专利名称：针对尼古丁成瘾的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种针对尼古丁(nicotine)成瘾的疫苗。更特别地，本发明提供了一种新尼古丁衍生物形式的半抗原，所述半抗原可适当地与合适的载体缀合以得到针对尼古丁成瘾的有效疫苗。
背景技术：
根据世界卫生组织统计全世界共有超过十亿吸烟者。估计每年有大约四百万人死于癌症、心脏病和其他与吸烟相关疾病。
被广泛接受的是人们持续吸烟是因为烟草含有尼古丁，这是一种成瘾性化学物质。事实上，许多戒烟策略是向具有烟瘾的人提供来自烟草之外来源例如来自贴剂(patch)或口胶剂(gum)的尼古丁。
另一种戒烟策略是提供刺激免疫系统通过产生针对尼古丁的抗体而从系统中清除尼古丁的疫苗。从而在用尼古丁疫苗免疫之后，如果一个人吸烟，那么所述抗体将在尼古丁到达大脑之前从系统中将其清除。结果是吸烟的人将无法经历所期待的尼古丁的刺激效果，或者所述效果显著下降。由于所述吸烟者会经历尼古丁刺激效果的减弱或停止，所以他/她将会丧失吸烟的渴望。
一些专利文献中已经描述了用于戒烟策略的尼古丁疫苗。
例如WO 99/61054描述了一种含有5-或6-烟酰基-接头-载体蛋白的尼古丁免疫原。
另外，US 6,232,082描述了尼古丁-载体缀合物，其中所述载体在3’，4’或5’-位置与尼古丁残基键合。US 6,232,082的半抗原含有在3’，4’或5’-位置用(CH2)n-Z部分衍生的尼古丁部分，其中Z是NH2、COOH、CHO或SH。这些半抗原用同双功能或异双功能交联剂与所述载体蛋白缀合。在这篇文献的式(I)中，X和Y分别表示所述交联剂与半抗原和载体连接的基团。然而，在所述US专利中描述的免疫原性研究使用了完全和不完全弗氏佐剂增强免疫应答。这种佐剂是不允许在人体中使用的。
WO 2004/09116描述了产生尼古丁-Qβ-缀合物的方法，所述方法包括合成O-琥珀酰-反式-3’-羟甲基尼古丁的N-羟基琥珀酰亚胺酯和将所述尼古丁衍生物与赖氨酸在Qβ的表面在形成酰胺键的条件下反应的步骤。这些缀合物的一个重要缺点是其在体内的弱稳定性。
WO 02/49667描述了一种可替宁(cotinine)缀合物，其中可替宁与载体通过1、2、5、6或4’位置缀合。WO 02/49667公开了一种半抗原缀合物，所述缀合物含有用-CO-NH-CH2-CH2-SH基团衍生的可替宁部分，所述半抗原通过γ-马来酰亚胺基丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯(GMBS)与卵清蛋白缀合。在所述国际申请中，观察到可替宁能够在体内拮抗尼古丁的效应。进一步地，猜想针对可替宁的免疫反应可以降低可替宁在尼古丁神经学效应上的削弱效应，从而使得对象渴望较少量的尼古丁。这个猜想似乎并不是有道理的，特别由于其并未得到任何实验证据的证实。
发明概述 本发明人开发了一种新的半抗原，所述半抗原可以有利地用于产生高效尼古丁疫苗。
本发明的半抗原是具有下式的尼古丁衍生物
其中五元环或六元环被一个R-SH基团取代，其中R表示CH2-Y-Z -Y表示O、S、NH或NH-CO；及 -Z表示直链或支链C1-C22亚烷基、直链或支链C2-C22亚烯基或聚亚烷基二醇部分。
前述尼古丁衍生物可用于产生免疫原性尼古丁-载体缀合物，所述缀合物可以有利地用于尼古丁成瘾的治疗性或预防性治疗，所述治疗包括将所述缀合物给予患有尼古丁成瘾或处于成为尼古丁成瘾的危险中的个人。本发明的尼古丁-载体缀合物是高度稳定的，并且可储存几个月或甚至几年而不显著丧失免疫原性效力。同时，本发明的缀合物的体内稳定性非常高，特别是如果所述尼古丁衍生物通过琥珀酰亚胺交联剂与所述缀合物结合，并且所述尼古丁衍生物和交联剂通过硫醚键连接。进一步地，本发明的尼古丁-载体缀合物可以用不多于几个相对简单的合成步骤产生，以高产量收获明确的缀合物产物。
