剂中出现180可降低标记试剂的成本并且可提高同位素纯度。这些同位素的实例是非限定性的，因为其它的轻原子同位素和重原子同位素也可用于l艮告物中。适用于制M有轻原子同位素和重原子同位素的基本原材料可从多种商业来源得到，比如CambridgeIsotopeLaboratories、Andover、MA(见www.isotope.com中的名单或"basicstartingmaterials")和Isotec(Sigma隱Aldrich的一个分支W^)。CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec还将按照^^托合成合同制备,斤期望的化合物。^#。独特的报告物可与感兴趣的样品相关联，从而利用含有所述报告物的标记试剂标记该样品的一种或多种分析物。这样有关才艮告物的信息可与有关该样品的一种或所种分析物的信息相关。然而，当检测报告物时，报告物并不需要与分析物物理地连接。而是可以在被标记分析物的离子断裂从而产生子片段离子和可检测的报告物之后，在例如串g量分析器的二级质量分析中检测报告物的独特总质量。所检测的报告物可用于鉴定被检测分析物所来源的样品。此外，所述独特报告物相对于其它报告物的量或相对于一个或多个校正标准物(例如用特定净艮告物标记的分才斤物)的量可用于测定一种或多种样品中分析物的相对量或绝对量(通常以浓度和/或量表示)。因此，特定样品中一种或多种分析物的信息(比如量)可与用于标记每种特定样品的报告物部分相关联。当M—种或多种分析物进行鉴定时，该信息可与涉及不同报告物的信息相关联，从而便于鉴定一种或多种样品中每种被标记分析物并测定其量。报告物包含固定电荷或能被电离。因为报告物包含固定电荷或能被电离，所以标记试剂可被分离或用于标记盐形式或两性离子形式的反应活性分析物。报告物的电离便于其在质镨仪中的测定。因此，才艮告物可作为离子(有时称为信号离子)而^L检测到。当电离时，净艮告物可包含一个或多个正电荷或负电荷。因此，报告物可包含一个或多个酸性基团或碱性基团，因为这样的基团可容易地在质*中电离。例如，报告物可包含一个或多个碱性氮原子(正电荷)或一个或多个可电离的酸性基团比如羧酸根、磺酸根或磷酸根(负电荷)。在一些实施方案中，报告物可包含取代或未取代的千基离子。37可选择报告基因使得其在通常用于分析物分析的条件下基本上不进行亚断裂(sub-fragment)。可选择报告物使得其在施加解离能以引起被标记分析物的至少一部分所选离子的X键和Y键在质镨仪中均断裂的条件下基本上不进行亚断裂。"基本上不进行亚断裂"，意指在成功分析目标分析物时，难于或不可能以高于背景噪音的水平检测到报告物的片段。可有意选棒报告物的总质量，使之与寻求测定的分析物或任何所预计的分析物的片段的质量相比是不同的。例如，当蛋白质或肽是分析物时，可选择报告物的总质量，使之与任何天然氨基酸或肽或其所预计的片段相比是不同的。这可便于分析物的测定，因为取决于分析物，没有任何可能的具有完全相同质量的样品成分可增加任何分析结果的可信度。对于肽而言预计背景很少的质量范围的实例可见于表1。表1:用于选择标记物片段离子m/z的可能"安静区域"<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>才艮告物的总质量可小于250道尔顿。这样的小分子可容易地在二级质量分析中测定，在所述二级质量分析中不含有具有与一级质量分析中完全相同质量的其它样品成分。在本文中，通常可在串^it谱仪中对在一级质量分析中测定的所选离子进行二级质量分析。因为可从一级质量分析中特定地选择出具有特定质荷比的离子用于可能的断裂和进一步的质量分析，一M量分析中未被选择的离子不再进行二M量分析，因此不会污染二级分析的谱。此外，质镨仪的灵敏度和检测器的线性(为定量目的)在这样的4^:量范围内可以相当稳健。另外，在这样的质量范围内，质语仪技术的目前状况可允许小于1道尔顿的基线质量分辨率。这些因素可证明其对改进本领域状态是有用的。连接物部分取决于是否已经与分析物发生反应，所述方法、混合物、试剂盒和/或组合物的实施方案所用的化合物中由LK、LK1、LK2、LK3、LK4、LK5活性基团连接起来。当X键和Y键均断裂时，可选择连接物以产生不带电物质(即当X键和Y键均断裂时经历中性物丟失(neutralloss))。连接物可以是非常小的部分，比如氣基或疏代装基。例如，连接物可包含至少一种重原子同位素并且包含下式9SNHNR1人人或其中每个W相同或不同，并且是含有1~8个^l子的烷基，所述烷基可任选地含有杂原子或取代或未取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子独立地包含被连接的氢、氘和/或氟原子。连接物可以是较大的结构部分，比如氨基酸或杂烷基。连接物可以是聚合物或生物聚合物(例如肽)。当被施加解离能水平时，连接物可以被设计成子片段(sub-fragment),包括亚断裂从而产生连接物的一种或多种中性片段。在一些实施方案中，由连接物仅产生中性片段。图9A-9B描述了,'-x/v部分(在一些实施方案中，其可被LK基团包含)。每个用波浪线结尾的键表示与报告物、载体、反应活性基团或分析物连接的点。连接物部分可包含一种或多种重原子同位素，使得其质量补告物之间的总质量差异。此外，对于混合物的每种被标记分析物而言或对于组和/或试剂盒的试剂而言，所述报告物-连接物组合的合计总质量(即作为整体的总质量)可以《一相同的。更具体而言，连接物部分可补偿不同样品中祐:标记分析物的报告掷之间的总质量差异，其中报告物的独特的总质量与被标记分析物所来源的样品相关，并且不管被标记分析物所来源的样品如何，对于样品混合物的每种被标记分析物而言，l艮告物-连接物组合的合计总质量都是相同的。这样，当被标记并且然后混合以产生样品混合物时，两个或更多个不同样品中相同分析物的总质量即可具有相同的总质量。例如，被标记的分析物，或者用于标记分析物的组和/或试剂盒中的标记试剂(例如质量标签)可以是同分异构体或同量异位物(isobar)。因此，如果由样品混合物的初始质量分析选择在质谗仪中特定质荷比的离子(即所选离子，取自样品混合物)，则来自组成样品混合物的不同样品的相同分析物再次出现在所选的离子中，其与样品混合物中其各自的浓度和/或量成比例。因此，连接物不仅连接报告物与分析物，它还可用于补偿独特报告物部分的质量差异，从而协调多个样品的被标记分析物中报告物-连接物组合的总质量。因为连接物可在标记试剂中起到报告物的质量平衡物的作用，从而使得对于组或试剂盒中的所有试剂而言报告物-连接物组合的合计总质量相同，所以连接物中的原子数越多，组和/或试剂盒中不同的同分异构/同量异位的标记试剂的可能数量就越大。换言之，通常连接物包含的原子数越多，存在的潜在报告物-连接物组合数就越大，因为在连接物中大多数任何位置的同位素都可被取代，从而产生连接物部分的同分异构体或同量异位物，其中连接物部分用于弥补报告物部分的质量差异并因此产生报告物-连接物同分异构体或同量异位物的组。这样的标记试剂的不同组特别适于相同和/或不同样品中分析物的多重分析。组和/或试剂盒中标记试剂的总数可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。组或试剂盒中标记试剂的多样性仅受到才艮告物和连接物部分的原子数、可获得的用于取代轻同位素的重原子同位素和可通过合成掺入同位素的多种合成构型的限制。然而，如上所述，多种同位素富集的基本原材料可容易地从制造商比如CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec处得到。这样的同位素富集的基本原材料可用在用于制备同量异位和同分异构的标记试剂组的合成方法中，或者用于制备同位素富集的原材料，所述同位素富集的原材料可用在用于制备同量异位和同分异构的标记试剂组的合成方法中。制备适用于标记试剂组中同量异位的标记试剂的一些实例可见于下述实施例部分。报告物-连接物组合本文所述的标记试剂包含通过X键连接的净艮告物和连接物。如上所述，对于标记试剂的组和/或试剂盒中的每个成员而言，报告物-连接物组合的总质量可以相同。此外，标记试剂的报告物-连接物组合的X键可被构建成当被施加解离能水平时至少所选离子的一部分断裂，从而从分析物中释放出报告物。因此，报告物的总质量(以m/z比表示)及其强度可直接在MS/MS分析中观察到。报告物-连接物组合可包含組或试剂盒中多种标记试剂的相同或不同重原子同位素的多种组合。在科学文献中，这有时^皮称为编码或同位素编码。例如，Abersold等人公开了同位素编码的亲和标签(isotopecodedaffinitytag,ICAT;参见WO00/11208)。一方面，Abersold等人的试剂不同于本发明的标记试剂，因为Abersold没有教导两种或更多种相同质量的标记试剂，比如同分异构的或同量异位的标记试剂。质镨忉质谱(MS):可利用串M谱仪和其它能选择并断裂分子离子的质脊义来实践本发明的方法。串^t脊汊(以及在较小程度上的单^t谱仪)能根据分子离子的质量-电荷(m/z)的比选择并断裂分子离子，然后记录所得的片段(子)离子镨。更具体而言，子片段离子(daughterfragmention)谱可通过给所选离子施加解离能水平(例如碰撞i秀发解离(CID))而产生。例如，可在一级质量分析中选择出对应于具有特定m/z比的被标记肽的离子并将其断裂，在二级质量分析中再分析。可进行这样的串联质量分析的代表性仪器包括但不限于磁性四区质镨仪(magneticfour-sector)、串联飞行时间质镨仪、三重四极杆质谱仪、离子阱质谱仪和混合四极杆飞行时间(Q-TOF)质i糾。这些类型的质谱仪可与多种电离源联合使用，所述电离源包括但不限于电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。当分析物并非已具有固定电荷时，可利用电离源产生用于一级质量分析的带电物质。其它的质语仪器和断裂方法包括MALDI-MS仪器中的源后衰变和利用MALDI-TOF(飞行时间)-TOFMS的高能CID。对于串^MHf^的最新综述,请参见R.Aebersold和D.Goodlett,Mass5^"r麵e^vzTiiVW^附iV^O^/w.及ev.JW:269-295(2001)。还参见美国专利No.6,319,476(为所有目的，其内容在此通过引用并入本文)中对TOF-TOF质量分析技术的论述。利用解离能水平的断裂公认的是，键可以因在质谱仪中发生的过程而断裂。此外，通过使离子经历解离能水平而可以在质镨仪中诱发键断裂。例如，通5撞诱导解离(CID)可在质镨仪中产生解离能水平。质语领域中普通技术人员应当了解用于施加引起断裂的解离能水平的示例性技术包括但不限于光解离、电子捕获和表面诱导解离。通过;並撞诱导解离来断裂键的方法包括使所选离子的动能态升高到发生键断裂的程度。例如，可通it^碰撞室中与惰性气体(比如氮、氦或氩)碰撞而转移动能。可转移给离子的动能量与允许i^^撞室的气体分子数成比例。当存在的气体分子越多时，可转移给所选离子的动能量就越多，而当存在的气体分子越少时，则越少的动能被转移。因此，很清楚，可对质谱仪中的解离能水平进行控制。还公认的是某些键较其它键更不稳定。分析物或报告物-连接物部分中键的不稳定性取决于所述分析物或所述才艮告物-连接物部分的性质。因此，可调节解离能水平使得可以可检测的方式断裂分析物和/或标签(例如报告物-连接物组合)。本领域技术人员应当理解如何对质谙仪元件进行这样的常规调整以达到合适水平的解离能，从而将至少部分被标记分析物的离子断裂成离子化的报告物部分和子片段离子。例如，可将解离能施加给从一级质量分析中选#^/分离的离子。在串^f镨仪中，可向提取的离子施加解离能水平，然后将所述离子转移到二级质量分析器中。所选的离子可具有选定的质荷比。所述质荷比可在由质*^的特性所决定的一定范围的质荷比内。当使用碰撞诱导解离时，可通过使离子通it^並撞室(在那里可施加解离能从而产生片段离子)而将其从一级质量分析器中转移到二级质量分析器中。例如，被送到二级质量分析器用于分析的离子可包括所有的、一些或部分的剩余的(未断裂的)所选离子、以及被标记分析物的报告物离子(信号离子)和子片段离子。利用计算机辅助数据库分析的分析物测定在一些实施方案中，可基于通过与已知或"理论的"分析物的光语进行计算机辅助比较而分析的子离子(daughter-ion)断裂模式来测定分析物。例如，在低能CIDM下断裂的肽离子的子片段离子镨可被认为是许多离散的断裂事件的总和。普通命名法按照断裂的酰胺键和键断裂后保留电荷的肽片段来区分子片段离子。电荷保留在易断裂酰胺键的N-末端侧导致形成b-型离子。如果电荷保留在断裂的酰胺键的C-末端侧，那么片段离子称为y-型离子。除了b-型和y-型离子外，CID质镨还可包含其它的诊断片段离子(子片段离子)。这些离子包括通过由谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸中性丢失氨(-17amu)或由含羟基的氨基酸比如丝氨酸和苏氨酸失去水(-18amu)而产生的离子。已发现某些4l^酸在低能CID条件下比其它氨基酸更容易断裂。这对于含有脯氨酸或天冬氨酸残基的肽而言尤其明显，并且在天冬氨酰-脯氨酸键上甚至更明显(Mak,M.等，及fl/wV/CV附附"".Ma^5)^"ra附""837-842)(1998)。因此，Z画pro二聚体或Z-asp二聚体的肽键相比于所有其它^酸二聚体组合之间的肽键将倾向于更不稳定，其中Z是任何天然的氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。因此，对于肽和蛋白质样品而言，低能CID镨在重叠b-和y-系列离子、来自相同肽的内部片段离子、和铵根离子(immonium)以及其它中性丢失的离子中含有多余的序列特异性信息。解释这样的CID谱以从头组装母肽的JL^酸序列是具有挑战性的并JL^C时的。鉴定肽序列的最重要的联的计算机运算法则的开发。这样的方法由程序比如SEQUEST(Eng，J.等/爿附.Maw5^"ra附.，5:976-989(1994))和MASCOT(Perkins,D.等￡/e"w/7/^MMS,M:3551-3567(1999))作为示例。简而言之，实验性肽CID谱(MS/MS语)与从蛋白质或基因组序列数据库中得到的肽序列计算产生的"理论"子片段离子谱相匹配或相关联。所i^目匹配或相关联U于MS/MS模式中子片段离子的所预测质量和所观察质量之间的相似性。根据实验性片段模式和"理论"片段模式的一致程度对潜在的匹配或相关性进行评分。对搜索给定肽M酸序列数据库的限制是可区别的，以至于单一的肽CID谱即可足够用于鉴定整个基因组或表达序列标签(EST)数据库中任何给定的蛋白质。其他论述请参见Yates,J.R,Trends,76:5-8(2000)和Yates，J.R.，￡7醋—0聰、":893-900(1998)。因此，子片段离子的MS/MS镨分析不仅可用于测定被标记分析物的分析物，其还可用于测定被检测分析物所来源的分析物。例如，MS/MS分析中肽的鉴定可用于测定肽从中作为蛋白质酶消化结果而断裂下来的蛋白质。预计这样的分析可用于其它分析物，比如寡核苷酸。X键和Y键X是报告物原子和连接物原子之间的键。Y是连接物原子和反应活性基团或分析物(如果标记试剂已经与反应活性分析物反应)的原子之间的键。可用于本发明实施方案中的多种标记试剂(即RP-X-LK-Y-RG)的X键和Y键在经历解离能水平时可以在至少一部分所选离子中断裂。因此，可在质谱仪中调节解离能水平，使得被标记分析物(即RP-X-LK-Y-分析物)的至少一部分所选离子中X键和Y键二者都断裂。X键的断裂将才艮告物从分析物释放出来，使得I艮告物可独立于分析物而^L检测。Y键的断裂取决于X键是否已经断裂。Y键可比X键更不稳定。X键可比Y键更不稳定。X键和Y键可以具有同样的相对不稳定性。在一些实施方案中，X键可比Y键更不稳定。在一些实施方案中，X键断裂而Y键则保持不变。在另一些实施方案中，X键断裂并且Y键也断裂。当目标分析物是蛋白质或肽时，可根据酰胺(肽)键调节X键和Y键的相对不稳定性。X键、Y键或X键和Y键二者与典型的酰胺(肽)键相比较可以更不稳定、同样不稳定或更稳定。例如，在解离能条件下，与Z-pro二聚体或Z-asp二聚体(其中Z是任何天然的絲酸，proAM氨酸和asp是天冬氨酸)的肽键相比，X键和/或Y键可能较不易于断裂。在一些实施方案中，X键和Y键将在大约与典型的酰胺键相同的解离能水平下进行断裂。在一些实施方案中，X键和Y键将在与典型的酰胺键相比更高的解离能水平下进行断裂。在一些实施方案中，X键和Y键也可以Y键的断裂导致X键断裂的方式存在，反之亦然。这样，X键和Y键可基本上同时断裂，从而在二级质量分析中没有显著量的分析物或其子片段离子包含部分标记物。"显著量的分析物"意指小于25%并且优选小于10%的可在MS/MS傳中,皮检测到的部分标记分析物。因为在二^"量分析(MS/MS)的图镨方面分析物的被标记和未被标记的片段之间可存在清楚的区分，所以该特征可简化从子片段离子镨的计算机辅助分析中鉴别分析物。而且，在一些实施方案中，因为分析物的片段离子可被报告物/连接物部分全部标记或未标记(但不是部分地标记)，因此可能很少或没有跨断裂键的同位素分布而引起的子片段离子的质量M，而这种质量M在同位素存在于在二级质量分析中常规检测的部分被标记分析物的不稳定单键的每一侧上时是存在的。分析物的标记可通过使分析物的官能团与标记试剂的反应活性基团(RG)反应来标记分析物。如上所述，分析物上的官能团可以是亲电基团或亲核基团之一，并且标记试剂的官能团(即RG或反应活性基团)可以是亲电基团或亲核基团中的另一种。所述亲电基团和亲核基团可反应而在分析物与标记试剂之间形成共价连接。标记反应可发生在溶液中。在一些实施方案中，分析物或标记试剂之一可以是载体结合的。标记反应有时可在含水条件下进行。可选择用于标记生物分子比如蛋白质、肽、核苷酸和寡核苷酸的含水条件。标记反应有时可在有机溶剂或有机溶剂混合物中进行。可选择用于小分子分析物的有机溶剂。可在宽范围内使用水与一种或多种有机溶剂的混合物。例如，可制备水和约60%至约95%的一种或多种有机溶剂(v/v)的溶液并用于标记分析物。在一些实施方案中，可制备水和约65%至约80%的一种或多种有机溶剂(v/v)的溶液并用于标记分析物。有机溶剂的非限定性实例包括N，N，-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(ACN)和醇比如甲醇、乙醇、丙醇和/或丁醇。当进行标记及^应时，可调节pH。pH可在4-10的范围内。pH也可在该范围之外。一般而言，可通过加入非亲核性有M调节非含水反应的碱性。合适的碱的非限制性实例包括N-甲基吗啉、三乙胺和N,N-二异丙基乙胺。或者，可利用生物緩沖剂比如(N-[2-轻乙基哌嗪-N，-[2-乙磺酸)(HEPES)或4-吗啉乙磺酸(MES)或无机緩冲剂比如碳酸钠和/或碳酸氢钠调节含水溶剂的pH。因为至少一个反应活性基团可以是亲电性的，所以可理想地选择緩冲剂以不含任何亲核基团。本领域技术人员应当理解，借助常规实验，可以采用能用于调节标记反应的pH的其它緩沖剂，从而方l更用标记试剂标记分析物。样品处理在本发明的某些实施方案中，可在标记分析物之前以及之后处理样品。处理可适用于整个样品或其级分。处理可适用于样品混合物或其级分。处理可用于减少样品的复杂性或用于〗吏样品处于更好的形式用于分^f。处理可有助于分析物的标记。处理可有助于样品成分(例如被标记分析物)的分析.处理可简化样品的^作。处理可有助于前述两种或更多种情况。例如，可利用酶处理样品。所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白质和肽)、核酸酶(以降解寡核苷酸)或一些其它酶。可选择具有同样可清楚预测降解模式的酶。两种或更多种蛋白酶和/或两种或更多种核酸酶还可一起使用或与其它酶一起使用，从而降解样品成分。例如，蛋白水解酶胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，其断开赖氨酸或精氨酸与非特异性氨基酸之间的肽键，从而产生含有胺末端(N-末端)和赖氨酸或精氛酸g末端氨基酸(C-末端)的肽。这样由蛋白质裂解而形成的肽是可预测的，并且其在胰蛋白酶消化的样品中的存在和/或量可标志着其来源蛋白质的存在和/或量。此外，肽的游离胺末端可以是便于其标记的良好的亲核物。其它的示例性蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶C。例如，当用蛋白酶比如胰蛋白酶消化时，蛋白质(例如蛋白质Z)可能产生3种肽(例如肽B、C和D)。因此，已经利用蛋白水解酶比如胰蛋白酶消化的样品，当被分析证实含有肽B、C和D时，可认为该样品起初含有蛋白质Z。肽B、C和D的量也将与被消化样品中蛋白质Z的量相关联。这样，对样品(或其级分)中一种或多种肽B、C和D的鉴定和/或量的任何测定可用于鉴定和/定量初始样品(或其级分)中的蛋白质Z。因为酶的活性是可预测的，所以可预测由已知序列的蛋白质降解而产生的肽的序列。利用该信息，可形成"理论"肽信息。因此，对来自实际样品质语分析的子片段离子(如上所述)的计算机辅助分析中进行"理论"肽片段的测定可用于测定一种或多种未知样品中的一种或多种肽或蛋白质。一些情况下，样品处理可包括处理待标记的一种或多种分析物的前体。例如，如果所述待标记的一种或多种分析物是源自被消化的蛋白质的肽并且标记试剂(对于该实例而言)被选择成与肽或肽分析物的胺基(例如赖氨酸的N-a-胺基和N-s-胺基)反应，则可以便于标记反应的方式处理样品的蛋白质(分析物前体分子)。在该实例中，蛋白质可被还原剂(例如三[2-羧乙基I膦(TCEP))还原，然后通过与封闭试剂(例如曱烷硫代磺酸甲酯(MMTS))反应而封闭硫醇基。这样，蛋白质的硫醇基被封闭，因此不干扰分析物的胺与标记试剂之间的标记反应。本领域技术人员应当理解，可利用容易得到的试剂和可借助常规实验调整的方案处理某些其它前体分子。可，艮据待标记分^斤物和标记试剂的性质精确选择试剂和条件。在一些实施方案中，样品处理可包括将一种或多种分析物的前体固定到固相载体上，不管是否已用标记试剂进行标记。在一些实施方案中，固定可有助于降低样品复杂性。在一些实施方案中，固定可有助于分析物的标记。在一些实施方案中，固定可有助于分析物前体的标记。在一些实施方案中，固定可有助于选择性标记具有某一特性的样品成分级分(例如它们含有或缺少半胱氨酸部分)。所述固定可有助于上述两种或更多种情况。分离在一些实施方案中，被标记分析物的样品或样品混合物的处理可包括分离。可对被标记或未被标记的分析物、被标记或未被标记的分析物前体、或其级分进行一次或多次分离。可对来自固相捕获的一个或多个级分进行一次或多次分离。可对两种或更多种上述物质进4亍分离。例如，可制备来自不同样品的含有被不同标记的分析物的样品混合物。