专利名称：Azd1152的马来酸酯(盐)共晶体的制作方法
AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体
本发明涉及新的共晶体，更特别涉及2-{乙基[3-({4-[(5-{2-[(3-氟苯 基)氨基]-2-氧代乙基HH-吡唑-3-基)氨基]喹唑啉-7-基)氧基)丙基]氨基) 乙基二氢磷酸酯(本文称为AZD1152)的新的共晶体，其为在治疗过度增 殖性疾病比如癌症中有用的极光(aurora)激酶抑制剂。更特别地，本 发明涉及AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体，用于制备AZD1152的马 来酸酯(盐)共晶体的方法、包含AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体 的药物组合物、AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体在制备用于治疗过度 增殖性疾病比如癌症的药物中的用途及通过给药治疗有效量的 AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体来治疗人类或动物体中的过度增殖性 疾病比如癌症的方法。本发明还涉及AZD1152的马来酸酯(盐)共晶 体的具体的结晶形式。
时发^的无控细胞增殖。这 一 丧失似乎通常I由对通过细胞周;控制细 胞进程的细胞路径的基因损伤导致。
在真核生物中，认为蛋白质磷酸化的有序级联控制细胞周期。已经 识别了在该级联中起决定性作用的若干个蛋白质激酶家族。这些激酶中 有许多激酶在人肿瘤中的活性与正常组织中相比有所增加。这可通过蛋 白质的表达水平增加(例如由于基因扩增所致)或通过在共同激活剂或者 抑制蛋白质的表达的改变而发生。
这些细胞周期调节剂中第 一个被识别的并被广泛地研究的是细胞 周期蛋白依赖激酶(或CDK)。最近，已经识别出结构不同于CDK家族 的蛋白质激酶并且发现其在细胞周期调节中起关键作用。这些激酶还似 乎在肺瘤生成中很重要并且包括果蝇极光蛋白质(Drosophila aurora )和 酿酒酵母(S.cerevisiae)Ipll蛋白质的人同系物。这些基因极光-A、极光-B 和极光-C(还分别称作极光2、极光1和极光3)的这三种人的同系物编码 细胞周期调节的丝氨酸-苏氨酸蛋白质激酶(在Adams等，2001， Trends in Cell Biology. 11(2): 49-54中总结)。这些通过G2和有丝分裂表现表达和 激酶活性的峰值。 一些观测显示了人极光蛋白质涉及癌。极光-A基因定 位于染色体20ql3 -在包括乳房肿瘤和结肠肿瘤的两种人肿瘤中通常被
3扩增的结构域。极光-A可能是该扩增子的主要靶基因，因为极光-A的
DNA被扩增并且mRNA在原发性人结直癌中以大于50%;故过度表达。 在这些肿瘤中，极光-A蛋白水平显示大大高于相邻的正常组织。另外， 使用人极光-A转染啮齿动物的成纤维细胞导致转变，赋予在软琼脂中生 长的能力并在棵鼠中形成肿瘤。(Bischoff等,1998, The EMBO Journal. 17(11): 3052-3065)。其它工作(Zhou等，1998, Nature Genetics. 20(2): 189-93)已表明极光-A的人工过度表达导致中心体数目增加并且以非整 倍增加，这是在癌的发展过程中的已知事件。
还表明，当与正常细胞相比，在胂瘤细胞中，极光-B(Adams等，2001, Chromsoma. 110(2):65画74)和极光-C(Kimura等，1999, Journal of Biological Chemistry, 274(11): 7334-40)的表达增加。极光-B在癌细胞中 的过度表达和极光-B的水平增加已经显示与结直肠癌的晚期有关 (Katayama等，(1999)J. Natl. Cancer Inst. 91:1160)。此外， 一份报道显示， 极光-B的过度表达通过在丝氨酸10处增加的组蛋白H3磷酸化作用而诱 导非整倍性，并且过度表达极光-B的细胞形成更具攻击性的发展为转移 性病灶的胂瘤(Ota, T.等，2002, Cancer Res. 62: 5168-5177)。极光-B是染 色体过客蛋白，其与至少三种其它的过客蛋白Survivin、 INCENP和 Borealm存在于稳定的络合物中(Carmena M.等，2003, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 842-854)。 Survivm在癌中也一皮上调并且包含BIR (细胞程 序死亡蛋白质(IAP)Repeat的杆状病毒抑制剂)结构域并因此可在保护肿 瘤细胞免于细胞程序死亡和/或有丝分裂突变中发挥作用。
关于极光-C,其表达被认为只限于睾丸，但是已经在多种癌系中发 现其被过度表达。(Katayama H等，2003, Cancer and Metastasis Reviews 22: 451-464)。
重要地是，还已证明了通过用反义寡核苷酸处理人肿瘤细胞系而消 除极光-A的表达和作用(WO 97/22702和WO 99/37788)导致细胞周期停 滞并且在这些肺瘤细胞系中发挥抗增殖作用。另外，极光-A和极光-B 的小分子抑制剂已被证明在人肿瘤细胞中具有抗增殖作用(Keen等， 2001, Poster #2455， American Association of Cancer Research annual meeting),诸如通过siRNA治疗而选择性仅消除极光-B的表达 (Ditchfield等，2003, journal of Cell Biology, 161(2): 267-280)。这显示了 抑制极光-A和/或极光-B的作用将具有抗增殖作用，该作用可用于治疗人肺瘤和其它的过度增殖疾病。极光激酶^L抑制作为这些疾病的治疗手 段相对于以细胞周期上游的信号路径(例如通过生长因子受体酪氨酸激
酶诸如表皮生长因子受体(EGFR)或其它受体被激活的那些路径)为靶标 具有显著的优点。因为细胞周期是所有这些不同的信号事件的最终下 游，针对细胞周期的疗法诸如抑制极光激酶被预测在所有的增殖性肿瘤 细胞中都具有活性，而针对特异性信号分子(例如EGFR)的方法被预测 仅仅在表达这些受体的肺瘤细胞亚类中具有活性。还据信在这些信号路 径之间存在显著的"crosstalk"，意味着一种组分,皮抑制可一皮其它所补
在国际专利申请WO 03/55491和WO 2004/058781中描述了极光激 酶的抑制剂，并且特别在WO 2004/058781中公开了具有以下结构式的 化合物，其在本文中被称作AZD1152:
AZD1152是一种快速并完全地转化(在人血浆中)成本文称为 AZD1152HQPA的活性部分的前药
AZD1152HQPA
AZD1152HQPA是才及光激酶的ATP-竟争性和可逆性抑制剂，具有对 抗极光A、 B-INCENP和C-INCENP的强活性(Ki值分别是1369 土419.2
AZD1152nM, 0.359 土0.386 nM和17.03 土12.2 nM)。已经发现AZD1152在人结肠 直肠(SW620、 HCT116、 Colo205)和肺(A549、 Calu-6)肺瘤异种移植清单
中以统计显著性抑制肿瘤生长。
AZD1152公开在WO 2004/058781中，呈二盐酸盐形式，也呈水合 形式的游离碱。特别地，公开的游离形式为三水合物至四水合物形式。
从制备的观点来看，水合形式是成问题的，因为在制备、干燥、贮 存和加工期间它们需要适当的控制。另外，获得和保持具有一致的化学 计量化合物与水的比率的化合物样品是困难的。在AZD1152的之前公 开的形式特别是游离形式的情况下，水分子仅仅松散地结合至AZD1152 的每个分子，所以水分子与AZD1152药物结合和分离的程度随温度和 相对湿度的变化极大。因此，对于一定重量的AZD1152,根据AZD1152 分子数的AZD1152的实际量将取决于温度和相对湿度，因为含水量将 变化。因此，按重量测定的任何剂量的功效也取决于其暴露的温度和相 对湿度。已经使用动态蒸汽吸附(Dynamic Vapour Sorption)来测量与 AZD1152相关的水含量随湿度的变化。
W02004/05 8781 —般性地公开了其中公开的化合物的某些可药用 盐。AZD1152仅仅被公开为二 和游离形式。没有提及AZD1152的
改善本文讨论的问题的令人惊奇的益处和特别地没有益处。
出人意料地和令人惊奇地是，我们发现AZD1152的马来酸酯(盐) 共晶体以无水形式存在，其是基本上不吸湿性的。而且，尽管药物与马 来酸酯(盐)的化学计量比可以在例如0.8:1至1.2:1或0.9:1至1.1:1的范围 内变化，但是我们发现本文公开的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体具 有可重现的药物与马来酸酯(盐)的化学计量比，其基本上为l:l。因此， AZD1152马来酸酯(盐)共晶体的重量剂量的功效比已经评价的 AZD1152的游离形式、二盐酸盐及其它共晶体形式受温度和相对湿度影 响的程度小得多。另夕卜，AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体更容易制备， 因为更少需要控制制备过程中的湿度水平。马来酸酯(盐)共晶体的无 水性质进一步意味着使用有限制的含水条件和/或高温环境将其制剂是 可能的，因为在使用水相环境的加工条件例如湿法制粒期间水化/脱水的 风险较低。另外，我们发现AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体令人惊奇地包含 比游离形式更少的杂质。特别地，在将游离形式转化成马来酸酯(盐) 形式之后，似乎某些存在于游离形式中的顽抗性杂质(recalcitrant impurities )令人惊奇地以小得多的程度存在。
因此，本发明提供一种AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体。 为了避免引起疑惑，术语"AZD1152的马来酸酯(盐)"、"AZD1152 马来酸酯(盐)共晶体"或"AZD1152马来酸酯(盐)"(或本文使用 的任何其它类似术语)指所有形式的AZD1152和马来酸之间的结合物， 包括盐形式。特别地，这些术语包括
(i) AZD1152和马来酸之间的非离子结合物(即,其中在药物和马 来酸之间不存在质子传递)；或
(ii) 离子相互作用物，其中存在AZD1152和马来酸之间的质子传 递，形成AZD1152的马来酸盐，或
(iii) 上述(i)和(ii)的混合物。
在本发明的一个具体的实施方案中，马来酸酯(盐)共晶体包括 AZD1152药物和马来酸之间的非离子结合物(即，其中药物和马来酸之 间不存在质子传递)。
在本发明的另一个实施方案中，所述马来酸酯(盐)共晶体是 AZD1152的马来酸盐。
在一个具体的实施方案中，AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体是通 过在合适的溶剂中混合游离形式的AZD1152与马来酸形成的，所述合适 的溶剂比如曱醇、二甲亚砜(DMSO)或DMSO与甲醇的混合物、乙腈及其 它类似的溶剂。所述马来酸酯(盐)共晶体可以通过使结晶发生，然后 分离得到的结晶物质来分离。本发明的AZ1152的马来酸酯(盐)共晶体 的鉴定可以通过质子核磁共振(NMR)分析来确认。