发明详述 因此，本发明的一个方面涉及具有下式(I)的尼古丁衍生物
其中五元环或六元环被一个R-SH基团取代，其中R表示CH2-Y-Z -Y表示O、S、NH或NH-CO；及 -Z表示直链或支链C1-C22亚烷基、直链或支链C2-C22亚烯基或聚亚烷基二醇部分。
根据另一个特别优选的实施方案，在式I中，Y表示NH或NH-CO。最优选地，Y表示NH。
根据进一步优选的实施方案，在式(I)中，Z是C1-C4亚烷基，最优选地是亚乙基。
式(I)中的R-SH残基可以键合至尼古丁分子的五元环的3’、4’或5’位置。优选地，R键合至所述五元环的3’或4’位置，最优选地至3’位置。
根据另一个特别优选的实施方案，式(I)的尼古丁衍生物被所述R-SH残基反式取代。在另一个特别优选的实施方案中，本发明的尼古丁衍生物是L-尼古丁衍生物。
本发明特别优选的尼古丁衍生物是3′-(2-巯基乙基氨甲基)尼古丁、3′-(3-巯基丙酰氨基甲基)尼古丁和3′-(巯基乙酰氨基甲基)尼古丁。
本发明的另一方面涉及本发明的尼古丁衍生物的前体，由如下分子式(Ia)表示
其中五元环或六元环被一个R-S-CO-R’部分取代，R具有与本文前面所定义的相同含义并且其中R’-CO表示低级酰基，优选含有1至8个碳原子、更优选1至6个碳原子、更优选1至5个碳原子的支链或直链酰基。在一个特别优选的实施方案中，上述式中的R’-CO表示选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基和新戊酰基、最优选乙酰基和丙酰基的低级酰基。
在本发明一个特别优选的实施方案中，所述前体是3’-(S-乙酰巯基乙酰氨基甲基)尼古丁。这些前体可以通过S-脱乙酰和后续缀合(优选地通过两步一锅法(two-step one-pot procedure))而容易地转变为相应的本发明的尼古丁衍生物缀合物。本领域技术人员通常知道适当的S-脱乙酰反应。另外，本发明人发现这些S-乙酰巯基化合物对于氧化(即形成二硫二聚体)相当不敏感，并且所述前体与相应的尼古丁衍生物相比在纯化和储存过程中可以更方便地操作。
本发明另一方面涉及具有下式(II)的半抗原-载体缀合物
其中五元环或六元环被一个R-SH基团取代；p是1至500；R具有与本文前面相关于式(I)所定义的相同含义。
在本发明的半抗原-载体缀合物中使用的载体可以是能够安全地用于人体并且能够与本发明的尼古丁衍生物化学连接的任何免疫原性物质。在一个优选的实施方案中，所述载体选自由免疫原性物质、病毒、病毒样颗粒、蛋白质复合物、蛋白质、多肽、脂质体和免疫刺激复合物(ISCOM)组成的一组。根据一个特别优选的实施方案，所述载体是免疫原性蛋白质或多肽。免疫原性蛋白质的特别合适的实例包括破伤风类毒素、白喉类毒素、匙孔血蓝蛋白(KLH)、血蓝蛋白、清蛋白、无毒突变体白喉类毒素CRM197、来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白复合物(OMPC)、不耐热大肠杆菌(Escherichia coli)的B亚基、来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的重组外蛋白A(recombinant exoprotein A，rEPA)和由噬菌体Qb的重组外壳蛋白组装的病毒样颗粒，最优选的实例是破伤风类毒素、白喉类毒素、匙孔血蓝蛋白(KLH)、血蓝蛋白、清蛋白、无毒突变体白喉类毒素CRM197、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)、不耐热大肠杆菌的B亚基和由噬菌体Qb的重组外壳蛋白组装的病毒样颗粒。在本发明一个优选的实施方案中，提供如本文定义的半抗原-载体缀合物，其中所述载体是蛋白质，其中半抗原蛋白质摩尔比例大于1。