被不同标记意指每个标记物含有独特的可被识别的特性(例如含有在MS/MS分析中产生独特"信号离子，，的独特的报告物部分)。为分析样品混合物，可分离样品混合物的成分并仅对样品混合物的级分进行质量分析。这样，可实质上降低分析的复杂性，因为可单个地分析被分离的分析物的质量从而提高分析方法的灵敏度。当然，可对样品混合物的一个或多个其它级分重复分析一次或多次，从而允许分析样品混合物的所有级分。如果加入到样品混合物中的每种样品的量是已知的，则可使用被不同地标记的相同分析物在与其在样品混合物中的丰度成比例的浓度或量下进行共洗脱的分离条件以测定含有样品混合物的每种样品中每种被标记分析物的量。因此，在一些实施方案中，对样品混合物的分离可使分析简化，而同时维持质量分析(例如MS/MS分析)中所测信号与样品混合物中被不同地标记的分析物的量之间的相关性。可利用色谦进行分离。例如，可利用液相色谱/质镨(LC/MS)实现这样的样品分离和质量分析。此外，可使用任何适于分离感兴趣的分析物的色谱分离方法。例如，色镨分离可以是正相色谱、反相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱或亲和色谱。可进行电泳分离。可使用的电泳分离技术的非限定性实例包括但不限于一维电泳分离、二维电泳分离和/或毛细管电泳分离。同量异位的标记试剂或标记试剂组可用于标记样品的分析物。当进行分离步骤时同量异位的标记试剂是特别有用的，因为标记试剂组的同量异位的标记物在结构上和化学上是不可区分的(并且可以在总质量上是不可区分的，直到发生断裂从分析物除去了报告物)。因此，用不同的同量异位标记物进行标记的相同组成的所有分析物都可以完全相同的方式进行色谱分离(即共洗脱)。因为它们在结构上和化学上是不可区分的，所以来自分离过程的洗脱液可包含与样品混合物中被标记分析物的量成比例的每种同量异位性标记分析物的量。此外，根据如何制备样品混合物(样品的某些部分、另外加入的任选成分(例如校正标准物)以制备样品混合48物)的知识，可使样品混合物中被标记分析物的量反过来与其所来源的样品中被标记分析物的量相关联。标记试剂还可以是同分异构的。虽然同分异构体有时可通过色语分离，但存在可操作分离过程以共洗脱所有被不同标记的相同分析物的情形(其为条件依赖性的)，其中存在于洗脱液中的所有被标记分析物的量与样品混合物中的其浓度和/或量成比例。本文所用的同量异位物与同分异构体的不同之处在于同量异位物是结构上和化学上不可区分的相同总质量的化合物(除了同位素含量和/或分布以外)(参见例如图1)，而同分异构体则是结构上和/或化学上可区分的相同总质量的化合物。工作流程在一些实施方案中，可在进行样品处理步骤之前进行样品的分析物的标记。在一些实施方案中，可在其它样品处理步骤中进行分析物的标记。在一些实施方案中，分析物的标记是样品处理的最后步骤和/或在紧接着制备样品混合物之前进行分析物的标记。用蛋白质组分析作为非限定性实例，存在至少几个可能使用的工作流程。为帮助理解下面的论述，有时区分前体蛋白质和分析物肽。然而，应当理解蛋白质或肽中任一种或其二者皆可被认为是本文所述的分析物。在一种类型的工作流程中，前体蛋白质可被消化成肽分析物，所述肽分析物然后可被标记试剂标记。在另一种类型的工作流程中，前体蛋白质可被标记试剂标记然后被消化成标记的肽分析物。在另一种类型的工作流程中，前体蛋白质可被捕获到固相栽体上、被消化然后可标记载体结合的肽。任选地还可标记流过的肽(flowthroughpeptide)。在另一种类型的工作流程中，前体蛋白质可被捕获在固相栽体上、被标记然后载体结合的蛋白质可被消化以产生被标记的肽。任选地还可分析流过的肽。不管工作流程如何,可在MS分析之前按照期望对被标记肽进行另外的样品处理(例如分离步骤)。总之，可在已经进行一次或多次分离和/或样品处理步骤之前或之后标记分析物。本发明并不局限于在何时进行分析物的标记，只要可标记一种或多种样品的分析物以及可由不同标记的样品制备一种或多种样品混合物即可。分析物的相对定量和绝对定量在一些实施方案中，对样品混合物的不同标记的相同分析物进行相对定量是可能的。通过将在二级质量分析中测定的报告物相对量(例如所记录的峰的强度、面积和/或高度)进行比较，所述二级质量分析是针对一级质量分析中观察到的选定被标记分析物进行的，有可能对不同标记的相同分析物进行相对定量。换句话说，当每个报告物可与用于制备样品混合物的具体样品的信息相关联时，某报告物相对于二级质量分析中所观察到的其它报告物的相对量即是样品混合物中该分析物的相对量。当合并而形成样品混合物的成分已知时，可基于针对一级质量分析中所选的被标记分析物的离子观察到的报告物的相对量倒算用于制备样品混合物的每种样品中分析物的相对量。可对一级质量分析中观察到的所有不同标记分析物重复进行该方法。这样，可测定用于制备样品混合物的每个不同样品中每种^J[活性分析物的相对量(通常以浓度和/或量表示)。在一些实施方案中，可测定分析物的绝对量。对于这些实施方案而言，可向样品混合物中添加已知量的一种或多种不同标记的分析物(校正标准物)。校正标准物可以是被用于标记样品混合物中分析物的标记物组中的同分异构或同量异位标记物进行标记的所期望的分析物，只要与用于形成样品混合物的任何样品相比，用于校正标准物的报告物是独特的即可。一到目对于样品混合物中被不同标记的分析物的报告物相对量测定校正标准物的报告物的相对量，就可能计算样品混合物中所有被不同标记的分析物的绝对量(通常以浓度和/或量表示)。这样，基于如何制备样品混合物的信息，还可测定每种被不同标记的分析物的绝对量(对于每种被不同标记的分析物而言，分析物所来源的样品中含有校正标准物)。尽管前面说述，合适时，可针对报告物中任何天然存在的或人工制造的同位素的丰度对才艮告物离子(即信号离子)的强度(或面积或高度)进行校正。这些类型的校正的更完善的实例还可见于2003年11月26日提交的名称为"MethodandApparatusForDe-ConvolutingAConvolutedSpectrum"的未决和共有的美国临时专利申请No.60/524，844中。越谨慎精确定量每个报告物的强度，则初始样品中分析物的相对定量和绝对定量就筒言之，利用这些方法，可以将与特定信号离子相关的增重质量(upmass)和减重质量(downmass)同位素峰的强度添加到与所述信号离子(即报告物)相关的主要强度峰上，使得可将所有强度适当地归属于正确的报告物。合适时，可推导出不与特定信号离子相关的峰强度。通过将所有峰强度分配给合适的信号离子，与信号离子相关的相对定量和绝对定量信息可以相当精确。越精确地将强度分配给正确的报告物，定量测定就可越精确。蛋白质组分析本发明的方法、混合物、试剂盒和/或组合物可用于复杂分析，因为利用质量分析技术可以快速和重复的方式使得样品被多重化、分析和再分析。例如，可对样品混合物分析一种或多种样品中单个分析物的量。可测定构成样品混合物的样品中那些分析物的量(通常以浓度和/或量表示)。因为样品处理和质量分析可快速进行，所以这些方法可重复数次，这样可检测样品混合物中多种不同标记的分析物相对于其在分析物所来源的样品中的相对量和/或绝对量。有关这样的快速多重分析的一种有利应用是在蛋白质组分析领域中。蛋白质组学视为针对生物学方法的结构、功能和调控描述基因組序列中编码信息的实验性方法。这可通过由细胞或组织所表达的总蛋白质成分的系统分析而实现。与本发明的方法、混合物、试剂盒和/或组合物的实施方案组合使用的质谱法是用于这样的总蛋白质分析的一个可能工具。例如，利用一组4种同量异位标记试剂，可在一个实验中得到4个时间点以测定蛋白质表达的上调或下调，例如，基于生长细胞对特定刺激物的反应。还可进4亍较少的时间点而引入一个或两个对照物。在所有情形下，可在单一多重实验中测定蛋白质表达的上调或下调(任选i^目对于对照物)。此外，由于处理是平行进行的，所以结果是直接可比的，因为不具有方案的轻微变化可影响结果的风险。4.本发明多个实施方案的描述多个实施方案包括下面部分所述的一种或多种试剂盒、阵列、库、混合物、化合物、被标记分析物和方法。A.化合物说明书第35/104页各实施方案中的每一种都可使用由结构式r所代表的一种或多种化合物，或其盐形式和/或7jc合物形式RP-X-U<-(Y-RG)mSVS'ti、v变量m可以是l3的整数，通常是l，这时所述化合物可由结构式1#所代S',S',^针对每种化合物，上述结构式中的变量可独立地按下述进行选择RG可以是亲核基团或亲电基团，或是分析物与亲核基团或亲电基团的^JL产物；r和t可以都是0，或r和t之一可以是l且另一个可以是O;当r和t之一是l时，S，可以是连接物，例如与固相栽体或亲和配体偶联的可断开连接物；X和Y可以各自是键，其中X可与RP和LK中每一个的原子或任选的取代基偶联从而使RP与LK连接，并且Y可以将LK的原子或任选的取代基与RG偶联；RP和LK可以各自任选地和独立地被取代，其中RP和LK可各自独立地是杂芳基或杂环烷基，或被杂芳基或者杂环烷基取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪疾基团；或者LK可以是连接部分，并且RP可以是叔胺、在环氮上与X键合的4-9元含氮杂芳基或杂环烷基、5-6元的芳基亚甲基、5-6元的杂芳基亚甲基或5-6元的杂环烷基。在一些实施方案中，上述值可满足选自以下的一个或多个前提M:1)RP-X-LK-Y不是聚合物；2)RP和LK并不都含有哌溱基；RP和LK并不都选自氨基酸(比如天然氨基酸)、核苷酸、寡核苷酸、肽和蛋白质；和3)当t是0时，基团RP不是含有环氮原子的任选地取代的5、6或7元杂环烷基，所述环氮原子与式-C(J)2-LK，-的取代或未被取代的结构部分发生N誦烷基化使得LK，是誦C(O)誦、-C(S)國、國C(NH)國或-C(NRz)-，其中Rz是可任选地含有杂原子并含有1至8个碳原子的烷基或任选地取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子独立地含有连接的氢、氘和/或氟原子，并且每个J可相同也可不同，并且是H、氘(D)、Rz、ORz、SRz、NHRz、N(Rz)2、氟、氯、溴或碘。在多个实施方案中，RG可以是由RG所代表的亲核基团或亲电基团，并且每个化合物可以是标记试剂；并且多个化合物可以是标记试剂试剂盒、标记试剂的库等。在一些实施方案中，RG可指分析物与RG所限定的亲核基团或亲电基团的反应产物，其中每个化合物可以是被标记分析物。多个这样的化合物可以是被标记分析物的混合物、被标记分析物的库等。为精确参考这样的实施方案中的某些描述，用-分析物表示分析物与RG所限定的亲核基团或亲电基团的反应产物。一些实施方案可以是由结构式r或1#所代表的单个的同位素富集的化合物。在多个实施方案中，多个化合物可以是同位素富集的。同位素富集的化合物可富集了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、高达15、高达20、高达25或更多个相同或不同的重原子同位素。一些实施方案可包括多个不同的化合物，例如两个或更多个，其中所述多个化合物可以是例如试剂盒、库、阵列、混合物等。在这样的实施方案中，对于每个不同的化合物而言，RP和LK可以各自具有独特的总质量，可弥#傳个化合物的RP之间独特的总质量的差异，使M个化合物的RP和LK的合计总质量可以相同。在一些实施方案中，两个或更多个不同的化合物可以是同量异位的同分异构体，其中化合物具有同分异构的化学结构但却具有相同的总质量。在一些实施方案中，两个或不同的化53合物可以是同量异位的同位素化形式，其中所述化合物具有相同的化学结构和相同的总质量但却具有不同的同位素组成，例如至少一个同量异位的同位素化形式是同位素富集的。在多个实施方案中，r和t之一可以是l，并且S，可以是与固相载体或亲和配体偶联的可断开连接物。因此，当S，是固相载体时，多个实施方案可包括标记试剂的固相负栽的库、被标记分析物的固相负载的库等。在一些实施方案中，对于每个不同的化合物而言，由S，表示的可断开连接物可在固相栽体上的单独的阵列位置处与固相载体偶联，所述固相载体含有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚环氧乙烷、聚丙烯酰胺、玻璃、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或反相二氧化硅，基质为凝胶、膜或表面的形式，由此试剂盒是不同化合物的阵列库。在一些实施方案中，RG可以是亲核基团或亲电基团，由此试剂盒是标记试剂的阵列库；或者RG可以是分析物与亲核基团或亲电基团的反应产物；由此试剂盒;l被标记分析物的阵列库。在一些实施方案中，对于每个不同的化合物而言，由S，表示的可断开连接物可在单独的固相载体珠、球、粒子或颗粒上与固相栽体偶联，所述固相载体^^有聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚环氧乙烷、聚丙烯酰胺、玻璃、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或反相二氧化硅，由此试剂盒是不同化合物的固相栽体库。在一些实施方案中，RG可以是亲核基团或亲电基团，由此试剂盒是标记试剂的固相载体库；或者RG可以是分析物与亲核基团或亲电基团的反应产物；由此试剂盒是被标记分析物的固相载体库。在一些实施方案中，对于每个不同的化合物而言，由S，表示的可断开连接物可与不同亲和配体相偶联，所述亲和配体选自抗原、抗体、抗体片段、抗生物素蛋白、生物素、链霉抗生物素蛋白、蛋白质A、凝集素和碳水化合物，由此试剂盒是亲和配体库。在一些实施方案中，RG可以是亲核基团或亲电基团，由此试剂盒是标记试剂的亲和配体库；或者RG可以是分析物与亲核基团或亲电基团的反应产物；由此试剂盒是被标记分析物的亲和配体库。在多个实施方案中，试剂盒、阵列、库、被标记分析物混合物和方法中的化合物，以及同位素富集的化合物还可由结构式I-S，至VI-S，或I至VI中之一或其同位素化形式代表FjP，-X-LK1-Y-RGS'rS',Kg,;RP2-X-LK2-Y-RGSVs、h一sRP3-X-LK3-Y-RGIIRP4-X-LK4-Y-RGSVs、IV_S,;RP5-X-LKS-Y-RGsvs'tv_s,;RPS-X-LK6-Y-RGi,IRP'-X-LK'-Y-RGI;RP2-X-LK2-Y-RGII;RP3-X-LK3-Y-RGIII;RP4-:X-LK4-Y-RGIV;RP5-X-LK5-Y-RGV;RP6-X-LK6-Y-RGVI变量r、s、S，、X，和X如上所述或进一步如下所述，并可符合上述相关前提^4K变量RP1、RP2、RP3、RP4、RP5、RP6、LK1、LK2、LK3、LK4、LKS和LK^在下面进行更详细地描述，并且可符合上MRP-X-LK-Y及其变量RP/RP，和LK/LK，的相关前提条件。例如，对于可由结构式V或V-S，代表的化合物而言，LKS可以是由结构式E表示的连接部分(应当理解，在结构中通过波浪线识别与标记试剂其余部分的连接点)RP5-X-LK5-Y-RGV,其中RP5可以是报告物基团RP(如上所定义)并且LKS可以是由结构式E所代表的连接部分:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>其中每个n独立地可以是1~3的整数；并且每个R独立地可以是H、D、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基或卣素。在多个实施方案中，至少一个化合物可由结构式D表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>在另一个实例中，对于可由结构式I或I-S，表示的化合物而言，RP1可以是由结构式A所代表的报告物基团(应当理解，在结构中通过波浪线表示与标记试剂其余部分的连接点)a环A可以是芳香性的；每个Z可以独立地是CH、CW或N，前提是不超过2个Z基团是N;n可以是l或2，通常是2，这样环A是6元环；每个R2可以独立地选自定义部分中所述的合适取代基，或更通常可选自氢、氘、-OH、卣素、-CN、-N02、烷基、烯基、^l^、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、-议3或-1-113;每个W可以独立地是氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基；T可以是-O-、-NR4-、-S画、誦C(O)-、-S(O)-、-S02-、-NR4C(0)-、C(0)NR4-、-NR4S02-、，S02NR4-、-C(O)O國、-OC(O)國、-NR4C(0)04-OC(0)NR4-;每个W独立地是氢、氘、烷基、杂烷基、芳基或芳烷基；LK1是连接部分；X是报告物的原子和LKt之间的键；和Y是连接物的原子和RG的原子之间的键。在多个实施方案中，R^和LK^中至少一个可以同位素地富集一个或多个重原子同位素，例如RP1。在一些实施方案中，R^和LK^二者都可以各自同位素地富集一个或多个重原子同位素。在一些实施方案中，RP1和LW每一个各自含有至少两个重原子同位素。在一些实施方案中，RP1和LK1中每一个各自含有至少三个重原子同位素。在一些实施方案中，n是2由此环A可以是6元环。在一些实施方案中，环A的邻位或对位中任一个Z基团可以是C-T-R3。在多个实施方案中，环A的邻位或对位中任一个Z基团可以是C-NHC(O)-R3或C-NHS02-R3，并且每个113可以独立地是任选地取代的烷基。在一些实施方案中，n是2，并且每个Z独立地是CH或CR2,因此Rpi可由结构式A-l表示在一些实施方案中，式A中的至少一个原子是用重原子同位素进行同位素富集的。在一些实施方案中，LK^可包含氩基酸、肽、Cm亚烷基链，其中所述链的1~4个亚甲基单元独立地被^J^酸、-O画、國NR画、-S-、陽C(O)画、—S(O)誦、-S02-、國NRC(O)-、-C(O)NR画、-NRS02—、-S02NR-、画C(O)O-、-OC(O)隱、-NRC(O)O-、國OC(O)NR國或亚芳基、芳基亚烷基、亚杂烷基、亚杂环龍基、亚杂芳基或亚杂芳烷a代，其中每个R独立地是氢、氘、或任选地取代的d-6烷基。M酸部分可以是甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、脯氨酸或鸟氨酸。在一些实施方案中，LK^可以是任选地取代的Cm亚烷基链，其中所述链的14个亚甲基单元可独立地被-C(O)O-、-C(O)國、國O-、-NH画、國C(O)NH隱、-S-、画NH-、國S(O)-、-S02-或^J^酸取代，其中基团A的亚甲基单元a可以被-O-、-S-或-NH-代替。在一些实施方案中，LK1的亚甲基单元之一可被任选地取代的氮杂亚烷基、氮杂亚环烷基或氮杂亚芳^^取代。在多个实施方案中，至少一种化合物可由结构式I-1所代表<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>其中邻近碳原子的符号"*"可表示该碳可以是13〔同位素，邻近氮原子的符号"*"可表示该氮可以是15N同位素。在一些实施方案中，至少一种化合物可由结构式I-10所代表在多个实施方案中，至少一种化合物可由选自下面的结构式所代表:其中R8可以是价键、亚烷基或画(CH2)s-(0-CH2CH2)p-(CH2)s-;p可以是l、2、3或4;并且每个s可以独立地是O、1、2或3。在一些实施方案中，所述化合物可由结构式II或II-S，所代表，其中Rpz可以是由结构式B所代表的报告物基团环B可以是非芳香性的；n可以是l或2;每个W可以独立地是O、S或NR,在一些实施方案中，结构式II中的每个W可以是O或其同位素；每个W，可以独立地是CH2、CHR2、C(R2)2、C(O)、S(O)、S(0)2或C=N-R4;Q可以是CH或CR2;每个R2可以独立地选自定义中所述的合适取代基，或更通常可选自氢、氘、陽OH、g素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、-113或-1-113;每个W可以独立地是氢、氘、或任选地取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基;t可以是-o國、画nr4画、-s-、-c(o)國、-s(o)-、-so2-、-nr4c(o)-、-c(o)nr4-、-NR4s02-、-s02NR4-、-c(O)O画、-OC(O)陽、陽NR4c(0)0画或醒OC(0)NR4國；每个W可以独立地是氢、氘、烷基、杂烷基、芳基或芳烷基；LK^可以是连接部分；X可以是报告物的原子和LK^之间的键；和y可以是连接物的原子和rg的原子之间的键。在一些实施方案中，至少一个w部分是o，至少一个w，部分是chr2。在多个实施方案中，m^和li^中至少一个可以被一种或多种重原子同位素进行同位素富集，例如rp2。在一些实施方案中，1^2和1^2二者可以各自被一种或多种重原子同位素进行同位素富集。在一些实施方案中，RP2和lk"中每一个含有至少两种重原子同位素。在一些实施方案中，RP2和lk^中每一个含有至少三种重原子同位素。在多个实施方案中，可按照lk1的多个实施方案定义lk2。在一些实施方案中，所述报告物基团是式B，其中n是2并且每个w都是o。因此提供式b-1的报告物基团其中每个W如上述所定义并且如本文中所定义。在一些实施方案中，所述报告物基团是式B,其中n是l并且每个W是O。因此提供式B-2的报告物基团<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>其中每个W如上述所定义并且如本文中所定义。在一些实施方案中，所述化合物可由结构式II-d所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在一些实施方案中，所述化合物可由结构式II-e所代表:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在一些实施方案中，RP1中的至少一个原子被重原子同位素进行同位素富集。