还应当理解本发明的化合物或共晶体可显示出互变异构的现象，本 说明书中的公式图仅仅可以代表其中 一 种可能的互变异构形式。应当理 解本发明包括具有极光激酶抑制活性，特别是极光-A和/或极光-B激酶 抑制活性的任何互变异构形式，其不能只限于公式图中使用的任一种互 变异构形式。
本发明还涉及AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的特定的结晶形 式。该结晶形式是通过从有机溶剂比如甲醇和二曱亚砜(DMSO)的混合
7酯(盐)晶体制备的。进一步的实^^细节
提供在实施例中。
因此，本发明提供了 AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶形式。
所述AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶形式的特征是其提 供基本上如图1所示的X射线粉末衍射图。
AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体结晶形式的最显著的X射线粉 末衍射峰显示在表1中
表1
2-6。角相对强度％2-6 °角相对强度 ％
5.11810022.42518.8
6.44618.823.22826.8
8.15828.123.58337.7
10.17113.123.99425.7
11.9175.924.27124.1
12.8611824.67123.3
13.84948.325.3219.1
14.90925.225.57432.9
15.2343625.81343.8
15.73827.626.2135.3
16.50618.827.12216
16.8842327.94645.4
17.23242.528.41831.6
18.13413.828.84721.7
19.32762.729.72526.1
19.8238.830.52118.8
20.0826131.7415.4
20.58261.433.42414.7
21.0083236.18115.3
21.66387.338.10610.8
8根据本发明，提供一种AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶 形式，其中所述共晶体具有在约2-6=15.2。处有至少一个特征峰的X射 线粉末衍射图。
根据本发明，提供一种AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶 形式，其中所述共晶体具有在约2-6=12.9°处有特征峰的X射线粉末衍射图。
根据本发明，提供一种AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶 形式，其中所述共晶体具有在约2-6=15.2或10.2处有特征峰的X射线 粉末衍射图。
根据本发明，提供一种AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶 形式，其中所述共晶体具有在约2-6=18.1°处有特征峰的X射线粉末衍射图。
根据本发明，提供一种AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶 形式，其中所述共晶体具有在约2-6=10.2。、 12.9。、 15.2。或18.1。处有 特征峰的X射线粉末衍射图。
根据本发明，提供一种AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶 形式，其中所述共晶体具有在约2-6=12.9。和15.2°和/或10.2。处有特征 峰的X射线粉末衍射图。
根据本发明，提供一种AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶 形式，其中所述共晶体具有在约2-6=10.2°、 12.9°、 15.2。和18.1°处有 特征峰的X射线粉末衍射图。
根据本发明，提供一种AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶 形式，其中所述共晶体具有在约如表1中显示的2-6。值中的任何一个 或其组合处有特征峰的X射线粉末衍射图。
根据本发明，提供一种AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶 形式，其中所述共晶体具有与图1所示X射线粉末衍射图基本相同的X 射线粉末衍射图。
当本文说明本发明涉及AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶 形式时，通过X射线粉末衍射数据测定的结晶度适宜地为大于约60%, 更适宜地大于约80%，优选地大于约90%。
在定义AZD1152的马来酸酯(盐)结晶物结晶形式的X射线粉末衍射峰值的前文中，在表述"约2-6="中所用的术语"约"用于表明
峰的精确位置(即所述的2-e角度值)不应当看作是绝对值，因为本领域 技术人员应当理解，峰值的精确位置可以在所用机器之间、样品之间或
由于测量条件的稍微变化而稍微变化。在前段中也说明AZD1152的马 来酸酯(盐)共晶体的结晶形式提供与图1中显示的X射线粉末衍射图 "基本上"相同的X射线粉末衍射图，且具有基本上大多数表l中显示 的主峰(2-6角度值)，特别是约2-6=10.2。、 12.9。、 15.2。或18.1。。应当 理解，在本文中的术语所用的"基本上"还意味着指X射线粉末衍射图 的2-6角度值可以随所用的机器、样品或由于测量条件的稍微变化而稍 微变化，因此，图中显示的或表中引用的峰值仍不应被看作是绝对值。 在这点上，本领域已知获得的X射线粉末衍射图可以具有一个或多 个测量误差，取决于测量条件(比如所用的装置、样品制剂或设备)。特 别地，通常已知X射线粉末衍射图的强度可根据测量条件和样品制剂波
动。例如，x射线粉末衍射领域的技术人员将认识到峰值的相对强度可
能受到例如尺寸大于30微米和长宽比不均匀的晶粒的影响，其可能影 响样品的分析。本领域技术人员还将认识到反射的位置可能受样品位于 衍射计中的精确高度和衍射计的零点校准的影响。样品的表面平面性也 可能具有小的影响。因此，本领域技术人员应当理解本文出现的衍射图 数据不应看作是绝对的(其它信息参见Jenkins, R&Snyder, R丄.
'Introduction to X-Ray Powder Diffractometry' John Wiley & Sons, 1996)。因此，应当理解本发明的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的 结晶形式不限于提供与图1中显示的X射线粉末衍射图相同的X射线粉 末衍射图的晶体，提供与图1中显示的基本上相同的X射线粉末衍射图 的任何晶体都落入本发明的范围内。X射线粉末衍射领域的技术人员能 判断X射线粉末衍射图的基本同 一性。
通常，X-射线粉末衍射图中的衍射角的测量误差为约2- 6 =0.5。或更 小(或者，更适当地，约2-6=0.2。或更小)，当考虑图1中的X射线粉末 衍射图和当解释上文和表l中所指代的峰位置时，应当考虑这样的测量 误差度。因此，当说明例如所述共晶体具有在约2-6=15.2° (或上述提及 的任一个其它角度)处有至少一个特征峰的X射线粉末衍射图时，那么 这可以解释为2- 6 =15.2。加或减0.5。，或者2- 6 =15.2。加或减0.2。。
根据本发明的另一个方面，提供一种制备如本文定义的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的方法，所述方法包括在合适的溶剂中混合游离
形式的AZD1152的溶液与马来酸的步骤，所述溶剂比如甲醇、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲亚砜(DMSO)或DMSO与甲醇的混合物、乙腈、及其它类 似的溶剂。所述方法可以进一步包括结晶和任选地分离如此形成的结晶 的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的步骤。
所述方法还可包括用合适的溶剂洗涤AZD1152的马来酸酯(盐) 共晶体；和干燥该AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的其它步骤。
适当地，将游离形式的AZD1152溶于合适的溶剂(比如二曱亚石风、 曱醇、其混合物或N-曱基-2-p比咯烷酮)中，通常与马来酸的溶液(其溶于 相同的或者相容的溶剂中)混合。可选地，可以将固体马来酸加入到游离 形式的AZD1152溶液中(或者，反之亦然，即可以将游离形式的AZD1152 溶液加入到固体马来酸中)。适当地，搅拌该溶液以促进游离形式的 AZD1152和加入的马来酸混合。所述物质(理想地而非排他性地为1 : 1 的比例)可以在环境温度下混合，尽管该过程也可在较高的温度下进行。
可以使用本领域已知用于分离AZD1152的结晶的马来酸酯(盐) 形式的任何合适的方法。适当地，通过过滤收集AZD1152的马来酸酯 (盐)共晶体。
优选地，在真空下干燥洗涤的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体。 通常，游离形式的AZD1152 :马来酸的比例为1:1是期望的。通过 在0.6-1.4游离形式的AZD1152 : 1.0马来酸范围内的任何组成下混合游 离形式的AZD1152和马来酸可以获得该期望的1:1比例。适当地，在该 混合物中游离形式的AZD1152:马来酸的比例在0.9-1.1的范围内，特 別地在1.0-1.1游离形式的AZD1152 : 1.0-1.1马来酸的范围内。通常， 应当使用过量的马来酸，特别地，在该混合物中游离形式的AZD1152: 马来酸的比例在0.6-1.0的范围内，特别地在0.9-1.0游离形式的 AZD1152 : l.O马来酸的范围内。
AZD1152马来酸酯(盐)共晶体典型地自结晶(selfcrystallise), 但本领域技术人员应当理解如果需要或期望促进共晶体形成，可以使用 晶种。
根据本发明的一个进一步的方面，提供一种药物组合物，其包括如 本文定义的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体以及可药用稀释剂或载体。 本发明的组合物可以是适于口服使用的形式(如片剂、锭剂、硬或软
ii胶嚢、水性或油性混悬剂、乳剂、可分散的粉剂或颗粒剂、糖浆或酏剂)、 适于局部使用的(例如霜剂、膏剂、凝胶剂或水性或油性溶液或混悬剂)、 适于吸入给药的(例如呈精细粉碎的粉剂或液体气雾剂)、适于吹入给药 的(例如呈精细粉碎的粉剂)或适于肠胃外给药的(例如呈用于静脉内、皮 下、肌内或肌内给药的无菌水性或油性溶液，或者呈用于直肠给药的栓 剂)。
本发明的组合物可以使用本领域众所周知的常身见药用赋形剂通过 常规方法获得。因此，目的用于口服使用的组合物可以包含，例如一种 或多种着色剂、甜味剂、调味剂和/或防腐剂。
用于片剂剂型的合适的可药用赋形剂包括，例如惰性稀释剂比如乳 糖、碳酸钠、磷酸朽或碳酸钓、制粒剂和崩解剂比如玉米淀粉或藻酸