本发明的免疫缀合物内的间隔基(spacer)将尼古丁衍生物共价连接至载体。本领域熟知可用于交联半抗原和载体(特别是蛋白质/多肽成份)的间隔基。优选地，在本发明中，所述间隔基是异双功能交联剂，特别是琥珀酰亚胺交联剂的残基，如 -N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯， -N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)， -N-(ε-马来酰亚胺基已酰氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)， -N-(N-马来酰亚胺基丙酰基)-9-氨基-4，7-二氧杂壬酸N-琥珀酰亚胺酯(NHS-PEG2-马来酰亚胺)，或 -N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)， 所述交联剂用于修饰载体以产生巯基活性载体。在第二步中，尼古丁衍生物被偶联至所述巯基活性蛋白以产生所述免疫缀合物，其中衍生自所述异双功能交联剂的间隔基将所述尼古丁衍生物连接至所述载体。根据一个优选的实施方案，在本发明的缀合物中，半抗原和间隔基被一个硫醚键连接在一起。其中半抗原和间隔基通过硫醚键结合的缀合物产生高体内稳定性的优点。
本发明一个进一步的方面涉及如本文上文所定义的半抗原-载体缀合物在疫苗组合物的制备中的用途，所述疫苗组合物特别是用于预防或治疗尼古丁成瘾的方法中的疫苗组合物，所述方法包括给予治疗有效量的所述半抗原-载体缀合物。本发明的缀合物的优点是它们在体内条件下高度稳定。另外，本发明的半抗原-载体缀合物可以制备为明确的形式，这意味着不希望的副作用的风险被有效地最小化。
适当的给予模式包括皮下、肌内、穿粘膜和静脉内给予。最优选地，所述疫苗组合物被皮下或肌内给予。
相信尼古丁的成瘾效应与尼古丁穿越血脑屏障的能力有关。本发明治疗或预防尼古丁成瘾的方法基于阻止尼古丁穿越血脑屏障。特别地，将尼古丁半抗原-载体缀合物给予人将会在被人的血流中产生针对尼古丁的抗体。如果所述人吸烟，其血液中的尼古丁将会与循环的抗尼古丁抗体结合，阻止尼古丁到达大脑。因此，所述抗体将阻止尼古丁在大脑中产生的生理和心理效应。由于吸烟者会经历这些效应的减弱或消除，因此他/她将会丧失吸烟的渴望。如果一个人在用本发明的尼古丁半抗原-载体缀合物免疫后使用无烟烟草，可以预期同样的治疗效果。另外，本发明的缀合物和抗体可以通过影响尼古丁刺激周围神经系统的能力而发挥作用。
本发明的缀合物适于治疗和预防尼古丁成瘾。对于治疗尼古丁成瘾，本发明的尼古丁-载体缀合物被给予患有尼古丁成瘾的人。对于预防尼古丁成瘾，处于发展为尼古丁成瘾的危险中的人用本发明的缀合物治疗。
本发明的疫苗组合物含有足够引发免疫应答的量的至少一种尼古丁半抗原-载体缀合物。使用本发明的尼古丁半抗原载体缀合物的初次免疫产生高效价的特异于尼古丁的抗体。给予需要治疗尼古丁成瘾的人的缀合物的治疗有效量可由本领域技术人员容易地确定。合适的剂量范围是1-1000μg/剂。通常一个人需要一周至几周的时间产生针对外源抗原的抗体。人血液中抗体的产生可以通过使用本领域普通技术人员熟知的技术监控，所述技术例如ELISA、放射免疫测定、表面等离子共振、以及Western印迹方法。治疗效果也可以通过评估尼古丁的各种物理效应例如血压监控。