在多个实施方案中，所述化合物可由结构式III或III-S，所代表，其中Rps可以是由结构式C所代表的净艮告物基团:rx和Ry可以各自独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基或杂烷基，其中RX和Ry的合适的任选取代基可独立地选自定义中所述的合适取代基，或更通常可选自氢、氘、-OH、卤素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、-R3、-t-R3、核糖、脱氧核糖或磷酸酯，或者w和Ry可一起形成环c，环c，可以是任选地取代的杂芳基或杂环烷基，其中环c的合适的任选取代基可以独立地选自定义中所述的合适取代基，或更通常可选自氢、氘、画OH、卣素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环絲、國R3、画t-R3、核糖、脱氧核糖或磷酸酯；每个RS可以独立地是氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基；t可以是膽o画、-nr4-、-s國、陽c(o)-、-s(o)画、-so2-、-nr4c(o)-、-c(o)nr4-、-NR4S02-、-S02NR4-、國C(O)O誦、画OC(O)画、-议4<:(0)0-或曙0<:(0)114-;每个R"独立地是氢、氘、烷基、杂烷基、芳基或芳烷基；Lf可以是连接部分，前M当RX和Ry—起形成环C，时，则连接RX和Ry的环氮与除了取代的或未取代的式-C(JVLK，-部分以外的基团相连接，使得LK，是-C(O)-、-C(S)濕、醫C(NH)陽或-C(NRz)画，其中Rz是含有1~8个碳原子并可任选地含有杂原子的烷基或任选地取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子独立地含有连接的氢、氘和/或氟原子，J相同或不同并且是H、氖(D)、Rz、ORz、SRz、NHRz、N(Rz)2、氟、氯、溴或碘；X可以是报告物的原子和LK^之间的键；和Y可以是连接物的原子和RG的原子之间的键。在多个实施方案中，RP3和LK3中至少之一可以被一种或多种重原子同位素进行同位素富集，例如RP3。在一些实施方案中，RpS和LI^二者可以各自被一种或多种重原子同位素进行同位素富集。在一些实施方案中，每个RP3和LK3各自含有至少两种重原子同位素。在一些实施方案中，每个RP3和LK3各自含有至少三种重原子同位素。在一些实施方案中，LKS是符合以下条件的连接部分当RX和Ry一起形成环C时，则LK可以是除了-C(J)2C(0)-，-C(J)2C(S)-、-C(J)2=NH-或-C(J)2-NR、以外的基团，其中每个J可以独立地是氢、氘、R4、OR4、SR4、NHR"或N(R4)2。在多个实施方案中，可按照LK^的多个实施方案定义LK3。在一些实施方案中，报告物基团是式C，其中Ri和Ry—起形成环C，。因此提供式C"的报告物基团其中q是06，并且环C如上述和本文中所定义。在一些实施方案中，才艮告物基团可以由C表示，其中环C，，是杂环烷基并且q是2、3或4。因此，提供式C-1的报告物基团在一些实施方案中，式C-1中至少一种原子被重原子同位素进行同位素富集。在一些实施方案中，式C-1中至少一种原子被两种重原子同位素进行同位素富集。在一些实施方案中，报告物基团c的上述结构需要连接物不是通过X键与氮原子发生N-烷基化的取代或未取代的乙酸部分。在一些实施方案中，所述化合物可由结构式III-c所代表其中q可以是06的整数，并且LK可含有g。在一些实施方案中，化合物可由选自下面的结构式所4义表:5和m-2在多个实施方案中，RP可包含任选地取代的哌溱基，并且LK可以68是芳基或环烷基、或被芳基或环烷基取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪^&团。而且，对于可由结构式VI或VI-S，所代表的化合物而言，RP6或LK6中至少之一可含有任选地取代的核^、或被任选地取代的核>^^取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪族基团。Rp6和LK6的任选取^(^可独立地选自氢、氘、-OH、卤素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、-R3、-T-R3、核糖、脱氧核糖或磷酸酯；每个RS可以独立地是氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基或杂芳览基；T可以是-O画、-NR4-、國S画、-C(O)國、-S(O)-、-S02-、-NR4C(0)-、國C(0)NR4—、-NR4S02-、-S02NR4-、师C(O)O-、誦OC(O)-、-NR4C(0)04-OC(0)NR4-;每个W独立地是氢、氘、烷基、杂烷基、芳基、或芳烷基；X是报告物的原子和LK^之间的键；和Y是连接物的原子和RG的原子之间的键，其中RP6和LK6至少之一可被一种或多种重原子同位素进行同位素富集；前提是如果RP6是杂环烷基，则所述杂环烷基不是含有环氮原子的5、6或7元杂环烷基，所述环氮原子被取代或未取代的式-C(J)rLK，-部分所N-烷基化使得LK，是-C(O)-、-C(S)匪、-C(NH)國或-C(NRz)-，其中Rz是可任选地含有杂原子并含有18个碳原子的烷基或任选地取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子独立地含有连接的氢、氘和/或氟原子，J相同或不同并且是H、氘(D)、Rz、ORz、SRz、NHRz、N(Rz)2、氟、氯、溴或碘。而且，对于可由结构式IV或IV-S，所代表的化合物而言，RP"和LK4可各自独立地是杂芳基或杂环烷基、或被杂芳基或杂环烷基取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪泉基团，其中RP4和LK4的合适的任选取代基可独立地选自定义中所述的合适取代基，或更通常可选自氢、氘、-OH、卤素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、-R3、-T-R3、核糖、脱氧核糖或磷酸酯；每个W可以独立地是氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基；T可以是丽O-、-NR4-、-S-、-C(O)-、誦S(O)隱、-S02-、-NR4C(0)-、-C(0)NR4-、-NR4S02-、-S02NR4-、誦C(O)O-、-OC(O)國、-NR4C(0)0-或-OC(0)NR4-;每个R"可以独立地是氢、氖、烷基、芳基或芳烷基；X可以是报告物的原子和LK"之间的键；和Y可以是连接物的原子和RG的原子之间的键。在多个实施方案中，RP4和LK^中至少之一可以被一种或多种重原子同位素进行同位素富集，例如RP4。在一些实施方案中，RP"和LK"二者可以各自被一种或多种重原子同位素进行同位素富集。在一些实施方案中，RP4和LK4中每一个4、有至少两种重原子同位素。在一些实施方案中，处4和1^4中每一个各自含有至少三种重原子同位素。在多个实施方案中，RP-和LK^中的杂芳基或杂环烷基可各自独立地选自任选地取代的咪哇基、呋喃基、吡咯基、嚷吩基、嚅唑基、噻喳基、异嚅哇基、异瘗唑基、瘗二唑基、嚅二哇基、吡梵基、嘧梵基、吡嗪^基、峻嚷基、查啉基、异壹啉基、吲嗤基、苯并^恶唑基、苯并异喏、哇基、苯并呋喃基、苯并逸哇基、中氮茚基(indolizinyl)、咪唑并吡咬基、吡哇基、三哇基、异噻唑基、噹峻基、四哇基、苯并咪哇基、苯并瘗哇基、苯并异噻喳基、苯并瘗二哇基、苯并嚅二哇基、吲咮基、四氢吲哚基、氮杂吲咮基、咪唑并吡梵基、喹唑啉基、噪呤基、吡咯并[2,3嘧梵基、吡咯并[3,4嘧咬基、苯并(b)瘗吩基、吗啉基、哌咬基、哌秦基、吡咯烷基和硫代吗啉基。在多个实施方案中，处4或LK"中至少之一可以包含任选地取代的哌,基、或被哌漆基取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪波基团，或在一些实施方案中，RP4可以是任选地取代的哌噪基，例如N-曱基哌溱基。在多个实施方案中，RP4或LK4中至少之一可以包含任选地取代的核碱基(例如任选地取代的嘌呤基或嘧哽基)、或被任选地取代的核M取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪波基团。在一些实施方案中，LK"可以是任选地取代的核碱基，或被任选地取代的核磁基取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪波基团。所述核碱基，例如LK"中的核碱基，可任选地被9H-嘌呤-6-胺、2-絲-lH-嘌呤-6(9H)-酮、4-絲嘧咬-2(lH)-酮、5-甲基嘧咬-2,4(lH,3H)國二酮等取代。所述核威基可以是取代的或未被取代的。在多个实施方案中，所述化合物可由选自以下的结构式所代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>上述横穿过环所画的M示该键可与该环中任何可取代的原子相连接；横穿过两个环所画的键表示可与那两个环中任何一个环的任何可取代的原子相连接的键。基团R5可以是-C(J)rC(O)-、國C(JVC(S)画、画C(J)2國C(NH)画或画C(J)2-C(NRZ)-，其中Rz是可任选地含有杂原子并含有1~8个碳原子的M或任选地取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子独立地含有连接的氢、氘和/或氟原子；每个J相同或不同并且是H、氘(D)、Rz、ORz、SRz、NHRz、N(Rz)2、氟、氯、溴或碘。116和117可各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、-R3、-T-R3、核糖、脱氧核糖或磷酸酯，其中每个113可以独立地是氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基。R8和R9可各自独立地是H、氘(D)、氟、氯、溴、缺或卤代烷基(例如CF3基团)。在一些实施方案中，所述化合物可以是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>B.方法根据本发明的方法，可利用使分析物与公开的化合物反应来标记待检测分析物，所述公开的化合物例如由结构式I-S'至IV-S，或I至IV之一所代表的化合物，其中RG是作为亲核基团或亲电基团的反应活性基团。可通过质量分析测定被标记分析物、分析物本身、所述分析物的一个或多个片段和/或标记物的片段。在一些实施方案中，本发明的方法可用于分析相同样品中不同的分析物以及两种或更多种不同样品中相同和/或不同分析物的多重分析。两种或更多种样品可相混合形成样品混合物。在多重分析中，标记试剂可用于确定分析物来自样品混合物中的哪个样品。可测定每种混合而形成样品混合物的两种或更多种样品中每一种内的分析物的绝对量和/或相对量(相对于不同样品中的相同分析物而言)(通常以浓度或量表示)。此外，对分析物片段(例如子片段离子)的质量分析可用于鉴定分析物和/或分析物前体，比如在分析物前体分子被降解的情况下。所述方法的一个特性在于可利用独特的标记物对来自不同样品的分析物进行差异性同位素标记(即同位素编码)这一事实，所述独特的标记物在化学上是同分异构的或同量异位的(具有相等的质量)并且可鉴定分析物所来源的样品。所述#皮差异性标记的分析物在质"#^的MS模式下是不可辨别的，因为它们都具有相同的(总)质荷比。此外，当经历解离能水平时，比如通过碰撞诱导解离(CID)，所述标记物可断开而产生可在质谱仪中通过质量(质荷比)进行解析的独特的报告物。质谱中所观察到的报告物的相对量可与样品混合物中被标记分析物的相对量相关联，并且意味着可与分析物所来源的样品中分析物的量相关联。因此，才艮告物(即信号离子)的相对强度可用于测量合并而形成样品混合物的两种或更多种不同样品中分析物的相对量。如果将每种分析物(对其而言期望进行绝对定量)的校正标准物掺入到样品混合物中，则可根据报告物的信息，推导出两种或更多种样品中分析物的绝对量(通常以浓度和/或量表示)。例如，分析物可以是利用酶消化反应处理样品进行蛋白质降解而产生的肽。可利用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶C)处理样品而实现蛋白质降解。通过测定样品混合物中肽的身份和含量并鉴定肽所来源的样品，任选地与来自所述样品的其它肽的测定相结合，可相对于75其所来源的样品而鉴定和/或定量所述被降解肽的前体蛋白质。由于该方法允许对一种以上样品(即来自样品混合物)中的一种或多种蛋白质进行多重测定，因此其是一种多重方法。在一些实施方案中，本发明涉及一种方法，包括使所述两种或更多种样品中的每种(每种样品含有一种或多种反应活性分析物)与标记试剂组中的不同标记试剂反应，其中所述组中的不同标记试剂各自包含式RP-X-LK-Y-RG。因此，通过分析物的亲核基团或亲电基团分别与不同标记试剂的亲电或亲核的反应活性基团(RG)反应，每种样品的一种或多种分析物被"RP-X-LK-Y-"部分所标记。所述标记方法可产生两种或更多种被差异性标记的样品，所述样品各自^^有一种或多种^L标记分析物。所述组的标记试剂可以是同分异构的或同量异位的。每种标记试剂的报告物可与每种被标记分析物所来源的样品一起被鉴定，并因此用于鉴定每种被标记分析物所来源的样品。RGU应活性基团，其特性已在前面描述过。RP是报告物部分，其特性也已在前面描述过。对于所述组的每种试剂而言，每种报告物的总质量可以是不同的。LK是连接物部分，其特性已在前面描述过。连接物的总质量可补偿不同标记试剂的才艮告物之间的总质量差异，4吏得对于所述组的每种试剂的报告物-连接物组合的合计总质量相同。X是报告物的原子与连接物的原子之间的键。Y是连接物的原子与反应活性基团的原子之间的键(或者与分析物^^应后，Y是连接物的原子与分析物的原子之间的键)。当在质i碧仪中经历解离能水平时，至少部分被标记分析物中的X键和Y键断裂。X键和Y键的特性已在前面描述过。一旦每种样品的分析物被该样品的独特的标记试剂所标记，则所述两种或更多种被不同标记的样品或其部分可混合而产生样品混合物。当希望定量时，可记录组合而产生样品混合物的每种样品的体积和/或量。每种样品相对于样品混合物总样品体积和/或量的的体积和/或量可用于确定对于检测来自样品混合物的分析的每种样品中被检测分析物的量(通常以浓度和/或量表示)而言所必需的比例。因此，样品混合物可包含复杂的混合物，其中通it^每种所述两种或更多种样品中分析物的量进行相对定量或绝对定量(在还向样品混合物中添加校正标准物的情况下)，可鉴定和/或定量相同和/或不同分析物的相对量。可对混合物应用光镨4支术，其中可利用一级质量分析器对样品混合物或其级分进行一级质量分析。然后可从一级质量分析中选择特定质荷比的离子。然后可对所选离子施加解离能7jC平(例如碰撞诱发解离(CID))从而引起所选离子的断裂。通过给被标记分析物的具有特定质荷比的所选离子施加解离能水平，至少可将部分所选离子中的X键和/或Y键断裂。X键和Y键二者的断裂可引起报告物-连接物部分的断裂并引起从分析物中释放带电荷的或电离的报告物。经历解离能水平的离子还可引起分析物的断裂，从而产生分析物的子片段离子。然后离子(剩余的所选离子、子片段离子和带电荷的或电离的报告物)或其级分可直接导入到二级质量分析器中。可对所选离子或其片段进行二级质量分析。二级质量分析可测定以所选质荷比存在的每个独特报告物的总质量(或m/z)和相对量以及样品混合物的至少一种反应分析物的子片段离子的总质量。对于以所选质荷比存在的每种分析物而言，子片段离子可用于鉴定以所选质荷比存在的分析物。例如，可按照之前所述的名称为"利用计算机辅助数据库分析的分析物测定"部分进行该分析。在一些实施方案中，所述方法的某些步骤可重复一次或多次。例如，在一些实施方案中，来自一级质谦分析的所选质荷比的离子(不同于任何之前所选的质荷比)可被施加解离能水平进行处理从而形成至少一些所选离子的电离的报告物部分和电离的子片段离子，如前所述。可对所选离子、电离的报告物部分和子片段离子或其级分进行二级质量分析。还可测定二级质量分析中每种报告物部分的总质量和相对量以及子片段离子的总质量。这样，可得到信息，用于鉴定和定量来自一级质量分析的一种或多种其它分析物。在一些实施方案中，整个方法可重复一次或多次。例如，当样品混合物已被分级(例如通过色谱或电泳分离)时，可重复所述方法一次或多次。通it^每种样品重复该方法，可分析全部的整个样品混合物。预计在一些实施方案中，整个方法可被重复一次或多次，并且在每次这些重复中，某些步骤还可被重复一次或多次，比如如上所述的。这样，可以尽最大可能地探讨和测定样品混合物的含量。质i普领域的普通技术人员应当理解，可在串^tt镨仪中进行一级和二^t量分析。适于进行串^tt量分析的仪器如前所述。虽然串^镨仪是优逸的，但可使用单M脊仗。例如，可通过锥孔电压断裂(cone-voltagefragmentation)诱发分析物断裂，之后利用单级四级杆质脊义或飞行时间质^^t所得片段进行质量分析。在其它实例中，可使用激光源使分析物经历解离能水平并在源后分解之后记录在飞行时间质谱仪或串联飞行时间(TOF-TOF)质a中所得的片段。应当理解，在一些实施方案中，带有单一分析器的仪器可进行一级和二级质量分析。根据前面公开的多重方法，在一些实施方案中，与分析物的键(例如肽骨架中的酰胺(肽)键)的断^目比，X键的断裂可能更容易或更不容易，或基本上相等。在一些实施方案中，与分析物的键(例如肽骨架中的酰胺(肽)键)的断裂相比，Y键可能更容易或更不容易断裂。在一些实施方案中，在X键和Y键断裂之后，所述组的每种试剂的连接物在电荷上是中性的(即连接物断裂而产生中性质量丢失，并因此在MS/MS光镨中观察不到)。在一些实施方案中，在标记试剂组内、混合物的被标记分析物或试剂盒的标记试剂内，X键和Y键的位置不变。在一些实施方案中，在用于断裂分析物(例如肽骨架中的酰胺(肽)键)的条件下，所述组的每种试剂的报告物基本上不进行亚断裂。在一些实施方案中，X键与Y键相比不容易断裂。在一些实施方案中，Y键与X键相比较不容易断裂。在一些实施方案中，X键和Y键的不稳定性大约相同，或以其它方式选择X键和Y键使得X键或Y键中之一的断裂导致X键或Y键中另一个的断裂。在一些实施方案中，本发明的方法包括使两种或更多种样品(每种样品含有一种或多种分析物)与不同的标记试剂反应从而产生各自含有一种或多种被标记分析物的两种或更多种被不同标记的样品，以及混合两种或更多种^L不同标记的样品或其部分、和任选地一种或多种校正标准物从而产生混合物，所述混合物包含被本文中所述的标记试剂标记的分析物。在一些实施方案中，用标记试剂标记用于产生混合物的每种样品，所述标记试剂含有可用于鉴定分析物并定量分析物在混合物和/或分析物所来源的^"品中的相对量或绝对量的独特寺艮告物。在多个实施方案中，标记试剂或"同量异位的质量标签"可由任何结构式I"、1#、I-S，至IV-S，或I至IV所代表，通常由I至IV之一所代表，其中RG代表亲核基团或亲电基团，并且其余变量的定义如上面对化合物78所述。例如，在一些实施方案中，本发明的方法包括使两种或更多种样品(每种样品含有一种或多种反应分析物)与同量异位的质量标签组反应从而产生各自含有一种或多种被标记分析物的两种或更多种被不同标记的样品，以及混合两种或更多种被不同标记的样品或其部分、和任选地一种或多种校正标准物从而产生样品混合物。一旦标记试剂与反应分析物进行反应，Y键将连接连接物与分析物；RP(在各式分别由RP1、RP2、RP3、RP4、RP5和处6表示)和LK(在各式分别由LK1、LK2、LK3、LK4、1^5和1^6表示)中至少之一可被一种或多种重原子同位素进行同位素富集;当同量异位的质量标签与分析物反应时，每个质量标签可将相同的质量加到分析物中；并且当发生断裂时，每个同量异位的质量标签的RP(在各式分别由RP1、RP2、RP3、RP4、Rps和Rps表示)可产生具有与所述组中其它同量异位质量标签的信号离子不同的质量的信号离子。根据一些实施方案，来自样品的分析物可与固相载体反应(每种样品与不同的固相载体反应，并因此与不同的报告物反应)，不与反应活性基团反应的样品的树脂结合成分任选地可被洗去。然后可在使可断开连接而从栽体释;^出报告物-连接物-分析物复合物。可在可断开连接物的断开条件下类似地处理每种载体，从而得到两种或更多种不同的样品(每种样品含有一种或多种被标记分析物)，其中可通过与其所连接的独特报告物鉴定和/或定量与特定样品相关联的被标记分析物。然后可将所收集的样品混合而形成样品混合物，如前所述。例如，用于前述方法中的所述组的每个不同标记试剂可与固相栽体相结合。可利用几种方法中的任何方法制M有标记试剂的栽体(见下述实施例部分)。在一些实施方案中，同量异位质量标签的氨基、羟基或巯基可与合适栽体的可断开连接物反应。所述可断开连接物可以是"空间位阻的可断开连接物"。可断开连接物的断开将从栽体释放出被标记分析物。空间位阻的固相栽体的非限定性实例包括三苯甲基氯树脂(trityl國Cl，Novabiochem,P/N01-64-0074)、2匪氯三苯曱基氯树脂(Novabiochem，P/N01-64-0021)、DHPP(Bachem，P/NQ隱1755)、MBHA(AppliedBiosystemsP/N400377)、4-甲基三苯甲基氯树脂(Novabiochem，P/N01-64-0075)、4國甲氧基三苯甲基氯树脂(Novabiochem,P/N01-64-0076)、羟基画(2國氯苯基)甲基-PS(Hydroxy國(2-chlorophnyl)methyl國PS))(Novabiochem,P/N01-64-0345)、Rink酸树脂(NovabiochemP/Ns01-64-0380,01-64-0202)、NovaSynTGT醇树脂(Novabiochem,P/N01-64-0074)。在一些实施方案中，本发明的方法还可包括在进行样品的分析物的标记之前，利用至少一种酶消化每种样品以部分或完全降解样品成分，如上文标题为"样品处理"的部分所详细描述的。例如，所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白质和肽)或核酸酶(以降解寡核苷酸)。所述酶还可一起使用从而降解样品成分。所述酶可以是蛋白水解酶比如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶C。在一些实施方案中，所述方法还可包括在进行一级质量分析之前分离样品混合物，如上文标题为"分离"的部分所详细描述的。这样，可仅对样品混合物的级分进行一级质量分析。可利用任何分离方法进行分离，包括通过色谱或电泳。例如，液相色镨/质镨(LC/MS)可用于实现这样的样品分离，之后进行质量分析。此外，可使用适于分离感兴趣分析物的任何色谱分离方法。合适的色谱和电泳分离方法的非限定性实例如前所述。在另一些实施方案中，本发明的方法可包括酶处理降解样品成分和分离步骤二者。如前所述，可通过分析子片段离子的总质量来测定与所选离子相关的分析物。一种这样的测定方法被描述于名称为"利用计算机辅助数据库分析的分析物测定"的部分中。一旦已确定分析物，有关二级质量分析中每种报告物部分的总质量和相对量以及子片段离子总质量的信息即为确定有关样品混合物的其它信息提供基础。可利用质谱中的峰强度确定才艮告物的量。在一些实施方案中，可通过分析利用质谱仪得到的报告物(信号离子)信号的峰高或峰宽而测定报告物的量。