(algemcacid);粘合剂比如淀粉；润滑剂比如硬脂酸镁、硬脂酸或滑 石；防腐剂比如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯，和抗氧化剂比 如抗坏血酸。片剂剂型可以为未包衣的或包衣的，以改良它们的崩解和 随后活性成分在胃肠道之内的吸收，或者改善它们的稳定性和/或外观， 在各种情况下，使用本领域众所周知的常规包衣剂和方法。
用于口服的组合物可以是硬明胶胶嚢的形式，其中将活性成分与惰 性固体稀释剂例如碳酸钩、磷酸钓或高呤土混合；或者是软明胶软胶嚢
的形式，其中将活性成分与水或油比如花生油、液体石蜡、大豆油、椰 子油或优选橄榄油或任何其它可接受的载体混合。
含水混悬剂通常包含精细粉碎形式的活性成分和一种或多种混悬 物，比如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、 聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，比如卵磷 脂或烯化氧与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、或氧化乙烯 与长链脂族醇的缩合产物例如十七乙烯氧基鯨蜡醇，或氧化乙烯与衍生 自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物比如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、或 氧化乙烯与长链脂族醇的缩合产物例如十七乙烯氧基鲸蜡醇，或氧化乙 烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物比如聚氧乙烯山梨醇单 油酸酯、或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例 如聚乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。所述含水混悬剂也可包含一种或多种 防腐剂(比如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯、抗氧化剂(比如抗 坏血酸)、着色剂、调味剂、和/或甜味剂(比如蔗糖、糖精或阿司帕坦)。.油性混悬剂可以通过将活性成分悬浮在植物油(比如花生油、橄榄 油、芝麻油或椰子油)或矿物油(比如液体石蜡)中来制备。所述油性混悬 剂也可以包含增稠剂比如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂比如 上文列出的那些和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过 加入抗氧化剂比如抗坏血酸来保存。
适合通过加入水制备水性混悬剂或溶液的可分散的或冷冻干燥的 粉剂和颗粒剂通常包含活性成分和分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多 种防腐剂。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂已在上文举例说明。还可使 用其它赋形剂比如甜味剂、调味剂和着色剂。本发明的药物组合物也可 以为水包油型乳剂的形式。油相可以是植物油，比如橄榄油或花生油， 或者矿物油比如例如液体石蜡，或者任何这些的混合物。适宜的的乳化 剂可以是例如天然存在的树胶比如如阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然存在 的磷脂比如大豆卵磷脂、衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如去水 山梨糖醇单油酸酯)和所述偏酯与氧化乙烯的缩合产物比如聚氧乙烯去 水山梨糖醇单油酸酯。所述乳剂也可以包含甜味剂、调味剂和防腐剂。
糖浆或酏剂可以用甜味剂来配制，所述甜t朱剂比如甘油、丙二醇、 山梨醇、阿司帕坦或蔗糖，也可以包含緩和剂、防腐剂、调。木剂和/或着 色剂。
药物组合物也可以是无菌可注射的水性或油性混悬剂、溶液、乳剂 或特殊体系的形式，其可以使用 一 种或多种上文已经提及的合适的分散 剂或润湿剂和悬浮剂根据已知的方法配制。无菌可注射的制剂也可以是 在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液或混悬剂， 例如聚乙二醇中的溶液。
栓剂制剂可以通过将活性成分与合适的非刺激性赋形剂混合来制 备，所述赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直 肠中熔化而释放药物。合适的赋形剂包括，例如可可脂和聚乙二醇。
局部制剂比如霜剂、膏剂、凝胶剂和水性或油性溶液或混悬剂通常 可以通过将活性成分与常规局部可接受的赋形剂或稀释剂使用本领域 众所周知的常规方法配制获得。
用于吹入给药的组合物可以是精细粉碎的粉剂形式，所包含微粒的
平均直径为例如30jLim或更小，优选5jam或更小，更优选5 " m至1 粉剂本身包括单独的活性成分或者用一种或多种生理学可接受的吹入法的粉剂方便地保留在包含1至
50mg的活性成分胶嚢中，利用涡轮式吸入装置给药，比如用于吹入已
知试剂色甘酸钠的装置。
通过吸入给药的组合物可以是常规增压气雾剂的形式，用于将活性 成分分配成包含精细粉碎的固体的气雾剂或液滴。可以使用常规气雾剂 推进剂比如挥发性的氟代烃类或烃类，气雾剂装置方便地用于分配计量 量的活性成分。
关于制剂的进 一 步信息，请读者参照Comprehensive Medicinal Chemistry, 第5巻,第25.2章(Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990。
因此，在本发明的一个进一步的方面，提供用于治疗的AZD1152的 马来酸酯(盐)共晶体。进一步提供用作药物的AZD1152的马来酸酯(盐) 共晶体。本发明的另一个方面提供AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体用 作治疗过度增殖性疾病的药物，所述过度增殖性疾病比如癌症，持别是 结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或胰腺癌或白血 病或淋巴瘤。本文提及的白血病和淋巴瘤可能是骨髓系的肿瘤比如急性 髓性白血病或淋巴系的肺瘤。
另外，提供AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体用于通过治疗来治疗 温血动物比如人类的方法。本发明的另 一个方面提供AZD 1152的马来酸 酯(盐)共晶体用于治疗过度增殖性疾病的方法，所述过度增殖性疾病 比如癌症，特别是结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾 癌或赎_腺癌或白血病或'淋巴瘤。
在本发明的另一个方面，提供AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体在 制备治疗其中抑制 一种或多种极光激酶有益的疾病的药物中的用途。特 别地，预期抑制极光A激酶和/或极光B激酶可能是有益的。优选地， 抑制极光B激酶是有益的。'在本发明的在另一个方面，提供AZD1152 的马来酸酯(盐)共晶体在制备治疗过度增殖性疾病的药物中的用途， 所述过度增殖性疾病比如癌症，特別是结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、前 列腺癌、膀胱癌、肾癌或胰腺癌或白血病或淋巴瘤。
根据另一个方面，提供AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体用于治疗 患有疾病的人类的方法，所述疾病中抑制 一种或多种极光激酶是有益 的，其包括给药需要其的人类治疗有效量的AZD1152的马来酸酯(盐)
14共晶体的步骤。特别地，预期抑制极光A激酶和/或极光B激酶可能是
有益的。优选地，抑制极光B激酶是有益的。进一步提供AZD1152的马 来酸酯(盐)共晶体用于治疗患有过度增殖性疾病的人类的方法，所述 过度增殖性疾病比如癌症，特别是结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺 癌、膀胱癌、肾癌或胰腺癌或白血病或淋巴瘤，其包括给药需要其的人 类治疗有效量的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的步骤。AZD1152的
明的方面。
对于上述提及的治疗用途，给药剂量将根据施用的化合物、给药方 式、所需的治疗、显示的病症和动物或患者的年龄和性别变化。因此， 应当根据众所周知的医学原理来计算剂量的大小。
在使用AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体用于治疗或预防目的时， 通常给药的可接受日剂量范围为例如0.05 mg/kg体重至50 mg/kg体重，如 果需要可以分剂量给药。通常当施用肠胃外途径时，给药较低的剂量。 因此，例如，对于静脉内给药，通常采用的剂量范围为例如0.05 mg/kg 体重至25 mg/kg体重。类似地，对于吸入给药，采用的剂量范围为例如 0.05 mg/kg体重至25 mg/kg体重。
物之外，还可以涉及常规外科手术或放疗或化疗。这样的化疗可以包括 一种或多种下述种类的抗肿瘤剂
(i) 用在医学肿瘤学中的抗增殖药/抗胂瘤药及其组合，诸如烷化剂 (例如顺铂，卡铂，环磷酰胺，氮芥，美法仑，苯丁酸氮芥，白消安和亚 硝基脲)；抗代谢物(例如抗叶酸物诸如氟代嘧啶如5-氟尿嘧啶和替加氟， 雷替曲塞，曱氨蝶呤，阿糖胞苷和羟基脲；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗 生素如多柔比星(adriamycin),博来霉素，多柔比星，柔红霉素，表 柔比星，伊达比星，丝裂霉素-C,放线菌素D和光辉霉素)；抗有丝分 裂剂(例如长春花生物碱如长春新碱，长春碱，长春地辛和长春瑞滨，以 及紫杉类如紫杉酚和泰素帝)；拓朴异构酶抑制剂(例如表鬼臼脂素如依 托泊苷和替尼泊苷，安吖啶，拓朴替康和喜树碱)；
(ii) 细胞生长抑制剂诸如抗雌激素(例如他莫昔芬，托瑞米芬，雷洛 昔芬，屈洛昔芬和碘氧芬(iodoxyfene)),雌激素受体向下调节剂(例如 fulvestratrant)、抗雄激素(例如比卡鲁胺，氟他胺，尼鲁米特和醋酸环丙
15孕酮)，LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林，亮丙瑞林和布舍 瑞林)，孕激素类(例如醋酸曱地孕酮)，芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑，来 曲唑，伏氯唑和依西美坦)和5a-还原酶的抑制剂诸如非那雄胺；
(iii) 抑制癌细胞入侵的药剂(例如金属蛋白酶抑制剂如马立马司他 和尿激酶纤溶酶原激活物受体功能的抑制剂)；