应当明白初次给予本发明的免疫原性缀合物可能需要后续一或多次加强给予缀合物。这种加强会增强针对本发明的尼古丁半抗原-载体缀合物的抗体的产生。
本发明的疫苗组合物可含有至少一种佐剂。用于本发明的佐剂应当选择为不抑制载体蛋白的作用。用于本发明的佐剂是那些对于人体生理学可接受的那些，包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝、基于油/表面活性剂的乳剂佐剂例如MontanideTM(其中不同的表面活性剂(特别是甘露油酸酯)与矿物油组合)、含有角鲨烯的乳剂例如MF59TM、单磷酰脂质A、或奈瑟氏球菌突变体脂多糖(如PCT/NL98/0063所述)。
本发明的疫苗组合物可任选地含有一或多种药物学可接受的赋形剂。合适的赋形剂包括无菌水、盐溶液和缓冲液。根据一个优选的实施方案，本发明的半抗原-载体缀合物的疫苗组合物溶解于处于药物学可接受的pH的水性盐溶液中。或者，所述疫苗组合物含有所述半抗原-载体缀合物的悬浮液。
另外，所述疫苗组合物可以任选地含有至少一种助剂，例如分散介质、包衣、微球体、脂质体、微囊、脂类、表面活性剂、润滑剂、防腐剂和稳定剂。
本发明的疫苗组合物优选地是无菌的。另外，所述组合物可含有防止微生物侵染及生长的成份。
优选所述疫苗组合物以易于立即给予的无菌水性液体的形式生产。
本发明的尼古丁衍生物可使用不产生蛋白质-蛋白质缀合物的合成途径有利地连接至载体。因为这些蛋白质-蛋白质缀合物不利地影响所述疫苗组合物的溶解度和效力，本发明的另一方面涉及含有本发明的半抗原-载体缀合物和药物学可接受的赋形剂的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物不含有蛋白质-蛋白质缀合物。
本发明通过如下实施例进一步说明。
实施例 实施例1 如下合成反式-3′-尼古丁-N-(2-巯基乙基)氨甲酰(1) N，N′-双-(反式4′-可替宁酰羰基)胱胺(A) 1.00g(4.54mmol)反式-4′-可替宁羧酸、0.45g(2.00mmol)二盐酸化胱胺和0.68g(4.44mmol)N-羟基苯并三唑的混和物从25ml无水N，N-一二甲基甲酰胺浓缩两次。残渣溶于25ml无水N，N-二甲基甲酰胺，并且加入0.80ml(4.59mmol)N，N-二异丙基乙胺和0.68ml(4.39mmol)N，N′-二异丙基碳二亚胺。在室温搅拌所述混和物。在20h后，加入4ml(0.2mol)水并且持续搅拌1h。之后，在真空中浓缩所述混和物。将残渣置于100ml 0.5M KHSO4中并用氯仿洗涤(3×25ml)。向水相层中缓慢加入固体Na2CO3.H2O(8.0g)，之后用氯仿萃取(3×25ml)。合并有机层，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩得到糖浆状化合物A，用于下一步而无需纯化。
将氯仿中的化合物A的一小份样品用三氟乙酸酸化，之后浓缩。残渣自甲醇浓缩(2×10ml)；1H NMR(D2O)，δ 8.84-8.86(m，2×2H)，8.59-8.64(m，2×1H)，8.17(dd，2×1H)，5.14(d，2×1H)，3.45-3.85(m，2×2H)，3.17-3.24(m，2×1H)，2.93-3.02(m，2×1H)，2.76-2.86(m，2×3H)，2.71(s，2×3H).13C NMR(D2O)，δ 180.0，176.4，149.2，145.5，143.9，142.9，131.8，68.0，50.1，41.6，40.1，37.5，32.0。离子喷雾质谱MH+(发现/计算)557/557。