因为每个样品可被不同的标记试剂标记并且每种标记试剂可包含可与特定样品相关联的独特报告物，所以二级质量分析中不同报告物的测定鉴定了所选分析物的离子来源于何种样品。当发现多种报告物时(例如根据本发明的多重法)，可相对于其它报告物测定每种报告物的相对量。因为所检测的每种报告物的相对量与样品混合物中分析物的相对量相关，所以可确定组合而形成样品混合物的每种样品中分析物的相对量(通常以浓度和/或量表示)。合适时，如上文在名称为"分析物的相对定量和绝对定量，，的部分中所讨论的，可针对天然或人工产生的同位素丰度对与报告物相关的峰强度进行校正。更具体而言，当组合而形成样品混合物的每种样品的体积和/或量已知时，可基于所检测的每种报告物的相对量而计算每种样品中分析物的相对量(通常以浓度和/或量表示)。可对具有不同质荷比的所选离子重复进行该分析一次或多次，从而得到组合而形成样品混合物的每种样品中一种或多种其它分析物的相对量。合适时，可针对天然或人工产生的同位素丰度对与报告物相关的峰强度和进行校正。当含有与分析物相连接的独特报告物的校正标准物(具有所选的质荷比)以已知量(通常以浓度和/或量表示)被加入到样品混合物中时，与所述校正标准物相关的独特报告物的量可用于测定组合而形成样品混合物的每种样品中分析物的绝对量(通常以浓度和/或量表示)。这是可能的，因为与校正标准物的报告物相关的分析物的量是已知的，并且对于与所选离子相关的^L标记分析物而言，所有其它净艮告物的相对量可^L测定。因为对于每种独特的报告物(包括校正标准物的报告物)而言，所测的报告物的相对量和与组合而形成样品混合物的每种样品相关的分析物的量成比例，故可基于根据用于产生样品混合物的配方而计算的比例来测定每种样品中分析物的绝对量(通常以浓度和/或量表示)。合适时，可针对天然存或人工产生的同位素丰度对与报告物相关的峰强度进行校正。可对具有不同质荷比的所选离子重复进行该分析一次或多次，从而得到组合而形成样品混合物的每种样品中一种或多种其它分析物的绝对量。合适时，可针对天然或人工产生的同位素丰度对与报告物相关的峰强度进行校正。在一些实施方案中，可利用消化和/或分离步骤实施该方法。在一些81实施方案中，可重复包含或不包含所述消化和/或分离步骤的方法的步骤一次或多次，从而鉴定和/或定量样品中一种或多种其它分析物或所述两种或更多种样品(包括用栽体结合的标记试剂标记的样品)中每种样品内的一种或多种分析物。取决于样品混合物中是否存在针对特定分析物的校正标准物，定量可以是相对于其它被标记分析物的，或其可以是绝对的。这样的分析方法可特别适用于复杂性质的多重样品的蛋白质组分析，尤其是在一级质量分析之前进行被标记分析物的预分离(例如液相色谱或电泳分离)的情况下。在一些实施方案中，分析物可以是样品或样品混合物中的肽。样品或样品混合物中的肽的分析可用于测定样品或样品混合物中可鉴别蛋白质的量(通常以浓度和/或量表示)，其中可在一级质量分析之前降解一种或多种样品中的蛋白质。此外，可为进行测定的目的而比较来自不同样品的信息，比如用于比较对细胞中蛋白质的量的影响，所述细胞与不同浓度的可影响细胞生长的物质一起进行了孵育。其它非限定性实例可包括比较患病的和健康组织或细胞培养物的表达蛋白质成分。这可包括在利用感染剂比如细菌或病毒进行感染或其它疾病状态比如癌症后比较细胞、组织或生物流体中的表达蛋白质水平。在其它实例中，可进行蛋白质浓度随时间变化(时间-进程)的研究以检测药物处理对细胞或组织的表达蛋白质成分的影响。在又一些实例中，随时间釆集的不同样品的信息可用于检测和监测作为疾病(例如癌症)或感染结果的组织、器官或生物流体中特定蛋白质的浓度。在一些实施方案中，分析物可以是样品或样品混合物中的核酸片段。有关核酸片段的信息可用于测定样品或样品混合物中可鉴定的核酸分子的量(通常以浓度和/或量表示)，其中在一级质量分析之前降解样品。此外，可为进行上述测定的目的而比较来自不同样品的信息。c混合物在一些实施方案中，本发明涉及混合物(例如样品混合物)。所述混合物可包含至少两种被不同标记的分析物，其中所述两种被标记分析物中的每种可来自不同的样品并且包含式RP-X-LK-Y-分析物。对于每个不同的标记物而言，混合物的一些被标记分析物可以相同，一些被标记分析物可以不同。所述原子、结构部分或X键、Y键、RP和LK如前所述并且乂^开了其特征。可通过混合两个或多个标记>^应的所有或部分产物而形成混合物，其中每个标记反应使用通式RP-X-LK-Y-RG的不同标记试剂，其中所述原子、结构部分或X键、Y键、RP、LK和RG如前所述并且公开了其特征。标记试剂可以是同位素编码的同分异构的或同量异位的标记试剂。每种不同标记试剂的独特的才艮告物可表示所述两种或更多种被标记分析物中每一种来自哪个标记反应。标记试剂可以是同分异构的或同量异位的。因此，混合物的两种或更多种被标记分析物可以是同分异构的或同量异位的。混合物可以是任何上述方法中所公开的样品混合物。与那些方法相关的标记试剂和被标记分析物的特征如前所述。混合物的分析物可以是肽。混合物的分析物可以是蛋白质。混合物的分析物可以是肽和蛋白质。混合物的分析物可以是核酸分子。混合物的分析物可以是碳水化合物。混合物的分析物可以^J旨质。混合物的分析物可以是类固醇。混合物的分析物可以是小于1500道尔顿的小分子。混合物的分析物可以包含两种或更多种分析物类型。分析物类型可以例如选自肽、蛋白质、寡核苷酸、碳水化合物、脂质、类固醇和/或小于1500道尔顿的小分子。在多个实施方案中，本发明的混合物包含至少两种被标记分析物，其中至少一种被标记分析物来自组合形成混合物的其它被标记分析物的不同样品。例如，分析物可以是蛋白质、肽、核苷酸、碳水化合物、脂质、类固醇或小于1500道尔顿的小分子。在多个实施方案中，被标记分析物可以由任何结构式r、1#、I-S，至VI-S，或I至VI所代表，通常由I至VI之一所代表，其中RG代表亲核基团或亲电基团与分析物的反应产物，例如被标记分析物可由下述式的化合物之一或由其盐形式和/或水合物形式代表P-X-LK-(Y-分析物〉mS'rS',RP-X-LK-Y-分析物S'rS',FjP，-X-LK^Y-分析物S'rS',Rp2-X-LK2-Y-分析物Rp3-X-LK3-Y-分析物S'rS'iRp4-X-LK4-Y-分析物S'rS'tRpS-X-LK5-Y-分析物s'rs'tRp6-X-LK6-Y-分析物svs'trp^x-lkLy-分析物Rp2-X-LK2-Y-分析物RP、X-LK、Y-分析物RP4-X-LK4-Y-分析物RP5-X-LK5-Y-分析物RpS-X-LK、Y-分析物其中变量如上所定义。通常RP/LK(或RPVLK1、RP2/LK2、RP3/LK3、RP4/LK4、RpS/LKS或RP"LK6)中至少之一可被一种或多种重原子同位素进行同位素富集；并且每种被标记分析物的基团RP-X-LK-(或RP、X-LK1-、RP2-X-LK2-、RP3-X-LK3-、RP4-X-LK4-、RP5-X-LK5-、RP6-X-LK6-)可具有相同的质量。通过标记试剂与分析物的反应加入到分析物中的结构部分断裂后，每种被标记分析物的RP可产生信号离子，所述信号离子可鉴别分析物所来源的样品。因此，所述信号离子的强度与混合物中分析物的量以及#>入而形成样品混合物的初始样品中分析物的量相关。在一些实施方案中，RP和LK中每一个包含至少两种重原子同位素。在一些实施方案中，RP和LK中每一个包含至少三种重原子同位素。例如，在一些实施方案中，本发明的方法包括使两种或更多种样品(每种样品含有一种或多种^J[分析物)与标记试剂组或"同量异位的质量标签"组反应，从而产生各自含有一种或多种被标记分析物的两种或更多种被不同标记的样品，以及混合两种或更多种被不同标记的样品或其部分，以及任选地一种或多种校正标准物从而产生样品混合物。一旦使标记试剂与反应活性分析物反应，Y键即可连接连接物与分析物；RP(在各式中分别由RP1、RP2、RP3、RP4、RpS和Rp6表示)和LK(在各式中分别由LK1、LK2、LK3、LK4、1^5和0^6表示)中至少之一(例如RP)可被一种或多种重原子同位素进行同位素富集；当同量异位的质量标签与分析物反应时，每种质量标签可将相同的质量加到分析物中；并且裂解后，每种同量异位质量标签的RP(在各式中分别由RP1、RP2、RP3、RP4、Rps和Rp6表示)可产生与所述组中其它同量异位质量标签的信号离子的质量不同的信号离子。可用于根据上述方法标记分4斤物的示例性化合物(例如质量标签/标记试剂)之前已在标题"化合物"项下进行了论述。D.试剂盒在多个实施方案中，本发明的试剂盒可包含一种或多种标记试剂或"同量异位的质量标签"，其中至少一种可由结构式r、1#、I-S，至VI-S，或I至VI中的任何一个或其盐形式和/或水合物形式所代表，通常由I至VI之一所代表，其中RG代表亲核基团或亲电基团，其中其余变量如上所定义。所选用于试剂盒中的化合物通常是"同位素编码的"。"同位素编码的"意指对所述试剂盒的每种化合物中同位素的分布进行选择，而产生对于每种不同化合物(即标记试剂)而言包含独特质量的报告物。通常，报告物基团和连接物基团(例如多个式中的RP/LK、RPVLK1、RP2/LK2、RP3/LK3、RP4/LK4、RP5/LK5或RP6/LK6)中至少之一可被一种或多种重原子同位素进行同位素富集；并且每种被标记分析物的基团RP-X-LK-(或RP、X-LK、、RP2-X-LK2-、RP3-X-LK3-、RP4-X-LK4-、RpS-X-LKS-或RP、X-LK、)可具有相同的质量。通常，当裂解时，每种被标记分析物的RP可产生具有与所述试剂盒中其它同量异位质量标签的信85号离子不同的质量的信号离子。同样，公开了标记试剂的其它特性。例如，标记试剂可用于相同样品中或两种或更多种不同样品中一种或多种分析物的多重分析。所述试剂盒的每种同量异位的标记试剂(即质量标签)被一种或多种重原子同位素进行同位素富集(编码)。标记试剂可被同位素地富集以包含两个或多个重原子同位素。标记试剂可被同位素富集以包含三种或更多种重原子同位素。标记试剂可被同位素富集以包含四种或更多种重原子同位素。在一些实施方案中，至少一种重原子同位素可被掺入到标记试剂的羰基或硫代羰基中，并且至少一种其它重原子同位素可^L掺入到标记试剂的报告物基团中。标记试剂包含含有固定电荷或可电离的报告物基团。因此，所迷报告物基团可包括易于电离的碱性或酸性部分。在一些实施方案中，所述报告物可以是含有羧酸、磺酸或磷酸基团的化合物。因此，在一些实施方案中，所述标记试剂可以其盐形式进行分离。在一些实施方案中，标记试剂可包含氣基或硫代n连接物。包含g或硫代n连接物的标记试剂可以活性酯形式用于分^f物的标记。在活性酯中，醇基形成离去基团(LG)，例如，在一些实施方案中，所述离去基团示于图9中。在一些实施方案中，活性酯可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯。实施例才艮据下述实施例，还可进一步理解本教导的各方面，所述实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例中所用的缩写的定义如下HMI代表六亚甲基亚胺，Pbf代表2，2，4，6，7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺^LioFmoc代表9-芴基甲！U^J^Trt代表三苯甲基，Mpe代表3-曱基-戊-3-基，HATU代表0-(7-氮杂苯并三唑-l-基)-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸盐，NMP代表1-甲基-2-他咯烷酮，FmocOSu代表(9-芴基甲IUJtiJlJ0琥珀酰亚胺，DMAP代表4-二甲基氨基吡啶，THF代表四氢呋喃，HBTU代表O-(苯并三唑-l-基)-N，N，N，，N，画四曱基脲六氟磷酸盐，以及HOBT代表1-羟基苯并三唑水合物。进行胺的酰化以在质量标签上产生反应活性基团的一般方案图10以图示方式说明了进行胺的酰化以在适于与半胱氨酸氛基酸的巯基反应的质量标签上产生反应活性基团的方案I和方案II。方案I:将相应的胺(l-400nmol)溶解在碳酸氢钠(0.2M)水溶液和乙腈(v/v2:l或l:1)中。通备所述胺的浓度范围在约0.01至约0.1M的范围内。加入溶于乙腈中的;^M戈乙酸N-羟基琥珀酰亚胺(约0.4M，相对于游离胺而言过量约IO倍)并同时旋涡反应混合物。室温下摇动混合物约10分钟至约30分钟。产物用HPLC进行纯化，并用质谱(MS)进行确认。方案II:室温下将溶于CH2Cl2(3mL)中的^f戈乙酸酐(0.74g，2.1mmol)加入到含有N，N-二异丙基乙胺(DIEA，1.9mmol)的相应的胺(1.9mmol)的搅拌溶液中。室温下，进一步搅拌反应溶液1.5至3小时，然后在二氯甲烷和水之间进行分配。将有机层用无水Na2S04干燥，真空下浓缩，并用硅胶快速色镨进行纯化。将产物用NMR和/或MS进行表征。根据方案II将可通过商业渠道得到的3,4-二甲氧基苄基敏Aldrich)酰化以形成质量标签(1)。NMR(CDC13):53.72(s，2H)，3.90(s,6H),4.60(d，2H)，6.61(d，2H)，7.28(t,1H).MS中的[M+印+:336.0，计算值；336.0，实测值。II.质量标签(2)的合成图11以图示方式说明了质量标签(2)的合成。将4-氨基-千胺(Aldrich，1mmol)、琳R乙酸N-羟基琥珀酰亚胺(Pierce,1mmol)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA，100nL)在二氯甲烷(10mL)中混合并在室质量标签(标记试剂)的合成I.质量标签(1)的合成温下搅拌l小时。减压除去溶剂。将产物用M柱色i瞽进行纯化，用正己烷、乙酸乙酯(20%-60%)进行洗脱得到4-IL^-N-碘代乙酰苄胺(收率62.2%)。^NMR(MeOD):7.1(d，2H),6.75(d，2H)，4.21(s，2H)，3.65(s,2H)。MS中的[M+H+:291.0，计算值；291.0,实测值。将4-tJ^-N-碘代乙酰节胺(0.172mmol)、乙酸酐(0.2ml)和DIEA(0.2ml)在乙腈(3ml)中搅拌1.5小时。减压蒸发溶剂。在二氯甲烷和水之间分配残留物。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将褐色剩余物用硅胶柱色镨进行纯化，用二氯甲烷和甲醇进行洗脱得到产物质量标签(2)(35mg，收率61%)。MS中的[M+Hl+:333.0，计算值；333.0，实测值。III.质量标签(3)的合成图12以图示方式i兌明了质量标签(3)的合成。向N-Boc-卩-叔丁基-a-琥珀酰亚胺基-天冬氨酸(Boc-Asp(But)誦OSu)(Bacchem,0.1mmol)与DMF(1ml)的混合物中加入六亚甲基亚胺(Aldrich，0.4mmol)。加入另外的DMF(2ml)。室温下摇动混合物2小时形成Boc-Asp(But)-HMI。将Boc-Asp(But)-HMI用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征(M+H+:371.3,计算值；371.1,实测值)。室温下通过将Boc-Asp(But)-HMI暴露于二氯甲烷(O.lml)和三氟乙酸(TFA，O.lml)的溶液中20分钟而对Boc保护的胺基脱保护。40'C下真空蒸发溶剂至干。然后根据方案I将游离胺酰化而得到质量标签(3)([M+H+:383.0,计算值；383.0，实测值)。IV.质量标签(4)和质量标签(5)的合成图13以图示方式说明了质量标签(4)和(5)的合成。利用方案I通过酰化可从商业渠道得到的O-千基丝氨酸的胺基而制得质量标签U)。(MS中的[M+H]+:364.0，计算值；364.0，实测值)。利用方案I通过酰化可从商业渠道得到的S-(对甲基千基)半胱氨酸的胺基而制得质量标签(5)。(MS中的[M+Hl+:394.0，计算值；394.0,实测值)。V.质量标签(6)、(7)和(8)的合成图14以图示方式说明了质量标签(6)、(7)和(8)的合成。A.质量标签(6)的合成用冰7JC浴冷却BocNH-OH(1-2mmol)的DMF(2-4ml)溶液。加入氢化钠(1.5-2倍当量于BocNH-OH)。在氢气停止放出后，加入苄基溴(Aldrich，1倍当量于BocNH-R-OH)同时旋涡混合物。室温下摇动混合物5小时。离心后，将产物BocNH-O(Bzl)用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征。室温下通过将BocNH-O(Bzl)暴露于4-8ml25%TFA的二氯甲烷溶液中30分钟以对Boc保护的胺基脱保护。将脱保护的化合物NH2-0(Bzl)用水芊取两次，然后用制备性HPLC进行纯化或者在蒸发溶剂后直接用在酰化反应中。根据方案I将NH2-0(Bzl)酰化以提供质量标签(6)(M+H+:292.0,计算值；292.0，实测值)。B.质量标签(7)的合成用水水浴冷却BocNH-CH2CH2-OH(1-2mmol)的DMF(2-4ml)溶液。加入氢化钠(1.5-2倍当量于BocNH-CH2CH2-OH)。在氢气停止放出后，加入千基溴(Aldrich,1倍当量于BocNH-CH2CH2-OH)同时旋涡混合物。室温下摇动混合物5小时。离心后，将产物BocNH-CH2CH2-0(Bzl)用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征。室温下通过将BocNH-CH2CH2-0(Bzl)暴露于4-8ml25%TFA的二氯甲烷溶液中30分钟以对Boc保护的胺基脱保护。将脱保护的化合物NHrCH2CH2-0(Bzl)用水萃取两次，然后用制备性HPLC进行纯化或者在蒸发溶剂后直接用在酰化反应中。根据方案I将NH2-CH2CHrO(Bzl)酰化以提供质量标纷7X[M+H+:320.0,计算值；320.0，实测值)。C.质量标签(8)的合成用冰水浴冷却BocNH-(CH2)5-OH(1-2mmol)的DMF(2匿4ml)溶液。加入氢化钠(1.5-2倍当量于BocNH-(CH2)5-OH)。在氢气停止放出后，加入苄基溴(Aldrich，1倍当量于BocNH-(CH2)5-OH)并同时旋涡混合物。室温下摇动混合物5小时。离心后，将产物BocNH-(CH2)5-0(Bzl)用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征。室温下通过将BocNH-(CH2)s-0(Bzl)暴露于4-8ml25%三氟乙酸的二氯曱烷溶液中30分钟以对Boc保护的胺基脱保护。将脱保护的化合物NHHCH2)s-0(Bzl)用水萃取两次，然后用制备性HPLC进行纯化或者在蒸发溶剂后直接用在跣化反应中。根据方案I将NHr(CH2)5-0(Bzl)酰化以提供质量标签(8)(M+H]+:362.1，计算值；362.2,实测值)。VI.质量标签(9)、(10)和(11)的合成图15以图示方式说明了质量标签(9)、(10)和(11)的合成。A.质量标签(9)的合成将FmocGly(AppliedBiosystems，1mmol)、N，N，N，，N，國四甲基(琥珀酰亚胺)-脲四氟硼酸盐(TSTU，AdvancedChemTech，1mmol)和N，N誦二异丙基乙胺(DIEA,Aldrich，2mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF，Burdick&Jackson,6ml)中。室温下摇动混合物半小时。蒸发溶剂形成FmocGly-OSu，其直接用于以下步骤中。向溶于DMF(0.8ml)和0.2M碳酸氢钠的水溶液(2.8ml)中的L-丝氨酸(Bzl)(NovaBiochem,0.4mmol)加入溶于DMF(2.4ml)的FmocGly-OSu(0.4mmol)并同时旋涡。室温下摇动混合物20分钟。将化合物FmocGly-Ser(Bzl)用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征(M+Hl+:475.2，计算值；475.2，实测值)。室温下将FmocGly-Ser(Bzl)(0.17mmol)暴露于4ml20%艰咬的DMF溶液中15分钟以除去Fmoc保护基。40'C下真空蒸发溶剂。将残留物用制备性HPLC进行纯化，将化合物Gly-Ser(Bzl)用MS进行表征([M+H+:253.1，计算值；253.2，实测值)。90将溶于DMF(0.48ml)的FmocGly-OSu(0.08mmol)加入到溶于DMF(2.6ml)和0.2M碳酸氢钠的水溶液(0.26ml)中的化合物Gly-Ser(Bzl)中并同时旋涡。室温下摇动混合物20分钟。将所形成的化合物FmocGly-Gly-Ser(Bzl)用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征([M+H+:532.2，计算值；532.2，实测值)。室温下将FmocGly-Gly-Ser(Bzl)(0.5mg)暴露于0.2ml20%派咬的DMF溶液中lO分钟以除去Fmoc保护基。40。C下真空蒸发溶剂至干。根据方案I将脱保护的胺酰化以提供质量标签(9)(质谱中的M+H+:478.0，计算值;478.0，实测值)。B.质量标签(10)的合成根据A部分制备Gly-Ser(Bzl),并根据方案I进行酰化，以提供质量标签(10)([M+H+:421.0，计算值;421.0，实测值)。C.质量标签(11)的合成将FmocGly画Ser(Bzl)(0.01mmol)、TSTU(0.02mmol)、和DIEA(0.02mmol)溶解在DMF(O.lml)中。室温下摇动混合物40分钟，然后转移到甘氨酸(O.lmmol)和碳酸氢钠(0.2mmol)的在水溶液(0.05ml)中并同时旋涡。室温下摇动混合物30分钟，将产物FmocGly-Ser(Bzl)-Gly用半制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征([M+H+:532.2,计算值;532.2，实测值)。将FmocGly誦Ser(Bzl)陽Gly(1mg)暴露于0.2ml20%旅咬的DMF溶液中lO分钟以除去Fmoc保护基。40。C下真空蒸发溶剂后，根据方案I将脱保护的胺酰化以提供质量标签(11)([M+H+:478.0,计算值;478.0,实测值)。VII.质量标签(12)的合成图16以图示方式说明了质量标签(12)的合成。将FmocGly(1mmol)、TSTU(1mmol)和DIEA(1.5mmol)溶解在DMF(5ml)中。室温下摇动混合物40分钟，然后转移到甘氨酸(4mmo1)溶于5ml0.2M碳酸氢钠水溶液的溶液中并同时旋涡。