一种水解酶活性的荧光检测方法与流程

本发明属于生物分析技术领域，涉及一种水解酶活性的荧光检测方法。

背景技术：

水解酶是催化水解反应的一类酶的总称，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。简便、快速和灵敏地检测水解酶的活性，对于疾病的早期诊断、疗效观察和预后监测具有极其重要的意义。

目前，对于水解酶的活性测定多采用荧光分析法和比色分析法。其中，荧光分析法是基于溶液中物质的荧光强度变化来对物质含量进行定量分析的方法，具有检测成本低、设备简单、操作简便、准确度高等优良特性。以碱性磷酸酶为例，目前可用于其活性测定的荧光分析方法有以下两类：(1)基于聚合诱导发光的原理，碱性磷酸酶将水溶性的磷酸-四苯乙烯水解生成不溶于水的四苯乙烯，四苯乙烯聚合后会产生荧光，从而实现对碱性磷酸酶的荧光分析，但是该方法存在选择性差，灵敏度低和抗干扰能力不足等缺陷(1.Gu X,et al.(2013).A new fluorometric turn-on assay for alkaline phosphatase and inhibitor screening based on aggregation and deaggregation of tetraphenylethylene molecules[J].Analyst,138(8):2427-2431；2.Liang J,et al.(2013).Fluorescent light-up probe with aggregation-induced emission characteristics for alkaline phosphatase sensing and activity study[J].ACS Applied Materials&Interfaces,5(17):8784-8789.)；(2)以碳量子点作为荧光探针，碳量子点表面富集的羧基基团被引发聚集时可导致荧光的猝灭，从而实现对碱性磷酸酶的荧光分析，然而该方法存在检测成本高，抗干扰能力差和可能具有毒性等缺陷(1.Qian Z,et al.(2015).Carbon quantum dots-based recyclable real-time fluorescence assay for alkaline phosphatase with adenosine triphosphate as substrate[J].Analytical Chemistry,87(5):2966-2973；2.Qian Z S,et al.(2015).A real-time fluorescent assay for the detection of alkaline phosphatase activity based on carbon quantum dots[J].Biosensors and Bioelectronics,68:675-680.)。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种水解酶活性的荧光检测方法，该方法基于荧光分析测定水解酶活性，灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，可重现性好，操作简单，检测时间短，成本低廉，可用于水解酶活性的临床检测。

本发明的技术方案如下：

一种水解酶活性的荧光检测方法，包括以下步骤：将含有底物和Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液与待测水解酶溶液孵育，生成Cu⁺-浴铜灵二磺酸络合物，测定反应液在402nm处的荧光发射强度，根据荧光发射强度与水解酶活性的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性；所述的底物为非还原性底物，与待测水解酶反应生成还原性产物。

所述的Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针由Cu²⁺和浴铜灵二磺酸混合制备。

所述的水解酶选自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、碱性磷酸酶、中性磷酸酶或酸性磷酸酶。

所述的水解酶为α-半乳糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷。

所述的水解酶为β-半乳糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷。

所述的水解酶为α-葡萄糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷。

所述的水解酶为β-葡萄糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

所述的水解酶为α-甘露糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷。

所述的水解酶为β-甘露糖苷酶时，底物可以是对氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷。

所述的水解酶为碱性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。

所述的水解酶为中性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。

所述的水解酶为酸性磷酸酶时，底物可以是抗坏血酸-2-磷酸。

本发明的水解酶活性的荧光检测方法，底物不具有还原性，不能还原Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针，底物在水解酶的作用下能够生成还原性产物，产生的还原性产物能将Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针还原成Cu⁺-浴铜灵二磺酸络合物。在含有底物和Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液与待测水解酶溶液孵育过程中，底物与水解酶反应生成还原性产物，还原性产物将Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针还原成Cu⁺-浴铜灵二磺酸络合物，导致检测液在402nm处的荧光发射信号下降。本发明通过测定反应液在402nm的荧光强度，最终根据荧光强度与水解酶活性的标准曲线关系，得到待测水解酶溶液中水解酶的活性。

本发明只需一步操作即可实现对水解酶活性的测定，荧光探针制备过程极其简单，具有化学性质稳定、水溶性好和生物相容性好等优良特性。本发明的荧光检测方法具有灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，可重现性好，操作简单，检测时间短和成本低廉等优点，可用于临床样品中水解酶活性的快速、高灵敏检测，极大地降低了检测成本。