反式-4′-可替宁-N-(2-巯基乙基)氨甲酰(B) 将化合物A(≈2mmol，游离碱)溶于20ml甲醇中并浓缩。将残渣复溶于20ml甲醇/水中，99/1，v/v，并加入0.60g(2.10mmol)tris-(2-羧乙基)膦氢氯化物。将混和物在室温搅拌3h，在此期间膦逐渐溶解。之后，将混和物用100ml氯仿稀释，并用50ml 1M NaHCO3洗涤。水相层用氯仿萃取(2×25ml)。将合并的有机层用50ml 1M NaHCO3再洗涤一次并再次用氯仿萃取水相层(2×25ml)。合并有机层，干燥(MgSO4)，并过滤。浓缩滤液得到糖浆状B，通过TLC和HPLC确定纯度大约为97％。
用Waters Alliance 2695 HPLC进行HPLC分析，如下配置并操作 柱C18，2.1x150mm，3μm(Waters BioSuite PA-A). 流速0.2ml/min，分离设备在UV检测器之后(splitter na UV detector) 洗脱液A水，0.1％TFA 洗脱液B乙腈，0.08％TFA 梯度20min中，5％至67％洗脱液B 检测UV-Waters PDA 996254nm；Mass-Micromass Quattro Micro APIES+ 离子喷雾质谱MH+(发现/计算)280/280。1H NMR(CDCl3)，δ 8.61(dd，1H)，8.52(d，1H)，7.58(dt，1H)，7.34-7.39(m，1H)，6.04(br，1H)，4.77(dd，1H)，3.33-3.50(m，2H)，2.72-2.88(m，3H)，2.60-2.66(m，2H)，2.65(s，3H).1.26(t，1H).13C NMR(CDCl3)，δ 173.2，170.8，150.2，148.7，135.3，134.6，124.3，65.0，48.6，42.6，34.6，28.6，24.6。
反式-3′-(2-巯基乙基氨甲基)尼古丁(1) 自无水四氢呋喃(2×5ml)浓缩粗化合物B(≈2mmol)，并溶于10ml无水四氢呋喃。在氮气环境下将所述溶液缓慢加入到于四氢呋喃中的10ml1M硼烷-四氢呋喃复合物中。所述反应混和物在室温搅拌20h。加入无水甲醇(5ml)并浓缩混和物。残渣自无水甲醇(3×10ml)浓缩，并溶解于10ml1NHCl。之后缓慢加入50ml 1M NaHCO3并用氯仿(3×25ml)萃取所述混和物。合并有机层，干燥(MgSO4)并过滤。向滤液中加入三氟乙酸(0.45ml，6mmol)，之后浓缩。自甲醇(2×10ml)浓缩残渣并进一步用HPLC纯化。
实施例2 免疫缀合物的制备从实施例1中描述的含有巯基的半抗原开始，用J.WDrijfhout and P.Hoogerhout“Methods of preparing peptide-carrier conjugates”InFmoc Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach(W.C.Chan andP.D.White，eds.).Oxford University Press，2000，pp.229-241中描述的方法进行。
材料 ·载体破伤风类毒素(TTd)或牛血清白蛋白(BSA)。
·交联剂N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯、N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)、N-(N-马来酰亚胺基丙酰基)-9-氨基-4，7-二氧杂壬酸N-琥珀酰亚胺酯(NHS-PEG2-马来酰亚胺)和N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)。