室温下摇动混合物20分钟，将产物FmocGly-Gly用制备性HPLC进行纯^ft并用MS进行表征([M+H+:355.2,计算值；355.2，实测值)。将BocNH-O(Bzl)(有关制备请参见V.A.部分和图14)(0.2mmol)暴露于5ml25%TFA的二氯甲烷溶液中30分钟以除去Boc保护基而形成NH2-0(Bzl)。将NHrO(Bzl)用水萃取，用制备性HPLC进行纯化并用MS进行&([M+H+:124.1,计算值;124.2，实测值)。将FmocGly-Gly(0.02mmol)、TSTU(0.02mmol)和DIEA(0.03mmol)溶解在DMF(0.2ml)中。室温下摇动混合物40分钟，然后转移到NH2-0(Bzl)(2mg)溶于DMF(O.lml)和0.2M碳酸氲钠水溶液(O.lml)的溶液中并同时旋涡。室温下摇动混合物20分钟，将产物FmocGly-Gly國NH画O(Bzl)用HPLC进行纯化并用MS进行表征(M+H+:406.0，计算值；405.8，实测值)。室温下将FmocGly-Gly-NH-O(BzI)暴露于0.2ml20%哌咬的DMF溶液中10分钟以除去Fmoc保护基。蒸发所有溶剂后，根据方案I对脱保护的胺进行跣化以提供质量标签(12)([M+H+:406.0,计算值;405.8，实测值)。VIII.质量标签(13)的合成根据方案I将O-爷基酪氨酸酰化以提供质量标签(13)(MS中的[M+H]+:440.0，计算值;440.2,实测值)。IX.质量标签(14)和(15)的合成图17以图示方式说明了质量标签(14)和(15)的合成。根据方案I将s-N-(千fLi^J+赖氨酸的a-胺基酰化以形成质量标签(14)(MS中的[M+H+:435.0,计算值;435.0，实测值)。根据方案I将a-N-(爷lLiJliO-赖氨酸的s-胺基酏化以形成质量标签(15)(MS中的[M+H+:463.1，计算值;463.0,实测值)。X.用于合成质量标签(16)、(17)、(18)、(19)和(20)的一般方案图18以图示方式说明了用于合成质量标签(16)、(17)、(18)、(19)和(20)的一般方案。向溶于0.2M碳酸氢钠水溶液(l-4ml)中的二胺(NH2-R，-NH2)(0.4-4mmo1)中加入溶于DMF(1-4ml)的氯甲酸千酯(AlfaAesar，0.1-2mmol)并同时旋涡。在图18中定义了R，。氯甲酸苄酯与二胺的摩尔比是1:2-6。室温下摇动混合物5-20分钟。将产物NHrR，-NH(Z)用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征。然后利用方案I将单胺酰化以提供合适的质量标签。质量标签(16)(MS中的[M+H+:335.0,计算值；335.0，实测值)。质量标签(17)(MS中的M+H+:377.0，计算值；377.0,实测值)；质量标签(18)(MS中的[M+H]+:407.1，计算值；407.2,实测值)；质量标签(l9)(MS中的[M+H]+:451.1,计算值；451.0，实测值)；质量标签(20)(MS中的[M+H+:479.1，计算值；479.2，实测值)。XI.质量标签(21)、(22)、(23)和(24)的合成图19以图示方式说明了质量标签(21)、(22)、(23)和(24)的合成。A.质量标签(21)的合成将a-N-Fmoc个N-(爷氧基羰基)鸟氨酸(FmocOrn(Z))(AdvancedChemTech,0.25mmol)、TSTU(0.25mmol)和DIEA(0.375mmol)溶解在DMF(3mL)中。室温下摇动混合物1小时，然后转移到lmmol甘氨酸和碳酸氢钠的水溶液(3mL)中。室温下摇动混合物30-60分钟，将产物FmocOrn(Z)-Gly用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征(FmocOrn(Z)-Gly:[M+H+:546.2，计算值；546.4，实测值)。将FmocOrn(Z)-Gly(2mg)暴露于O.lmL20%艰咬的DMF溶液中10分钟以除去Fmoc保护基。蒸发所有溶剂后，根据方案I将脱保护的胺酰化以拔，供质量标签(21)([M+H]+:492.1，计算值;492.0,实测值)。B.质量标签(22)的合成将a-N-Fmoc个N-(苄氧基羰基)鸟氨酸(FmocOrn(Z))(AdvancedChemTech，0.25mmol)、TSTU(0.25mmol)和DIEA(0.375mmol)溶解在DMF(3mL)中。室温下摇动混合物l小时，然后转移到lmmolL-丙氨酸和碳酸氢钠的水溶液(3mL)中。室温下摇动混合物30-60分钟，将产物FmocOrn(Z)-Ala用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征(FmocOrn(Z)-Ala:M+H+:560.2,计算值；560.2，实测值)。将FmocOrn(Z)-Ala(2mg)暴露于O.lmL20%哌咬的DMF溶液中10分钟以除去Fmoc保护基。蒸发所有溶剂后，根据方案I将脱保护的胺酰化以提供质量标签(22)([M+H+:506.1，计算值;505.8，实测值)。C.质量标签(23)的合成将FmocOrn(Z)-Gly(0.1mmol)、TSTU(0.2mmol)和DIEA(0.3mmol)溶解在DMF(1ml)中。室温下摇动混合物l小时，然后转移到碳酸氩钠(1.5mmol)和L醫丙氛酸(1mmol)的水溶液(1ml)中。室温下摇动混合物30分钟，将产物FmocOrn(Z)-Gly-Ala用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征([M+H]+:617.2,计算值;617.2，实测值)。将FmocOrn(Z)-Gly-Ala(2mg)暴露于O.lmL20%旅咬的DMF溶液中10分钟以除去Fmoc保护基。蒸发所有溶剂后，根据方案I将脱保护的胺酰化以提供质量标签(23)([M+H]+:563.1，计算值;563.2,实测值)。D.质量标签(24)的合成将FmocOrn(Z)-Ala(0.1mmol)、TSTU(0.2mmol)和DIEA(0.3mmol)溶解在DMF(1ml)中。室温下摇动混合物1小时，然后转移到碳酸氢钠(1.5mmol)和甘氨酸(1mmol)的水溶液(1ml)中。室温下摇动混合物30分钟，将产物FmocOni(Z)-Ala-Gly用制备性HPLC进行纯化并用MS进行表征([M+H+:617.2，计算值;617.2，实测值)。将FmocOrn(Z)-Ala-Gly(2mg)暴露于0.1mL20%嗛咬的DMF溶液中10分钟。蒸发所有溶剂后，根据方案I将脱保护的胺酖化以提供质量标签(24)(M+H]+:563.1，计算值;563.2，实测值)。XII.质量标签标记的Glu-Fib肽人[Glu1]-纤维蛋白肽B[Glu國Fib,SEQIDNo.:25GVNDNEEGFFSAR)，CAS#:103213-49-6利用标准的Fmoc-肽合成方案(Novabiochem目录，2004-2005)在三苯甲基氯树脂(P/N:Novabiochem,01-64-0074)上装配所述肽。使用下述^J^酸衍生物Fmoc-Arg(Pbf)-OH(P/N:Novabiochem,04-12-1145)、Fmoc-Glu(C)tBu)國OH(P/N:Novabiochem,04-12-1020)、Fmoc画Gly國OH(P/N:Novabiochem,04-12-1001)、Fmoc-Val-OH(P/N:Novabiochem,04-12-1039)、Fmoc-Asn(Trt)-OH(P/N:Novabiochem,04-12-1089)、Fmoc國Asp(Mpe)國OH(P/N:Bachem，B國3560)、Fmoc-Phe-OH(P/N:Novabiochem,04-12-1030)、Fmoc-SeifBu)画OH(P/N:Novabiochem,04-12-1033)、Fmoc-Ala画OH(P/N:Novabiochem,04-12-1006)。A.质量标签标记的Glu-Fib肽(38)的合成(参见图30)将约10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯树脂用20%(v/v)哌啶的DMF溶液处理(2mLxl分钟，过滤，然后2mLx5分钟)、过滤并清洗(NMP)。将4-(Fmoc-氨基)苯甲酸(P/N:Bachem，B-3260;10倍当量于树脂上Glu-Fib的量)用溶于NMP(~1mL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033,9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(30当量)进行活化，加入到树脂中并混合30分钟。然后过滤树脂，用NMP清洗，并断开Fmoc基团。然后将艰唤乙酸-TFA盐(10当量)用溶于NMP(~1.5mL)中的HATU(9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(60当量)进行活化，并加入到树脂中。30分钟后，用NMP清洗树脂，之后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200^1，2小时)将缀合的M树脂上断开(和脱保护)并用Et20进行沉淀。利用MALDI-TOF(芥子酸介质，计算值M+H^1843.8,实测值〖M+H+=1844.9)进行化合物(38)(参见图30)的分析。进一步的质镨分析:在MALDI和电喷雾平台上对质量标签标记的Glu-Fib肽(38)进行MS/MS分析。数据显示质量标签是MALDI平台的良好测试物，但在电喷雾平台中的信号离子峰的强度则非常弱(数据未显示)。用13C、15N和/或2H不同标记的氨基苯曱酸不能从商业渠道得到，95B.质量标签标记的Glu-Fib肽(39)的合成(参见图30)将约10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯树脂用20%(v/v)嗛咬的DMF溶液进行处理(2mLxl分钟，过滤，然后2mLx5分钟)、过滤并清洗(NMP)。将4-(Fmoc-iJ^乙基)苯甲酸(P/N:Fhica,04062;IO倍当量于树脂上Glu-Fib的量)用HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(30当量)的NMP溶液(1mL)进行活化，加入到树脂中并混合30分钟。然后过滤树脂，用NMP清洗，并裂解Fmoc基团。然后将哌漆乙酸-TFA盐(10当量)用HATU(9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(60当量)的NMP溶液(~1.5mL)进行活化，并加入到树脂中。30分钟后，用NMP清洗树脂，之后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200^L，2小时)将缀合的J!;U^树脂上断开(并脱保护)并用Et20进行沉淀。利用ES-MS进行化合物(39)的分析(直接注入水中，计算值[M+H+=1829.8,实测值[M+H广-1829.9)(见图30)。进一歩的质语分析:在MALDI和电喷雾平台上对质量标签标记的Glu-Fib肽(39)进行MS/MS分析。数据显示质量标签是MALDI平台的良好测试物但在电喷雾平台中的信号离子峰的强度则非常弱(数据未显示)。用13C、151\和/或211不同标记的#^苯曱酸不能从商业渠道得到，需J^成。C.质量标签标记的Glu-Fib肽(40)的合成(参见图31)将约10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯树月旨用20%(v/v)艰啶的DMF溶液处理(2mLxl分钟，过滤，然后2mLx5分钟)、过滤并清洗(NMP)。将Fmoc-4-羧甲基旅噢(P/N:Chem-Impex,04960;10倍当量于树脂上Glu-Fib的量)用溶于NMP(~1mL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033,9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(30当量)进行活化，加入到树脂中并混合30分钟。然后过滤树脂，用NMP清洗，并断开Fmoc基团。然后将哌唤乙酸-TFA盐(10当量)用溶于NMP(~1.5mL)中的HATU(9.5当量)和N,N-二异丙基乙胺(60当量)进行活化，并加入到树脂中。30分钟后，用NMP清洗树脂，之后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200jil，2小时)将缀合的肽从树脂上断开(和脱保护)并用Et20进行沉淀。利用ES-MS进行化合物(40)(参见图31)的分析(直接注入水中，计算值[]\1+11+=1836.9，实测值[1\1+11]+=1837.0)。进一步的质谱分析:在MALDI和电喷雾平台上对质量标签标记的Glu-Fib肽(40)进行MS/MS分析。数据显示质量标签是MALDI和电喷雾平台的良好测试物。肽的信号离子强度和断裂方式与当前的fTRAQTM试剂N-甲基哌嗪乙酸相似(数据未显示)。D.质量标签标记的Glu-Fib肽(41)的合成(参见图32)化合物(41b):向胸腺嘧啶乙酸丙酯(41a)(可根据Alahiane,A.;Taourirte，M.;Rochdi，A.;Redwane，N.;Sebti,S.;Engels,J.W.;Lazrek,H.B.,"Buildingblocksforpolyamidenucleicacids:Facilesynthesisusingpotassiumfluoridedopednaturalphosphateasbasiccatalyst",iVMc/e仍iVfes，iV"c/eCVfes在iV"c/"V^"Vfc2003，22,109-114进4亍合成；1.33g，5.88mmol)和2画Boc-0tJ0-溴乙烷(P/N:Fluka，17354，2.978g，13.29mmol)的DMF溶液(30mL)中加入固体形式的K2C03(3.4g，24.60mmol)并在环境温度下搅拌20小时。此时的TLC分析显示形成单一的产物(41b)(Rf=0.33,二氧化法&，1:1EtOAc-正己烷；UV254nm，通过以3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加热使TLC显色)。减压除去DMF后，在EtOAc(350mL)和稀HC1(150mL，0.5M)之间分配所得的油。然后将EtOAc层用盐水(100mLx2)清洗，以Na2S04干燥并浓缩得到无色油。利用快速色镨(CombiFlash纯化系统，120g柱，85mL/分钟，270nm，0-5分钟20%EtOAc的己烷溶液，然后80%EtOAc的己烷溶液，收集18mL级分，级分24-30含有纯的产物)纯化所述油得到2.02g(收率93%)产物(41b)。ES画MS(直接注入MeOH中，计算值1\1+"&+=<:171127]\306+"3+=392.18，实测值[]\1+3]+=392.15)。化合物(41c):向化合物(41b)(1.10g,2.98mmol)的THF溶液(30mL)加入NaOH溶液(3.6mL，1M)并搅拌30分钟。减压除去溶剂，残留物在环境温度下用95%TFA的水溶液(20mL)处理1小时。减压除去TFA-水，将由此得到的油溶解在饱和NaHC03(15mL,pH=8-9)溶液中并加入溶于丙酮(80mL)中的溶液形式的FmocOSu(1.20g，3.58mmol)。搅拌反应混合物19小时，此时TLC分析显示形成单一的产物(41c)(Rf=0.22;二氧化>^1，9:1:0.01CH2Cl2-MeOH-AcOH,UV254nm，通过以3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加热使TLC显色)。然后浓缩反应混合物以除去丙酮，将由此得到的剩余物用水(100mL)进行稀释。通过Et20(100mLx3)萃取以除去非极性杂质。酸化(pH~1，HCl,1M)水层并用CH2C12(150mLx3)萃取。将<:112<:12层用Na2S04千燥并浓缩得到1.41g白色固体的产物(41c)(收率98%)。ES-MS(MeOH直接注入)计算值[1\1+3+=[(:241123]^306+~&+=472.15，实测值[M十Nar-472.09。将约lOmgFmoc-Glu-Fib-三苯曱基氯树脂用20"/o(v/v)旅咬的DMF溶液处理(2mLxl分钟，过滤，然后2mLx5分钟)、过滤并清洗(NMP)。将化合物(41c)(10倍当量于树脂上Glu-Fib的量)用HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5当量)和N,N-二异丙基乙胺(30当量)的NMP溶液(~lmL)进行活化，加入到树脂中并混合30分钟。然后过滤树脂，用NMP清洗，并裂解Fmoc基团。然后将p底,乙酸-TFA盐(10当量)用溶于NMP(~1.5mL)中的HATU(9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(60当量)进行活化，并加入到树脂中。30分钟后，用NMP清洗树脂，之后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200^L，2小时)将缀合的IU^树月旨上断开(和脱保护)并用Et20进行沉淀。利用ES-MS进行化合物(41)的分析(直接注入水中，计算值1\1+11+=1919.9,实测值[1\1+11+=1920.3)。进一步的质谦分析:在MALDI和电喷雾平台上对质量标签标记的Glu-Fib肽(41)进行MS/MS分析。数据显示质量标签是MALDI和电喷雾平台的良好测试物。信号离子强度强，并且观察到了所预期的肽断裂方式(数据未显示)。E.质量标签标记的Glu-Fib肽(42)的合成(参见图33)化合物(42b):向5-氟尿嘧咬(42a)(P/N:Oakwood，003241，0.5g,3.84mmol)和DMAP(46mg，0.384mmol)的乙腈溶液(25mL)中加入二碳酸二叔丁酯(P/N:Chem-Impex,00128，0.835g,3.84mmol)并在RT(RT代表室温)下搅拌17小时。TLC分析显示形成单一的产物N-l-Boc-5-氟尿嘧啶(42b)(R产0.86,二氧化歧板，7:3EtOAc-己烷，UV254nm，参考文献Jaime隱Figueroa，S.;Zamilpa，A.;Guzman,A.;Morgans,D.J.，"N-3-AlkyIationofUracilandDerivativesviaN画l-BocProtection",5^w^幼cOwi附簡/aiftVws,2001，37，3739-3746)。除去溶剂后得到的白色固体不需要进一步纯化而用于下一步及^应中。化合物(42c):将化合物(42b)(3.84mmol)溶解在DMF(20mL)中并冷却至0。C。向该溶液中加入固体形式的NaH(184mg，4.60mmol，60%，^tt在油中)并在RT下搅拌30分钟。此时加入BrCH2COOMe(P/N:Acros，16955，0.437mL，4.60mmol)并在RT下搅拌反应混合物2小时。TLC分析显示形成新的产物(R产0.64,二氧化>^1，1:1￡)入0己烷，UV254nm)。用旋转蒸发仪除去挥发物，并在EtOAc(250mL)和HC1(0.5M，lOOmL)之间分配所得的油。然后将EtOAc层用盐水(100mLx2)清洗，Na2S04干燥并浓缩得到无色油。利用快速色镨(CombiFlash纯化系统，40g柱，40mL/分钟，270nm，梯度25分钟内EtOAc在己烷中的增加为10-65%,收集18mL级分，级分15-25含有纯的产物)纯化所述油得到0.830g(收率71%)产物(42c)。ES-MS(直接注入MeOH中，计算值M+Na+=C12H15FN206+Na+=325.08，实测值[M+Na么325,12)。化合物(42d):将化合物(42c)(0.403mg,1.33mmol)用TFA-CH2C12(1:1,10mL)溶液处理15分钟并除去挥发物以得到白色固体的化合物(42d)(0.250g，收率93%,Rf=0.40,二氧化^^L，1:1EtOAc-己烷，UV254nm)。ES-MS(直接注入MeOH中，计算值]\1+11+=[(:71171^204+11+=203.05，实测值[]\1+11+=203.09)。化合物(42e):向(42d)(0.250g,1.23mmol)和BrCH2CH2NHBoc(P/N:Fluka，17354，0.482g,2.15mmol)的DMF溶液(15mL)中加入固体形式的K2C03(0.509g，3.69mmol)并在RT下搅拌悬液23小时。TLC分析显示形成单一的产物(42e)(R产0.28，二氧化>^，1:1EtOAc-己烷，UV254nm，通过用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加热使TLC显色)。利用旋转蒸发仪除去溶剂和挥发物后，在EtOAc(200mL)和稀HC1(100mL,pH=3-4)之间分配所得的油。然后将EtOAc层用盐水(50mLx2)清洗，Na2S04干燥并浓缩得到无色油。利用快速色语(CombiFlash纯化系统，40g柱，40mL/分钟，270nm，梯度25分钟内EtOAc在己烷中的增加为40-60%,收集18mL级分，级分12-20含有纯的产物)纯化所述油得到0.382g(收率卯％)产物(42e)。ES-MS(直接注入MeOH中，计算值M+Na+=[C14H2()FN306+Na+1=368.12，实测值[M+Na+=368.23)。化合物(42f):将LiOHH20(55mg，1.32mmol的水溶液(2mL))加入到(42e)(0.226g，0.66mmol)溶于DMF(10mL)中的溶液中并搅拌20分钟，此时TLC分析显示甲酯已完全水解(Rf=0,二氧化硅板，l:lEtOAc-正己烷；UV254nm，通过用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加热使TLC显色)。减压除去挥发物并将残留物在RT下用TFA-拟9:1，10mL)处理1小时。除去TFA-水后，将残留物溶解在饱和NaHC03(30mL，pH=8-9)溶液中。