(iv) 生长因子功能抑制剂如这种抑制剂包括生长因子抗体，生长 因子受体抗体(例如抗erbb2抗体曲妥珠单抗[HerceptinTM]和抗erbbl抗 体西妥昔单抗[C225])，法尼基转移酶抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂和丝氨 酸-苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家 族酪氨酸激酶抑制剂诸如,(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧 基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，AZD1839), #-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-曱氧 基乙氧基)p奎唑啉-4-胺(埃罗替尼(erlotinib) ， OSI-774)和6-丙烯酰胺基 -AH3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033)),例如血小 板衍生生长因子家族的抑制剂和例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；
(v) 抗血管生成剂如抑制血管内皮细胞生长因子的作用的那些，(例 如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[AvastinTM]，化合物诸如在国 际专利申请WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856和WO 98/13354 中公开的那些)和通过其它机制起作用的那些化合物(例如三羧氨基喹 啉(lmomide)，整联蛋白av(33功能的抑制剂和血管抑素)；
(vi) 血管杀伤剂，诸如考布他汀A4和在国际专利申请WO 99/02166, WO00/40529, WO 00/41669， WO01/92224, WO02/04434和 WO02/08213中公开的化合物；
(vii) 反义治疗，例如针对上面列举的靶标的那些，如ISIS 2503, 和抗-ras反义治疗；
(viii) 基因治疗方法，包括例如置换异常基因如异常p53或异常 BRCA1或BRCA2的方法，GDEPT(基因引导的酶前药治疗)方法诸如使 用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的方法，和增加患者对化 学治疗或放射治疗的耐受性的方法诸如多药抗药性基因治疗；和
(ix) 免疫疗法，包括增加患者肿瘤细胞的免疫原性的离体和体内方 法，诸如用细胞因子如白细胞介素-2、白细胞介素-4或粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子的细胞因子转染，降低T细胞无变应性的方法，使用转染 的免疫细胞如细胞因子转染的树状细胞的方法，使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法，以及使用抗个体基因型抗体的方法。
此外，AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体可以与一种或多种细胞周 期抑制剂联合使用。特别是与抑制bubl、 bubRl或CDK的细胞周期抑 制剂联合使用。
这样的联合治疗可以通过同时、顺序或分别给药治疗的单个组分的 方式来实现。这样的组合产物采用在本文描述的剂量范围之内的本发明 的化合物和在其批准剂量范围之内的其它可药用活性剂。
根据本发明的一个方面，提供一种适用于治疗细胞增殖性病症(比如 癌症)的组合，其包括如上文定义的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体 和如上文定义的另外的抗肺瘤剂。
根据本发明的这一方面，提供一种用于联合治疗细胞增殖性病症(比 如癌症)的药物产品，其包括如上文定义的AZD1152的马来酸酯(盐) 共晶体和如上文定义的另外的抗肿瘤剂。
除了它们在治疗药物中的用途之外，AZD1152的马来酸酯(盐)共 晶体还可用作开发和标准化体外和体内试验系统中的药理学工具，所述 系统用于评价细胞周期活性抑制剂在实验动物如猫、狗、兔、猴、大鼠 和小鼠中的作用，这种评价是作为寻找新的治疗剂的 一部分。
A " :士'廿合仗AL / 口人4L 孤？ + 、、t ril ，,、/ 7 汰>^7^，1 t^M^么下卡 太
"^C升O 5'V叫7V -且'口、少一"N 、7/乂 'J*^、 z入-v甲'J T^r *tT 4111 丁 ， ^h、
文描述的本发明的替代或优选的实施方案同样适用。
本发明的马来酸酯(盐)共晶体抑制极光激酶特别是极光A激酶和 /或极光B激酶的丝氨酸-苏氨酸激酶活性，由此抑制细胞周期和细胞增 殖。抑制极光B激酶的化合物是特别令人感兴趣的。这些性质可以例如 使用下文给出的一种或多种方法评价。
(a)##*^ X ^^#翔试-發
该分析确定试验化合物抑制抑制丝氨酸-苏氨酸激酶活性的能力。编 码极光A的DNA可以通过全基因合成或克隆获得。然后，将此DNA 在合适的表达系统中表达，得到具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的多肽。在 极光A的情况下，通过聚合酶链反应(PCR)将编码序列从cDNA分离出， 克隆到杆状病毒表达载体pFastBac HTc(GibcoBRL/Life technologies)的 BamHl和Notl限制性核酸内切酶位点。5' PCR引物包含限制性核酸内 切酶BamHl 5对极光A编码序列的识别序列。这使得极光A基因插入到具有6个组氨酸残基、间隔区和由pfastbac HTc载体编码的rTEV 蛋白酶裂解位点的框架中。3， PCR引物用另外的编码序列代替极光A 终止密码子，所述另外的编码序列之后是终止密码子和限制性核酸内切 酶Notl的识别序列。该另外的编码序列(5' TAC CCA TAC GAT GTT CCAGATTACGCTTCTTAA3，)编码多肽序列YPYDVPDYAS。该序 列从流感血凝素蛋白获得，经常用作标记物表位序列，其可以使用特异 性单克隆抗体筌定。因此，重组pFastBac载体编码N-末端6 his标记的、 C末端流感血凝素表位标记的极光-A蛋白。装配重组DNA分子的具体 方法可以在标准i果本中找到，例如Sambrook等人1989, Molecular Cloning陽A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press和Ausubel等人1999, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc。
重组病毒的产生可以按照制造商GibcoBRL的方案进行。简而言之， 将携带极光A基因的pFastBac-1载体转移到包含杆状病毒基因组 (bacmid DNA)的E. coli DH10Bac细胞中，经由细胞移位活动，将包含庆 大霉素耐药基因和包括杆状病毒多角体蛋白启动子的极光A基因的 pFastBac载体的区域直接换位到bacmid DNA中。通过庆大霉素、卡那 霉素、四环素和X-gal选择，得到的白色集落应当包含编码极光A的重 组bacmid DNA。从一些BH10Bac白色集落的小规模培养物中提取出 Bacmid DNA,使用CellFECTIN试剂(GibcoBRL)按制造商的说明书转染 到在包含10%血清TC100培养基(GibcoBRL)中生长的Spodoptera fmgiperdaSf21细胞中。在转染72小时后，通过收集细胞培养物收获病 毒颗粒。用0.5 ml培养基感染100 ml包含1 x 1()7细胞/ml的Sf21s培养 基混悬液。感染48小时后，收获细胞培养基，使用标准斑块分析方法 测定病毒滴度。使用病毒母液以感染复数(M01)3感染Sf9和"High 5" 细月包以确定重组才及光A蛋白的表达。
为了大规模表达极光A激酶活性，将Sf21昆虫细胞在补充有10% 胎牛血清(Viralex)和0.2% F68 Pluronic(Sigma)的TC100培养基中在28 。C培养，在Wheaton滚动装置上以3 r.p.m滚动。当细胞密度达到1.2x106 细胞ml"后，将它们用斑块纯极光A重组病毒以感染复数1感染，并 在48小时后收获。所有随后的纯化步骤在4X:下进行。将包含总共2.0 X 108细胞的冷冻昆虫细胞小球解冻，用溶胞緩冲液(25 mM HEPES(N-[2-
18羟乙基]哌。秦-N， -[2-乙烷磺酸])在4。C下pH7.4、 100mMKCl、 25 mM NaF、 lmMNa3V04、 1 mM PMSF(苯基曱基磺酰氟)、2mM2-巯基乙醇， 2 mM咪唑、1 pg/ml抑肽酶、1 pg/ml胃酶抑素，1 pg/ml亮肽素)稀释， 使用1.0 ml每3xl0 细胞。使用dounce匀浆器进行溶胞，随后将溶胞 产物以41,000g离心35分钟。将吸出的上清液泵到包含500 pi Ni NTA(次氮基-三-乙酸)琼脂糖(Qiagen,产品编号30250)的直径5 mm的色 谱柱上，色谱柱已经用溶胞緩沖液平衡。在用12 ml的溶胞緩冲液洗涤 柱，接着用7 ml的洗涤緩沖液(25 mMHEPES,在4。C下pH7.4, 100 mM KC1、 20 mM咪唑、2 mM 2-巯基乙醇)洗涤后，达到洗脱液的UV吸收 基线水平。使用洗脱緩冲液(25 mM HEPES,在4。C下pH7.4, 100 mM KC1、 400 mM 。末哇、2 mM 2-巯基乙醇),人柱上洗脱出结合的才及光A蛋 白。收集对应于UV吸收峰的洗脱级分(2.5 ml)。将包含活性极光A激 酶的洗脱级分用透析缓冲液(25 mMHEPES在4。C下pH7.4, 45%甘油 (v/v)、 100mMKCl、 0.25% Nomdet P40(v/v)、 1 mM 二硫苏糖醇)充分透 析。
将每批新的极光A酶通过用酶稀释剂(25mM Tris-HCl pH7.5、 12.5mMKCl、 0.6mM DTT)稀释进行滴定分析。对于典型的批次(其可以 从Upstate获得)，将母液酶用酶稀释剂以lpl每ml稀释，各个分析孔使 用20jul的稀释酶。将试验化合物(在二甲亚砜(DMSO)中10mM)用水稀 释，将10nl稀释的化合物转移到分析板的各孔中。"完全"和"空白" 对照孔包含2.5%的DMSO而不是化合物。除了"空白"孔外，将二十微 升新鲜稀释的酶加入到所有孔中。将二十微升的酶稀释剂加入到"空白，， 孔中。然后将包含0.2|uCi [ 3p]ATP(Amersham Pharmacia,比活性 三2500Ci/mmol)的二十微升的反应混合物(25mM Tris-HCl, 12.7mM KC1， 2.5mM NaF, 0.6mM 二為t苏糖醇，6.25mM MnCl2, 7.5mM ATP, 6.25jaM 肽底物 [biotin画LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG])加入到所 有的试验孔中开始反应。将板在室温下培养60分钟。为了停止反应， 向所有孔中加入100 ju 1 20%v/v正磷酸。用96-孔板收集器(TomTek)将肽 底物捕获在带正电荷的硝基纤维素P30过滤垫(filtermat) (Whatman) 上，然后用P板计数器分析"P的结合。"空白"(没有酶)和"完全"(没 有化合物)对照值用于测定试验化合物抑制50。/。酶活性(IC50值)的稀释 范围。(b)雄斧焱^ 3^瘅#教试發