载体溶于0.1M磷酸钠缓冲液中，pH8，浓度为对于TTd为3.0mg/ml和对于BSA为3.0mg/ml。交联剂新鲜溶于N，N-二甲基乙酰胺中，浓度为0.20M或80mM。将50μl等份的0.20M交联剂加入到1.75ml TTd溶液中，而将50μl等份的80mM交联剂加入到1.75ml BSA溶液中。混和所述溶液并在室温下静置1h。之后将反应混和物加入到用含有5mM EDTA，pH 6(用氦脱气)的0.1M磷酸钠缓冲液平衡的PD-10TM柱中。用相同的缓冲液进行洗脱。修饰的蛋白质以3.0ml体积收集，并立即用于缀合含有巯基的半抗原。
将纯化后的含有巯基的半抗原(三氟乙酸)(3-4μmol)溶于250μl水中并加入到2.0ml新鲜制备的于含有5mM EDTA，pH 6的0.1M磷酸钠缓冲液中的巯基活性载体溶液中。混和所述溶液并在室温静置16-24h。之后将反应混和物加入到用pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)平衡的PD-10TM柱中。用相同的缓冲液进行洗脱。免疫缀合物(≈3.5mg)以3.5ml体积收集，并在2-8℃储藏直至制备疫苗。
由含有巯基的半抗原和吡啶二硫代丙酰基修饰的蛋白质制备的缀合物显示对于TTd和BSA的半抗原/蛋白质摩尔比例分别为大约60和30。
实施例3 疫苗和免疫 疫苗通过用PBS，pH 7中磷酸铝悬浮液(0.5-1.5mg/ml)适当地稀释由化合物1和溴乙酰化的TTd和(溴乙酰氨基)丙酰化的TTd制备的缀合物原液(1mg/ml)制备。普通PBS用磷酸铝悬浮液稀释以得到模拟疫苗。八只一组的小鼠在第0天和第28天用含有于0.3ml PBS中的50μg免疫缀合物和75μg AlPO4的疫苗组合物进行免疫。在第42天取血清并在-20℃储藏直至使用。
实施例4 抗体效价 实施例3的血清中的抗体效价通过酶联免疫吸附测试(ELISA)确定。实施例2中使用NHS-PEG2-马来酰亚胺交联剂制备的半抗原-BSA缀合物用作包被抗原。尼古丁、可替宁或乙酰胆碱在抑制ELISA中用作抑制剂。
发现测试的缀合物在小鼠中诱导满意的抗体效价。应答是尼古丁特异性的。抗体与可替宁或乙酰胆碱没有显著交叉反应。
实施例5 如下合成反式-3′-(3-巯基丙酰氨基甲基)尼古丁(2) 90mg(0.47mmol)3′-氨基甲基尼古丁[Pentel et al.2000]、0.42g(2.0mmol)3，3′-二硫代二丙酸和144mg(1.0mmol)羟基苯并三唑水合物的混和物自5ml无水N，N-二甲基甲酰胺浓缩两次，复溶于5ml无水N，N-二甲基甲酰胺，并加入155μl(1.0mmol)N，N-二异丙基碳二亚胺。在室温过夜搅拌所述混和物。之后加入100μl水并持续搅拌1h。最后，加入0.43g(1.5mmol)tris-羧乙基膦氢氯化物并继续搅拌3小时。浓缩反应混和物。将残渣置于10ml0.5M KHSO4中并用氯仿洗涤(4×3ml)。通过缓慢加入固体Na2CO3中和水相层并用氯仿萃取(4×3ml)。干燥有机层(MgSO4)，过滤，并浓缩以得到2作为主要产物(MH+＝279.9)。通过制备型HPLC获得纯化合物。
实施例6 如下制备反式-3′-(S-乙酰巯基乙酰氨基甲基)尼古丁(3的前体) 90mg(0.47mmol)3′-氨基甲基尼古丁[Pentel et al.2000]溶于5ml乙腈，并加入144mg(1.0mmol)羟基苯并三唑水合物和165mg(0.55mmol)五氟苯基S-乙酰巯基乙酸酯。2h后，加入77μl(1.0mmol)三氟乙酸并浓缩反应混和物。通过制备型HPLC纯化3′-(S-乙酰巯基乙酰氨基甲基)尼古丁，质谱分析显示MH+＝308.0。纯化后的化合物在-20℃储藏直至用于缀合。化合物3由3′-(S-乙酰巯基乙酰氨基甲基)尼古丁通过用例如羟胺进行S-脱乙酰产生。最方便的是在存在巯基活性蛋白质[Drijfhout and Hoogerhout 2000]的条件下进行脱乙酰以得到尼古丁缀合物而无需立即分离3。