然后将Fmoc-OSu(P/N:AdvanceChemTechRC8015,0.268g，0.79mmol，溶于丙酮(30mL)中)的溶液加入到水溶液中并在环境温度下搅拌l小时。TLC分析显示形成产物(42f)(R产0.20;二氧化硅板，9:1:0.01CH2Cl2-MeOH-AcOH，UV254nm,通过用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加热使TLC显色)。然后浓缩反应混合物以除去丙酮，将由此得到的残留物用水(150mL)进行稀释。用Et20(100mLx2)萃取以除去非极性杂质。酸化(pH1，HC1，1M)7JC层并用EtOAc(250mL)萃取。将EtOAc层用盐水清洗(50mLx2),用Na2S04干燥并浓缩得到0.107g(3步总收率35%)无色粘性油的产物(42f)。ES-MS(MeOH直接注入)计算值[]\1+"3+=<:23112(^]\306+~3+=476.12，实测值[]\1+~8+=476.20。将约10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯树脂用20%(v/v)派咬的DMF溶液处理(2mLx1分钟，过滤，然后2mLx5分钟)、过滤并清洗(NMP)。将化合物(42f)(10倍当量于树脂上Glu-Fib的量)用溶于NMP(1mL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5当量)和N,N國二异丙基乙胺(30当量)进行活化，加入到树脂中并混合30分钟。然后过滤树脂，用NMP清洗并断开Fmoc基团。然后将派唤乙酸-TFA盐(10当量)用溶于NMP(~1.5mL)中的HATU(9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(60当量)进行活化，并加入到树脂中。30分钟后，用NMP清洗树脂，然后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200^L，2小时)将缀合的M树脂上断开(并脱保护)并用Et20进行沉淀。利用ES-MS进行化合物(42)的分析(直接注入水中，计算值[]\1+11]+=1923.8,实测值[M+H"^1924.0)。进一步的质镨分析:在MALDI和电喷雾平台上对质量标签标记的Glu-Fib肽(42)进行MS/MS分析。数据显示质量标签是MALDI和电喷雾平台的良好测试物。信号离子强度强，并观察到了所预期的肽断裂方式(数据未显示)。F.质量标签标记的Glu-Fib肽(43)的合成(参见图34)化合物(43b):向(43a)(P/N:Oakwood,003333，1.0g，5.55mmol)和DMAP(67mg,0.55mmol)的乙腈溶液(40mL)中加入二碳酸二叔丁酯(P/N:Chem-Impex，00128，1.21g，5.55mmol)并在RT下搅拌2小时。TLC分析显示形咸单一的产物(43b)(R产0.81,二氧化>^1,1:1EtOAc誦己烷，UV254nm，参考文献Jaime-Figueroa，S.;Zamilpa，A.;Guzman，A.;Morgans,D.J.，"N-3-AlkylationofUracilandDerivativesviaN-l-BocProtection",争汰"/c0附附Mw/cflri卿，2001,仏3739-3746)。除去溶剂后得到的白色固体不需要进一步纯化而用于下一步及^应中。化合物(43c):将化合物(43b)(5.55mmol)溶解在DMF(35mL)中并冷却至0。C。向该溶液中加入固体形式的NaH(267mg，6.66mmol，60%，^t在油中)并在RT下搅拌30分钟。此时加入BrCH2COOtBu(P/N:Aldrich,124230，0.984mL，6.66mmol)并在RT下搅拌反应混合物1小时。TLC分析显示形成一个主要的产物(43c)(R产0.60，二氧化珪板，1:4EtOAc-己烷，UV254nm)。用旋转蒸发仪除去挥发物，并在EtOAc(250mL)和HCl(0.5M,100mL)之间分配所得的油。然后将EtOAc层用盐水(50mLx2)清洗，Na2S04干燥并浓缩得到无色油。利用快速色谱(CombiFlash纯化系统，120g柱，85mL/分钟，270nm，25%EtOAc的己烷溶液，收集18mL级分)纯化所述油而得到0.528g(收率20%)产物(43c)。ES-MS(直接注入MeOH中，计算值[M2+Na]+=[C32H42F6N4012+Na+=811.26,实测值[1\12+"&+=811.42)。化合物(43d):将化合物(43c)(0.528g,1.34mmol)用TFA-CH2C12(1:9,15mL)溶液处理5分钟并除去挥发物得到白色固体的化合物(43d)(0.3卯g，收率99%，Rf=0.22，二氧化>^1，1:4EtOAc-己烷，UV254nm)。ES曙MS(直接注入MeOH中，计算值M+Na^CuH!3F3N204+Na、317.07，实测值[M+Na、317.15)。化合物(43e):向(43d)(0.3卯g，1.32mmol)和BrCH2CH2NHBoc(P/N:Fluka，17354，1.112g,4.62mmol)的DMF溶液(15mL)中加入固体形式的K2C03(1.094g,7.92mmol)并且在RT下搅拌悬液23小时。TLC分析显示形成单一的产物(Rf=0.70，二氧化v^L,1:1EtOAc-己烷，UV254nm，通过用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加热使TLC显色)。利用旋转蒸发仪除去挥发物，在EtOAc(200mL)和稀HCl(100mL,pH=3-4)之间分配所得的油。然后将EtOAc层用盐水(50mLx2)清洗，Na2S04干燥并浓缩得到无色油。利用快速色诿(CombiFlash纯化系统，40g柱，40mL/分钟，270nm，35%EtOAc的己烷溶液，收集18mL级分，级分10-15含有纯的产物)纯化所述油得到0.256g(收率45%)产物(43e)。ES-MS(直接注入MeOH中，计算值[M+Na+=C18H26F3N3O6+NaI+=460.17，实测值M+Na^460.30)。化合物(43f):将化合物(43e)(0.256g，0.59mmol)用TFA-水(95:5，10mL)处理并搅拌l小时。减压除去挥发物，将残留物用Et20清洗。将由此所得的白色沉淀溶解在饱和NaHC03(30mL，pH=8-9)中。然后将Fmoc-OSu(P/N:AdvanceChemTechRC8015，0.239g，0.71mmol的丙酮溶液(2mL))的溶液加入到水溶液中并在环境温度下搅拌1小时。TLC分析显示形成产物(43f)(R产0.24;二氧化珪板，9:1:0.01CH2Cl2-MeOH-AcOH,UV254nm，通过以3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加热使TLC显色)。然后浓缩>^应混合物以除去丙酮，并将由此得到的残留物用水(150mL)进行稀释。用Et20(100mLx2)萃取以除去非极性杂质。酸化(pH1，HCl，1M)水层并用EtOAc(250mLx2)萃取。将EtOAc层用Na2S04干燥并浓缩得到0.266g白色固体(43f)。ES-MS(MeOH直接注入)计算值]\1+3+=<:24112(^3]\306+~3+=526.12，实测值[M+Na十526.20。将约10mgFmoc-Glu-Fib-三苯曱基氯树脂用20%(v/v)哌啶的DMF溶液处理(2mLxl分钟，过滤，然后2mLx5分钟)、过滤并清洗(NMP)。将化合物(43f)(10倍当量于树脂上Glu-Fib的量)用溶于NMP(~1mL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5当量)和N，N國二异丙基乙胺(30当量)进行活化，加入到树脂中并混合30分钟。然后过滤树脂，用NMP清洗，并断开Fmoc基团。然后将艰，秦乙酸-TFA盐(10当量)用溶于NMP(1.5mL)中的HATU(9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(60当量)进行活化，并加入到树脂中。30分钟后，用NMP清洗树脂，然后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200fiL，2小时)将缀合的^U^树脂上断开(和脱保护)并用Et20进行沉淀。利用ES-MS进行化合物(43)的分析(直接注入水中，计算值[M+H广-1973.8，实测值M+H]^1974.0)。进一步的质镨分析:在MALDI和电喷雾平台上对质量标签标记的Glu-Fib肽(43)进行MS/MS分析。lt据显示质量标签是MALDI和电喷雾平台的良好测试物。信号离子强度强，并且观察到了所预期的肽断裂方102式(数据未显示)。G质量标签标记的Glu-Fib肽(46)的合成(参见图36)化合物(46b):向O'C下的(46a)(P/N:Chem-Impex01343,2.73g,5.88mmol)的THF溶液(50mL)中加入BH3THF(14.7mL,1M)并使反应在RT下进行18小时。小的等分量(用MeOH淬灭)的TLC分析显示形成新的产物和一些Boc脱保护的产物(Rf(46b)=0.50，二氧化#，1:1EtOAc-己烷，UV254nm,通过用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加热使TLC显色，由TLC上强茚三酮阳性的基线斑点鉴定Boc脱保护的产物(与化合物(46a)不同))。用MeOH淬灭反应，加入J^1酸二叔丁酯(P/N:Chem-Impex，00128,1.28g，5.88mmol)并在RT下搅拌1小时。此时TLC分析显示仅存在化合物(46b)。浓缩反应混合物，利用快速色谱(CombiFlash纯化系统，120g柱，85mL/分钟，270nm,0-15分钟10%EtOAc的己烷溶液，然后60%EtOAc的己烷溶液，收集18mL级分)纯化所述油得到2.12g(收率80%)产物(46b)。ES-MS(MeOH直接注入)计算值[]\1+~31+=[(:2711311^038+3+=472.19，实测值[]\1+3+=472.17。化合物(46c):在RT下，于4小时内向(46b)(1.07g,2.38mmol)和CBr4(P/N:AWrichC11081,1.18g，3.57mmol)的CH;jCl2溶液(10mL)中加入PPh3溶液(P/N:AldrichT84409,0.685g，2.39mmol,溶于3mLCH2C12中)(使用注射泵)，添加完PPh3后，再搅拌反应混合物1小时。TLC显示形成主要产物(46c)R产0.50，二氧化樹良，1:4EtOAc-己烷，UV254nm，通过用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加热使TLC显色)。减压除去溶剂，利用快速色谢CombiFlash纯化系统，120g柱，85mL/分钟，270nm,0-5分钟5%EtOAc的己烷溶液，然后20%EtOAc的己烷溶液，收集18mL级分)纯化所述油得到0.6卯g(收率56%)产物(46c)。ES-MS(MeOH直接注入)计算值[M+Na+=[C27H30BrNO2S+NaI+=534.11，实测值+=534.06。化合物(46e):向(46c)(0.461g，O.卯mmol)和(46d)(0.244g，1.08mmol)的DMF(25mL)溶液中加入固体K2C03(0.372g,2.70mmol)并且在RT下搅拌68小时。TLC显示存在产物(46e)(Rf=0.50，二氧化珪板，1:1EtOAc-己烷，UV254nm,通过用3%(w/v)茚三酮的EtOH溶液加热使TLC显色)、未反应的(46c)和(46d)。减压除去DMF后，在EtOAc(200mL)和稀HCl(150mL,0.5M)之间分配所得的油。然后将EtOAc层用盐水(50mLx2)清洗，Na2S04干燥并浓缩得到无色油。利用快速色谦(CombiFlash纯化系统，40g柱，40mL/分钟，265nm,0-1分钟20%EtOAc的己烷溶液，然后1-10分钟35%EtOAc的己烷溶液，然后50。/。EtOAc的己烷溶液，收集18mL级分，级分19-27含有纯的产物)纯化所述油得到0.200g(收率34%)产物(46e)。ES-MS(直接注入MeOH中，计算值[]\1+~31+=\3068+&+=680.28，实测值[]\1+&+=680.23)。化合物(46f):在RT下用TFA-CH2C12(9:1，10mL)处理化合物(46e)(0.200g，0.304mmol)30分钟然后减压除去TFA-CH2C12。将由此得到的黄色油与THF共蒸发直到所述油无色为止(硫醇基的再次三苯甲基化作用)。然后将油溶解在DMF(5mL)中并用N，N-二异丙基乙胺(P/N:Applied说osystems400136,pH9-10,湿pH试纸)磁z化。将N,N國二异丙基乙胺(0.206mL，1.19mmol)加入N-Me國哌漆乙酸2TFA(0.152g，0.395mmol)和HATU(AppliedBiosyslems，4317033，0.138g,0.364mmol)的DMF溶液(2mL)中；混合1分钟并加入到上述Boc脱保护的(46c)的溶液中。1小时后，将^Ji混合物用HCl(1M)酸化，用盐水(150mL)稀释并用CH2C12(150mL)萃取。将二氯甲烷层用Na2S04干燥并浓缩得到0.207g白色泡沫的产物(46f)(98%)。ES-MS(直接注入MeOH中，计算值[1\1+11+=[(:391147&058+11+=698.33，实测值[]\1+11+=698.27)。化合物(46g):向(46f)(72mg，0.1mmol)溶于THF誦水(2:1，3ml)的溶液中加入NaOH溶液(0.20mL，1M)并混合30分钟。利用TFA溶液(1M)将反应中和至pH=3并真空干燥得到产物(46g)。将约10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯树脂用20%(v/v)哌咬的DMF溶液处理(2mLx1分钟，过滤，然后2mLx5分钟)、过滤并清洗(NMP)。将化合物(46g)(10倍当量于树脂上GIu-Fib的量)用溶于NMP(1mL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(60当量)进行活化，加入到树脂中并混合30分钟。然后过滤树脂，用NMP清洗，然后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200nL，2小时)将缀合的Jlb^树脂上断开(和脱保护)并用Et20进行沉淀。向产物肽(1:5CH3CN-水，0.60ml)的冰冷却溶液中加入过甲酸溶液(0.6mL)并在0匸混合5分钟(过甲酸(HCOOOH)溶液制备将4mLHCOOH(99%)+0.45mLH202(30%)+0.25mL水混合并使4^LRT下放置1小时)。ES-MS分析显示存在所预期的氧化产物(46)。(计算值[M+HI+=2013.8，实测值1\1+11+=2013.7)。进一步的质谱分析:在MALDI平台上对质量标签标记的Glu-Fib肽(46)进行MS/MS分析。数据显示质量标签是MALDI平台的良好测试物(数据未显示)。在MS分析(电喷雾)中，+3荷电物质的量远远低于仅含有胸腺嘧咬核碱基的标签的情形。当在MALDI平台上分析时，在肽断裂时该化合物仅给出"y，，离子系列(数据未显示)-因此大大降低了用于分析的MS/MS镨的复杂性。G质量标签标记的Glu-Fib肽(47)的合成(参见图37)向>^基丙氨酸(P/N:TCIAmericaC0514，1g，5.90mmol)溶于NaHC03水溶液(pH=8-9,50mL)的溶液中加入Fmoc-OSu溶液(2.4g,7.08mmol，溶于150mL丙酮中)并在RT下搅拌18-19小时。减压除去丙酮并用150mL水稀释悬液。用Et20(100mLx3)萃取以除去非极性杂质。用浓HC1将水层酸化至pH1，然后加入AmberliteIR-120-H树脂(P/N:Aldrich216534,12g，1.9mmol/g-S03H基)，混合并过滤。冻干滤液得到2.52g白色吸湿性固体的Fmoc-磺基丙氨酸。ES-MS(直接注入水中)，负性模式，计算值M-Hr4Q8HrN07S-H]-3卯.06，实测值[M-H]:3卯.03。将约10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯树脂用20%(v/v)哌啶的DMF溶液处理(2mLx1分钟，过滤，然后2mLx5分钟)、过滤并清洗(NMP)。将Fmoc-磺基丙氨酸(10倍当量于树脂上Glu-Fib的量)分别用溶于NMP(~lmL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033，9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(30当量)溶液进行活化，加入到树脂中并混合30分钟。然后过滤树脂，用NMP清洗，并断开Fmoc基团。然后将派溱乙酸-TFA盐(10当量)用溶于NMP(1.5mL)中的HATU(9.5当量)和N,N隱二异丙基乙胺(60当量)进行活化，并加入到树脂中。30分钟后，用NMP清洗树脂，然后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200pL，2小时)将缀合的M树脂上断开(和脱保护)并用Et20进行沉淀。利用ES-MS进行化合物(47)的分析(直接注入水中，计算值[M+H、2070.9，实测值[M+H+=2071.8)。进一步的质谱分析:在MALDI平台上对质量标签标记的Glu-Fib肽(47)进行MS/MS分析。数据显示质量标签是MALDI平台的良好测试物(数据未显示)。在MS分析(电喷雾)中，+3荷电物质的量远远低于仅含有胸腺嘧咬核碱基的标签的情形。当在MALDI平台上分析时，在肽裂解时该化合物仅给出"y"离子系列(数据未显示)-因此大大降低了用于分析的MS/MS色谱的复杂性。H.质量标签标记的Glu-Fib肽(49)的合成(参见图38)向Br(CH2)3C02Et(P/N:Aldrich167118,0.645mL,4.5mmol)的EtOAc溶液(20mL)中加入l-甲基艰唤(P/N:Aldrich130001，1mL，9.0mmol)并搅拌过夜。过滤沉淀后，浓缩EtOAc层，利用快速色镨(CombiFlash纯化系统，12g珪胶柱，30mL/分钟，20%甲醇的CH;jCl2溶液，收集18mL级分)纯化由此所得的油产物(49a)。将产物(49a)溶解在水(4mL)中并在95。C加热4小时。除去水后，将固体(49b)用THF清洗并真空干燥。ES-MS(直接注入水中，计算值[M+H+=[C9H18BrN202+H+=187.14，实测值[]\1+11+=187.18)。将约10mgFmoc-Glu-Fib-三苯甲基氯树脂用20%(v/v)哌啶的DMF溶液处理(2mLx1分钟，过滤，然后2mLx5分钟)、过滤并清洗(NMP)。将化合物(49b)(10倍当量于树脂上Glu-Fib的量)用溶于NMP(lmL)中的HATU(P/N:AppliedBiosystems4317033,9.5当量)和N，N-二异丙基乙胺(30当量，对于化合物21而言是60当量)进行活化，加入到树脂中并混合30分钟。然后过滤树脂，用NMP清洗，然后用CH3CN清洗。利用95:5TFA-水(200^L，2小时)将缀合的肽从树脂上断开(和脱保护)并用Et20进行沉淀。利用ES-MS进行化合物(50)的分析(直接注入水中，计算值[]\1+11+=1738.8，实测值[M+Hr-1739.2)。进一步的质谱分析:在MALDI和电喷雾平台上对质量标签标记的Glu-Fib肽(49)进行MS/MS分析。数据显示丙酸衍生物(49)可能是合适的测试物(数据未显示)。然而，接近的MS/MS模式的分析显示存在一些其中部分标签仍然是结合的肽片段。可通过掺入含有重原子同位素的原材料而将前述合成方法用于制备同位素编码的标记试剂。下述实施例阐明了用于产生同位素编码的同量异位标记试剂的多种方法。同量异位质量标签(标记试剂)的合成I.利用氘同位素进行同位素编码的同量异位质量标签A.质量标签(25)的合成图20以图示方式说明了质量标签(25)的合成。将FmocSer(Bzl)(1mmol)、TSTU(1mmol)和DIEA(2mmol)溶解在DMF(6mL)中。室温下摇动混合物半小时。蒸发溶剂而形成FmocSer(Bzl)-OSu，其直接用于以下步骤。向甘氨酸(0.4mmol)溶于DMF(0.8ml)和0.2M碳酸氢钠水溶液(2.8ml)的溶液中加入溶于DMF(2.4ml)中的Fmoc-Ser(Bzl)-OSu(0.4mmol)并同时涡旋。室温下摇动混合物20分钟。将化合物FmocSer(Bzl)-Gly用制备性HPLC进行纯化。将FmocSer(Bzl)-Gly(50mg)暴露于溶于DMF(5ml)的20%哌咬中10分钟以除去Fmoc保护基。蒸发溶剂后，将产物Ser(Bzl)-Gly用制备性HPLC进行纯化，并用MS进行表征([M+H]+:253.1，计算值；253.0，实测值)。将Fmoc甘氨酸-2，2-d2(ISOTEC,0.14mmol)、TSTU(0.21mmol)和DIEA(0.28mmol)溶解在DMF(1mL)中。室温下摇动混合物45分钟，然后转移到Ser(Bzl)-Gly(0.14mmol)溶于0.2M碳酸氯钠水溶液(2ml)的溶液中。再加入DMF(1ml)。室温下摇动混合物20分钟，将化合物FmocGly(d2)-Ser(Bzl)-Gly用制备性HPLC进行纯化，并用MS进行表征([M+司+:534.2，计算值；534.2，实测值)。将FmocGly(d2)-Ser(Bzl)-Gly暴露于溶于DMF(5ml)的20%旅咬中15分钟以除去Fmoc保护基。蒸发溶剂后，将产物Gly(d2)-Ser(Bzl)-Gly用制备性HPLC进行纯化，并用MS进行表征(M+H+:312.1,计算值；312.0，实测值)。根据方案I将Gly(d2)-Ser(Bzl)-Gly酰化以提供质量标签(25)([M+H]+:480.1，计算值；480.0，实测值)。B.质量标签(26)的合成图21以图示方式说明了质量标签(26)的合成。利用冰水浴冷却Boc-L-Ser(NovaBichem，2mmol)的DMF溶液(4ml)。加入氢化钠(Aldrich，6mmol)。在氢气停止放出后，加入苄基-a，a糊d;j溴(ISOTEC，2mmo1)并同时涡旋。