T该分析确定试验化合物抑制丝氨酸-苏氨酸激酶活性的能力。编码
极光B的DNA可以通过全基因合成或克隆获得。然后，将此DNA在 合适的表达系统中表达，得到具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的多肽。在极 光B的情况下，通过聚合酶链反应(PCR)从cDNA分离编码序列，以与 上述对极光A类似的方式克隆到pFastBac系统中(即直冲妻表达6-组氨酸 标记的极光B蛋白)。
为了大规模表达极光B激酶活性，将Sf21昆虫细胞在补充有10% 胎牛血清(VirBlex)和0.2% F68 Pluromc(SigmB)的TC100培养基中在28 。C培养，在WheBton滚动装置上以3 r.p.m滚动。当细胞密度达到1.2x106 细胞ml"时，将它们用斑块纯极光B重组病毒以感染复数1感染，并 在48小时后收获。所有随后的纯化步骤在4。C下进行。将包含总共2.0 x 108细胞的冷冻昆虫细胞小球解冻，用溶胞緩沖液(50 mM HEPES(N-[2-羟乙基]哌。秦-N， -[2-乙烷磺酸])在4。C下pH7.5、 1 mM Na3V04、 1 mMPMSF(苯基甲基磺酰氟)、1 mM 二硫苏糖醇、1吗/ml抑 肽酶、1 pg/ml胃酶抑素、1貼/ml亮肽素)稀释，使用1.0 ml每2 x 107 个细胞。使用超声匀浆器进行溶胞，随后将溶胞产物以41,000g离心35 分钟。将吸出的上清液泵到包含1.0 ml CM琼脂糖Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)的5 mm直径的色镨柱上，色i普柱已经用溶胞緩冲液 平衡。在用12 ml的緩沖液洗涤柱后，接着用7 ml的洗涤緩沖液(50 mM HEPES,在4°C下pH7.4, 1 mM 二硫苏糖醇)洗涤柱后，洗脱液的UV吸 收达到基线水平。使用梯度洗脱緩沖液(50 mM HEPES,在4。C下pH7.4, 0.6MNaCl、 lmM二硫苏糖醇，从0%洗脱緩冲液至100%洗脱緩冲液， 经15分钟，流速0.5 ml/分钟)从柱中洗脱出结合的极光B蛋白。收集对 应于UV吸收峰的洗脱级分(l.O ml)。将洗脱级分用透析緩沖液(25 mM HEPES在4。C下pH7.4、 45%甘油(v/v)、 100 mM KC1、 0.05%(v/v)IGEPAL CA630(Sigma Aldrich)、 1 mM 二硫苏糖醇)充分地透析。分析透析级分 的极光B激酶活性。
通过在50mMTris-HClpH7.5、 O.lmMEGTA、 0.1%2-巯基乙醇、 0.1 mM vandate钠、10 mM乙酸镁、含有0.1 mg/ml GST-INCENP [826-919] 的O.l mMATP中在30。C活化极光B(5mM)30分钟制备极光B-INCENP酶(如Upstate提供的)。
将每批新的极光B-INCENP酶通过用酶稀释剂(2SmM Tris-HCl pH7.5、 12.5mMKCl、 0.6mM DTT)稀释进行滴定分析。对于典型的批次， 将母液酶用酶稀释剂以15jul/ml稀释，每个分析孔使用20jLU稀释的酶。 用水稀释试验化合物(在二甲亚砜(DMSO)中10mM),将10jul稀释的化 合物转移到分析板的孔中。"完全"和"空白"对照孔包含2.5。/。DMSO 而不是化合物。除了 "空白"孔外，将二十微升新鲜稀释的酶加入到所 有孔中。将二十微升的酶稀释剂加入到"空白"孔中。然后，将包含0.2pCi [ 3p]ATP(Amersham Pharmacia,比活性^2500Ci/mmol)的二十微升的 反应混合物(25mM Tris-HCl, 12.7mM KC1, 2.5mM NaF, 0.6mM 二硫苏 糖醇，6.25mM MnCl2, 15mM ATP, 6.25|uM 肽底物 [biotin-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG])加入到所有的试验 孔中开始反应。将板在室温下培养60分钟。为了终止反应，向所有孔 中加入100 jul 20% v/v正磷酸。使用96-孔板收集器(TomTek)将肽底物 捕获在带正电荷的硝基纤维素P30过滤垫(Whatman)上，&然后用P板 计算器分析"P的结合。"空白"(没有酶)和"完全"(没有化合物)对照
值用于测定试验化合物抑制50。/。酶活性(IC50值)的稀释范围。
(c) #斧勿應袭f和i凝4f凝^为V,
化合物典型地导致磷组蛋白(phosphohistone ) H3水平抑制和细胞核面 积增力口。
将每孔1(^SW620细胞置于在costar 96孔板中的100)ulDMEM培 养基(包含10 % FCS和1 。/。谷氨酰胺)(DMEM为Dulbecco's Modified Eagle's Medium(SigmaD6546))中，在37°C和5% C02下放置过夜至粘 附。然后，给细胞给药在培养基中稀释的化合物(向每孔中加入50jul以 得到0.00015 ju-ljuM浓度的化合物)，在用化合物处理24小时后，固定 细胞。
首先使用光学显微镜检查细胞，纪录细胞的任何形态学变化。然后， 向每孔中加入100jul的3.7%甲醛，将板在室温下放置至少30分钟。在 纸巾上倾析和轻敲板除去固定液，然后使用自动板洗涤器将板在 PBS(Dulbecco' s磷酸盐緩冲盐水(Sigma D8537))中洗涤一次。加入100H 1的PBS和0.5 % triton X-100,将板放在混合器上5分钟。将板在100 julPBS中洗涤，将溶液倒干净(tipped off)。加入在PBS 1% BSA(牛 血清白蛋白和0.5 %吐温中的50 jul初级抗体、1:500兔子抗石舞组蛋白H3。 抗磷组蛋白H3兔多克隆06-750购自Upstate Biotechnology"将板在室 温下在混合器中放置 一 小时。
笫二天，将抗体倒干净，将板用PBS洗涤两次。在单位面积中，加 入在PBS 1 % BSA、 0.5 %吐温中的50iul二级抗体、1:10,000 Hoechst 和1:200 Alexa Fluor 488山羊抗兔子IgGA(货号11008的分子探针)。将 该板包裹在锡箔中，并在室温下振摇1小时。将抗体倒干净，用PBS洗 涤板两次。向每孔中加入200 ia 1的PBS，将该板振摇10分钟，除去PBS。 向每孔中加入lOO)ul的PBS,并将板密封以备分析。使用Arrayscan Target Activation算法进行分析，以测定磷組蛋白H3的细胞水平和核面 积变化。结果报道为得到磷组蛋白H3水平50%抑制和类似地细胞核面 积增加50。/。所需的有效浓度(EC50值)。
除非另有说明，本发明利用非限制性实例、数据和附图在本文中进 行阐述，其中-
(i) 给出的产率仅用于阐述，其不一定是可得到的最大值；
(ii) 其中用于晶种的产品可以通过现有已知的方法获得，比如在 WO 2004/058781中描述的那些；
(iii) 如本文描述的制备的AZD1152马来酸酯(盐)共晶体的鉴定是 通过在六氘代二甲亚砜中在400 MHz的1H NMR确认，加入四甲基硅 烷(TMS)用作参考(TMS二O.OO ppm)。
如本文描述的AZD1152和AZD1152 HQPA公开在WO 2004/058781 中。将在WO2004/058781中提供的关于AZD1152、 AZD1152HQPA和 制备所述化合物中的所有中间体的详细制备过程以其全部《1入本文作 为参考。
制备方法1
步骤1: 7-(3-羟丙氧基)喹唑啉-4-OHV酮的制备
将2-氨基-4-氟苯甲酸和l,3-丙二醇一起搅拌，并加热至120。C。加入 乙酸曱脒，并搅拌该混合物3.5小时，得到7-氟喹唑啉-4-酮。然后，经2 小时50分钟，将氬氧化钾在l,3-丙二醇中的溶液加入该混合物中，接着
22将其冷却至15。C。此后，加热该混合物至125。C5小时，然后冷却至75。C。 将稀盐酸(约6。/。w/w)逐渐加入到反应混合物中，直到获得pH4.5。经6小 时将该混合物冷却至(TC，并再保持在该温度一'J、时，接着通过离心分 离粗产物。用水洗涤粗产物，并在真空中干燥，之后将其溶于甲醇中， 轻度回流，并在42。C的温度和减压下部分浓缩。然后，经3小时，将该 溶液冷却至(TC,并通过过滤分离最终产品，接着在真空中干燥。回收 7-(3-羟丙氧基)会唑啉-4(3H)-酮，产率73%。
H-NMR(DMSO d6): U.90(br s, 1H), 8.04(s, 1H), 8.00(d, 1H), 7.10(m， 2H), 4.17(t, 2H), 3.58(t, 2H), 1.92(m, 2H): MS(+ve ESI): 221(M+H)+
步骤2: 4-氯-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉的制备
将7-(3-羟丙氪基)会唑啉-4(3H)-酮、甲苯和N,N-二异丙基-曱酰胺 (DIPF)混合在一起，并加热至76。C,之后，在76。C下，经l小时加入亚石克 酰氯。然后，经l小时加入另外的亚硫酰氯，之后，将其温度保持在76 。C l小时。回流该混合物ll小时，得到澄清溶液，将其冷却至38。C,并 经受真空蒸馏除去甲苯和亚硫酰氯。然后，加入甲苯，将该溶液保持在 35°C,同时将其用助滤剂(硅藻土或珍珠岩助滤剂和活性碳)净化。部分 浓缩得到的溶液，之后加入庚烷，并骤冷该混合物至0。C和搅拌23小时。 通过过滤分离形成的浅椋色混悬液，用冷的庚烷洗涤，然后在真空和30 。C下干燥，得到4-氯-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉(63.6%)。 !H-NMR(DMSO d6): 13.25(br s, 1H), 8.34(s, 1H), 8.06(d, 1H), 7.17(m, 2H), 4.21(t, 2H), 3.83(t, 2H), 2.23(m, 2H): MS(+ve ESI): 257, 259(M+H)+。
歩骤3: (3-U7-(3-氯丙氧基)喹唑啉-4-基l氨基VlH-吡唑-5-基〗乙酸的制备 将4-氯-7-(3-氯丙氧基)喹唑啉加入到1摩尔当量的(3-氨基-lH-吡唑 -S-基)乙酸在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的溶液中，然后静置U小时的时 间。观察用或不用晶种和加入或不加入作为抗溶剂的乙腈下产物的结 晶。通过过滤分离得到的固体，用N-甲基吡咯烷酮和乙腈洗涤，然后在 真空中干燥，得到呈灰白色固体的(3-{[7-(3-氯丙氧基)喹唑啉-4-基]氨 基^lH-吡唑刁-基)乙酸盐酸盐^-NMR(DMSO d6;含有NMP作为溶剂化物)8.92(s, 1H), 8.8(d, 1H), 7.46(pr of d, IH), 7.38(d， IH), 6.7(s, IH), 4.32(t, 2H), 3.85(t, 2H), 3.73(s, 2H), 3.3(t, 2H), 2.7(s, 3H), 2.51(m, 6H), 2.27(m, 2H), 2.18(t, 2H), 1.93(m, 2H).