实施例7 本发明的疫苗由化合物1、2和3的破伤风类毒素缀合物根据实施例2和3中描述的方法制备。每一种疫苗在八只一组的小鼠中通过在第0天和第28天用含有于0.3ml PBS中的50μg免疫缀合物和75μg AlPO4的疫苗组合物进行免疫而测试。在第42天取血清，血清的抗体效价通过使用同源半抗原-BSA缀合物进行直接ELISA确定。接下来取自四组小鼠的血清在半抗原1-BSA缀合物(“1-BSA”)上通过直接ELISA测试。在半抗原1-BSA缀合物上分别使用尼古丁和乙酰胆碱的抑制ELISA用于评估取自四组小鼠的血清的抗尼古丁抗体的尼古丁结合亲和力和特异性。
直接ELISA 微量滴定板上的孔用100μl于PBS中的半抗原-BSA缀合物溶液(0.5μg/ml)在室温温育过夜。平板用含有0.04％ Tween 80的自来水漂洗。所述孔与100μl于PBS中0.1％ Tween 80中的各个血清的系列稀释液在37℃温育60min。平板用含有0.04％ Tween 80的自来水漂洗，并将所述孔与100μl于PBS中0.1％ Tween 80中的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG的1:5000稀释溶液在37℃温育60min。平板再次用含有0.04％ Tween 80的自来水漂洗。底物溶液通过向10ml的0.11M乙酸钠/柠檬酸缓冲液(pH5.5)中连续添加100μl于96％乙醇中3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(10mg/ml)和4μl30％过氧化氢新鲜制备。每孔与100μl底物溶液在室温温育10min。最后，反应通过加入100μl 2M硫酸终止，在450nm读取光密度。效价计算为在50％最大光密度(OD50)的血清稀释度倒数的对数。
抑制ELISA 混和来自每组八只小鼠的血清的相等等份并在于PBS中的0.1％Tween80中1:400000稀释。将抑制剂(尼古丁、可替宁或乙酰胆碱)以10-1M浓度溶于1:400000稀释的混和血清。在准备好的1:400000血清稀释液中制备系列十倍稀释(高至10-12M)的抑制剂。
平板用半抗原-BSA缀合物包被并如上所述漂洗。在第二步中，孔与100μl抑制剂溶液在37℃温育60min，之后用含有0.04％ Tween 80的自来水漂洗。与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG温育，之后将底物如上所述处理。效价计算为在50％最大光密度(OD50)的抑制剂浓度(mol/L)的以十为底的负对数。由OD(450nm)对抑制剂浓度(mol/L)的以十为底的负对数作图得到的曲线确定IC50值。
结果 通过对同源半抗原-BSA缀合物进行直接ELISA确定的血清平均抗体效价示于表1。
表1 通过对1-BSA缀合物包被进行直接ELISA确定的血清平均抗体效价示于表2。
表2 用尼古丁作为抑制剂对1-BSA缀合物包被的抑制ELISA结果示于
图1，其中示出了由OD(450nm)对抑制剂浓度(mol/L)的以十为底的负对数作图得到的曲线。
所述曲线示出对于1-BSA，尼古丁IC50对于来自用半抗原1缀合物免疫的小鼠的抗体是最大的，对于来自用半抗原3缀合物免疫的小鼠的抗体是最小的。