室温下摇动混合物5小时，将化合物BocSer(Bzl-d2)用制备性HPLC进行纯化，并用MS进行表征([M+H+:298.2，计算值；298.2，实测值)。将BocSer(Bzl-d2)(0.4mmol)、TSTU(0.6mmol)和DIEA(0.8mmol)溶解在DMF(2mL)中。室温下摇动混合物l小时，然后逐滴转移到甘氨酸(2mmol)溶于3mL1M碳酸氬钠水溶液的溶液中。室温下摇动混合物30分钟，将产物BocSer(Bzl-d2)-Gly用制备性HPLC进行纯化，并用MS进行表征([M+H+:355.3，计算值；355.2,实测值)。室温下，将BocSer(Bzl-d2)-Gly(64mg)溶于三氟乙酸(TFA，AppliedBiosystems，1ml)和二氯曱烷(2ml)的溶液中暴露30分钟以除去Boc保护基。将混合物用水萃取两次(每次1.5ml)。合并萃取物并用制备性HPLC进行纯化。将产物Ser(Bzl-d2)-Gly用MS进行表征([M+H]+:255.1,计算值；255.2，实测值)。将FmocGly(0.3mmol)、TSTU(0.3mmol)和DIEA(0.45mmol)溶解在DMF(2mL)中。室温下摇动混合物1小时，然后逐滴转移到Ser(Bzl-d2)-Gly溶于0.2M碳酸氢钠水溶液(2ml)的溶液中。再加入DMF(lml)。室温下摇动混合物20分钟，将产物FmocGly-Ser(Bzl-d2)-Gly用制备性HPLC进行纯化，并用MS进行表征([M+H+:534.3，计算值；534.4，实测值)。将FmocGly-Ser(Bzl-d2)-Gly暴露于5ml20%旅咬的DMF溶液中10分钟以除去Fmoc保护基。蒸发溶剂后，将产物Gly-Ser(Bzl-d2)-Gly用制备性HPLC进行纯化，并用MS进行表征(M+H+:312.2，计算值；312.4，实测值)。根据方案I将Gly-Ser(Bzl-d2)-Gly酰化以提供质量标签(26)([M+H]+:480.1，计算值；480.2,实测值)。II.利用12CV13C和"N/15N同位素编码的同量异位质量标签A.质量标签(27)的合成图22以图示方式说明了质量标签(27)的合成。将FmocGly(13C2,15N)(ISOTEC，0.33mmol)、TSTU(0.66mmol)和DIEA(0.66mmol)溶解在DMF(2ml)中。皇温下摇动混合物40分钟，然后逐滴转移到L-丝氨酸(Bzl)(NovaBiochem，2mmol)溶于DIEA(4mmol)、DMSO(8ml)和水(2ml)的溶液中。室温下摇动混合物20分钟，过滤后，将含有产物的滤液用制备性HPLC进行纯化，将产物FmocGly(13C2，"N)画Ser(Bzl)用MS进行表征(M+H+:478.2,计算值；478.2实测值)。将FmocGly(13C2，15N)-Ser(Bzl)、TSTU(0.6mmol)和DIEA(0.6mmol)溶解在DMF(2ml)中。室温下摇动混合物1小时，然后逐滴转移到Gly(13C2，15N)(ISOTEC，lmmol)溶于水(2ml)和碳酸氢钠(2mmol)的溶液+并同时涡旋。再加入DMF(4ml)。室温下摇动混合物30分钟，离心后，将含有产物的上清液用制备性HPLC进行纯化，将产物FmocGly(13C2，15N)-Ser(Bzl)-Gly(13C2,"N)用MS进行表征([M+H]+:538.2，计算值；538.2，实测值)。室温下将FmocGly(13C2,15N)-Ser(Bzl)-Gly(13C2，15N)(4mg)暴露于0.2ml溶于DMF的20%嗛咬中10分钟以除去Fmoc保护基。蒸发溶剂后，根据方案I将脱保护的胺酰化以提供质量标签(27)([M+H+:484.1,计算值；484.0，实测值)。B.质量标签(28)的合成图23以图示方式说明了质量标签(28)的合成。将Boc-L國Ser(NovaBiochem,5.82mmol)溶解在DMF(6ml)中并用水7JC浴冷却。加入氢化钠(17.46mmol)并同时涡旋。室温下摇动混合物15分钟。当不再有气体放出后，加入溴节(a-"C)(ISOTEC，2.91mmol)并同时涡旋。皇温下摇动混合物4小时，然后用制备性HPLC进行纯化。将产物BocSer(Bzl-a-"C)用MS进行表征([M+H+:297.1，计算值；297.2，实测值)。109用10ml溶于二氯甲烷中的30。/oTFA将BocSer(Bzl-a-"C)(300mg)脱保护30分钟，然后用水萃取两次(每次3mL)。合并7jc层，并用制备性HPLC进行纯化。将产物Ser(Bzl-ct-"C)用MS进行表征(M+H+:197.1，计算值；197.0，实测值)。将FmocGly(2-13C,15N)(ISOTEC,1mmol)、TSTU(2mmol)和DIEA(2mmol)溶解在DMF(3ml)中。室温下摇动混合物1小时，然后转移到Ser(Bzl-a-"C)溶于3ml0.2M碳酸氢钠的水溶液中并同时涡旋。室温下摇动混合物20分钟,并用制备性HPLC进行纯化，将产物FmocGly(2誦"C，15N)-Ser(Bzl画a-"C)用MS进行表征([M+H+:478.2，计算值；478.2，实测值)。将FmocGly(2-13C，15N)-Ser(Bzl-a-13C)(0.021mmol)、TSTU(0.042mmol)和DIEA(0.042mmol)溶解在DMF(0.5ml)中。室温下摇动混合物l小时，转移到甘氨酸("C2,"N)(ISOTEC，0.1mmol)溶于0.5ml0.2M碳酸氢钠的水溶液中并在室温下摇动混合物20分钟，用制备性HPLC进行纯化，用MS对产物FmocGly(2國"C，15N)-Ser(Bzl-a-13C)-Gly(13C2,15N)进行表征([M+H+:538.2，计女值；538.0,实测值)。室温下，用0.8ml溶于DMF中的20%哌咬将FmocGly(2-13C,15N)-Ser(Bzl-a-13C)-Gly(13C2，15N)(12mg)脱保护10分钟，蒸发所有溶剂后，根据方案I将游离胺进行酖化以提供质量标签(28)([M+H1+:484.1，计算值；484.0，实测值)。含有同量异位质量标签的固相栽体^I.FmocGly-Ser(Bzl-"C6)的合成图24以图示方式说明了FmocGly-Ser(Bzl-13C6)(29)的合成按照与制备FmocGly(2-13C，15N)-Ser(Bzl-a-13C)(MS中的(M+H+:481.2,计算值；481.2，实测值)的步船目同的步骤制备所述化合物(参见利用重原子同位素进行同位素编码的同量异位质量标签的合成，§IIB)。II.树脂键合的质量标签的合成图25以图示方式说明了树脂键合的同量异位的同位素编码的质量标签(30)、(31)和(32)的合成。A.树脂键合的同量异位同位素编码的质量标签(30)的合成将1g湿的^J^PEGA树脂(NovaBiochem，0.05mmol取代)用水、DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF进行清洗。通常用每种溶剂清洗树月旨两次(每次约5ml)。将FmocPAL连接物(AppliedBiosystems，0.15mmol)、TSTU(0.15mmol)和DIEA(0.225)溶解^EDMF(1ml)中。室温下摇动混合物20分钟，然后转移到悬于约1mlDMF中的树脂中。室温下摇动混合物1小时。过滤后，将树脂用DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF清洗两次。将树脂用5ml在DMF中的20%哌啶清洗一次，然后室温下用5ml20%哌啶充分脱保护10分钟。过滤后，将树脂用DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF清洗两次。将FmocGly(13C2,15N)(ISOTEC,0.1mmol)、TSTU(0.1mmol)和DIEA(0.15mmol)溶解在DMF(1ml)中。室温下摇动混合物20分钟，然后转移到悬于约lmlDMF中的树脂中。室温下摇动混合物2小时。过滤后，将树脂用DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF清洗两次。将树脂用5ml在DMF中的20%哌咬清洗一次，然后室温下用5ml20%哌啶充分脱保护10分钟。过滤后，将树脂用DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF清洗两次。将FmocGly(13C2，15N)-Ser(Bzl)(0.1mmol)、HBTU/HOBT(AppliedBiosystems,0.1mmol)和DIEA(0.15mmol)溶解在DMF(1ml)中。室温下摇动混合物2小时。过滤后，将树脂用DMF、DCM、甲醇、DCM和DMF清洗两次。将树脂用5ml在DMF中的20%艰咬清洗一次，然后室温下用5ml20%派咬充分脱保护10分钟。过滤后，将树脂用DMF、DCM、曱醇、DCM和DMF清洗两次。将>5^^乙酸(0.15mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.15mmol)溶解在DMF(0.5ml)中。加入在DMF(0.5ml)中的DCC(Aldrich，0.15mmol)并同时涡旋。室温下摇动混合物l小时，过滤后，将溶^入到悬于含有碳酸氢钠(0.15mmol)的1mlDMF中的树脂中。室温下摇动混合物1小时。过滤后，将树脂键合的质量标签(30)用水、DMF、DCM、甲醇、DCM、DMF和DCM清洗两次。将树脂键合的质量标签以等份分装到管柱(cartridge)(MilliporeUFC30LG25)内，用SpeedVac进行干燥，并储存在水箱(-30'C)中以将来使用。每个管柱内有约4mg干燥的树脂键合的质量标签(30)。B.树脂键合的同量异位的同位素编码的质量标签(31)的合成除了FmocGly(13C2,15N)-Ser(Bzl)被替代为FmocGly(2-13C，"N)-Ser(Bzl-a，C)以外，用于合成树脂键合的质量标签(31)的步骤与用于合成树脂键合的质量标签(30)的步船目同。C.树脂键合的同量异位的同位素编码的质量标签(32)的合成除了FmocGly("C2/5N)和FmocGly("C2,N)-Ser(BzI)分别被替代为Fmoc甘氨酸和FmocGly-Ser(Bzl-"C6)以外，用于合成树脂^:合的质量标签(31)的步骤与用于合成树脂键合的质量标签(30)的步m目同。含有标记试剂的核碱基的合成图26以图示方式说明了从化合物(33)开始将核^(胸腺嘧啶)掺入到质量标签(36a)中，并通过中间化合物(34)和(35)继续进行反应。进行该转化的步骤描述如下化合物(34)的合成向胸腺嘧啶乙酸乙酯(33)(500mg，2.35mmol)和2曙Boc-(^J0國乙基溴(634mg，2.82mmol)的DMF溶液(50mL)中加入K2C03(974mg，7.05mmol)。将反应在环境温度下搅拌18小时。薄层色镨(TLC)分析显示形成单一的产物(二氧化>^良，EtOAc溶剂；R产0.7;UV,茚三酮)。减压除去DMF后，将产物用快速色镨(ISCOCompanion纯化系统；40gSiO;j柱，在260nm检领ij,';j^J^=40mIV分钟；0-7分钟50%EtOAc的己坑溶液以除去未反应的2-Boc4i^)-乙基溴，然后100%EtOAc以洗脱产物)进行纯化。ES-MS(直接注入曱醇中)([M+H+:356.18，计算值；356.18，实测值)。注意可根据"Buildingblocksforpolyamidenucleicadds:Facilesynthesisusingpotassiumfluoridedopednaturalphosphateasbasic112catalyst.Alahiane,A.;Taourirte，M.;Rochdi，A.;Redwane，N.;Sebti,S.;Engels,J.W.;Lazrek,H.B.Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids(2003),22(2)，109-114，，制备化合物(33)，为所有目的，将其全部教导通过引用并入本文。化合物(35)的合成当TLC分析显示Boc脱保护完全时，在室温下用溶于二氯甲烷(DCM)中的卯％TFA处理化合物(34)(465mg，1.3mmol)30分钟。减压除去TFA-DCM溶液，将由此得到的泡沫溶解在DMF(25mL)中。然后通过加入二异丙基乙胺中和溶液(用湿pH试纸检查)。向该中性溶液中加入旅漆乙酸(206mg，1.3mmol)、HATU(494mg，1.3mmol)和二异丙基二乙胺(0.679mL，3.9mmol)溶于DMF(25ml)中的混合物。30分钟后，TLC分析显示形成产物(二氧化^良，EtOAc-MeOH(l:l)溶剂；Rf=0.2;UV，茚三酮)。减压除去DMF后，将产物用快速色谱(ISCOCompanion纯化系统；40gSi02柱，在260nm检测，流速=40mL/分钟；0画1分钟95%EtOAc的MeOH溶液，1-10分钟50%EtOAc的MeOH溶液，10-30分钟10%EtOAc的MeOH溶液)进行纯化。ES-MS(直接注入水中)([M+H+396.22计算值，396.28实测值)。化合物(36a)的合成向化合物(35)(300mg，0.76mmol)的水溶液(20mL)中加入NaOH溶液(1.14mL，IN)。在环境温度下搅拌溶液3小时。TLC分析显示乙基酯完全水解。然后用TFA酸化反应混合物，然后减压浓缩。由此得到的油直接使用而不需要进一步纯化。ES-MS(直接注入水中)([M+Na+390.18计算值，3卯.40实测值)。化合物(37a)的合成可通过名称为"反应活性基团"的部分中所述的众所周知的方法制备含有反应活性基团RG的化合物(37a)。含有核碱基的其它标记试剂的制备和同位素编码所述标记试剂的方法图27A以图示方式说明了用于以大于卯％的收率合成6-曱基尿嘧啶的乂/^p合成步骤。图26中所列出的一般方法可用于将6-曱基尿嘧啶转化为类似于化合物(36a)的异构体(36b)，同样，对于含有反应活性基团RG的化合物(37a)和(37b)也是如此。化合物(36a)和(37b)是通式RP-X-LK-Y-RG的化合物的实施方案，其中所述核M是连接物(LK)的成分，N-甲基p底溱是报告物(RP)的成分。图27B和27C鉴别了可从商业渠道得到的同位素取代的原材料(CambridgeIsotopeLabs,AndoverMA)，所述原材料可用于制备图27A中以图示方式说明的同位素富集形式的6-甲基尿嘧啶。如图所示，邻近碳原子的符号"^"表示该碳是"C同位素，邻近氮原子的符号"*"表示该氮是15N同位素。因此，利用公知的合成步骤和同位素取代的原材料可产生多种同位素取代的标记试剂及其前体。图28A-28B以图示方式说明了多种同位素富集形式的6-甲基尿嘧啶，所述6-甲基尿嘧咬可利用这些从商业渠道可得到的同位素取代的原材料和图27A中以图示方式说明的步骤制得。在图28A和28B中，标号+1、+2、+3、+4、+5、+6和+7用于分另1]表示含有1、2、3、4、5、6和7个重原子同位素的6-甲基尿嘧咬形式。因为可利用任何不含重原子的同位素至多达7个重原子的同位素的那些原料来制备6-甲基尿嘧啶形式，所以有可能制备至少8种不同的同量异位的通式(37b)的标记试剂。图28C中以图示方式"^兌明了一些示例性的同位素编码的标记试剂。注可根据以下文献制备6-甲基尿嘧啶1.Donleavy，J.J.;Kise，M.A.6-MethylUracil,OrganicSyntheses,ColI.Vol.2，p.422;Vol.17，p.63;2.Jiang,Z.;Wang,Z.;Ma，D.;Zhou,Y.Improvedsynthesisof6-methyluracil.TongjiDaxueXuebao，ZiranKexueban，2003,31(2)，250-252:3.6-Methyluracil.SAIJIYOUSHIGEYA;MSHINAKATOSfflYOSHI(YodogawaPharmaceuticalCo.,Ltd.,Japan).Jpn.KokaiTokkyoKoho(1981),2pp.JP56139467;PatentwritteninJapanese.摘要RefluxingMeCOCH2C02Mewittiureaandp-MeC6H4S03Hinhexane6hwittiazeotropicremovalofH20gaveMe3-ureidocrotonate,whichwasheatedwith10%NaOH0.5hat95。togive92.6%6-methyluracil。III.用于一步固相iTPAQ的方案Af醋絲a.将蛋白质样品(50-100pg)溶解在50nl变性緩沖剂(0.2M的NH4HC03水溶液，含有8M脲和20mMCaCl2)中。b.向样品溶液中加入2pi三[2-羧基乙基膦(TCEP，Sigma,50mM)并在37。C孵育1小时。c.加入lpi甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)试剂(Aldrich，200mM)并且旋涡样品溶液10分钟。d.将样品溶液用0.1MNH4HCO3(1:1，50jil)进^#释。e.向样品溶液中加入2nlLysC(Wako,lpg/pl)并将样品溶液在37'C孵育1小时以消化蛋白质。f.用水(1:1，100nl)稀释消化溶液。g.向消化溶液中加入10^(~5)胰蛋白酶(PromegaV5113,0.5ng/jil)并将消化溶液在37'C孵i4~6小时。h.向消化溶液中加入4filTCEP并将消化溶液在在37'C孵育1小时。必.《#處#标记*|爭應虞^^农a.用50mMTris緩冲液(pH8)(3x300^1)清洗Millipore管柱中树脂结合型同量异位的同位素编码质量标签(UFC30LG25,如前制备的)。b.将蛋白质消化溶液(~200nl)转移到步骤a的预处理的管柱中。c.低速旋涡所述管柱3060分钟。d.旋转所述管柱以除去未结合的肽。通过HPLC分析滤液(以确定捕获完成)。e.用0.1%TFA水溶液(3x300jil)清洗管柱中的树脂。f.将树脂在SpeedVac中进一步干燥。C.^#應#斧放被标记农a.将200jilTFA(95%)和TIPS(Aldrich，5%)的裂解混合物(cleavagecocktail)加入到所述管柱中。b.使所述管柱在室温下放置90分钟。c.低速(6xlOOOg)旋转所述管柱并且保留滤液。d.向所述管柱中加入额外的100pi0.1%TFA，并再次旋转所述管柱，保留滤液。e.合并滤液并在SpeedVac中干燥而得到^^有质量标记的肽的残留物。利用MS和LC/MS/MS分析被同量异位的质量标签标记的肽质量标签(38)和(39)是一对被广泛测试的质量标签。质量标签(38)和(39)具有下述结构式(39)e可利用合适的同位素取代的原材料与任何公知的氨基酸合成方法来合成质量标签(38)和(39)，例如，可利用合适的同位素取代的原材料与图25中所示的方法并结合从固相树脂载体上释放质量标签的断开步骤。质量标签(38)和(39)二者的质量为479.05Da，预计在经历解离能水平时会失去节基。然而，由于每个质量标签上氖取代基的放置，质量标签(38)将具有质量为91.05Da的信号离子，质量标签(39)将具有质量为93.07Da的信号离子。A.用质量标签(38)烷基化的肽的QTRAPTM2000分析将具有下述式的合成肽SEQIDNo.:1和SEQIDNo.:2的半胱氨酸氨基酸残基用质量标签(38)烷J^化并且利用RP-HPLC进行纯化SEQIDNo.:1IAVAAQNCYK、SEQIDNo.:2HYGGSVTGATCK:将纯化的被标记肽以1的浓度在0.1%TFA中重构。利用TurboIonSpray操作通过在QTRAP2000系统上的注入试验(infusionexperiment)>生质镨。釆集总计0.5分钟(40次扫描)。如图2A和2B所示，被标记的SEQIDNos.:1和SEQIDNos.:2的分子离子的片段离子(失去91Da)百分率小(分别约为3%和10%)。在QTRAP2000的MS/MS模式中，被标记的SEQIDNos.:1和SEQIDNos.:2产生91Da的信号离子(分别见图3A和3B)。它们的强^1A肽依赖性的并且通常至少约与铵离子的强度相同。在存在和强度方面，被标记肽的序列离子与相应的用琳K乙,基化的肽的那些离子是可比的。B.利用4700蛋白质组分析仪分析用质量标签(38)或(39)烷基化的肽将SEQIDNo.:1和SEQIDNo.:3(DCGATWWLGHSER)用质量标签(38)烷基化，利用RP-HPLC进行纯化，并且用0.1。/oTFA水溶液稀释至100nL。将每种样品(1jiL)与介质(1|iL饱和溶液)混合，然后将每种混合物(1nL)装载到MALDI板上用于分析。被标记的SEQIDNo.:1和SEQIDNo.:3的母离子分别为m/z1431.7和m/z1880.8。所述两个肽都是稳定的，并且在MS阶段^M见察到由母离子引起的信号离子的丟失(参见图4A和4B)。将CID气体压力设置在1x10-5托，被标记的SEQIDNo.:1产生的MS/MS镨为m/z1431.7,而被标记SEQIDNo.:3产生的MS/MS镨为m/z1880.8，总共釆集2000次扫描(参见图5A和5B)。信号离子和序列离子如图中所示。在MS/MS阶段中信号离子的强Jbl肽依赖性的，并通常小于利用QTRAP2000得到的强度。然而，当CID增加时所述强度则可显著增强(数据未显示)。序列范围与用碘代乙酸烷基化相应的肽所得的序列范围一致。C.利用质量标签和QTRAPTM2000定量肽为评价样品中蛋白质表达的相对定量，制备了含有5种肽的2种样品。5种肽的HPLC色镨列在图6A-C中。根据其保留时间从最早至最长，将这些肽命名为SEQIDNos.:1-5:SEQEDNo.:1IAVAAQNCYKSEQIDNo.:2IIYGGSVTGATCKSEQIDNo.:3DCGATWVVLGHSERSEQIDNo.:4VPADTEVVCAPPTAY1DFARSEQIDNo.:5VAHALSEGLGVIACIGEK将第一种样品还原、用质量标签(38)烷基化、并用胰蛋白酶消化。第二种样品含有与第一种样品相同的5种肽，但是用质量标签(39)而不是质量标签(38)进行烷基化。将第一种样品分等份(每份5皮摩尔)，并将每份与250飞摩尔至50皮摩尔的量的第二种样品相组合。利用MRM扫描模式在QTRAPTM2000上通过LC-MS/MS实验分析每种样品混合物。