MS(+ve ESI): 362.1015(M+H)+。
步骤4: 2-(34「7-(3-氯丙氧基)喹唑啉-4-基l氨基^m-吡唑-5-基)-N-(3-氟
苯基)乙酰胺的制备
将4-二曱基氨基吡啶(DMAP)、 N-曱基吗啉和3-氟苯胺(大的过量) 加入到(3-{[7-(3-氯丙氧基)会唑啉-4-基]氨基)-lH-吡唑-5-基)乙酸盐酸盐 在N,N-二曱基乙酰胺(DMA)中的混悬液中，在室温或低于室温下搅拌得 到的浆液。然后，经8小时，以控制的方式加入之前l-乙基-3-(3-二曱基 氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI.HC1)溶于水中的溶液，以便保持反应在 环境温度下。用少量产物种晶该混合物，保持搅拌几小时。还首先加入 抗溶剂乙腈，接着加入水以沉淀更多的产物。通过过滤分离物质，用
N,N-二曱基乙酰胺水乙腈的混合物、温的乙腈洗涤该滤饼，然后干
燥(在真空中或在氮气流下)，得到2-(3-{[7-(3-氯丙氧基)喹唑啉-4-基]氨 基} -1 H-吡唑刁-基)-N-(3-氟苯基)乙酰胺。
iH-丽R(DMSO d6;含有残留的DMA): 10.4(s， 1H), 8.9(s, IH), 8.8(d, IH): 7.59(pr of m， IH), 7.46(pr of d, IH), 7.33(m, 2H), 7.29(d, IH), 6.85(m， IH)， 6.75(s, IH), 4.35(t, 2H), 3.85(t, 4H), 2.95(s), 2.83(s), 2.56(s), 2.25(m, 2H), 1.95(s):
MS(+ve ESI): 455(M+H)+
步骤5: 243-「(743-「乙基(2-羟乙基)氨基l丙氧基卜喹唑啉-4-基)氨基l-lH-吡唑-5-基VN-(3-氟苯基)乙酰胺(AZD1152 HQPA)的制备
在惰性气氛(比如氮气提供的)下，将2-(3-{[7-(3-氯丙氧基)喹唑 啉-4-基]氨基〉-lH-吡唑-5-基)-N-(3-氟苯基)乙酰胺和2-(乙氨基)乙醇(12 摩尔当量)力。入到N,N-二甲基乙酰胺中，搅拌加热该混合物至90°C。在 12小时后，以控制的方式加入水，并趁热用产物种晶该批料。将该混合 物以仔细控制的方式冷却至2(TC,结晶出所需晶型的产物。然后，过滤 产物并用水/ N,N-二曱基乙酰胺的混合物和乙腈洗涤。此后，用温的乙
24腈(4(TC)使该滤饼形成浆液一段时间，过滤，再次用乙腈洗涤，然后干
燥(在真空中或在氮气流下)，得到呈灰白色固体的无水2-{3-[(7-{3-[乙基 (2-羟乙基)氨基]丙氧基p奎唑啉-4-基)氨基]-lH-吡唑-5-基卜N-(3-氟苯基)
乙酰胺，收率~90%。
丄H-画R(DMSO d6): 10.55(s, 1H), 9.45(br s, 1H), 8.98(s, 1H), 8.8(d, 1H), 7.63(pr of m, 1H), 7.47(pr of d, 1H)， 7.37(m, 2H), 7.32(d, 1H), 6.9(m, 1H), 6.77(s, 1H), 4.32(t, 2H), 3.83(br s, 2H), 3.76(t, 2H), 3.35(m， 2H), 3.25(m, 4H), 2.25(m, 2H), 1.25(t, 3H): MS(+ve ESI): 508.4(M+H)+
步骤6-单r叔丁基)2-r「3-g4-『r5j2-「〖3-氟苯基)氨基1-2-氧代乙基卜m-吡
唑-3-基)氨基1-喹唑啉-7-基}氧基)丙基1(乙基)氨基1乙基磷酸酯 fAZD1152 t-Bu P(5)酯l的制备
在N,N-二甲基乙酰胺中混合2-{3-[(7-{3-[乙基(2-羟乙基)氨基]丙氧 基卜喹唑啉—4-基)氨基]-lH-吡唑-5-基)-N-(3-氟苯基)乙酰胺和吡啶盐酸 盐，将该溶液骤冷至-15。C 。然后，加入二叔丁基二乙基亚磷酸酯 (diethylphosphoramidite)(1.5-2.1摩尔当量)，同时保持该温度。在原位 用30% w/w过氧化氢(约4.2摩尔当量)处理反应混合物，同时保持温度 低于环境温度。通过加入偏亚石克酸氢钠(10% w/v水溶液)破坏剩余过氧 化氢，同时保持温度低于40°C。然后，将得到的二-叔丁基 2-[[3-((4-[(5-(2-[(3-氟苯基)氨基]-2-氧代乙基HH-p比唑-3-基)氨基]-喹唑 啉-7-基}氧基)丙基](乙基)氨基]乙基磷酸酯的溶液加热至40。C,并加入 氢氧化钠溶液(2M)调节pH 5-6.5。保持温度和pH约90分钟的时间，同 时种晶。然后，加入水，并进一步调节pH至pH8-9的范围以使回收最 佳化。直接过滤该温的反应混合物，得到单-叔丁基2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-氟苯基)氨基]-^氧代乙基)-lH-吡唑-3-基)氨基]喹唑啉-:7-基)氧基)丙 基](乙基)氨基]乙基磷酸酯，将其用N，N-二曱基乙酰胺/水的混合物和 水洗涤，最后干燥(在真空中或合适的惰性气流中)，得到呈灰白色固体 的单(叔丁基)2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1&吡唑-3-基)氨基]喹唑啉-7-基}氧基)丙基](乙基)氨基]乙基磷酸酯，产率86-93%。 力-画R(DMSO d6): 10.48(s, 1H), 9.75(br s, 1H), 8.98(s, 1H), 8.85(d, 1H), 7.67(pr of m, 1H), 7.48(pr of d, 1H), 7.37(m, 2H), 7.3(d, 1H), 6.87(m, 1H),6.83(s, 1H), 4.34(t, 2H), 4.28(m, 2H), 3.88(s, 2H), 3.53(m, 2H)， 3.43(m, 2H) 3.33(m, 2H)， 2.3(m， 2H), 1.47(s, 9H), l'32(t, 3H): MS(+ve ESI):(M+H)+ 644.2761碎片(较少丁基)588.2147。
步骤7: 24乙基「3-({4-「(5-{2-「〖3-氟苯基)氨基1-2-氧代乙基}-111-吡唑-3-基)氨基l喹唑啉-7-基l氧基)丙基l氨基l乙基二氢磷酸酯(AZD1152)的制 备
将单(叔丁基)2-[[3-((4-[(5-(2-[(3-氟苯基)氨基]-2-氧代乙基〉-lH-吡 唑-3-基)氨基]-喹唑啉-7-基}氧基)丙基](乙基)氨基]乙基磷酸酯悬浮在 水/四氢呋喃(THF)的1:1混合物中，并在高温(优选50-60。C)下用1.5至 3.0摩尔当量的过量盐酸处理约1小时。然后，使用2.0M氪氧化钠碱化 该热溶液至pH 4.5-5.5,冷却至60。C并种晶。将水以控制的方式加入到 浆液中，控制冷却结晶混合物至室温，并通过过滤分离产物。用水洗涤 滤饼，在真空中干燥。干燥后，在环境温度下平衡固体2-{乙基 [3-(H-[(5-口-[(3-氟苯基)氨基]-2-氧代乙基》-lH-吡唑-3-基)氨基]喹唑啉 -7-基}氧基)丙基]氨基}乙基二氲磷酸酯至恒重得到水合物形式，为呈浅 黄色针状物质。 ^-画R(DMSO d6): MS(+ve ESI): 587.8(M+H)+
H-顧R(DMSO d6): 10.53(s, 1H), 8.57(s, 1H), 8.54(d， 1H), 7.62(d, 1H), 7.37(m, 2H), 7.27(s, 1H), 7.21(d, IH), 6.88(m, IH), 6.65(s, 1H), 4.27(t, 2H), 4.05(m, 2H), 3.75(s, 2H), 3.24(m, 2H), 3.21(t, 2H)， 3.13(q, 2H), 2.18(m, 2H)， 1.24(t, 3H): MS(+ve ESI): 588(M+H)+.
C26H31FN7O6P + 3,0H2O理论值C, 48.7%; H, 5.8%; N, 15.3%;实测值C 48.8%; H, 5.35%; N, 15.15%.