用乙酰胆碱作为抑制剂对1-BSA缀合物包被的抑制ELISA结果示于图2，其中示出了由OD(450nm)对抑制剂浓度(mol/L)的以十为底的负对数作图得到的曲线。
使用乙酰胆碱的抑制ELISA的结果示出尼古丁抗体结合是特异性的。
基于这些结果，得出结论本发明的半抗原1、2和3与破伤风类毒素载体的缀合物可以合适地用于诱导小鼠中抗尼古丁抗体应答，并因此提供合适的疫苗用于治疗性或预防性治疗尼古丁成瘾。
权利要求
1.具有下式的尼古丁衍生物
其中五元环或六元环被一个R-SH基团取代，其中R表示CH2-Y-Z
-Y表示O、S、NH或NH-CO；及
-Z表示直链或支链C1-C22亚烷基、直链或支链C2-C22亚烯基或聚亚烷基二醇部分。
2.权利要求1的尼古丁衍生物，其中Y表示NH或NH-CO。
3.权利要求1或2的尼古丁衍生物，其中Y表示NH。
4.前述任一项权利要求的尼古丁衍生物，其中Z表示C1-C4亚烷基，优选亚乙基。
5.前述任一项权利要求的尼古丁衍生物，其中R键合至所述五元环的3’或4’位置，优选至3’位置。
6.前述任一项权利要求的尼古丁衍生物，其中所述衍生物是3′-(2-巯基乙基氨甲基)尼古丁。
7.权利要求1-5任一项的尼古丁衍生物，其中所述衍生物是3′-(3-巯基丙酰氨基甲基)尼古丁。
8.权利要求1-5任一项的尼古丁衍生物，其中所述衍生物是3′-(巯基乙酰氨基甲基)尼古丁。
9.具有下式的尼古丁衍生物前体
其中五元环或六元环被一个R-S-CO-R’部分取代，R具有权利要求1-5任一项所定义的相同含义并且其中R’-CO表示低级酰基。
10.权利要求9的尼古丁衍生物前体，其中所述前体是3’-(S-乙酰巯基乙酰氨基甲基)尼古丁。
11.具有如下分子式的半抗原-载体缀合物
其中五元环或六元环被一个R-SH基团取代；p是1至500；且R具有与权利要求1中相同的含义。
12.权利要求11的半抗原-载体缀合物，其中所述载体选自由免疫原性物质、病毒、病毒样颗粒、蛋白质复合物、蛋白质、多肽、脂质体和免疫刺激复合物(ISCOM)组成的一组中。
13.权利要求12的半抗原-载体缀合物，其中所述载体是选自由破伤风类毒素、白喉类毒素、匙孔血蓝蛋白(KLH)、血蓝蛋白、清蛋白、无毒突变体白喉类毒素CRM197、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)、不耐热大肠杆菌的B亚基、来自铜绿假单胞菌的重组外蛋白A(rEPA)和由噬菌体Qb的重组外壳蛋白组装的病毒样颗粒组成的一组中的蛋白质。
14.半抗原-载体缀合物在制备用于预防或治疗尼古丁成瘾的方法中的疫苗组合物中的用途，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求11-13任一项的半抗原-载体缀合物。
15.含有权利要求11-13任一项的半抗原-载体缀合物和药物学可接受的赋形剂的疫苗组合物，其中所述疫苗不含有蛋白质-蛋白质缀合物。
全文摘要
本发明提供了一种新尼古丁衍生物形式的半抗原，所述半抗原可适当地与合适的载体缀合以得到针对尼古丁成瘾的有效疫苗。更特别地，本发明涉及具有式(I)的尼古丁衍生物本发明还涉及衍生自前述尼古丁衍生物的半抗原-载体缀合物和含有所述半抗原-载体缀合物的疫苗组合物。
文档编号C07D401/04GK101448817SQ200780018679
公开日2009年6月3日 申请日期2007年4月20日 优先权日2006年4月21日
发明者P·霍赫豪特, G·索梅尔 申请人:由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国