在MS/MS中，用质量标签(38)标记的肽产生了91Da的信号离子，而用质量标签(39)标记的肽则产生了93Da的信号离子。在MRM实验中，检测到了特定分子离子向片段离子的跃迁。由于用2种不同的标签将含有5种半胱氨酸的肽的每种样品混合物烷基化，因此监测到总共10种MRM过渡态(或对)SEQIDNo.:1为716.5/91和716.5/93;SEQIDNo.:2为811.5/91和811.5/93;SEQIDNo.:3为628.5/91和628.5/93;SEQIDNo,:4为829.9/91和829.9/93以及SEQIDNo.:5为707.5/91和707.5/93。图6中所述的光谙代表作为RPLC-保留时间函数的来自相应分子离子(即完整的肽离子)的特定片段离子(即91Da和93Da的离子)的丰度。由表1可见，所预计的比例与实验得到的比例一致。动态范围为1/0.05-1/10，跨度大于2个数量级。因为比例为1/0.1的来自质量标签(38)的91Da离子和比例为1/10的来自质量标签(39)的93Da离子仍然高于背景噪音，所以动态范围可以是3个数量级或更多。D.利用质量标签和4700蛋白质组分析仪定量肽制备上述来自C部分的样品1和2的混合物。在所得混合物中，来自样品1的肽的浓度被固定在0.2jiM。然后将每种(1)与介质(1nL)混合，然后M种化混合物(1jiL)装栽到MALDI板上并在4700蛋白质组分析仪上进行分析。将CID设置在9x10-6，在每个MS/MS实验中总共采集3000次扫描。91-离子和93-离子的峰面积强度用于计算实验比例(参见表l)。动态范围为1/0.05~1/10，跨度大于2个数量级。因为比例为1/0.1的来自质量标签(38)的91Da离子和比例为l/10的来自质量标签(39)的93Da离子仍然高于背景噪音，所以动态范围可以是3个数量级或更多。对于相对定量而言，动态范围为1个数量级的探针即可足够，因为通常相对蛋白质表达小于10倍。然而，对于绝对定量而言，需要大的动态范围的探针。由于本发明的质量标签的动态范围大于2个数量级，因此它们可用于蛋白质的绝对定量以;M目对定量。<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>表l:利用QTRAPTM或4700蛋白质分析仪对样品中质量标签标记的蛋白质的相对定量E.复杂蛋白质混合物的分析用质量标签(38)或质量标签(39)将每种含有19种肽的两种等同的蛋白质混合物烷基化。因此，混合物中用质量标签(38)烷基化的肽将产生91Da的信号离子，而混合物中用质量标签(39)烷基化的肽则将产生93Da的信号离子。将所述两种蛋白质的混合物以1:1或1:2混合并利用QTRAPTM分析混合物以基于每个分子离子在MS/MS阶段中信号离子(91/93)的比例测定每种样品中每种肽的比例。由表2中的数据可见，1:1混合物和1:2混合物的实验结果与所述19种肽中每一种的预计比例都相接近。肽肽序列(91/93)1:1比例的混合物(91/93)1:2比例的混合物BSA(aa223-228)CASIQK(S)EQIDNo.:6)1:1.071:2.04BSA(aa413-420)QNCDQFEK(SEQIDNo.:7)1:0.891:1.8BSA(aa460-468)CCTKPIESER(SEQIDMo.:8)1:0.861:2.2BSA(aa286-297)YICDNQDTISSK(SEQidNo.:9)1:0.731:1.96BSA(aa198-204)GACLLPK(SEQIDNo.:10)1:1.061:2.21BSA(aa387-399)DDPHACYSTVFDK(SEQIDNo.:l])1:1.071:1.44BSA(aa139-151)LKPDPNLCDEFK(SEQIDNo.:12)1:1.161:2.24BSA(aa508-523)RPCFSALTPDETYWK(SEQIDNo.:13)1:0.891:1.97转铁蛋白(aa27-37)WCAVSEHEATK(SEQIDNo.:14)1:1.01:1.5转铁蛋白(aa347-362)egtcpeap丁deck:pvk(SEQIDNo.:IS)1:1.281:2.44转铁蛋白(aaDDTVCLAK1:1.05I:1.7120<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>权利要求1.一种试剂盒，其包含至少两种不同的由下式所代表的化合物或其盐形式和/或水合物形式其中独立地对各种不同化合物而言RG是亲核基团或亲电基团，或是分析物与亲核基团或亲电基团的反应产物；r是0～1的整数；S’是与固相载体或亲和配体偶联的可断开连接物；X和Y各自是键，其中X偶联RP和LK中每一个的原子或任选的取代基从而将RP与LK相连接，Y将LK的原子或任选的取代基与RG偶联；RP和LK各自任选地并且独立地被取代，其中RP是报告物基团并且LK是由结构式E所代表的连接部分LK5其中每个n独立地是1～3的整数，并且每个R独立地是H、D、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、或卤素基团；和每个化合物的RP具有独特的总质量，并且每个化合物的LK具有独特的总质量以补偿每个化合物的RP之间的独特总质量的差异使得每个化合物的RP和LK的合计总质量相同。2.权利要求1的试剂盒，其中RP是杂芳基、杂环烷基或被杂芳基或杂环烷基取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪族基团。3.权利要求l的试剂盒，其中所述连接部分LKS是由下述结构式所代表的基团或所述基团的同位素化形式4.权利要求l的试剂盒，其中所述化合物中的至少一种是或其同位素化形式。5.权利要求l的试剂盒，其中所述试剂盒的所有化合物是同量异位的。6.权利要求5的试剂盒，其中所述化合物是同量异位的同分异构体。7.权利要求5的试剂盒，其中所述化合物是同量异位的同位素化形式。8.权利要求l的试剂盒，其中所述试剂盒的每个化合物都包含独特的同位素编码的报告物。9.权利要求1的试剂盒，其中RP包含任选地被取代的哌奉基，LK是芳基或环烷基，或被芳基或环烷基取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪族基团。10.权利要求l的试剂盒，其中RG是亲核基团或亲电基团。11.权利要求10的试剂盒，其中RG是选自以下基团的亲电基团N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、五氟苯酯、2-硝基苯酯、4-硝基苯酯、2，4-二硝基苯酯或2，4-二卣代苯酯、混合酸酐、马来酰亚胺、烷基卣、a-卣代-酰基的芳基卣化物、三苯曱基卣化物、以及曱硅烷基卤化物。12.权利要求10的试剂盒，其中RG是选自以下基团的亲核基团胺、羟基以及硫醇基。13.权利要求l的试剂盒，其中r是0。14.权利要求1的试剂盒，其中由S，所代表的所述可断开连接物与所述固相载体偶联。15.权利要求14的试剂盒，其中所迷试剂盒的每种不同的化合物被固定到载体上，所述载体是与固定任何其它不同化合物的栽体分开的。16.权利要求15的试剂盒，其中所述试剂盒的每种不同化合物被固定在所述固相栽体的分开的阵列位置上，由此所述试剂盒是所述不同化合物的阵列库。17.权利要求15的试剂盒，其中所述固相栽体包含聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯、聚丙烯酰胺、玻璃、二氧化硅、可控多孔玻璃(CPG)或反相二氧化硅。18.权利要求17的试剂盒，其中RG是分析物与亲核基团或亲电基团的反应产物。19.权利要求1的试剂盒，其中RG是亲核基团或亲电基团与分析物的反应产物，并且所述分析物是蛋白质、肽、核苷酸、寡核苷酸、脂质、类固醇或小于1500道尔顿的小分子。20.权利要求l的试剂盒，其中当被施加解离能水平时，至少一部分化合物中的X键和Y键均发生断裂。21.权利要求l的试剂盒，其中当被施加解离能水平时，至少一部分化合物中的RP发生亚断裂。22.—种混合物，其包含多种由下式所代表的被标记分析物或其盐形式和/或水合物形式其中独立地对各种被标记分析物而言r是01的整数；S，是与固相栽体或亲和配体偶联的可断开连接物；X和Y各自是键，其中X偶联RP和LK中每一个的原子或任选的取代基从而将RP与LK相连接，Y将LK的原子或任选的取代基与-分析物偶联；RP和LK各自任选地并且独立地被取代，其中RP是报告物基团，LK是由结构式E所代表的连接部分LK5:其中每个n独立地是13的整数，并且每个R独立地是H、D、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、或卣素基团；和每个被标记分析物的RP具有独特的总质量，并且每个被标记分析物的LK具有独特的总质量以补偿每个被标记分析物的RP之间的独特总质量的差异，使得每个被标记分析物的RP和LK的合计总质量相同。23.权利要求22的混合物，其中每个-分析物是蛋白质、肽、核苷酸、寡核苷酸、碳水化合物、脂质、类固醇、氨基酸或小于1500道尔顿的小分子。RP-X-LK-Y-分析物24.权利要求22的混合物，其中每个RP包含独特的同位素编码，所述同位素编码识别所述分析物所来源的样品。25.—种由下式所代表的同位素富集化合物或其盐形式和/或水合物形式RP-X-LK画Y陽RG，RG是亲核基团或亲电基团，或是分析物与亲核基团或亲电基团的反应产物；X和Y各自是键，其中X偶联RP和LK中每一个的原子或任选的取代基从而将RP与LK相连接，Y将LK的原子或任选的取代基与RG偶联；RP和LK各自任选地并且独立地被取代，其中RP是报告物基团，LK是由结构式E所代表的连接部分LKS:其中每个n独立地是13的整数，并且每个R独立地是H、D、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、或卤素基团；和所述化合物的至少两个原子用重原子同位素进行同位素富集。26.权利要求25的同位素富集化合物，其中RP和LK各自包含至少一个重原子同位素。27.权利要求25的同位素富集化合物，其中RP和LK各自包含至少两个重原子同位素。28.权利要求25的同位素富集化合物，其中RP和LK各自包含至少三个重原子同位素。29.—种方法，包括a)使两种或更多种各自含有一种或多种分析物的样品与不同的标记试剂反应，从而产生各自含有一种或多种被标记分析物的两种或更多种被不同标记的样品，其中所述标记试剂由下式化合物或其盐形式和/或水合物形式表示RP-X-LK-Y-RG其中独立地对各种标记试剂而言RG是亲核基团或亲电基团；r是0~1的整数；S，是与固相栽体或亲和配体偶联的可断开连接物；X和Y各自是键，其中X偶联RP和LK中每一个的原子或任选的取代基从而将RP与LK相连接，Y将LK的原子或任选的取代基与RG偶联；RP和LK各自任选地并且独立地被取代，其中RP是才艮告物基团，LK是由结构式E所代表的连接部分LK5:其中每个n独立地是13的整数，并且每个R独立地是H、D、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、或卣素基团；和每个被标记分析物的RP具有独特的总质量，并且每个被标记分析物的LK具有独特的总质量以补偿每个被标记分析物的RP之间的独特总质量的差异，使得每个被标记分析物的RP和LK的合计总质量相同;和b)混合两种或更多种被标记的样品或其一部分以及任选的一种或多种校正标准物从而产生混合物。30.权利要求29的方法，其中所述两种或更多种样品是酶消化反应的产物。31.权利要求29的方法，其中每种样品是分离过程的级分。32.权利要求29的方法，其中所述一种或多种分析物是蛋白质、核酸分子、碳水化合物、脂质、类固醇、氨基酸或小于1500道尔顿的小分子。33.权利要求29的方法，其中所述一种或多种分析物是肽。34.权利要求29的方法，其中所述一种或多种被不同标记的分析物各自包含独特的报告物，所述报告物鉴别所述分析物所来源的样品。35.权利要求29的方法，还包括c)对样品混合物或其级分进行一级质镨分析；d)用解离能水平处理来自所述一级质语分析的被标记分析物的具有所选质荷比的所选离子，从而形成至少一些所选离子的信号离子和电离的子片段离子；和e)对所选离子、信号离子和子片段离子或其级分进行二级质量分析。36.权利要求35的方法，还包括f)测定二级质量分析中每种信号离子部分的总质量和相对量以及子片段离子的总质量。37.权利要求36的方法，还包括对具有不同的所选质荷比的所选被标记分析物的离子重复进行步骤(d)至(f)一次或多次。38.权利要求36的方法，还包括重复步骤(c)至(f)一次或多次，每次用样品混合物的不同级分。39.权利要求35的方法，其中所述报告物在用于测定分析物的条件下基本上不进行亚断裂。40.权利要求35的方法，其中所述报告物在用于测定分析物的条件下进行亚断裂。41.权利要求35的方法，其中通过分析子片段离子而鉴别与具有所选质荷比的所选离子相关的被标记分析物。42.权利要求35的方法，其中相对于其它信号离子测定二级质量分析中每个信号离子的相对量。43.权利要求42的方法，其中使与被鉴别分析物相关的每种信号离子的相对量与被加入而形成混合物的每种样品的量相关联，从而测定组合而形成所述混合物的所述两种或更多种样品中每种样品内分析物的相对量。44.权利要求43的方法，其中(i)所述混合物还包含已知量的至少一种用于被鉴别分析物的校正标准物，并且相对于与所述校正标准物相关的信号离子的量测定每种信号离子的绝对量；和(ii)相对于每种信号离子的量测定混合物的每种不同样品中被鉴别分析物的绝对量。45.权利要求43的方法，还包括对具有不同的所选质荷比的所选被标记分析物的离子重复进行步骤(d)至(f)一次或多次，从而鉴定和/或测定组合而形成混合物的所述两种或更多种样品中每种样品内一种或多种其它分析物的相对量。46.权利要求43的方法，还包括对具有不同的所选质荷比的所选被标记分析物的离子重复进行步骤(d)至(f)一次或多次，从而鉴定和/或测定组合而形成混合物的所述两种或更多种样品中每种样品内一种或多种其它分析物的绝对量。47.—种试剂盒，其包含由结构式VI所代表的化合物或其盐形式和/或水合物形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中Rpe和LK^各自独立地是杂芳基或杂环烷基、或被杂芳基或杂环烷基取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪族基团，其中RpS或LK^中至少之一含有任选地被取代的核碱基、或被任选地被取代的核碱基取代或插入的直链或支链的脂肪族或杂脂肪族基团；Rp6和lk6的任选取代基独立地选自氢、氘、-oh、卤素、-cn、-n02、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、-r3、-t-r3、核糖、脱氧核糖或磷酸酯；每个W独立地是氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基；t是-o-、-nr4-、-s關、-c(o)-、-s(o)-、-so2-、-nr4c(o)-、-c(o)nr4-、-nr4s02-、-s02nr4-、-c(o)o陽、-oc(o)-、-nr4c(0)04-oc(0)nr4-;每个W独立地是氢、氘、烷基、杂烷基、芳基、或芳烷基；x是报告物的原子和LK^之间的键；和y是连接物的原子和rg的原子之间的键，其中rp6和lk6中至少之一被一种或多种重原子同位素进行了同位素富集。48.权利要求47的试剂盒，其中仅LK^是核碱基。49.权利要求48的试剂盒，其中至少一种化合物由下述结构式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中x将RS和rm禹联，y将r"和rg偶联；rs是誦c(j)2-c(o)画、-c(j)2-c(s)-、-<:(1)2-(:(]\11)-或-(:(<1)2-(:(1^)國，其中Rz是可任选地含有杂原子的含有1~8个碳原子的烷基或任选地被取代的芳基，其中所述烷基和芳基的碳原子独立地含有连接的氢、氘和/或氟原子；以及每个J相同或不同，并且是H、氘(D)、Rz、ORz、SRz、NHRz、N(Rz)2、氟、氯、溴或碘；116和117各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、-R3、-T-R3、核糖、脱氧核糖或磷酸酯，其中每个113独立地是氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基、或杂芳烷基；以及RS和W各自独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘或卣代烷基，前提是118和119不同时是氢。50.权利要求48的试剂盒，其中至少一种所述化合物是下述化合物或其同位素化形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>51.权利要求l的试剂盒，其中至少一种化合物由结构式I代表:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中:Rpi是由结构式A所代表的报告物基团:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中，环A是芳香性的；每个Z独立地是CH、CW或N,前提是不超过2个Z基团是N;ii是1或2j每个R2独立地选自氢、氖、-OH、卣素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、-R3或-T-R3;每个RS独立地是氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基；TA-0—、一NR4—、—S—、一C(0)一、隱S(O)一、誦SOr、,NR4C(0)顯、國G(0)NR、、-NR4S02-、-S02NR4-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NR4C(0)(^-OC(0)NR4-;每个W独立地是氢、氘、烷基、杂烷基、芳基、或芳烷基；LK1是连接部分LKS;X是报告物的原子和LK^之间的键；和Y是连接物的原子和RG的原子之间的键，其中R^和LK1中至少之一被一种或多种重原子同位素进行了同位素富集。52.权利要求51的试剂盒，其中环A是6元环。53.权利要求52的试剂盒，其中环A的邻位或对位的Z基团是C-T-R3。54.权利要求53的试剂盒，其中环A的邻位或对位的Z基团是C國NHC(O)-R3或C-NHS02-R3,并且每个R3独立地是任选地被取代的烷基。55.权利要求51的试剂盒，其中RP可由结构式A-l表示:56.权利要求l的试剂盒，其中至少一种化合物由结构式II表示:环B是非芳香性的；n是l或2;每个W独立地是O、S或NR、每个W，独立地是CH2、CHR2、C(R2)2、C(0)或C-N-R4;Q是CH或CR2;Q是CH或CR2;每个R2独立地选自氢、氘、-OH、卤素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、-R3或画T-R3;每个RS独立地是氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基、或杂芳烷基；TA一O-、—NR4—、—S—、國C(0)—、一S(O)一、S02—、-NR4C(0)—、—C(0)NR4—、RPzOC-LK2-Y-RG其中RP2是由结构式B所代表的报告物基团-NR4S02-、-S02NR4-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NR4C(0)04-OC(0)NR4-;每个R"独立地是氢、氘、烷基、杂烷基、芳基、或芳烷基；LK^是连接部分LK5;X是报告物的原子和LK^之间的键；和Y是连接物的原子和RG的原子之间的键，其中RP2和LK2中至少之一被一种或多种重原子同位素进行同位素富集。57.权利要求56的试剂盒，其中至少一种化合物由结构式II-d所58.权利要求56的试剂盒，其中至少一种化合物由结构式II-e所代表59.权利要求l的试剂盒，其中至少一种化合物由结构式III所代表代表:其中Rps是由结构式C所代表的报告物基团:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中,RX和Ry各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基或杂烷基，其中RX和Ry的任选取代基独立地选自氢、氘、-OH、卣素、-CN、-N02、-R3、-T-R3、核糖、脱氧核糖或磷酸酯,或者Rx和Ry—起形成环C，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>环C，是杂芳基或杂环烷基，其中环C'的取代基独立地是氢、氖、-OH、卤素、-CN、-N02、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂烷基、-R3、-T-R3、核糖、脱氧核糖或磷酸酯；每个RS独立地是氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、杂烷基、杂环烷基、杂芳基、或杂芳烷基；T、—NR4—、—S國、-G(O)國、隱S(0)—、-S02—、-NR4C(0)-、G(0)NR4—、-NR4S02-、-S02NR4-、-C(O)O-、國OC(O)誦、顯NR4c(0)0一或画OC(0)NR4-;每个W独立地是氢、氘、烷基、杂烷基、芳基、或芳烷基；LK3是连接部分LK5;X是报告物的原子和LK^之间的键；和Y是连接物的原子和RG的原子之间的键，其中Rps和LK3中至少之一被一种或多种重原子同位素进行了同位素富集。60.权利要求59的试剂盒，其中环C，由结构式III-c所代表其中，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>III-C其中q是0~6的整数并且LK3包含羰基。全文摘要本发明涉及利用独特的标记试剂或独特的标记试剂组通过质量分析测定分析物的方法、混合物、试剂盒和/或组合物。所述标记试剂可以是同分异构的或同量异位的，并且可用于制备适于对被标记分析物进行多重分析的混合物。文档编号C07D239/54GK101443664SQ200780013535公开日2009年5月27日申请日期2007年2月15日优先权日2006年2月15日发明者严雄伟,乔·Y·拉姆,克里希纳·G·乌帕德亚,奚国良,海伦娜·黄,苏巴卡尔·戴伊,苏巴西什·普尔卡亚斯塔,萨西·皮拉伊,袁保淼,袁咏莲,达里尔·J·C·帕平申请人:阿普里拉股份有限公司