歩骤8: 24乙基「3-({4-「(542-「(3-氟苯基)氨基卜2-氧代乙基llH-吡唑-3-基)氨基1喹唑啉-7-基}氣基)丙基1氨基}乙基二氬磷酸酯马来酸酯(盐) 「AZD1152马来酸酯(盐)l的制备
将2-丁烯二酸(Z)(1.57摩尔当量；449.80 ju moles; 52.21 mg)溶于曱 醇(123.54 mmoles; 5.00 ml; 3.96 g)中，向该溶液中加入之前制备的AZD1152的甲醇化溶液(呈游离形式的三水合物-1.00摩尔当量，286.14 la moles; 40.00 mL; 31.87 g)，接着再加入曱醇(123.54 mmoles; 5.00 mL; 3.96 g)。在室温下持续搅拌该混合物过夜。生成白色混悬液，通过 过滤回收固体，然后在真空中干燥。用NMR分析证实该共晶体为马来酸 酯(盐)。
步骤8的可替代的方法
将粗AZD1152(估计在7.44g(^— 100%, 11.61 millimoles)加入到二甲 亚砜(36ml)中，在环境下静置产生浅褐色溶液。向该溶液中加入马来酸 (1.76g, 15.16 millimoles, 1.31摩尔当量)在甲醇(36ml)中的溶液，将该 混合物静置在环境温度下过夜。第二天，将澄清溶液的等分试样转移到 小瓶中，刻痕并密封几小时。形成白色固体沉积物，将其转移到烧瓶中 并持续搅拌。逐渐地，该溶液变得浑浊，沉淀出固体。将该浆液静置并 沉降几天，最后过滤。用二甲亚砜/曱醇(总共15ml)的l:l混合物洗涤该滤 饼，用曱醇(3 x 25ml)使其原位形成浆液，然后在真空中干燥。NMR证 实该固体是AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体(产率约78.7%)。
制备方法2
步骤1: 2-(3-U7-(3-氯丙氧基)喹唑啉-4-基l氨基VlH-吡唑-5-基)-N-(3-氟
苯基)乙酰胺的制备
向(3-([7-(3-氯丙氧基)喹唑啉-4-基]氨基卜lH-吡唑-5-基)乙酸盐酸盐 (如在上述制备方法1中所述制备的)在N,N-二曱基乙酰胺(DMA)中的混 悬液中加入4-二曱基氨基吡啶(DMAP)，同时保持温度在15-25。C(理想 的是15。C),接着加入N-甲基吗啉，同时仍保持该温度。以保持温度低 于25。C的速率加入3-氟苯胺(大的过量，理论上为10-15摩尔当量)。同 时，将l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI.HCl)溶于水 中，得到约42。/。w/v的溶液(在该方法中，水存在的量对后来结晶的结果 4艮重要)。经8小时，将该溶液以控制的方式加入浆液，以便保持反应在 20-25°C;然后，用优选形式的产物的的晶体(理论上，用量为预期量的 约1%)种晶该混合物。搅拌该混合物约16小时，同时保持该温度(理想 的是20-25°C),然后以控制的方式首先加入乙腈，接着加入水，并保 持该温度在20-25。C,之后再延长搅拌约21小时；这将使产物的回收和形成最佳化。通过过滤分离物质，用N,N-二曱基乙酰胺水乙腈的混 合物(体积比5 : 3 : 2)、乙腈洗涤该滤饼，然后干燥(在真空中或在氮气
流下)，得到包含一些DMA的2-(3-{[7-(3-氯丙氧基)喹唑啉-4-基]氨 基〉-lH-吡唑-S基)-N-0氟苯基)乙酰胺，产率约76-78%。 iH-NMR(DMSO d6;含有残留的DMA): 10.4(s, 1H), 8.9(s, 1H), 8.8(d， 1H), 7.59(pr of m, 1H), 7.46(pr of d, 1H), 7.33(m, 2H), 7.29(d, 1H), 6.85(m, 1H), 6.75(s, 1H), 4.35(t, 2H), 3.85(t, 4H), 2.95(s), 2.83(s), 2.56(s), 2.25(m, 2H), 1.95(s):
MS(+ve ESI): 455(M+H)+
步骤2: (2-{3-「(743-「乙基(2-羟乙基)氨基l丙氧基卜喹唑啉-4-基)氨 基l-lH-吡唑-5-基卜N-(3-氟苯基)乙酰胺(AZDU52 HQPA)的制备
在惰性气氛(比如氮气提供的)下，将2-(3-{[7-(3-氯丙氧基)喹唑 啉—4-基]氨基)-lH-吡唑-S-基)-N-(3-氟苯基)乙酰胺和2-(乙氨基)乙醇(理 论上12摩尔当量)加入到N,N-二曱基乙酰胺中，搅拌加热该混合物至90 。C。在12-16小时(理想的是12小时)之后，将该反应冷却回到约85°C， 并以控制的方式加入水以保持温度在80-85°C。将该批料调节至80°C, 并用产物优选形式的晶体(理论上，用量为预期量的约1%)种晶。经约 20小时的时间，将该混合物以仔细控制的方式冷却至20°C,以便以所 需晶型和足够获得良好过滤速度的尺寸结晶该产物。然后，过滤该产物， 并用水/ N,N-二曱基乙酰胺的混合物和乙腈洗涤，适当地脱溶剂 (deliquored),得到水合形式的产物。此后，用温的乙腈(理想的是， 在40。C的温度下)使该滤饼原位形成浆液一段时间(理想的是2小时)，接 着过滤，再用乙腈洗涤，然后干燥(在真空中或在氮气流下)，得到呈灰 白色固体的几乎无水的2-{3-[(7-{3-[乙基(2-羟乙基)氨基]丙氧基}-喹唑 啉-4-基)氨基]-lH-吡唑-5-基)-N-(3-氟苯基)乙酰胺，收率85-90%。 iH画N匿(DMSO d6): 10.55(s, 1H), 9.45(br s, 1H), 8.98(s, 1H), 8.8(d, 1H), 7.63(pr of m, 1H), 7.47(pr of d, 1H), 7.37(m, 2H), 7.32(d, 1H), 6.9(m, 1H), 6.77(s, 1H), 4.32(t, 2H), 3.83(br s, 2H), 3.76(t， 2H), 3.35(m, 2H), 3.25(m, 4H)， 2.25(m, 2H), 1.25(t, 3H): MS(+ve ESI): 508.4(M+H)+
28步骤3:单(叔丁基)2-「「3-(M-「(542-IY3-氟苯基)氨基l-2-氧代乙基卜lH-吡 唑-3-基)氨基1-喹唑啉-7-基}氧基)丙基1(乙基)氨基1乙基磷酸酯 fAZDl 152 t-Bu P(5)酯l的制备
经一段持续时间(理论上3小时)，向吡啶盐酸盐在N,N-二甲基乙酰胺 的浆液中装料2-{3-[(7-{3-[乙基(2-羟乙基)氨基]丙氧基}-喹唑啉-4-基)氨 基]-lH-吡唑刁-基卜N-(孓氟苯基)乙酰胺和二叔丁基二乙基亚磷酸酯(理 论上l摩尔当量)在N，N-二曱基乙酰胺中的溶液，保持该温度在-20至-10 。C(理论上-15。C)。接着，经l小时的时间，进一步加入二叔丁基二乙基 亚磷酸酯(理论上0.5摩尔当量)，同时保持温度在J0至-10。C(理论上-15 。C)。
用30% w/w过氧化氲(约4.2摩尔当量)原位处理该反应混合物，同时 使温度保持低于-10。C(理论上-12至-8。C),并保持在该温度一段时期 (理想的是，16小时)。通过加入偏亚硫酸氢钠(10% w/v水溶液)破坏剩余 过氧化氢，同时保持温度低于4(TC 。
然后，将得到的二-叔丁基2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-氟苯基)氨基]-2-氧代 乙基)-lH-吡唑-3-基)氨基]-喹唑啉-7-基)氧基)丙基](乙基)氨基]磷酸三乙 酯的溶液加热至40°C,并加入氩氧化钠溶液(理-沦上2M)调节pH 5.5-6.5(理想的是pH 6)，用适当的结晶物质种晶。通过加入另外的氬氧 化钠溶液至少2小时的时期来保持温度和维持pH5-6。然后，装料水， 再调节pH至pH 8-9(理想的是pH 8.8)的范围，同时保持温度(理想的是 40°C,但在35-45。C的范围内)16小时的时间，以便使回收最佳化。直接 过滤该温的反应混合物，得到单-叔丁基2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-氟苯基)氨 基]-2-氧代乙基)-lH-他唑-3-基)氨基]喹唑啉-7-基)氧基)丙基](乙基)氨基] 乙基磷酸酯，将其用水洗涤几次，最后干燥(在真空中或合适的惰性气流 中)，得到呈灰白色固体的单(叔丁基)2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-lH-吡唑-3-基)氨基]喹唑啉-7-基}氧基)丙基](乙基)氨基] 乙 基磷酸酯，产率86-93%。
!H-NMR(DMSO d6): 10.48(s, 1H), 9.75(br s, 1H), 8.98(s, 1H), 8.85(d, 1H), 7.67(pr of m, 1H), 7.48(pr of d, 1H), 7.37(m, 2H), 7.3(d, 1H), 6.87(m, 1H), 6.83(s, 1H), 4.34(t, 2H), 4.28(m, 2H), 3.88(s, 2H), 3.53(m, 2H), 3.43(m, 2H), 3.33(m, 2H), 2.3(m, 2H), 1.47(s, 9H), 1.32(t, 3H): MS(+veESI):(M+H)+644.2761碎片(较少丁基)588.2147.
29步骤4: 24乙基「3-(M-r(5-f2-r(3-氟苯基)氨基l-2-氧代乙基VlH-吡唑-3-
基)氨基l喹唑啉-7-基l氧基)丙基l氨基)乙基二氳磷酸酯(AZD1152)的制
昼
将单(叔丁基)2-[[3-((4-[(5-(2-[(3-氟苯基)氨基]-2-氧代乙基)-lH-吡 唑-3-基)氨基]-喹唑啉-7-基}氧基)丙基](乙基)氨基]乙基磷酸酯悬浮在 水/四氲咬喃(THF)混合物中，用1.5和3.0摩尔当量的过量盐酸(理论上， 浓度为2M和包含1.5摩尔当量)处理。将该混合物加热至55-65。C(理想 的是6(TC),保持在60'C下约1小时。使用氬氧化钠(优选2M浓度和包 含1.7摩尔当量>5咸化该热溶液，得到pH为范围pH 5.0-5.5,然后，在 55-65。C(理想的是6(TC)下用产物优选形式的晶体种晶(理论上，用量为 预期量的约0.05% w/w)。在该温度下搅拌该混合物至少一小时，之后加 入水，经约12小时搅拌该浆液并以控制的方式冷却，接着在环境温度 下搅拌至少4小时，然后通过过滤分离产物。首先用水，接着用THF 连续洗涤滤饼，在真空中干燥或者使用增湿方法，在增湿方法中使水蒸 汽弄湿的惰性气体经过固体，直到获得恒重。在真空中干燥后，在环境 温度下平衡固体2-{乙基[3-({4-[(5-{2-[(3-氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1& 吡唑-3-基)氨基]喹唑啉-7-基}氧基)丙基]氨基}乙基二氬磷酸酯至恒重， 得到水合形式，呈浅黄色针状物质。得到产物的产率为约81%。 H画丽R(DMSO d6): MS(+ve ESI): 587.8(M+H)十
^-丽R(DMSO d6): 10.53(s, 1H), 8.57(s, 1H), 8.54(d, 1H), 7.62(d, 1H), 7.37(m, 2H), 7.27(s, 1H), 7.21(d, 1H), 6.88(m， 1H), 6.65(s, 1H), 4.27(t, 2H), 4.05(m, 2H), 3.75(s, 2H), 3.24(m， 2H), 3.21(t， 2H), 3.13(q， 2H), 2.18(m, 2H), 1.24(t, 3H): MS(+ve ESI): 588(M+H)+
C26H31FN706P + 3.0 H20理论值C， 48.7%; H, 5.8%; N, 15.3%;实测值 C, 48.8%; H, 5.35%; N, 15.15%.步骤5: 2-{乙基「3-(M-「〖542-「(3-氟苯基)氨基l-2-氧代乙基VlH-吡唑-3-
基)氨基1喹唑啉-7-基}氧基)丙基1氨基}乙基二氢磷酸酯马来酸酯(盐) 『AZDU52马来酸酯(盐)l的制备
将2-丁烯二酸(Z)(1.57摩尔当量；449.80 ju moles; 52.21 mg)溶于曱 醇(123.54 mmoles; 5.00 ml; 3.96 g)中，向该溶液中加入之前制备的 AZD1152的甲醇化溶液(游离形式的三水合物-1.00摩尔当量，286.14p moles; 40.00 mL; 31.87 g),接着再加入曱醇(123.54 mmoles; 5.00 mL; 3.96 g)。在室温下持续搅拌该混合物过夜。生成白色混悬液，通过 过滤回收固体，然后在真空中干燥。用NMR分析证实该共晶体为 AZD1152的马来酸酯(盐)。
上述步骤5的可替代的方法
将粗AZD1152(估计在7.44g(^— 100%, 11.61 millimoles)加入到二曱 亚砜(36ml)中，在环境下静置，产生浅褐色溶液。向该溶液中加入马来 酸(1.76g, 15.16 millimoles, 1.31摩尔当量)在甲醇(36ml)中的溶液，将 该混合物静置在环境温度下过夜。第二天，将澄清溶液的等分试样转移 到小瓶中，刻痕并密封几小时。形成白色固体沉积物，将其转移到烧瓶 中并持续搅拌。逐渐地，该溶液变得浑浊，沉淀出固体。将该浆液静置 并沉降几天，最后过滤。用二甲亚砜/甲醇(总共15ml)的l:l混合物洗涤该 滤饼，用曱醇(3 x 25ml)使其原位形成浆液，然后在真空中干燥。NMR 分析证实该共晶体是AZD1152的马来酸酯(盐)(产率约78.7%)。
上述步骤5的另一种可替代的方法
将AZD1152(游离形式的三水合物-1.00摩尔当量，8.51mmoles; 5.74 g)和2-丁烯二酸(Z)(1.20摩尔当量；10.2 mmoles; 1.19 g)溶于二甲亚石风 (35ml)中，并加热到60。C。将抗溶剂乙腈(20ml)加入到该热的混合物中， 然后用产物AZD1152马来酸酯(盐)优选形式的晶体(0.005摩尔当量； 42.6微摩尔；30.7mg-理论上，用量为预期量的约0.5% w/w)种晶该混合 物。将该反应混合物保持在60。C4小时，之后经3小时的时间加入另外的 乙腈(40ml)。在60。C下持续搅拌12-20小时(理论上16小时)。以控制的方 式冷却该反应至20。C,通过过滤分离产物。首先用二曱亚砜/乙腈(1 : 2体积比)的混合物洗涤该滤饼，接着用乙腈洗涤。在真空中或在温的惰性
气体的气流(理论上40。C)下干燥该固体，得到呈白色固体的AZD1152马 来酸酯(盐)，产率约88%。
图l : AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体(通过上述方法l制备的)的 X射线粉末衍射图-2 6值绘制在横轴上，相对谱线强度(计数)绘制在纵轴上。
图2 :根据上述方法1制备的AZD1152马来酸酯(盐)共晶体的差示 扫描热分析图。
图3 :根据上述方法2制备的AZD1152马来酸酯(盐)共晶体的差示 扫描热分析图。
图4 : 一批根据上述方法1制备的AZD1152马来酸酯(盐)共晶体的 动态蒸汽吸附等温曲线图。
图5 : —批根据上述方法2制备的AZD2252马来酸酯(盐)共晶体的 动态蒸汽吸附等温曲线图。
图6 : AZD1152游离形式的动态蒸汽吸附等温曲线图。
图7: AZD1152(通过上述方法2制备的)的马来酸酯(盐)共晶体的 X射线粉末衍射图一2 6值绘制在横轴上，相对谱线强度(计数)绘制在 纵轴上。
特征数据 核磁共振光谱
用质子NMR光谱可以证实在所述共晶体中组分的结构和近似比 例。典型的数据显示如下。.