附图说明

图1是实施例1中含有不同组分的检测液的荧光发射光谱图，其中，a为不加碱性磷酸酶，b为不加抗坏血酸-2-磷酸，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。

图2是实施例2中荧光发射强度与碱性磷酸酶活性之间的关系曲线图。

图3是实施例3中含有不同蛋白质样品的检测液在402nm处荧光发射强度的比较图，其中，a为碱性磷酸酶，b为酸性磷酸酶，c为人血清蛋白酶，d为胰蛋白酶，e为凝血酶，f为血红蛋白，g为空白对照。

图4是实施例4中荧光发射强度与血清样品体积之间的关系曲线图。

图5是实施例5中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加α-半乳糖苷酶，b为不加对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。

图6是实施例6中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加β-半乳糖苷酶，b为不加对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。

图7是实施例7中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加α-葡萄糖苷酶，b为不加对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。

图8是实施例8中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加β-葡萄糖苷酶，b为不加对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。

图9是实施例9中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加α-甘露糖苷酶，b为不加对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。

图10是实施例10中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加β-甘露糖苷酶，b为不加对氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。

图11是实施例11中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加中性磷酸酶，b为不加抗坏血酸-2-磷酸，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。

图12是实施例12中含有不同组分的检测液的荧光发射强度光谱图，其中，a为不加酸性磷酸酶，b为不加抗坏血酸-2-磷酸，c为不加浴铜灵二磺酸，d为不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针，e为所有试剂都加。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。

实施例1

本发明方法用于检测碱性磷酸酶活性的可行性分析实验。

将20μL 0.05mg mL^-1碱性磷酸酶样品加入到2980μL含有2mM抗坏血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图1可以看出，在检测液中不加碱性磷酸酶(a)或底物(b)时，检测液在402nm处的荧光发射强度较强；在检测液中不加浴铜灵二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针(d)或所有组分都存在的情况下(e)时，在～402nm处的荧光发射强度很弱。由此可见，本发明的荧光方法可用于检测碱性磷酸酶的活性。

实施例2

本发明方法用于检测碱性磷酸酶活性的荧光发射强度与碱性磷酸酶活性之间的关系。

将20μL的浓度为0，20，40，60，80，100，120，140，160，180和220mU mL^-1的碱性磷酸酶样品分别加入到2980μL含有2mM抗坏血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

从图2可以看出，随着样品中碱性磷酸酶活性的增加，检测液在～402nm处的荧光发射强度相应减弱，且荧光发射强度与碱性磷酸酶活性具有很好的定量关系。由此可见，本发明的荧光分析方法可用于样品中碱性磷酸酶活性的定量测定。

实施例3

本发明方法用于检测碱性磷酸酶活性的选择性。

将20μL 0.05mg mL^-1的碱性磷酸酶或20μL 0.5mg mL^-1的其他蛋白质溶液加入到2980μL含有2mM抗坏血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液在～402nm处的荧光发射强度。

从图3可以看出，与空白对照相比，虽然其他蛋白质的浓度为碱性磷酸酶浓度的10倍，但是只有当加入碱性磷酸酶时，检测液在～402nm处的荧光发射强度才会显著下降。由此可见，本发明的荧光分析方法用于检测碱性磷酸酶活性时具有很高的选择性。

实施例4

本发明方法用于检测碱性磷酸酶活性时在血清样品中的检测性能。

分别将4，8，12，16和20μL的正常人血清样品分别加入到含有2mM抗坏血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

从图4可以看出，随着血清样品体积的增加，检测液在～402nm处的荧光发射强度相应下降，且荧光发射强度与血清样品的体积具有很好的定量关系。由此可见，本发明的荧光分析方法可用于血清样品中碱性磷酸酶活性的定量测定，因此具有很好的实用性。

实施例5

本发明方法用于检测α-半乳糖苷酶活性的可行性分析实验。

将20μL 0.01mg mL^-1α-半乳糖苷酶样品入到2980μL含有2mM对氨基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图5可以看出，在检测液中不加α-半乳糖苷酶(a)或底物(b)时，检测液在～402nm处的荧光发射强度较强；在检测液中不加浴铜灵二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针(d)或所有组分都存在的情况下(e)时，在～402nm处的荧光发射强度很弱。由此可见，本发明的荧光分析方法可用于检测α-半乳糖苷酶的活性。