3235
化学位移/ppm化学位移/ppm原子原子
1NR27NR
27.63(m)284.32(2H t, 5.8)
3NR292.25(m)
46.89(m)303.37(m)
7.33(m)31NR
67.37(m)323.48(m)
7NR334.22(m)
89.76*(s,宽)343.30(2H q, 7.1)
9NR351.28(3Ht, 7.1)
10NR36NR
116.77(s)37NR
12NR38NR
133.85(s)39NR
14NR40NR
1510.51(s)41NR
1611.99*(s,宽)42".O(s,宽)
177.48(dd, 9.1,2.4)4314.0(s,宽)
18NR446.28(s)
197.29(d, 2.4)456.28(s)
208.81(d, 9.3)46NR
HN16
33化学位移/ppm化学位移/ppm原子原子
21NR47NR
22NR4814.0(s，宽)
23NR49NR
248.98(s)50NR
25NR5114.0(s，宽)
26NR
NR^没有共振
NMR积分计算马来酸与AZD1152的比例为约1 : 1.04。 差示扫描量热法
使用Mettler DSC820e对根据制备方法1和2制备的AZD1152马来
酸酯(盐)共晶体进行差示扫描量热法(DSC)分析。以10。C/分钟的恒定 速率将包含在40 ju 1铝锅中的典型地少于5mg物质的样品从25 。C加热至 325°C,所述铝锅装备有可刺穿的盖。
使用利用氮气的净化气体-流速100 ml/分钟。
一批根据上述方法1制备的AZD1152马来酸酯(盐)共晶体的结 果(参见图2)显示出由于熔融，该马来酸酯(盐)共晶体表现出大的、 快速地吸热，起始温度为180°C。在熔融后，由于熔融后马来酸的降解， 观察到大的吸热现象。应当理解DSC的起始温度和/或峰温度值可能随 机器、方法或样品不同而稍微变化，因此，引述的值不应当看作是绝对 值。
一批根据上述方法2制备的AZD1153马来酸酯(盐)共晶体的结 果(参见图3)显示出由于熔融，该马来酸酯(盐)共晶体表现出大的、 快速地吸热，起始温度为183°C。在熔融后，由于熔融后马来酸的降解， 观察到大的吸热现象。应当理解DSC的起始温度和/或峰温度值可能随 机器、方法或样品不同而稍微变化，因此，引述的值不应当看作是绝对 值。
动态蒸汽吸附
分析仪器Surface Measurements Systems Dynamic Vapour SorptionAnalyser 。
在25。C下，在下述相对湿度(RH)下0、 20、 40、 60、 80、 95、 80、 60、 40、 20、 0% RH, —式双份，使在规定温度下的约5 mg包含在石 英试杆中的物质接受湿润的氮气，氮气流速为200 ml/分钟。
根据经IO分钟平均的重量标准0.002%重量变化/分钟监测在特定相 对湿度下物质的重量，直到其是稳定的。如果该重量仍然变化，那么将 其保持在特定的相对湿度下直到重量是稳定的(至多为最长时间12小 时)。
将一批根据方法1制备的AZD1152马来酸酯(盐)共晶体的结果 显示在图4中。将一批根据上述方法2制备的AZD2252马来酸酯(盐) 共晶体的结果显示在图5中。
显示在图4和5中的动态蒸汽吸附的结果显示出该样品是不吸湿 的，重量增加应归于表面吸附。在图5中在周期1期间观察到的重量减 轻归于存在于样品中来自制备的少量溶剂。这点被在0%RH重量减轻所 证实。 一旦蒸发溶剂，物质在0。/。RH保持其重量。本领域技术人员将充 分里理解该观测结果。
游离形式的AZD1152的动态蒸汽吸附显示在图6中。
游离形式的动态蒸汽吸附显示出水含量相当不确定，取决于贮存的 相对湿度。水含量的这一变化应归于不同的水化状态，其可以从脱水状 态改变至四水合物状态和更高。X射线粉末衍射
如上所述AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的X射线粉末衍射图 显示在图1中。
AZD1152马来酸酯(盐)的其它制备方法已经在上述方法2中列出。 方法2制备的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的X射线粉末衍射图 显示在图7中。将主要峰值显示在下述表2中。
表2
角度(2- 6
5.13 6.45
8.14 10.18
相对强度(％) 80.3 57.9 40.5 9.1
角度o e
22.45 23.22 23.58 23.98
相对强度(％) 13.5 21.8 33.8 20.811.967.824.3014.8
12.8558.424.6516.1
13.8514.325.5627.8
14.9612.525.8352.5
15.2725.726.3735.6
15.751327.9838.4
16.5319.728.4434.3
17.2923.628.9116.9
19.3110029.7229.6
19.7855.130.3413
20.1099.532.7214.5
20.6040.536.2122.3
21.0120.538.1811.9
21.6882.3
如上所述，本领域已知可以获得x射线粉末衍射图，所述图案具有
一个或多个测量误差，取决于测量条件(比如所用装置、样品制剂或设
备)。特别地， 一般已知X射线粉末衍射图的强度可以根据测量条件和
样品制剂波动。例如，x射线粉末衍射领域的技术人员将认识到峰值的
相对强度可能受例如尺寸大于30微米和长宽比不均匀的晶粒的影响， 其可能影响样品的分析。本领域技术人员也将认识到反射的位置可能受 样品位于衍射计中精确高度和衍射计的零点校准的影响。样品的表面平 面性可能也具有小的影响。因此，本领域技术人员应当理解本文出现的 衍射图案数据不应看作是绝对值(进一步的信息参见Jenkins， R & Snyder R.L. 'Introduction to X-Ray Powder Diffractometry' John Wiley & Sons, 1996)。
同样如上所述，通常，X-射线粉末衍射图中衍射角的测量误差为约 2-6=0.5。或更小(或更适当地，约2-6=0.2。或更小)，当考虑图1中的X 射线粉末衍射图和当解释在本文上述和表1中所指的峰值时，应当考虑 这种测量误差的程度。因此，本领域技术人员应当理解图7和上述表2 中列出的数据显示用方法2制备的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体与用方法l(显示在图l和表l中)制备的AZD1152的马来酸酯(盐)共 晶体的结晶形式相同。
权利要求
1. AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体，其中AZD1152为
2. 如权利要求1中定义的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结 晶形式。
3. 根据权利要求2的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的结晶形 式，其中所述共晶体具有在约2-6=12.9°和15.2。和/或10.2处有特征峰 的X射线粉末衍射图。
4 一种如权利要求i中定义的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体的制备方法，所述方法包括在合适的溶剂比如甲醇、二曱亚砜(DMSO)或 其混合物中混合游离形式的AZD1152的溶液与马来酸的步骤。
5. 药物组合物，包括如权利要求1中定义的AZD1152的马来酸酯(盐) 共晶体以及可药用稀释剂或载体。
6. 用于治疗的如权利要求1中定义的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体。
7. 如权利要求1中定义的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体在制备用 于治疗其中抑制一种或多种极光激酶有益的疾病的药物中的用途。
8. 如权利要求1中定义的AZD1152的马来酸酯(盐)共晶体在制备用 于治疗过度增殖性疾病比如癌症的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种2-{乙基[3-({4-[(5-{2-[(3-氟苯基)氨基]-2-氧代乙基}-1H-吡唑-3-基)氨基]喹唑啉-7-基}氧基)丙基]氨基}乙基二氢磷酸酯(AZD1152)的新的共晶体，其为一种在治疗过度增殖性疾病比如癌症中有用的极光激酶抑制剂。
文档编号C07D403/12GK101448823SQ200780017957
公开日2009年6月3日 申请日期2007年5月14日 优先权日2006年5月16日
发明者G·J·塞彭达, R·斯托里 申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司