实施例6

本发明方法用于检测β-半乳糖苷酶活性的可行性分析实验。

将20μL 0.01mg mL^-1β-半乳糖苷酶样品加入到2980μL含有2mM对氨基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图6可以看出，在检测液中不加β-半乳糖苷酶(a)或底物(b)时，检测液在～402nm处的荧光发射强度较强；在检测液中不加浴铜灵二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针(d)或所有组分都存在的情况下(e)时，在～402nm处的荧光发射强度很弱。由此可见，本发明的荧光分析方法可用于检测β-半乳糖苷酶的活性。

实施例7

本发明方法用于检测α-葡萄糖苷酶活性的可行性分析实验。

将20μL 0.05mg mL^-1α-葡萄糖苷酶样品加入到2980μL含有2mM对氨基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图7可以看出，在检测液中不加α-葡萄糖苷酶(a)或底物(b)时，检测液在～402nm处的荧光发射强度较强；在检测液中不加浴铜灵二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针(d)或所有组分都存在的情况下(e)时，在～402nm处的荧光发射强度很弱。由此可见，本发明的荧光分析方法可用于检测α-葡萄糖苷酶的活性。

实施例8

本发明方法用于检测β-葡萄糖苷酶活性的可行性分析实验。

将20μL 0.05mg mL^-1β-葡萄糖苷酶样品加入到2980μL含有2mM对氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图8可以看出，在检测液中不加β-葡萄糖苷酶(a)或底物(b)时，检测液在～402nm处的荧光发射强度较强；在检测液中不加浴铜灵二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针(d)或所有组分都存在的情况下(e)时，在～402nm处的荧光发射强度很弱。由此可见，本发明的荧光分析方法可用于检测β-葡萄糖苷酶的活性。

实施例9

本发明方法用于检测α-甘露糖苷酶活性的可行性分析实验。

将20μL 0.01mg mL^-1α-甘露糖苷酶样品加入到2980μL含有2mM对氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图9可以看出，在检测液中不加α-甘露糖苷酶(a)或底物(b)时，检测液在～402nm处的荧光发射强度较强；在检测液中不加浴铜灵二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针(d)或所有组分都存在的情况下(e)时，在～402nm处的荧光发射强度很弱。由此可见，本发明的荧光分析方法可用于检测α-甘露糖苷酶的活性。

实施例10

本发明方法用于检测β-甘露糖苷酶活性的可行性分析实验。

将20μL 0.01mg mL^-1β-甘露糖苷酶样品加入到2980μL含有2mM对氨基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图10可以看出，在检测液中不加β-甘露糖苷酶(a)或底物(b)时，检测液在～402nm处的荧光发射强度较强；在检测液中不加浴铜灵二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针(d)或所有组分都存在的情况下(e)时，在～402nm处的荧光发射强度很弱。由此可见，本发明的荧光分析方法可用于检测β-甘露糖苷酶的活性。

实施例11

本发明方法用于检测中性磷酸酶活性的可行性分析实验。

将20μL 0.05mg mL^-1中性磷酸酶样品加入到2980μL含有2mM抗坏血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图11可以看出，在检测液中不加中性磷酸酶(a)或底物(b)时，检测液在～402nm处的荧光发射强度较强；在检测液中不加浴铜灵二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针(d)或所有组分都存在的情况下(e)时，在～402nm处的荧光发射强度很弱。由此可见，本发明的荧光分析方法可用检测中性磷酸酶的活性。

实施例12

本发明方法用于检测酸性磷酸酶活性的可行性分析实验。

将20μL 0.05mg mL^-1酸性磷酸酶样品加入到2980μL含有2mM抗坏血酸-2-磷酸和0.03mM Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针的检测液中，在25℃下孵育15min后，记录检测液的荧光发射光谱。

在可行性分析实验中，所缺组分用相同体积的缓冲液替代。从图12可以看出，在检测液中不加酸性磷酸酶(a)或底物(b)时，检测液在～402nm处的荧光发射强度较强；在检测液中不加浴铜灵二磺酸(c)、不加Cu²⁺-浴铜灵二磺酸荧光探针(d)或所有组分都存在的情况下(e)时，在～402nm处的荧光发射强度很弱。由此可见，本发明的荧光分析方法可用于检测酸性磷酸酶的活性。